CN105675569B - 一种检测金黄色葡萄菌肠毒素a的方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种检测金黄色葡萄菌肠毒素a的方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒，该方法包括如下步骤：(A)使金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体与单链信号探针DNA杂交，形成DNA杂交链；(B)使该杂交链与待测样品中金黄色葡萄菌肠毒素A时，DNA杂交链与金黄色葡萄菌肠毒素A反应释放出单链信号探针DNA；(C)利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶催化双链DNA水解成单核苷酸，单链信号探针DNA不水解而保留下来；(D)在单链信号探针DNA诱导下，银离子被维生素C还原生成近红外荧光银纳米簇；测定体系的荧光强度，从而测定待测样品中的金黄色葡萄菌肠毒素A的含量。

Description

一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体是一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒。
背景技术
食品安全已成为影响人类自身健康安全和社会稳定的重要因素，由食源性疾病和食品污染引发的食物中毒与食源性疾病平均每年发生数十亿例,发达国家每年至少有三分之一的人群患食源性疾病。其中由微生物污染造成的食源性疾病位居首位，而金黄色葡萄球菌肠毒素又是引起细菌性食物中毒的最主要的食源性疾病。金黄色葡萄球菌肠毒素由金黄色葡萄球菌产生，其污染源和传播途径极广，可途径食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。因此，防止其污染非常困难。金葡菌可产生A、B、C、D、E、F等多种肠毒素。金葡菌性食物中毒以A型肠毒素引起者最多。因此，对金黄色葡萄菌肠毒素A监测非常必要。
目前，金黄色葡萄菌肠毒素A的主要检测方法有：色谱法、免疫层析法、色谱-质谱联用法等方法。最近，Zhouping Wang公开了一种基于稀土荧光纳米晶-肠毒素A核酸适体的金黄色葡萄菌肠毒素的检测方法。
但色谱-质谱联用法仪器价格昂贵，并且需要专门技术人员才能进行检测工作，技术要求高，难于普及；免疫法试剂贵、且所用生物试剂非常容易失活，或需使用价格较昂贵的通过标记的DNA等不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
1.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法，该方法包括如下步骤：
1)将各DNA储备液在95℃下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟，然后，分别取含3.0μmol金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40μL置于2ml离心管中，在37℃下杂交1小时，生成金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交物Apt-ssDNA。
2)在37℃下，分别将浓度为0～50ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素A添加到Apt-ssDNA溶液中，金黄色葡萄菌肠毒素A与金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体反应，生成核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余未反应的APT-ssDNA和核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A等物质；所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’。
3)加入10μL缓冲溶液，缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl,10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4,pH 7.5，然后加入dNTP(10mM)18μL。再向体系中加入2μL Phi29DNA聚合酶10u/μl,在37℃下反应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交序列Ap-ssDN为摸板扩增成双链DNA。在65℃下保持10分钟使Phi29DNA去活。
4)再向该反应体系中加入2μL Exo III核酸外切酶20u/μL，在37℃下反应30分钟，Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不水解而保留下来；所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3’。
5)向反应液中加入25μL 1mmol硝酸银和10mM，pH7.0的180μL PBS，然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100μL浓度为1mM的新制备的抗坏血酸溶液，然后在45℃下反应5～10min；
6)将溶液转移至微量比色皿，以波长为585nm的光为激发光，测定体系荧光发射(610-800nm)光谱，体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素A存在线性关系，其线性方程式为，y＝286.87+96.12C，相关系数r＝0.9988，线性范围0.002～0.20ng/mL，检测限1pg/mL，回收率在97.5～114.3％。其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素A的检测无干扰。
上述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’-AGCAGCACAG AGGTCAGATGTACTTATGCATTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’。
上述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3’。
2.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的试剂盒，包括：金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系，所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATTTGAGAGTGAC CCTATGCGTGCTACC-3’；所述的单链信号探针DNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGC ATAGG-3’；所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4)、三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP和Phi29DNA聚合酶；所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶；所述的银离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。
3.一种可用于检测金黄色葡萄菌肠毒素A的金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体，其碱基序列为5’-AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCACGATCTTATT TGAGAGTGACCCTATGCGTG CTACC-3’。
本发明的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交；当有金黄色葡萄菌肠毒素A存在时，杂交链与金黄色葡萄菌肠毒素A反应释放出ssDNA；体系中存在Apt-ssDNA(剩余的)，Apt-金黄色葡萄菌肠毒素A和ssDNA。Apt-金黄色葡萄菌肠毒素A不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，Apt-金黄色葡萄菌肠毒素A存在对测定无干扰；杂交链可能有干扰；为了消除杂交链的干扰：a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，而单链信号探针ssDNA不水解而保留下来。此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光银纳米簇的ssDNA，通过检测体系的荧光强度，依据荧光强度与金黄色葡萄菌肠毒素A的量的关系，可以测定金黄色葡萄菌肠毒素A的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，提高了检测的灵敏度和精度。
本发明的优点：
本发明的检测方法和试剂盒，消除了背景荧光的干扰，提高了金黄色葡萄菌肠毒素A的检测灵敏度和精度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
检测金黄色葡萄菌肠毒素A的试剂盒包括：金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’-AGCAGCACAG AGGTCAGATGTACTTATGCATTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’。
所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3’。
所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4)、dNTP和Phi29DNA聚合酶。所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。
实施例2
一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法，具体操作过程如下：
将各DNA储备液在95℃下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0μmol金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体(Apt)的杂交缓冲溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40μL置于2ml离心管中，在37℃下杂交1小时，生成金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交物(Apt-ssDNA)。
在37℃下，分别将浓度为0～50ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素A添加到Apt-ssDNA溶液中，金黄色葡萄菌肠毒素A与金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体反应，生成核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余(未反应的)APT-ssDNA和核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A等物质。
加入10μL缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl,10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4,pH 7.5)，然后加入dNTP(10mM)18μL。再向体系中加入2μL Phi29DNA聚合酶(10u/μl),在37℃下反应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交序列(Ap-ssDNA)为摸板扩增成双链DNA。在65℃下保持10分钟使Phi29DNA去活。
再向该反应体系中加入2μL Exo III核酸外切酶(20u/μL)，在37℃下反应30分钟，Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不水解而保留下来。
向反应液中加入25μL 1mmol硝酸银和180μL PBS(10mM，pH7.0)。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100μL浓度为1mM的新制备的抗坏血酸溶液。然后在45℃下反应5～10min。
将溶液转移至微量比色皿，以波长为585nm的光为激发光，测定体系荧光发射(610-800nm)光谱。体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素A存在线性关系，其线性方程式为，y＝286.87+96.12C，相关系数r＝0.9988，线性范围0.002～0.20ng/mL，检测限1pg/mL，回收率在97.5～114.3％。其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素A的检测无干扰。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒
<130> 一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcagcacag aggtcagatg tacttatgca tttcctccca cgatcttatt tgagagtgac 60
cctatgcgtg ctacc 75
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccccccacac ccgatccccc cggtagcacg catagg 36

Claims (3)

1.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
1）将各DNA储备液在95℃ 下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟，然后，分别取含3.0 μmol金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40 μL和3.0 μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40 μL 置于2ml 离心管中，在37℃下杂交1小时，生成金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交物 Apt - ssDNA；
2）在37℃下，分别将浓度为0～50 ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素A添加到Apt- ssDNA溶液中，金黄色葡萄菌肠毒素A与金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体反应，生成核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A，释放出ssDNA；这时，体系中有ssDNA、剩余未反应的 Apt- ssDNA和核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A物质；所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’- AGCAGCACAGAGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’；
3）加入10 μL 缓冲溶液，缓冲溶液组成为50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2，10 mM(NH4)2SO4,pH 7.5，然后加入10 mM dNTP 18 µL；再向体系中加入2µl 10 u/µl 的Phi29DNA聚合酶, 在37℃下反应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交序列 Apt-ssDN 为模板扩增成双链DNA，在65℃下保持10分钟使Phi29 DNA去活；
4）再向该反应体系中加入2μL 20 u/μL的Exo III核酸外切酶，在37℃下反应30分钟，Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3’；
5）向反应液中加入25 μL 1 mmol 硝酸银和10 mM，pH7.0的180μL PBS，然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100μL浓度为1 mM的新制备的抗坏血酸溶液，然后在45℃下反应5 ～10 min；
6）将溶液转移至微量比色皿，以波长为585 nm的光为激发光，测定体系荧光发射 610-800 nm 光谱，体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素A存在线性关系，其线性方程式为，y = 286.87 +96.12 C，相关系数r = 0.9988，线性范围0.002～0.20 ng/mL，检测限1 pg/mL，回收率在97.5～114.3%，其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素A的检测无干扰。
2.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的试剂盒，其特征是，包括：金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系，所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’- AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCACGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’ ；所述的单链信号探针DNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAG CACGC ATAGG-3’ ；所述DNA扩增体系包括缓冲溶液 Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4 、三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP和Phi29 DNA 聚合酶；所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶；所述的银离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。
3.一种可用于检测金黄色葡萄菌肠毒素A的金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体，其碱基序列为5’- AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGACCCTATGCGTG CTACC-3’。
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