CN108949933B - 一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于重金属检测领域，具体公开了一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器。本发明通过巧妙地设计引物与模板(SEQ ID NO.1‑3所示)，使得在银离子存在下可对模板进行超快扩增，并使扩增产物在适宜环境中形成G四链体。进一步利用G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对银离子的快速、可视化检测。不仅如此，本发明所提供的传感器与方法对银离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。
Description
技术领域
本发明属于重金属检测领域，具体地说，涉及一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器。
背景技术
银是一种化学元素，化学符号Ag，原子序数47，银白色的过渡金属。银在自然界中很少量以游离态单质存在，主要以含银化合物矿石存在。银的化学性质稳定，活跃性低，价格贵，导热、导电性能很好，不易受化学药品腐蚀，质软，富延展性。其反光率极高，可达99％以上。银的最重要的化合物是硝酸银。在医疗上常用硝酸银的水溶液作眼药水，因为银离子能强烈地杀死病菌。同时，银离子还具有较高毒性，在水中易被生物富集，进而抑制蛋白的活性，间接地影响生物的繁衍。体内研究显示机体可通过吸入、皮肤接触、摄食等多种途径接触到纳米银，进而通过循环系统遍布全身，在包括皮肤、肝脏、肺、心血管系统和生殖系统在内的众多组织产生毒副反应，通过氧化应激和凋亡，对人体产生极大的危害。
目前银离子的检测方法很多，主要包括原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、电感耦合等离子体质谱法、电化学分析方法、原子吸收分光光度法等。这些方法具有灵敏度高、检测范围广、适合多种样品分析等优点，但是这些方法同样具有前处理复杂，需要大型仪器和专业人员操作、维护成本高、检测时间长、不适合用于现场快速检测等缺点。因此迫切需要一种对银的操作简单、价格低廉、灵敏、快速、准确的可视化检测新方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器，以求实现对银离子的快速、可视化检测。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器，包括：(1)sPCR扩增体系，(2)包含ABTS显色液的检测体系，所述检测体系用于对待测样品经由所述sPCR扩增体系进行扩增后所得产物进行显色检测；
其中，所述sPCR扩增体系包括：模板、DNA聚合酶、正向引物、反向引物、dNTP、缓冲液；
所述模板为：
TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTACCTCCTCCATGATAAGTCACGATTGTTGTTGCGATAGCGCCAGC；
所述正向引物为：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC；
所述反向引物为：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCACTCGTGACTTATCATCCACCACC。
所述正向引物和反向引物中的隔断为聚六乙二醇。
所述隔断与两端碱基通过磷酸二酯键方式连接。
本发明中，ABTS显色液的配方为：1mL DNAzyme底物缓冲液，柠檬酸0.933g，蒸馏水100mL，5μL ABTS底物溶液，1μL 30％H2O2。
DNAzyme底物缓冲液：即为pH 3.6的柠檬酸盐缓冲液，配方为：Na2HPO4.12H2O1.843g，柠檬酸0.933g，蒸馏水100mL。
ABTS底物溶液：取20mg 2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐粉末(购自Sigma公司)溶于1mL DMSO，即得。
所述DNA聚合酶为Ex Taq DNA聚合酶，所述缓冲液为10×Ex Taq Buffer，二者与所述dNTP均购自赛默飞科技(Thermo Scientific Life Technologies)。
在银离子存在的情况，基于银离子与胞嘧啶错配，上述正向引物和反向引物中斜体字体所示的碱基，将与上述模板序列中斜体字体所示的碱基成功配对，从而启动上述引物与模板的sPCR扩增。然而，由于隔断的存在，将阻碍DNA聚合酶的继续延伸，使得sPCR产物的5’末端和3’末端带有富G序列的单链。
进一步地，在K+的存在下，所述sPCR产物将结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的G-四链体结构，催化H2O2和ABTS显色，通过比色检测，完成对银离子的检测。
因此，基于上述检测原理，本发明所述的检测体系包括：酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。
其中，所述酶活缓冲液为：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
所述氯高铁血红素溶液为20mM的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2μL：1mL的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。
第二方面，本发明提供了一种利用前述传感器对银离子进行检测的方法。
所述方法可分为定性检测和定量检测。
当进行定性检测时，包括如下步骤：
S1、利用所述sPCR扩增体系分别对待测样品和阴性对照样品进行超快聚合酶链式反应(super Polymerase Chain Reaction,sPCR)，得sPCR产物：
S11、在冰上配制sPCR反应体系：
S12、迅速置于sPCR反应装置中进行温度控制：
90-95℃2s，55-60℃3s，30-40个循环；优选为95℃2s，58℃
3s，36个循环。
S13、完成sPCR反应过程，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证sPCR反应体系的扩增效果，反应条件：120V 2h，拍照系统：Molecular Imager Gel Doc XR(Bio-Rad)。
S2、利用所述检测体系对所述sPCR产物进行检测：
S21、配制检测体系：
酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和sPCR产物的体积比为8:1:1；优选为酶活缓冲液80μL、氯高铁血红素稀释溶液10μL、sPCR产物10μL；
S22、将上述物质混匀后，在37℃条件下反应30min，使sPCR产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的G-四链体结构，加入与S21所得混合物等量体积(对应上述优选，即为100μL)的ABTS显色液，混匀，37℃避光孵育10min，肉眼进行监测。
依据待测样品与阴性对照样品的颜色差异进行银离子的定性判断；
所述阴性对照样品为不含有银离子的去离子水。
当进行定量检测时，包括如下步骤：
SI、制作标准曲线：
将前述sPCR反应体系中的待测样品，分别替换为已知浓度的银离子溶液，形成具有不同银离子浓度的sPCR体系，扩增与检测步骤与前述方法相同；
之后，以银离子浓度为横坐标，以OD415值为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，所述不同银离子浓度的浓度区间为5nM～250nM；最低检出限是0.56nM，在本发明的一个具体实施方式中，采用5nM、30nM、90nM、120nM、160nM、200nM和250nM的银离子浓度制作标准曲线；
SII、将待测样品按照前述定性检测方法进行检测，并将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中银离子的含量，实现对银离子的定量检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器，通过巧妙地设计引物与模板，使得在银离子存在下可对模板进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到10分钟，显著减少了PCR反应的用时。进一步结合G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对银离子的快速、可视化检测。
不仅如此，本发明所提供的传感器与方法对银离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。
附图说明
图1为实施例1中聚丙烯酰胺凝胶电泳验证sPCR反应体系的扩增效果；其中，泳道1：DNA ladder；泳道2：Ag+加入到反应体系中获得的sPCR产物。
图2为实施例1中的定性实验的检测限；其中，1：0nM，2：1nM，3：2nM，4：3nM，5：5nM。
图3为实施例2所述的标准曲线。
图4为实施例3进行的特异性实验。
图5为对比例1进行的反向引物错配碱基优化实验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的发明构思的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所使用的实验材料如下：
SYBR Gold核酸染料、核酸分子量标准ultra-low range DNA ladder、dNTP、ExTaq DNA聚合酶、10×Taq buffer、氯高铁血红素、硝酸银、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、H2O2，均购自赛默飞科技(Thermo Scientific LifeTechnologies)。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。
除此之外，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1定性实验
本实施例以人为添加不同浓度银离子的超纯水作为待测样品，以说明本发明所述传感器的使用和本发明所述方法。
1、sPCR装置的搭建
sPCR装置的温度变化经由一个95℃的高温水浴锅和一个58℃的中温水浴锅来实现。采用Light Cycler型号的毛细管(20uL，04 929 292001，Roche)作为sPCR样品室。通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端；离心完成后带有样品的毛细管被固定在一个专用的塑料支架上。
2、sPCR反应
sPCR反应体系见下表：
表1
| 反应组分 | 终浓度 |
| Template | 0.01μM |
| Ex Taq DNA聚合酶 | 1.5U/mL |
| 反向引物 | 2μM |
| 正向引物 | 2μM |
| 待测样品 | 2μL |
| dNTP | 250μM |
| 10×Ex Taq Buffer | 1× |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足至10μL |
sPCR反应过程：
按照上表，在冰上配制10微升反应体系，迅速置于sPCR反应装置中进行温度控制：95℃2s，58℃3s，36个循环。
完成sPCR反应过程，使用20％聚丙烯酰胺凝胶电泳验证sPCR反应体系的扩增效果(见图1)，反应条件：120V 2h，拍照系统：Molecular Imager Gel Doc XR(Bio-Rad)。
实验结果表明，当目标金属离子存在的情况下，通用隔断引物可以与模板结合，并在短时间内完成扩增。
3、对sPCR产物的显色检测
配制检测体系：
80μL酶活缓冲液(100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4)，10μL氯高铁血红素稀释溶液(2μL氯高铁血红素原液(20mM)与1mL酶活缓冲液混合)与10μL sPCR产物。
混匀后，在37℃条件下反应30min，使sPCR产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的G-四链体结构，加入100μLABTS显色液，混匀，37℃避光孵育10min，肉眼进行监测。
进一步地，本实施例还采用不含有银离子的去离子水作为对照组，以验证本发明所提供的传感器和方法在定性检测方面的准确性。
分别选取0nM、1nM、2nM、3nM、5nM的银离子标准溶液进行PCR和显色反应，当添加银离子浓度达到1nM时与阴性出现了明显的颜色变化，因此确定定性检出限为1nM。实验结果见图2。
实施例2定量检测
本实施例在实施例1所述定性检测的基础上，通过利用不同浓度的银离子溶液制作标准曲线，实现对待测样品银离子的定量检测。
相对于实施例1，本实施例增加了制备标准曲线的步骤，具体如下：
利用已知浓度的银离子溶液，配制银离子终浓度分别为5nM、30nM、90nM、120nM、160nM、200nM和250nM的sPCR反应体系(所述反应体系中，除银离子终浓度与实施例1不同外，其余均与实施例1相同)，将sPCR产物在适宜的条件下可以形成G四链体，催化ABTS显色，标准曲线如图3所示。
回归方程为：Y＝0.004X+0.1645，R2＝0.9953。
对待测样品进行扩增和检测的方法同实施例1，在本实施例中，可将检测所得的OD415值代入上述回归方程进行计算，实现对待测样品的定量检测。
实施例3特异性实验
本实施例用于验证本发明所述传感器和方法的特异性。
本实施例通过将100nM的Ag+，以及100μM的Pb2+、Cr3+、Zn2+、Cd2+分别加入到反应体系中，按照实施例1所述方法进行特异性实验，实验结果如图4所示，显示本发明所述传感器和方法对银离子具有较高的特异性。
实施例4加标实验
本实施例用于验证本发明所述传感器和方法的灵敏度。
本实施例通过将10nM、50nM、100nM的Ag+加标样品分别加入到不含Ag+的去离子水中，然后同样品一样加入到反应体系中进行实验，实验结果如表2所示。
表2
对比例1
本对比例用于说明在本发明所设计的反向引物的错配碱基数目对检测准确性的影响。
本发明通过设计具有不同错配碱基数目的反向引物，选择最优的反向引物序列，具体如下：
将反向引物的错配碱基个数，分别设计为两个、四个和六个，分为三组进行实验。
序列如下：
两个错配：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCAC
TCGTGACTTATCATGGAGGACC；
四个错配：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCAC
TCGTGACTTATCATGGACCACC；
六个错配：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCAC
TCGTGACTTATCATCCACCACC。
将上述三组反向引物分别加入到反应体系中，按照实施例1所述反应体系和方法进行实验，结果如图5所示。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种银离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器
<141> 2018-05-22
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatcgcacc gtcaaaggaa cctcagtatc agtgctatac gtcgatcagt acctcctcca 60
tgataagtca cgattgttgt tgcgatagcg ccagc 95
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgggtaggg cgggttggcc aacccgccct acccactcat cgcaccgtca aaggaacc 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgggtaggg cgggttggcc aacccgccct acccactcgt gacttatcat ccaccacc 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgggtaggg cgggttggcc aacccgccct acccactcgt gacttatcat ggaggacc 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgggtaggg cgggttggcc aacccgccct acccactcgt gacttatcat ggaccacc 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgggtaggg cgggttggcc aacccgccct acccactcgt gacttatcat ccaccacc 58
Claims (10)
1.一种银离子错配型通用隔断扩增比色传感器，其特征在于，包括：(1)sPCR扩增体系，(2)包含ABTS显色液的检测体系，所述检测体系用于对待测样品经由所述sPCR扩增体系进行扩增后所得产物进行显色检测；在K+的存在下，sPCR产物将结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的G-四链体结构，催化H2O2和ABTS显色，通过比色检测，完成对银离子的检测；
其中，所述sPCR扩增体系包括：模板、正向引物和反向引物；
所述模板为：
TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTACCTCCTCCATGATAAGTCACGATTGTTGTTGCGATAGCGCCAGC；
所述正向引物为：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC；
所述反向引物为：
GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断-CCAACCCGCCCTACCCACTCGTGACTTATCATCCACCACC。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述正向引物和反向引物中的隔断为聚六乙二醇。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述检测体系包括：酶活缓冲液和氯高铁血红素溶液；
所述酶活缓冲液为：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
4.权利要求1～3任一项所述的传感器在检测银离子方面中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测为定性检测或定量检测。
6.一种利用权利要求1～3任一项所述的传感器对银离子进行定性检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、利用所述sPCR扩增体系分别对待测样品和阴性对照样品进行聚合酶链式反应，得sPCR产物；
S2、利用所述检测体系对所述sPCR产物进行检测：
S21、配制检测体系：
将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和sPCR产物按体积比为8:1:1混匀；
S22、在37℃条件下反应30min，加入与S21所得混合物等量体积的ABTS显色液，混匀，37℃避光孵育10min，酶标仪测定OD412-418nm；
依据待测样品与阴性对照样品的颜色差异进行银离子的定性判断；
所述阴性对照样品为不含有银离子的去离子水。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S1中：
sPCR反应体系为：
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S1中，将配置好的sPCR反应体系迅速置于sPCR反应装置中进行温度控制：
90-95℃ 2s，55-60℃ 3s，30-40个循环；优选为95℃ 2s，58℃ 3s，36个循环。
9.一种利用权利要求1～3任一项所述的传感器对银离子进行定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
SI、制作标准曲线：
利用已知浓度的银离子溶液，构建具有不同银离子浓度的sPCR体系，扩增与检测步骤与权利要求6中的S1和S2相同；
以银离子浓度为横坐标，以OD415值为纵坐标，绘制标准曲线；
SII、按照权利要求6所述的方法对待测样品进行检测，将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中银离子的含量，实现对银离子的定量检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述不同银离子浓度的浓度区间为5nM～250nM。
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