KR101958048B1

KR101958048B1 - 표적 핵산의 검출법

Info

Publication number: KR101958048B1
Application number: KR1020147013855A
Authority: KR
Inventors: 노리미츠 호사카; 사토시 히가시데
Original assignee: 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2019-03-13
Also published as: CN103975061A; US20140349295A1; EP2787077A1; CA2857308C; AU2012333771A1; WO2013065574A1; CN108103145A; TWI608103B; EP2787077B1; HK1249143A1; TW201333209A; JP6085564B2; EP2787077A4; KR20140091562A; ES2755934T3; CA2857308A1; AU2012333771B2; JPWO2013065574A1; US10876160B2; HK1199287A1

Abstract

본 발명은 표적 핵산의 새로운 검출 방법 및 그것에 사용하는 키트를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명의 검출 방법은 상보성을 갖는 형광 표지된 프라이머/프로브와 소광제 (?처) 표지된 프로브의 융해 온도 (Tm) 를 다르게 하여 설계하고, 형광 표지 프라이머가 표적 핵산에 우선적으로 어닐하도록 하였다. 표적 핵산에 결합되지 않았던 형광 표지 프라이머/프로브는 소광 프로브와 결합되어 형광을 발하지 않도록 한 검출 방법이고, 보다 간편하고 저렴하며 특별한 기능, 기기를 필요로 하지 않고 표적 핵산을 검출할 수 있다.

Description

표적 핵산의 검출법{METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID}

본 발명은 표적 핵산의 검출 방법 및 그 검출에 사용하는 키트에 관한 것이다.

핵산 염기 배열의 상보성을 사용한 표적 핵산의 검출 방법은 예전에는 서던 하이브리다이제이션으로부터 시작되어, 여러가지 개량 연구가 이루어져 현재에 이르렀고, 특히 in vitro 에서의 핵산 증폭법의 확립과 함께, 보다 미량의 표적 핵산의 검출이 가능해졌다.

표적 핵산의 검출 방법으로는, 라디오아이소토프 (RI), 발광제 (luminescent agent), 형광제 (fluorophore) 등의 표지와 결합된, 표적 핵산과 상보성을 갖는 핵산을 포함하는 검출 프로브를 사용한 검출 방법이 개발되어 있다. 방출 에너지가 상이한 복수의 RI 로 표지한 경우나, 방출광의 파장이 상이한 복수의 발광제 (혹은 형광제) 로 표지한 경우에는, 다항목 검출이 가능하다. 또한 Q 프로브 (Quenching Probe) 법으로서 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) 을 판정하는 방법도 확립되어 있다 (특허문헌 1).

또 그 반대로 표적 핵산을 라디오아이소토프 등으로 표지화시키고, 표적 핵산과 상보성을 갖는, 고상면에 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브와 어닐링시킴으로써, 복수의 표적 핵산의 양을 동시에 검출하는 것을 가능하게 한, 소위 DNA 칩, 마이크로 어레이 등의 핵산 염기 배열의 상보성을 이용한 표적 핵산의 검출 방법도 있다 (특허문헌 2).

한편, 핵산 증폭법으로는, Polymerase Chain Reaction (PCR) (특허문헌 3 및 특허문헌 4), Strand Displacement Amplification (SDA) (특허문헌 5), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) (특허문헌 6), Rolling Circle Amplification (RCA) (비특허문헌 1) 및 Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) (특허문헌 7) 등을 들 수 있다. 이들의 핵산 증폭법도 표적 핵산의 검출을 가능하게 한다.

또한, Ligase Chain Reaction (LCR) (특허문헌 8) 과 같은 리가아제를 사용한 핵산 증폭법도 존재하고 있다.

현재, 핵산의 증폭 방법으로서 많이 이용되고 있는 것은 PCR 법이다. PCR 법은 내열성 폴리머라아제와 표적 핵산과 상보성을 갖는 2 개의 프라이머를 사용하여, (1) 2 개 사슬 표적 핵산의 변성, (2) 변성된 표적 핵산에 대한 프라이머의 어닐링, (3) 프라이머로부터의 신장 반응과 같은 3 가지 단계를, 온도 제어를 실시함으로써 진행시키고, 이들 3 단계를 반복함으로써, 지수 함수적으로 표적 핵산을 증폭시키는 방법이다. 반응후의 증폭 산물을 전기 영동하고, 에티듐브로마이드 (EtBr), 사이버 그린 (SYBR (등록상표) Green) 등의 인터칼레이터를 사용함으로써, 증폭 산물의 유무를 검출할 수 있게 된다. 또, 상기 신장 반응시에, 형광제를 부가한 핵산 염기를 사용함으로써 증폭 산물을 검출하는 방법도 있다.

또한, 형광제와 소광제 (quencher) 를 사용함으로써, 표적 핵산의 증폭을 정량적으로 검출하는 방법도 확립되어 있다 (특허문헌 9). 구체적으로는 TaqMan (등록상표) probe 로 대표되는, 형광제와 소광제가 인접 부가된 올리고뉴클레오티드 프로브를 PCR 증폭 반응시에 첨가하여 PCR 반응을 실시한다. PCR 의 상기 단계 (2) 에서 그 프로브도 표적 핵산에 어닐링되고, 단계 (3) 의 신장 반응에 수반되어 폴리머라아제의 5' →3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 그 프로브가 분해되고, 소광제로부터 유리된 형광제의 방출광을 검출함으로써, 표적 핵산의 검출을 가능하게 한다.

이와 같은 형광제와 소광제의 조합을 이용한 핵산 검출 방법은 PCR 에 의한 증폭을 전제로 하여 여러가지 고안되어 있다 (특허문헌 10 및 특허문헌 11). 양자는 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브의 일방에 형광제를, 다른 일방에 소광제를 부가하고, PCR 의 어닐링 단계 (상기 (2)) 에서, 증폭 중의 표적 핵산을 검출하는 것을 목적으로 고안되어 있다.

LAMP 법은 표적 핵산의 6 개 영역에 대해 4 종류의 프라이머 (FIP, BIP, F3 및 B3) 를 설정하고, 사슬 치환 반응을 이용하여 일정 온도에서 증폭시키는 것을 특징으로 한다. 표적 핵산을 함유하는 시료, 프라이머, 사슬 치환형 DNA 합성 효소, 기질 등을 혼합하여 일정 온도 (65 ℃ 부근) 에서 보온함으로써 반응이 진행되어 검출까지의 공정을 1 단계로 실시할 수 있는 방법이다. 또한 루프 프라이머 B (LB) 및/또는 루프 프라이머 F (LF) 를 추가하여 사용함으로써, 증폭에 필요로 하는 시간을 1/2 에서 1/3 로 단축시킬 수 있게 된다 (특허문헌 12). 증폭 효율이 높기 때문에 표적 핵산을 15 분 ∼ 1 시간에 10⁹ ∼ 10¹⁰ 배로 증폭시킬 수 있고, 또한 매우 높은 특이성 면에서 증폭 산물의 유무에 따라 목적으로 하는 표적 유전자 배열의 유무를 판정할 수도 있다. 이러한 방법의 하나로서 핵산 증폭 반응의 부산물인 피로인산 이온을 불용성 염 (마그네슘염) 으로 하여 반응액의 탁도를 측정하거나, 그 피로인산 이온을 칼세인-망간 착물과 반응시켜, 유리된 칼세인 (형광 물질) 의 형광을 검출함으로써, 증폭 산물의 존재를 검출한다 (특허문헌 13). 또한, 형광 프로브를 이용한 검출 방법도 확립되어 있다 (특허문헌 14 및 특허문헌 15).

또, 형광 표지된 프라이머와 소광제로 표지한 프로브를 사용하여 LAMP 법에 의해 증폭된 표적 핵산을 검출하는 방법도 보고되어 있다 (비특허문헌 2). 구체적으로는 형광 표지된 프라이머를 사용하여 LAMP 법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고, 증폭후, 소광제로 표지된 프로브를 첨가하여, 표적 핵산의 증폭에 기여하지 못한 프리의 형광 표지된 프라이머와 소광제로 표지된 프로브를 어닐링시킴으로써, 표적 핵산의 증폭에 기여한, 즉 증폭 산물의 일부가 된 형광 표지된 프라이머의 형광제로부터의 방출광만을 검출하는 방법이다.

상기 모든 핵산 검출 방법도 일장 일단이 있고, 특히 반응이나 검출에 고가의 정밀 기기를 필요로 하고, 또한 각종 공정을 포함하기 때문에, 그 실시에는 숙련을 필요로 하는 것이 많고, 이들 핵산 검출 기술은 오로지 핵산 증폭을 전문으로 하는 특정 연구실내에서 실시되는 것이었다. 또, 예를 들어, 상기 비특허문헌 2 에 기재된 검출 방법에 있어서는, 소광제를 증폭 반응후에 첨가할 필요가 있고, 반응 용기의 마개를 개폐할 때에 증폭 산물의 비산으로 인해 시료 사이 혹은 실험 환경의 콘터미네이션을 일으킬 우려가 있다.

최근, 산업, 의료, 연구 등의 각종 분야에 있어서 핵산 증폭 시험 (Nucleic acid Amplification Test：NAT) 의 요구가 높아짐과 함께, 시험 항목의 종류도 충실해진 경우도 있어, 지금까지보다 한층 더 핵산 증폭 시험은 널리 보급되고 있다. 예를 들어, 의약품 분야에 있어서의 혈액 제재의 각종 바이러스에 대한 안전성 확보의 목적에서 실시하는 시험에도 핵산 증폭 시험이 이용되고 있다. 이러한 보급ㆍ일반화의 흐름에서, 지금까지 핵산 증폭 전용의 특정 연구실내에서만 실시되었던 핵산 증폭 시험이 일반 실험실이나 필드 워크, 베드사이드 등의 모든 장소나 장면에서도 실시할 수 있도록, 간편하게 사용할 수 있고, 또한 시험 환경을 오염시키는 일이 없는 핵산 검출 기술, 더 바람직하게는 다항목을 동시에 검출할 수 있는 기술이 요구되게 되었다.

일본 공개특허공보 2001-286300호 일본 공표특허공보 2001-521622호 일본 공개특허공보 소61-274697호 일본 공개특허공보 소62-000281호 일본 공개특허공보 평5-192195호 일본 공개특허공보 평2-005864호 일본 특허공보 제3313358호 일본 공개특허공보 평2-002934공보 일본 공표특허공보 평6-500021공보 일본 공개특허공보 평10-262700호 일본 공표특허공보 2004-511227호 국제 공개 제2002/024902호 일본 공개특허공보 2004-283161호 일본 공개특허공보 2001-272475호 국제 공개 제2009/051214호

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92：4641-4645 (1995) Journal of Medical Virology 81：966-972 (2009)

본 발명의 과제는 신규 표적 핵산의 검출 방법을 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 종래 기술보다 간편하고 저렴하게 표적 핵산을 검출하는 방법 및 검출에 사용하는 키트 등을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서, 밀폐계에서 간단하게 핵산의 증폭 및 검출이 가능한 방법을 새롭게 개발하였다. 구체적으로는 형광 표지된 프라이머와 소광제로 표지한 프로브를 사용하여 LAMP 법에 의해 증폭된 표적 핵산을 검출하는 방법에 있어서, 형광 표지 프라이머와 ?처 표지 프로브를 증폭 반응전에 첨가할 수 있게 하기 위해, 양자의 융해 온도 (melting temperature：이하 Tm) 에 차이를 두고, 반응 온도 조건에 따라 ?처 표지 프로브 존재하에서도, 보다 선택적으로 형광 표지 프라이머가 표적 핵산에 어닐링되기 쉽게 하였다. 그 후, 온도를 낮춤으로써, 표적 핵산에 결합할 수 없었던 형광 표지 프라이머와 ?처 표지 프로브를 어닐링할 수 있게 되고, 그 결과 퀀칭에 의해 형광 표지는 소광되어 표적 핵산에 결합할 수 있었던 형광 표지 프라이머의 형광 표지만을 검출할 수 있음을 알아냈다.

본 발명자들은 또한 상기 방법이 LAMP 법에 의한 증폭과 조합할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 어떠한 핵산 증폭 방법과도 조합할 수 있고, 또 표적 핵산의 증폭 공정을 포함하지 않아도, 즉 형광 표지 프라이머를 단순한 프로브로서 이용해도 실시할 수 있고, 본 발명의 과제를 해결할 수 있음을 찾아내어 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명의 구성은 이하의 [1] 내지 [13] 과 같다.

[1] 시료중에 존재하는 1 종류 이상의 표적 핵산을 검출하는 방법으로서, 이하의 단계를 포함하는 핵산을 검출하는 방법：

(1) 시료에

형광제로 표지된, 표적 핵산과 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 프라이머 또는 프로브와,

소광제로 표지된, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브와 상보성을 갖고, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브보다 융해 온도 (Tm) 가 낮은 올리고뉴클레오티드인 ?처 표지 프로브를 첨가하고；

(2) 그 시료를 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 융해 온도 (Tm) 이하이고, 또한 그 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 보다 높은 온도에서 보온하고；

(3) 그 시료를 그 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 이하의 온도에서 보온하고；

(4) 표적 핵산에 결합된 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 형광을 계측한다.

[2] 상기 단계 (2) 의 보온 동안에 표적 핵산을 증폭시키는 [1] 에 기재된 검출 방법.

[3] 상기 표적 핵산의 증폭을 등온 조건에서 실시하는 [2] 에 기재된 검출 방법.

[4] 상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다 짧은 [1]―[3] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

[5] 상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드가 수식 염기를 함유하고 있는 [1]―[3] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

[6] 상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브를 고상면에 고정시켜 사용하는 [1]―[5] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법.

[7] 2 종류 이상의 표적 핵산을 검출하기 위해서, 발광 파장이 상이한 2 종류 이상의 형광 표지 프라이머 또는 프로브와 각각에 대응되는 ?처 표지 프로브의 조합을 사용하는 [1]―[6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] 상기 단계 (4) 에 있어서의 형광 계측이 육안에 의한 판정인 [1]―[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[9] 상기 단계 (4) 에 있어서의 형광 계측이 형광 검출 기기에 의한 판정인 [1]―[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[10] [1]―[9] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법에 사용하기 위한 키트로서, 1 종류 또는 복수 종류의

형광제로 표지된, 표적 핵산과 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 프라이머 또는 프로브와；

각각의 형광제에 대응되는 소광제로 표지된, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브와 상보성을 갖고, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브보다 융해 온도 (Tm) 가 낮은 올리고뉴클레오티드인 ?처 표지 프로브

의 조합을；

포함하는 표적 핵산 검출용 키트.

[11] 상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다 짧은 [10] 에 기재된 표적 핵산 검출용 키트.

[12] 상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드가 수식 염기를 함유하고 있는 [10] 에 기재된 표적 핵산 검출용 키트.

[13] 추가로 핵산 증폭용 시약을 포함하는 [10]―[12] 에 기재된 키트.

[14] 상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브가 고상면에 고정되어 있는 [10]―[13] 중 어느 하나에 기재된 표적 핵산 검출용 키트.

비특허문헌 2 의 방법을 답습한 경우, 형광 표지 프라이머와 ?처 표지 프로브를 증폭 반응전에 첨가하면, 증폭 반응이 정상적으로 일어나지 않아 표적 핵산의 검출이 어려웠다. 그러나, 본 발명에 있어서는 형광 표지 프라이머 또는 프로브 (이하, 형광 표지 프라이머/프로브) 와 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 를 다르게 함으로써, ?처 표지 프로브 존재하에서도, 우선적으로 표적 핵산과 형광 표지 프라이머의 어닐링을 시킬 수 있게 되었다.

이러한 본 발명의 효과는 증폭 공정을 포함하는 비특허문헌 2 의 방법에 대해서뿐만 아니라, 증폭 공정을 포함하지 않는 다른 양태에서도 유효하게 발휘된다.

본 발명은 증폭 반응후에 ?처 표지 프로브를 첨가할 필요가 없기 때문에, 증폭 산물의 비산에 의한 시료 사이 혹은 실험 환경의 오염 걱정이 없다. 또, 종래의 하이브리다이제이션법과 비교하여, 세정 단계 등을 포함하지 않고, 온도 관리도 비교적 간편하고, 또한 정밀함이 요구되지 않기 때문에, 보다 간편하고 저렴하며 특별한 손재주, 기기를 필요로 하지 않고 표적 핵산을 검출할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 기본적인 양태의 모식도이다.
도 2 는 표적 핵산을 증폭시키는 공정을 부가한 본 발명의 모식도이다.
도 3a 는 본 발명을 마이크로 어레이에 응용한 경우의 모식도 (표적 핵산의 증폭을 하지 않은 양태) 이다.
도 3b 는 본 발명을 마이크로 어레이에 응용한 경우의 형광 표지 프라이머/프로브의 고정화의 예를 나타내는 모식도이다.
도 3c 는 본 발명을 마이크로 어레이에 응용한 경우의 모식도 (표적 핵산의 증폭 공정을 포함하는 양태) 이다.
도 4 는 실시예 2 에 있어서의 형광 표지 프라이머/프로브를 사용한 표적 핵산의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 5 는 실시예 2 에 있어서의 CT-LBc-Q1-0 (배열 번호 8) 첨가 전후의 형광 검출을 나타낸다.
도 6 은 실시예 3 에 있어서의 표준 반응, 클라미디아 트라코마티스, 임균의 판별 결과를 나타낸다.
도 7 은 실시예 4 에 있어서의 각 표적 핵산을 첨가한 경우의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 8 은 실시예 4 에 있어서의 증폭 반응후에 ?처 표지 프로브를 첨가하고, 95 ℃ 5 분 가열후 실온까지 냉각시킨 후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 9 는 실시예 5 에 있어서의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 10 은 실시예 6 에 있어서의 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 11 은 실시예 6 에 있어서의 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 12 는 실시예 7 에 있어서의 단항목 클라미디아 트라코마티스의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 13 은 실시예 7 에 있어서의 단항목 클라미디아 트라코마티스의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 14 는 실시예 7 에 있어서의 단항목 클라미디아 트라코마티스의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 형광 파장을 나타낸다.
도 15 는 실시예 7 에 있어서의 단항목 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 16 은 실시예 7 에 있어서의 단항목 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 17 은 실시예 7 에 있어서의 단항목 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 형광 파장을 나타낸다.
도 18 은 실시예 7 에 있어서의 단항목 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 19 는 실시예 7 에 있어서의 단항목 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 20 은 실시예 7 에 있어서의 단항목 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 형광 파장을 나타낸다.
도 21 은 실시예 7 에 있어서의 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 22 는 실시예 7 에 있어서의 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 23 은 실시예 7 에 있어서의 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 형광 파장을 나타낸다.
도 24 는 실시예 7 에 있어서의 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 25 는 실시예 7 에 있어서의 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 26 은 실시예 7 에 있어서의 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 형광 파장을 나타낸다.
도 27 은 실시예 7 에 있어서의 2 항목 임균과 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 28 은 실시예 7 에 있어서의 2 항목 임균과 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응후의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 29 는 실시예 7 에 있어서의 2 항목 임균과 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 증폭 반응후의 형광 파장을 나타낸다.
도 30 은 실시예 7 에 있어서의 3 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균 및 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 리얼타임 탁도 곡선을 나타낸다.
도 31 은 실시예 7 에 있어서의 3 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균 및 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 UV 조사시 반응 튜브를 나타낸다.
도 32 는 실시예 7 에 있어서의 3 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균 및 인공 핵산의 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브를 사용한 표적 핵산 증폭 반응의 형광 파장을 나타낸다.

이하에 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

「시료」란 검출 대상이 되는 「표적 핵산」을 포함하는 것으로 생각되는 혼합물이다. 시료는 사람을 포함하는 생체 (예를 들어 혈액, 타액, 체액, 체조직 등), 환경 (예를 들어, 토양, 해수, 환경수 (온천수, 욕조수, 냉각탑수 등)), 혹은 인공물 또는 자연물 (예를 들어, 빵 등의 가공 식품, 요구르트 등의 발효 식품, 혹은 쌀이나 밀 등의 재배 식물, 미생물, 바이러스) 에서 유래하는 것으로, 통상은 핵산 추출 조작을 거친 것을 사용한다. 필요에 따라 핵산 정제 조작을 추가해도 된다.

「표적 핵산」 이란 본 발명에 의해 검출해야 할 핵산 분자이다. 핵산의 종류로서는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA), 리보뉴클레오티드 (RNA) 및 이들 혼합물 또는 결합물이어도 된다. 또 그 구성 염기는 천연에 존재하는 뉴클레오티드, 예를 들어 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T), 사이토신 (C), 우라실 (U) 이지만, 그 이외의 천연 및 인공의 수식 염기를 함유하고 있어도 된다. 여기서 「수식 염기」란, 상기 5 개의 뉴클레오티드가 화학적 수식을 받은 염기를 의미한다. 이것에 한정되지 않지만, 메틸시티딘, 슈도우리딘, 4-티오우리딘, 디하이드로우리딘, 큐오신, 히포크산틴 (이노신 (I)) 등이 이것에 해당된다. 본 발명에 있어서 표적 핵산은, 검출할 때에는 1 개 사슬일 필요가 있지만, 2 개 사슬이나 고차 구조를 형성하고 있는 핵산이어도 열변성, 알칼리 변성 처리 등에 의해 1 개 사슬로 변환하고 나서 사용할 수 있다. 본 발명의 표적 핵산에는 이러한 변성 처리를 부가한 양태도 포함된다. 혹은 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응에 의해 제조되는 cDNA 도 「표적 핵산」 에 포함된다.

「올리고뉴클레오티드」란 아데노신, 티미딘, 시티딘, 구아노신, 우리딘 등의 뉴클레오티드 혹은 수식 염기를 갖는 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 결합에 의해 연결하여 이루어지는 직쇄상 올리고머를 의미하고, DNA, RNA, 이들의 결합물을 나타낸다. 경우에 따라서는 펩티드 핵산 (PNA) 이어도 된다.

「상보성」 이란 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 사슬이 다른 사슬과 어닐링되어 2 개 사슬 구조를 형성하고, 각 사슬의 각 뉴클레오티드가 왓슨-클릭형의 염기 대합 (對合) 을 하고 있는 것을 의미할 뿐만 아니라, 데옥시이노신 (dI), 2-아미노푸린 염기를 갖는 수식 뉴클레오티드의 대합 등의 비왓슨-클릭형의 염기 대합을 하고 있는 것도 의미한다.

「형광제」란 일정 파장의 여기광이 조사되면, 그 에너지를 흡수함으로써 전자가 여기되고, 그것이 기저 상태로 되돌아갈 때에 여분의 에너지를 전자파 (방출광) 로서 방출하는 분자 혹은 관능기를 의미한다. 구체적인 예로서는 플루오레세인 (fluorescein) 및 그 유도체 (플루오레세인포스포아미다이드 (FAM), 플루오레세인이소티오시아네이트 등), 로다민 (rhodamine) 및 그 유도체 (텍사스 레드 등), Cy 색소 (Cy 3, Cy 5 등) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

「소광제」란 형광제로부터 방출되는 방출광의 에너지를 흡수할 수 있는 적절한 에너지 준위를 갖는 분자 혹은 관능기를 의미한다. 플루오레세인포스포아미다이드 (FAM) 의 소광제로서 테트라메틸로다민 (TAMRA) 을 사용할 수 있도록, 형광제를 소광제로서 사용해도 된다. 그러나 소광제로서 보다 적합한 것은 형광제의 방출광을 흡수하여 여기해도, 스스로는 방출광을 발하지 않는 분자 혹은 관능기이다. 예를 들어, DABCYL, Black Hole Quencher (BHQ^TM (바이오 서치 테크놀로지스사)), Eclipse^TM Dark Quencher (에포크ㆍ바이오 사이언 시즈사) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

「보온」 이란 어느 특정 온도하에 시료를 두는 것을 의미한다. 열 전달의 수단은 목욕, 공기욕, 금속욕 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

융해 온도 (Tm) 란 2 개 사슬 DNA 의 용액을 가열해 갔을 때, DNA 분자의 1/2 이 해리되어 1 개 사슬이 될 때의 온도를 의미한다. 본 발명에 있어서는 50 mM Na^＋농도 (Na^＋ = 50×10^-3) 와 0.5 mM 올리고뉴클레오티드 농도 (Ct = 0.5×10^-6) 의 값이고, 최근접 염기 대법 (對法) (Nearest Neighbor method) 의 이하의 계산식에 의해 산출된다 (Nucl. Acids Res. (1990) 18(21)：6409-6412).

Tm = {(1000ΔH)/(－10.8＋ΔS＋Rln (Ct/4))}－273.15＋16.6log [Na^＋]

여기서, ΔH 는 하이브리드에 있어서의 최근접 엔탈피 변화의 합계 [kcal/㏖], ΔS 는 하이브리드에 있어서의 최근접 엔트로피 변화의 합계 [cal/㏖ㆍK], R 은 기체 상수 (1.987 cal/degㆍ㏖), Ct 는 올리고의 total 몰 농도 [㏖/ℓ] 및 Na^＋ 는 몰 농도 [㏖/ℓ] 를 나타낸다.

융해 온도 (Tm) 는 올리고뉴클레오티드의 염기 배열 및 그 길이에 따라 변화하고, 구아닌 및 사이토신의 함유량이 많을수록 그 길이가 길수록 융해 온도 (Tm) 가 높아진다. 따라서, 염기 배열 및 그 길이에 따라 어닐링 온도가 결정되지만, 반응 용액에 융해 온도 조정제를 함유시킴으로써, 융해 온도를 조정할 수도 있다.

핵산 증폭법에 사용하는 융해 온도 조정제의 예로서, 포름아미드, 베타인 (N,N,N,-트리메틸글리신), 프롤린, 디메틸술폭사이드, 트리메틸아민N-옥사이드 및 테트라알킬암모늄염 등을 들 수 있다.

「형광 표지 프라이머 또는 프로브 (이하, 형광 표지 프라이머/프로브)」란 「형광제」 가 결합된 「올리고뉴클레오티드」 이며, 표적 핵산과 상보성을 갖는 것이다. 표적 핵산을 증폭시키지 않은 양태에서는 「프로브」로서만 사용되지만, 표적 핵산을 증폭시키는 양태에서는 「프라이머」로서 사용할 수 있다. 「형광 표지 프라이머/프로브」 는 형광제가 결합된 (모노)뉴클레오티드, 예를 들어 Alexa Fluor^TM 뉴클레오티드 (인비트로젠) 를 사용하여 합성해도 되고, 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 형광제를 결합시켜도 된다. 단, 「형광 표지 프라이머/프로브」를 사용하여 표적 핵산의 증폭을 실시하는 경우, 즉, 「프라이머」로서의 양태에서 사용하는 경우에는, 3' 말단에 형광제를 결합시켜서는 안된다. 보다 바람직한 것은 5' 말단에 형광제를 결합시킨 「올리고뉴클레오티드」 이다. 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 염기 배열의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 15 base 이상, 보다 바람직하게는 20 base 이상, 더욱 바람직하게는 25 base 이상이 바람직하다. 또한 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 염기 배열의 길이는 표적 핵산과의 어닐링 및 그 후의 증폭 반응의 온도 조건을 고려하여, 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 융해 온도 (Tm) 는 30 ∼ 70 ℃, 바람직하게는 50 ∼ 65 ℃ 가 되도록 설계되는 것이 바람직하다.

「?처 표지 프로브」란 「소광제」 가 결합된 「올리고뉴클레오티드」 이다. 「?처 표지 프로브」 는 소광제가 결합된 뉴클레오티드를 사용하여 합성해도 되고, 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 소광제를 결합시켜도 되지만, 「?처 표지 프로브」 와 「형광 표지 프라이머/프로브」 가 어닐링되었을 때에, 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 형광제의 방출광 (형광) 이 소광제에 의해 효과적으로 상실되는 위치에 소광제를 결합시키는 것이 바람직하다. 표적 핵산의 증폭 반응을 수반하는 양태에 있어서 「?처 표지 프로브」 의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 신장 반응이 일어나지 않도록 블록시키고 있는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 「형광 표지 프라이머/프로브」 가 5' 말단에 형광제를 결합시킨 「올리고뉴클레오티드」인 경우, 3' 말단에 소광제를 결합시킨 「올리고뉴클레오티드」 에 대응되는 「?처 표지 프로브」로 하는 것이 바람직하다.

「?처 표지 프로브」 의 올리고뉴클레오티드의 염기 배열은 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 염기 배열과 상보성을 갖고, 또한 그 길이가 형광 표지 프라이머/프로브보다 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 염기 또는 그 이상 짧은 배열인 것이 바람직하고, 그 짧음이 「?처 표지 프로브」 의 5' 말단의 염기가 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 3' 단의 염기와 비교하여 적은 것에서 기인되는 것이 더 바람직하다. 혹은 염기 배열의 길이가 동일해도, Tm 값을 낮추는 효과를 갖는 수식 염기를 갖는 뉴클레오티드를 사용함으로써, 실질적으로 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 융해 온도 (Tm) 보다 「?처 표지 프로브」 의 융해 온도 (Tm) 가 낮아지도록 해도 된다. Tm 값을 낮추는 효과를 갖는 수식 염기를 갖는 뉴클레오티드란, 예를 들어 이노신을 갖는 뉴클레오티드이다. 보다 바람직하게는 실온 (예를 들어 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃ 혹은 30 ℃) 이상이 되도록 「?처 표지 프로브」 의 올리고뉴클레오티드의 염기 배열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 조건을 만족시키기 위해서는 올리고뉴클레오티드의 길이가 7 염기 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 9 염기 이상이다.

본 발명에서는, 형광 표지 프라이머/프로브와 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 는 상이한 것이 필요하고, ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 는 형광 표지 프라이머/프로브의 융해 온도 (Tm) 보다 낮은 것이다. 보다 구체적으로는, 5 ℃ 낮은 것이 바람직하고, 10 ℃ 낮은 것이 더 바람직하고, 15 ℃ 낮은 것이 보다 더 바람직하고, 20 ℃ 낮은 것이 더욱더 바람직하고, 30 ℃ 낮은 것이 특히 바람직하고, 35 ℃ 낮은 것이 특히 더 바람직하고, 40 ℃ 혹은 45 ℃ 이상 낮은 것이 보다 바람직하다.

시료에 「첨가」한다는 것은, 시료에 형광 표지 프라이머/프로브, ?처 표지 프로브 등의 시약을 첨가하는 양태 이외에, 그 시약에 시료를 첨가하는 양태도 포함된다.

「형광 표지 프라이머/프로브」 와 「?처 표지 프로브」 의 첨가시의 사용 비율은 몰 분자수의 비로 하여, 1：1, 1：2 혹은 1：10 이상이면 되고, 보다 바람직하게는 1：2 이상이면 된다.

「고상면에 고정」 이란 반응중, 「형광 표지 프라이머/프로브」를 편재시키는 것을 가리킨다. 이것에 한정되지 않지만, 구체적으로는 유리, 나일론 멤브레인, 반도체 웨이퍼, 마이크로 비즈 등의 표면에 「형광 표지 프라이머/프로브」를 고정시키는 것을 의미한다. 고정 방법은 공지된 기술을 이용하여, 직접 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 올리고뉴클레오티드 부위를 유리 등의 표면에 고정시켜도 되고, 비오틴-아비딘 등의 결합을 개재하여, 혹은 링커 분자를 개재하여 간접적으로 고정시켜도 된다.

「형광 표지 프라이머/프로브를 사용하여 표적 핵산을 증폭」 이란, 형광 표지 프라이머/프로브를 프라이머로서 사용하여 폴리머라아제에 의해 신장 반응을 실시하여, 표적 핵산을 증폭시키는 것을 의미한다. 또한, 당업자에게는 자명한 일이지만, 본 발명의 표적 핵산을 증폭시키는 공정을 포함하는 양태에 있어서는, 당연히 그 이외의 표적 핵산의 증폭에 필요한 시약, 예를 들어 프라이머나 폴리머라아제, dNTP 등을, 실시하는 증폭 방법에 따라 「형광 표지 프라이머/프로브」 및 「?처 표지 프로브」와 시료에 첨가하는 것으로 한다.

「증폭을 등온 조건에서 실시한다」란 일정 온도로 유지한 상태에서 표적 핵산을 증폭시키는 것을 말한다. 등온 증폭법으로는, Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICAN) 법, SDA 법, RCA 법, SMart Amplification Process version 2 (SMAP 2) 법 (Nature Methods 4：257-262 (2007)) 및 LAMP 법을 들 수 있다.

「UV 조사」란 파장 10 ㎚ ∼ 400 ㎚ 정도의 전자파를 조사하는 것을 말하지만, 그 전자파는 엄밀한 파장의 제어는 되어 있지 않아도 되고, 형광제의 여기광이 되면 된다.

「육안에 의한 판정」 이란 단시간, 예를 들어 UV 조사로부터 5 초, 15 초, 30 초 또는 1 분 이내에 육안으로 그 형광제의 방출광 유무의 판정을 실시하는 것이다. 경우에 따라서는 색 견본과 비교해도 된다.

「육안에 의한 판정」 의 경우, 「UV 조사」 에 의한 여기가 최적이고, 3 내지 4 항목 정도까지의 동시 다항목 검출이 가능하고, 「형광 검출 기기」 에 의한 측정의 경우, 포토 다이오드 어레이 검출기 등을 사용하여 보다 다항목의 동시 검출도 가능하다.

「키트」란 본 발명에 관련된 검출 방법에 사용하는 시약을 의미한다. 「형광 표지 프라이머/프로브」나 「?처 표지 프로브」 이외에, 검출에 필요한 시약, 도구 및 기구 등을 포함시켜도 된다. 또한 그 「키트」 의 취급 설명서나 색 견본을 포함하고 있어도 된다. 또, 핵산 증폭을 수반하는 양태에서는 핵산 증폭에 필요한 시약을 추가로 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 검출 방법에서는, 형광 표지 프라이머/프로브의 융해 온도 (Tm) 이하이며, 또한 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 보다 높은 온도에서 인큐베이션하고, 표적 핵산과 형광 표지 프라이머/프로브를 우선적으로 어닐링시키고, 이어서 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 이하의 온도에서 인큐베이션하고, 표적 핵산과 어닐링하고 있지 않은 형광 표지 프라이머/프로브와 ?처 표지 프로브를 어닐링시킴으로써, 표적 핵산과 어닐링하고 있지 않은 형광 표지 프라이머 프로브의 형광제와 ?처 표지 프로브의 소광제를 인접시키고, 이어서 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 이하의 온도로 시료를 유지한 채로, 표적 핵산에 결합된 형광 표지 프라이머 프로브의 형광을 계측함으로써, 표적 핵산을 검출한다.

본 발명의 검출 방법은, 「형광 표지 프라이머/프로브」 와 「?처 표지 프로브」 의 융해 온도 (Tm) 를 다르게 하고, 이들 융해 온도와 반응 온도의 관계를 제어하여, 「형광 표지 프라이머/프로브」 와 「?처 표지 프로브」 의 어닐링보다 「형광 표지 프라이머/프로브」 와 「표적 핵산」을 우선적으로 어닐링시킴으로써, 「표적 핵산」을 검출하는 것에 특징이 있다. 또한 검출에 필요한 형광 표지 프라이머/프로브와 ?처 표지 프로브를 증폭 반응후에 첨가할 필요가 없기 때문에, 조작이 종래의 기술과 비교하여, 간단하고, 증폭 산물의 확산에 의한 콘터미네이션을 방지할 수도 있다.

이하에 본 발명의 각 양태의 상세함을 개시하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 가장 기본적인 양태는 도 1 에 나타내는 바와 같다. 최초에 「형광 표지 프라이머/프로브」 및 「?처 표지 프로브」를 첨가하면, 이후에 어떠한 시약을 추가하지 않고, 폐쇄계에서 표적 핵산의 검출이 가능하다. 만일 형광 표지 프라이머/프로브의 Tm 값을 65 ℃, ?처 표지 프로브의 Tm 값을 35 ℃ 로 한다. 반응 온도를 60 ℃ (Step 1) 로 하면, 형광 표지 프라이머/프로브는 표적 핵산에 결합되지만, ?처 표지 프로브는 결합되지 않는다. 그 후, ?처 표지 프로브의 Tm 값 이하 (30 ℃) 로 하면 (Step 2), 표적 핵산에 결합되어 있지 않은 「형광 표지 프라이머/프로브」 와 「?처 표지 프로브」 의 어닐링이 일어난다. UV 조사에 의해 방출광 (형광) 을 발하는 것은 「표적 핵산」 에 결합된 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 형광제뿐이며, 「?처 표지 프로브」 에 결합된 「형광 표지 프라이머/프로브」 의 형광제로부터의 형광은 검출할 수 없다. 따라서, 시료의 형광 강도는 시료중의 「표적 핵산」 의 양에 의존하게 된다.

본 발명에 있어서 표적 핵산을 증폭시키는 공정을 포함하는 양태를 도 2 에 나타낸다. 종래 기술인 일본 특허공보 3016759호나 일본 특허공보 3999653호에 기재되어 있는 바와 같은 핵산 증폭 검출법은, PCR 의 어닐링 단계에서는 형광 표지 프로브가 표적 핵산 혹은 소광 표지 프로브와 어닐링한 것이 혼재되기 때문에, 형광 강도는 증폭된 표적 핵산의 양에 비례하지만 증폭된 표적 핵산의 양 그 자체를 나타내는 것이 아닌 것, 또, 형광 표지 프로브와 소광 표지 프로브는 이후에 계속되는 신장 반응을 저해시킬 가능성도 있기 때문에 정확성이 부족하다. 한편, 도 2 의 본 양태의 경우, 증폭된 2 개 사슬 산물에 형광 표지 프라이머/프로브가 도입되기 때문에, 최종적으로 증폭된 표적 핵산의 양만을 보다 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명을 소위 DNA 칩 혹은 마이크로 어레이에 적용한 양태를 도 3 에 나타낸다.

도 3a 는 형광 표지 프라이머/프로브를 프로브의 양태 (표적 핵산이 증폭되는 공정을 포함하지 않은 양태) 에서 사용한 모식도이다. 이 경우에는, 형광 표지 프라이머/프로브의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 고정되어 있어도 상관없다.

고정화 양태의 예를 도 3b 에 나타낸다.

(1) 형광 표지 프라이머/프로브의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 고정화되어 있다. 이 경우에는 대응되는 ?처 표지 프로브는 5' 말단에 소광제가 결합되어 있는 것이 바람직하다.

(2) 형광 표지 프라이머/프로브의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 결합된 형광제를 개재하여 고정화되어 있다. 이 경우에는 대응되는 ?처 표지 프로브는 5' 말단에 소광제가 결합되어 있는 것이 바람직하다.

(3) 형광 표지 프라이머/프로브의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광제가 결합되어 3' 말단에서 고정화되어 있다. 이 경우에는 대응되는 ?처 표지 프로브는 3' 말단에 소광제가 결합되어 있는 것이 바람직하다.

도 3c 는 표적 핵산이 증폭되는 공정을 포함하는 양태이다. 이 경우에는, 형광 표지 프라이머/프로브의 올리고뉴클레오티드의 3' 영역에서 고정되어 있지 않은 것이 바람직하다. 핵산 증폭의 공정을 포함하는 양태의 경우, 표적 핵산과 형광 표지 프라이머/프로브의 결합이 보다 안정된다.

마이크로 어레이에 결합시키는 핵산은 라디오아이소토프, 형광제 등으로 표지되고, 표지되어 있지 않은 고정화된 올리고뉴클레오티드 등에 어닐링시킨다. 그 후, 결합되어 있지 않은, 표지된 핵산을 세정에 의해 제거 후, 어닐링에 의해 마이크로 어레이에 결합된 핵산의 표지를 검출함으로써, 핵산의 검출이 가능해진다. 그러나, 도 3 의 양태를 보면 알 수 있도록, 고상면에 결합된 형광 표지 프라이머/프로브를 사용함으로써, 시료 전체의 형광 라벨화를 실시할 필요가 없어지고, 또 세정 공정을 필요로 하지 않기 때문에, 보다 간편하게 표적 핵산을 검출할 수 있게 된다.

본 발명은, 복수 종류의 형광 표지 프라이머/프로브, 즉 각각 상이한 방출광을 발하는 형광제로 표지된 복수 종류의 형광 표지 프라이머/프로브와 대응되는 ?처 표지 프로브를 사용함으로써, 복수 종류의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있다. 형광 표지 프라이머/프로브의 형광제는 외부로부터 에너지를 흡수함으로써, 전자가 여기되고, 그것이 기저 상태로 되돌아갈 때에 여분의 에너지를 전자파 (방출광) 로서 방출한다. 여기 상태와 기저 상태의 에너지 준위의 차이는 그 형광제 특이적이기 때문에, 상이한 형광제가 외부로부터 동시에 에너지를 흡수해도, 각각의 형광제는 형광제 특이적 파장의 방출광 (전자파), 즉 「상이한 색의 광」을 발한다. 이 방출광은 대응되는 ?처 표지 프로브의 소광제에 의해서만 흡수 소광되고, 다른 ?처 표지 프로브의 영향은 받지 않는다. 따라서, 형광제의 방출광의 「파장」, 즉 「색」 에 주목하면, 동시에 복수 종류의 표적 핵산을 검출할 수 있다. 이들 방출광은 분광 광도계 등을 사용하면, 각각 검출할 수 있지만, 육안으로도 혼합색 혹은 중간색으로서 검출할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은, 각종 세균, 진균, 바이러스 등의 병원체 검출에 적용할 수 있다. 세균으로는 Mycoplasma pneumoniae, 레지오넬라속균, 살모넬라속균, 장관 출혈성 대장균, 결핵균, 캄필로박터 (Campylobacter jejuni 및 Campylobacter coli), 백일해균 (Bordetella pertussis) 등을 들 수 있다. 진균으로는 Candida 속균, Aspergillus 속균, Cryptococcus 속균 등을 들 수 있다. 바이러스로는, 인플루엔자 A (H1N1) pdm 바이러스, 인플루엔자 A (H1N1) 바이러스, H5 아형 인플루엔자 바이러스, SARS 코로나 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1 형 및 2 형 (Herpes Simplex Virus type 1/2；HSV-1/2), 및 노로 바이러스 Genogroup I (GI) 및 Genogroup II (GII) 등을 들 수 있다. 그 밖에, 기생 동물로서는, 말라리아 원충, 크립토스포리듐 원충, 지아디아 원충 등을 들 수 있다. 또, 병원체 그 자체를 검출할 뿐 아니라, 병원성에 관여하는 유전자, 예를 들어, 독소 유전자 (예를 들어 베로 독소 (verotoxin；이하 VT) 유전자 1 형 (VT 1) 및 2 형 (VT 2)) 이나 약제 내성 유전자, 혹은 숙주에 대한 감염 (침입ㆍ정착ㆍ증식) 에 관련된 유전자 등을 검출할 수도 있다. 또한 Cytochrome 유전자 등의 1 염기 다형 (Single Nucleotide Polymorphism；SNP) 의 검출, 혹은 소 배성 (胚性) 판별의 판정을 위한 수컷 특이적 유전자 배열의 검출 등에 응용할 수 있다. 이들을 검출하기 위해서는, 검출 대상에 특이적 핵산 배열에 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드 배열인 형광 표지 프라이머/프로브를 우선 설계하고, 이어서 대응되는 ?처 표지 프로브를 설계하고, 본 발명의 검출 방법을 실시하면 된다.

특히 본 발명의 복수 종류의 표적 핵산을 검출하는 양태는 인간의 인플루엔자 바이러스 (A 형 (H1N1, H3N2, H1N2, H2N2, H9N1, H5N1 을 포함한다), B 형 및 C 형) 혹은 간염 바이러스 (A 형, B 형 및 C 형) 등의 근접종 바이러스를 한번에 검출 식별하는 데에 유효하다. 또, 성 감염증의 원인이 되는, 임균, 매독 트레포네이마균, 클라미디아 트라코마티스 등의 유무를 한번에 검출 식별하는 데에도 유효하다. 또한 감염성 위장염의 원인이 되는 노로 바이러스나 로타 바이러스 등의 유무를 한번에 검출 식별하는 데에도 유효하다. 혹은 수혈용 혈액의 스크리닝 검사로서 에이즈 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV) 및 C 형 간염 바이러스 (HCV) 의 유무를 한번에 검출 식별하는 데에도 유효하다.

본 발명의 키트는 시료중에 존재하는 1 종류 이상의 표적 핵산을, 증폭시키거나 혹은 증폭시키지 않고 검출하기 위해서 사용하는 표적 핵산 검출용 키트로서, 1 종류 또는 복수 종류의 형광제로 표지된, 표적 핵산과 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 프라이머/프로브와, 소광제로 표지된, 그 형광 표지 프라이머/프로브와 상보성을 갖고, 그 형광 표지 프라이머/프로브보다 융해 온도 (Tm) 가 낮은 올리고뉴클레오티드인 ?처 표지 프로브의 조합을 포함하는 표적 핵산 검출용 키트이다.

상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이는 상기 형광 표지 프라이머/프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다 짧거나, 혹은 상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드가 수식 염기를 함유하고 있는 것을 들 수 있다.

상기 형광 표지 프라이머/프로브가 고상면에 고정되어 있어도 된다. 또, 본 발명의 키트는 표적 핵산을 증폭시키기 위한 다른 시약을 함유해도 되고, 통상적인 핵산 검출용으로 사용하는 다른 시약을 필요에 따라 임의로 함유해도 된다.

이하에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. Tm 값의 영향 확인

(1) 측정 주형

측정용 주형으로서, 클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역의 일부 (배열 번호 21) 를 서브 클로닝한 플라스미드 DNA (이하 CT 플라스미드) 를 제조하였다.

(2) 프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브의 합성

클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역을 타겟으로 하고, 유연 (類緣) 균과의 교차성을 갖지 않는 LAMP 반응용의 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머 중, LB 의 5' 말단을 FAM 으로 형광 표지한 것을 형광 표지 프라이머/프로브로 하고, 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ1 을 표지한 것을 ?처 표지 프로브로 하였다. 또, ?처 표지 프로브에 대해서는, 5' 말단측을 3 ∼ 10 염기 삭제하고, Tm 값을 낮춘 ?처 표지 프로브도 설계하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하고, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브에 대해서는 니혼 바이오 서비스사에 의뢰하였다. ?처 표지 프로브의 Tm 값은 최근접 염기 대법 (Nearest Neighbor method) 의 계산값을 나타내고 있다.

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머＞

CT-FIP：5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 1)

CT-BIP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 2)

CT-F3：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 3)

CT-B3：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 4)

CT-LF：5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (배열 번호 5)

CT-LB：5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 6)

＜클라미디아 트라코마티스 형광 표지 프라이머/프로브＞

FAM-CT-LB：5'-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 7)

＜클라미디아 트라코마티스 ?처 표지 프로브＞

CT-LBc-Q1-0：5'-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 8) Tm＝60.6 ℃

CT-LBc-Q1-3：5'-CTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 9) Tm＝53.9 ℃

CT-LBc-Q1-5：5'-TCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 10) Tm＝49.7 ℃

CT-LBc-Q1-6：5'-CGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 11) Tm＝46.5 ℃

CT-LBc-Q1-7：5'-GTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 12) Tm＝37.5 ℃

CT-LBc-Q1-9：5'-AACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 13) Tm＝32.6 ℃

CT-LBc-Q1-10：5'-ACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 14) Tm＝26.7 ℃

(3) LAMP 반응 시약 조성 및 농도

LAMP 최종 반응 용액 30 ㎕ 중의 각 시약 농도가 이하가 되도록 조제하였다. ?처 표지 프로브는 미첨가를 대조로 하고, CT-LBc-Q1-0 (배열 번호 8), CT-LBc-Q1-3 (배열 번호 9), CT-LBc-Q1-5 (배열 번호 10), CT-LBc-Q1-6 (배열 번호 11), CT-LBc-Q1-7 (배열 번호 12), CT-LBc-Q1-9 (배열 번호 13) 혹은 CT-LBc-Q1-10 (배열 번호 14) 중 어느 것을 첨가하였다.

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM dATP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dCTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dGTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dTTP (GeneACT 사)

ㆍ38.4 U Bst DNA Polymerase (New England Biolab 사)

ㆍ프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브

0.8 μM CT-FIP (배열 번호 1)

0.8 μM CT-BIP (배열 번호 2)

0.1 μM CT-F3 (배열 번호 3)

0.1 μM CT-B3 (배열 번호 4)

0.4 μM CT-LF (배열 번호 5)

0.4 μM FAM-CT-LB (배열 번호 7)

0.8 μM CT-LBc-Q1-0 (배열 번호 8), CT-LBc-Q1-3 (배열 번호 9), CT-LBc-Q1-5 (배열 번호 10), CT-LBc-Q1-6 (배열 번호 11), CT-LBc-Q1-7 (배열 번호 12), CT-LBc-Q1-9 (배열 번호 13) 혹은 CT-LBc-Q1-10 (배열 번호 14)

(4) 증폭

증류수 (DW) 또는 CT 플라스미드 10⁴ copies 를 1 반응에 첨가하고, 리얼타임 탁도 측정 장치 LA-320C (테라멕스사) 를 사용하여 65 ℃ 120 분간 증폭 반응을 실시하였다.

(5) 판정

LA-320C 으로 증폭 반응 (LA-320C 에서는, 핵산의 증폭 반응을 그 부산물인 피로인산 마그네슘의 생성에 의한 흡광도의 변화, 즉 탁도의 변화에 따라 모니터링 한다. Tt 값：탁도 측정 데이터의 연산값이 반응 개시부터 소정의 판정값에 도달할 때까지의 시간, 탁도 곡선：탁도의 리얼타임 측정 데이터의 플롯) 의 확인을 실시함과 함께, 증폭후 반응 튜브에 UV 를 조사하여, 녹색의 형광 (FAM) 을 발하고 있는 것을 양성, 형광이 확인되지 않는 것을 음성으로 하였다.

?처 표지 프로브를 사용하고 있지 않은 경우에는, CT 플라스미드 10⁴ copies 의 증폭은 20.6 분에 확인되었다. 그에 비해, ?처 표지 프로브를 첨가한 것에서는 ?처 표지 프로브에 의해 증폭 시간이 상이하고, CT-LBc-Q1-0 (배열 번호 8) 에서는 92.4 분 (＋71.7 분), CT-LBc-Q1-3 (배열 번호 9) 에서는 41.5 분 (＋20.8 분), CT-LBc-Q1-5 (배열 번호 10) 에서는 27.8 분 (＋7.1 분), CT-LBc-Q1-6 (배열 번호 11) 에서는 25.5 분 (＋4.8 분), CT-LBc-Q1-7 (배열 번호 12) 에서는 22.8 분 (＋2.1 분), CT-LBc-Q1-9 (배열 번호 13) 에서는 20.7분 (＋0.0 분), CT-LBc-Q1-10 (배열 번호 14) 에서는 20.6 분 (-0.1 분) 이었다. 또, 어느 것의 ?처 표지 프로브를 사용한 경우에도, CT 플라스미드를 첨가한 튜브에서는 FAM 유래의 형광인 녹색이 확인되고, DW 를 첨가한 튜브에서는 형광을 확인할 수 없었다 (표 1).

「Tt (DW)」 는 DW 첨가, 「Tt (CT)」 는 CT 플라스미드 10⁴ copies 를 1 반응에 첨가하여 반응시켰을 때의 Tt 값을 나타낸다.

CT-LBc-Q1 을 첨가하고 있지 않은 경우에는, DW 첨가에 있어서도 형광 표지가 Quenching 되어 있지 않기 때문에 형광을 확인할 수 있었다. CT-LBc-Q1 을 첨가하고 있는 것 (Q1-0) 에서는, 어느 것이나 DW 첨가에서는 소광되어 있고, 또 CT 플라스미드를 첨가하고 있는 것에서는, CT-LBc-Q1 의 Tm 값에 영향 받지 않고 형광을 확인할 수 있었다.

[표 1] 이 나타내는 바와 같이, ?처 표지 프로브의 Tm 값이 클수록 증폭 시간이 지연되지만, Tm 값이 32.6 ℃ 이하에서는 그 영향이 없어진다. 따라서 ?처 표지 프로브의 Tm 은 32.6 ℃ 이하가 바람직하다는 것이 시사되었다.

실시예 2. LAMP 법에 의한 증폭후에 ?처 표지 프로브를 첨가한 경우

(1) 측정 주형

클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역을 타겟으로 하고, 유연균과의 교차성을 갖지 않는 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머 중, LB 의 5' 말단을 FAM 으로 형광 표지한 것을 형광 표지 프라이머/프로브로 하고, 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ1 을 표지한 것을 ?처 표지 프로브로 하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하고, 형광 표지 프라이머 및 ?처 표지 프로브에 대해서는 니혼 바이오 서비스사에 의뢰하였다.

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머＞

CT-FIP：5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 1)

CT-BIP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 2)

CT-F3：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 3)

CT-B3：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 4)

CT-LF：5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (배열 번호 5)

CT-LB：5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 6)

＜클라미디아 트라코마티스 형광 표지 프라이머＞

FAM-CT-LB：5'-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 7)

＜클라미디아 트라코마티스 Quencher 표지 프로브＞

CT-LBc-Q1-0：5'-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 8)

(3) LAMP 반응 시약 조성 및 농도

LAMP 최종 반응 용액 30 ㎕ 중의 각 시약 농도가 이하가 되도록 조제하였다.

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM dATP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dCTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dGTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dTTP (GeneACT 사)

ㆍ38.4 U Bst DNA Polymerase (New England Biolab 사)

ㆍ프라이머 및 형광 표지 프라이머/프로브

0.8 μM CT-FIP (배열 번호 1)

0.8 μM CT-BIP (배열 번호 2)

0.1 μM CT-F3 (배열 번호 3)

0.1 μM CT-B3 (배열 번호 4)

0.4 μM CT-LF (배열 번호 5)

0.4 μM FAM-CT-LB (배열 번호 7)

또, 증폭 반응후 이하의 시약을 첨가하였다.

ㆍ?처 표지 프로브

0.8 μM CT-LBc-Q1-0 (배열 번호 8)

(4) 증폭

DW 또는 CT 플라스미드 10⁴ copies 를 1 반응에 첨가하고, LA-320C 를 사용하여 65 ℃ 120 분간 증폭 반응을 실시하였다.

(5) 판정

실시예 1 과 동일하게 LA-320C 으로 증폭 반응의 확인을 실시하였다 (표 2, 도 4).

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는, Tt 값은 검출되지 않고, 탁도의 상승은 보이지 않았다. 한편, CT 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는, Tt 값이 18.7 분 및 탁도의 상승이 확인되었다. 이런 점들에서 CT 플라스미드, 즉 표적 핵산이 함유되는 반응 튜브에서만 증폭 반응이 일어났음이 확인되었다.

각 반응 튜브의 형광에 대해서는, DW 를 첨가한 반응 튜브 (Tube No. 1) 및 CT 플라스미드를 첨가한 반응 튜브 (Tube No. 2) 모두 형광이 검출되었다 (도 5). 다음으로 각 반응 튜브에 CT-LBc-Q1-0 (배열 번호 8) 을 실온에서 첨가하면, DW 를 첨가한 반응 튜브 (Tube No. 3) 은 소광되었다. 이에 비해, CT 플라스미드를 첨가한 반응 튜브 (Tube No. 4) 에서는 형광이 유지되었다.

실시예 3. LAMP 법을 이용한 클라미디아 트라코마티스와 임균의 동시 증폭 검출 방법

(1) 측정 주형

내부 표준 물질 주형으로서 클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역의 일부 (배열 번호 21) 를 서브 클로닝한 플라스미드 DNA (이하, CT 플라스미드라고 한다.) 를 제조하였다. 또, 표적 핵산 주형으로서 임균 mtrA 영역의 일부 (배열 번호 32) 를 서브 클로닝한 플라스미드 DNA (이하, NG 플라스미드라고 한다.) 를 제조하였다.

(2) 클라미디아 트라코마티스 프라이머 , TAMRA 표지 루프 프라이머 (형광 표지 프라이머 / 프로브 ) 및 BHQ2 표지 Quenching 프로브 ( ?처 표지 프로브 ) 의 합성

클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역을 타겟으로 하고, 유연균과의 교차성을 갖지 않는 프라이머를 설계하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하였다. 또, TAMRA 표지 루프 프라이머 및 BHQ2 표지 Quenching 프로브의 합성은 J-Bios 사에 의뢰하였다.

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머＞

CT-FIP：5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 1)

CT-BIP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 2)

CT-F3：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 3)

CT-B3：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 4)

CT-LB：5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 6)

＜클라미디아 트라코마티스 TAMRA 표지 루프 프라이머＞

TAM-CT-LF：5'-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3' (배열 번호 15)

＜클라미디아 트라코마티스 BHQ2 표지 Quenching 프로브＞

CT-LFc-Q2：5'-GGGGTTATCTT-(BHQ2)-3' (배열 번호 16)

(3) 임균 프라이머, FAM 표지 루프 프라이머 (형광 표지 프라이머/프로브) 및 BHQ1 표지 Quenching 프로브 (?처 표지 프로브) 의 합성

임균의 mtrA 영역을 타겟으로 하고, 유연균과의 교차성을 갖지 않는 프라이머를 설계하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하였다. 또, FAM 표지 루프 프라이머 및 BHQ1 표지 Quenching 프로브의 합성은 J-Bios 사에 의뢰하였다.

＜임균 프라이머＞

NG-FIP：5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3' (배열 번호 17)

NG-BIP：5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3' (배열 번호 18)

NG-F3：5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3' (배열 번호 19)

NG-B3：5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3' (배열 번호 20)

NG-LF：5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3' (배열 번호 22)

＜임균 FAM 표지 루프 프라이머＞

FAM-NG-LB：5'-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3' (배열 번호 23)

＜임균 BHQ1 표지 Quenching 프로브＞

NG-LBc-Q1：5'-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3' (배열 번호 24)

(4) LAMP 반응 시약 조성 및 농도

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM ATP

ㆍ2.1 mM CTP

ㆍ2.1 mM GTP

ㆍ2.1 mM TTP

ㆍ38.4 U Bst DNA 폴리머라아제 (New England Biolab 사)

ㆍ클라미디아 트라코마티스 프라이머, TAMRA 표지 루프 프라이머 및 BHQ2 표지 Quenching 프로브

0.8 μM CT-FIP (배열 번호 1) 및 CT-BIP (배열 번호 2)

0.1 μM CT-F3 (배열 번호 3) 및 CT-B3 (배열 번호 4)

0.4 μM CT-LB (배열 번호 6) 및 TAM-CT-LF (배열 번호 15)

0.8 μM CT-LFc-Q2 (배열 번호 16)

ㆍ임균 프라이머, FAM 표지 루프 프라이머 및 BHQ1 표지 Quenching 프로브

0.8 μM NG-FIP (배열 번호 17) 및 NG-BIP (배열 번호 18)

0.1 μM NG-F3 (배열 번호 19) 및 NG-B3 (배열 번호 20)

0.4 μM NG-LF (배열 번호 22) 및 FAM-NG-LB (배열 번호 23)

0.8 μM NG-LBc-Q1 (배열 번호 24)

(5) 증폭

DW 또는 CT 플라스미드 10⁴ 카피 또는 NG 플라스미드 10⁴ 카피 또는 CT 플라스미드 10⁴ 카피 및 NG 플라스미드 10⁴ 카피를 첨가하고, LA-320C 를 사용하여 65 ℃ 60 분간 증폭 반응을 실시하였다.

(6) 판정

클라미디아 트라코마티스 유래의 핵산 (CT) 이 증폭되면 UV 조사하에서 적색 (TAMRA) 을 육안으로 볼 수 있고, 임균 유래의 핵산 (NG) 이 증폭되면 녹색 (FAM) 을 육안으로 볼 수 있다. 상기 증폭 반응후, UV 를 조사하여 형광을 확인한 결과 (도 6), DW (음성 검체) 에서는 무색 (Tube No. 1 ∼ 4)；임균 양성 검체에서는 녹색 (Tube No. 5 ∼ 8)；클라미디아 트라코마티스 양성 검체에서는 적색 (Tube No. 9 ∼ 12)；두 양성 검체에서는 황색 (적색＋녹색) 을 육안으로 볼 수 있었다 (Tube No. 13 ∼ 16).

실시예 4. 클라미디아 트라코마티스, 임균 및 인공 핵산의 다항목 동시 증폭 검출

(1) 측정 주형

측정용 주형으로서, 클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역의 일부 (배열 번호 21) 를 서브 클로닝한 플라스미드 DNA (이하 CT 플라스미드), 임균의 mtrA 영역의 일부 (배열 번호 32) 를 서브 클로닝한 플라스미드 DNA (이하 NG 플라스미드), 인공 핵산 배열 (배열 번호 33) 을 서브 클로닝한 플라스미드 DNA (이하 ARITA2 플라스미드) 를 제조하였다.

클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역, 임균의 mtrA 영역 및 인공 핵산 배열을 타겟으로 하고, 유연균과의 교차성을 갖지 않는 LAMP 반응용의 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머 중, 클라미디아 트라코마티스 LF 의 5' 말단을 TAMRA 으로, 임균 LB 의 5' 말단을 FAM 으로, 인공 핵산 배열 LB 의 5' 말단을 Alexa Fluor^TM 350 (이하 Alexa 350) 으로 형광 표지한 것을 형광 표지 프라이머로 하고, 클라미디아 트라코마티스 LF 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ2 를 표지, 임균 LB 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ1 을 표지, 인공 핵산 배열 LB 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ0 를 표지한 것을 ?처 표지 프로브로 하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하고, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브에 대해서는 니혼 바이오 서비스사에 의뢰하였다.

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머＞

CT-FIP：5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 1)

CT-BIP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 2)

CT-F3：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 3)

CT-B3：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 4)

CT-LB：5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 6)

＜클라미디아 트라코마티스 형광 표지 프라이머/프로브＞

TAM-CT-LF：5'-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3' (배열 번호 15)

＜클라미디아 트라코마티스 ?처 표지 프로브＞

CT-LFc-Q2：5'-ACGTGCGGGGTTATCTT-(BHQ2)-3' (배열 번호 16)

＜임균 프라이머＞

NG-FIP：5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3' (배열 번호 17)

NG-BIP：5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3' (배열 번호 18)

NG-F3：5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3' (배열 번호 19)

NG-B3：5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3' (배열 번호 20)

NG-LF：5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3' (배열 번호 22)

＜임균 형광 표지 프라이머/프로브＞

FAM-NG-LB：5'-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3' (배열 번호 23)

＜임균 ?처 표지 프로브＞

NG-LBc-Q1：5'-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3' (배열 번호 24)

＜인공 핵산 프라이머＞

ARITA2-FIP：5'-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3' (배열 번호 25)

ARITA2-BIP：5'-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3' (배열 번호 26)

ARITA2-F3：5'-GGACAATCGAAGCCAGAA-3' (배열 번호 27)

ARITA2-B3：5'-ATCACGGATCGTATGTGG-3' (배열 번호 28)

ARITA2-LF：5'-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3' (배열 번호 29)

＜인공 핵산 형광 표지 프라이머/프로브＞

Ale-ARITA2-LB：5'-(Alexa 350)-AACGATCGCACTAAGCAT-3' (배열 번호 30)

＜인공 핵산 ?처 표지 프로브＞

ARITA2-LBc-Q0：5'-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ0)-3' (배열 번호 31)

(3) LAMP 반응 시약 조성 및 농도

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM dATP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dCTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dGTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dTTP (GeneACT 사)

ㆍ38.4 U Bst DNA Polymerase (New England Biolab 사)

ㆍ프라이머 및 형광 표지 프라이머/프로브

0.6 μM CT-FIP (배열 번호 1), NG-FIP (배열 번호 17)

0.6 μM CT-BIP (배열 번호 2), NG-BIP (배열 번호 18)

0.1 μM CT-F3 (배열 번호 3), NG-F3 (배열 번호 19)

0.1 μM CT-B3 (배열 번호 4), NG-B3 (배열 번호 20)

0.3 μM CT-LB (배열 번호 6), NG-LF (배열 번호 22)

0.1 μM ARITA2-FIP (배열 번호 25), ARITA2-BIP (배열 번호 26)

0.02 μM ARITA2-F3 (배열 번호 27), ARITA2-B3 (배열 번호 28)

0.1 μM ARITA2-LF (배열 번호 29)

0.4 μM TAM-CT-LF (배열 번호 15), FAM-NG-LB (배열 번호 23), Ale-ARITA2-LB (배열 번호 30)

또, 증폭 반응후 이하의 시약을 첨가하였다.

ㆍ?처 표지 프로브

0.8 μM CT-LFc-Q2 (배열 번호 16), NG-LBc-Q1 (배열 번호 24), ARITA2-LBc-Q0 (배열 번호 31)

(4) 증폭

DW, CT 플라스미드 10⁴ copies, NG 플라스미드 10⁴ copies 또는 ARITA2 플라스미드 10² copies 중 1 종류 혹은 복수 종류를 1 반응에 첨가하고, LA-320C 를 사용하여 65 ℃ 120 분간 증폭 반응을 실시하였다.

(5) 판정

실시예 1 과 동일하게, LA-320C 으로 증폭 반응의 확인을 실시하였다 (표 3, 도 7).

DW 를 첨가한 (CT, NG 및 ARITA2 플라스미드 모두-) 반응 튜브에서는 Tt 값은 검출되지 않고, 탁도의 상승은 보이지 않았다. 한편, CT 플라스미드, NG 플라스미드 혹은 ARITA2 플라스미드를 1 종류, 2 종류 조합하고, 혹은 3 종류 전부를 첨가한 반응 튜브에서는, 각각 Tt 값이 얻어지고, 또한 탁도의 상승이 확인되었다. 이런 점들에서 CT 플라스미드, NG 플라스미드 혹은 ARITA2 플라스미드를 1 종류 혹은 복수 종류 포함하는 반응 튜브에서만 증폭 반응이 일어났음이 확인되었다. 증폭 종료후의 반응 튜브에, CT-LFc-Q2 (배열 번호 16), NG-LBc-Q1 (배열 번호 24), ARITA2-LBc-Q0 (배열 번호 31) 0.8 μM 첨가하고, 95 ℃ 5 분 가열 후에 실온까지 냉각시킨 후, UV 를 조사하여 형광을 관찰하였다 (도 8).

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 증폭 산물이 없기 때문에, 형광을 확인할 수 없었다 (Tube No. 1). CT 플라스미드 첨가 반응 튜브에서는 적색의 형광을 확인할 수 있었다 (Tube No. 2). 마찬가지로 NG 플라스미드 첨가 반응 튜브에서는 녹색의 형광 (Tube No. 3), ARITA2 플라스미드 첨가 반응 튜브에서는 청색의 형광을 확인할 수 있었다 (Tube No. 4). 2 종의 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 각각의 형광색의 중간색을 나타내고, CT 플라스미드와 NG 플라스미드 첨가 반응 튜브에서는 황색의 형광 (Tube No. 5), CT 플라스미드와 ARITA2 플라스미드 첨가 반응 튜브에서는 자색의 형광 (Tube No. 6), NG 플라스미드와 ARITA2 플라스미드 첨가 반응 튜브에서는 옥색의 형광을 확인할 수 있었다 (Tube No. 7). 또, 3 종의 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 백색의 형광을 확인할 수 있었다 (Tube No. 8).

실시예 5. 프로브를 사용한 표적 핵산 (클라미디아 트라코마티스) 의 검출

(1) 시료의 조제

시료에는 반응후의 LAMP 반응액을 사용하였다. LAMP 반응 조건에 대해서는, 각 시약 조성과 최종농도는 이하에 나타내는 바와 같이 하고, 주형으로서 CT 플라스미드를 1 반응당 10⁴ copies 가 되도록 첨가, 혹은 주형 대신에 DW 를 첨가하고, LAMP 최종 반응 용액 30 ㎕ 로서 LA-320C 를 사용하여, 65 ℃ 40 분간 증폭 반응을 실시하였다. 또, 얻어진 반응액은 80 ℃ 5 분간 가열 처리를 함으로써, Bst DNA Polymerase 의 실활 처리를 실시하고, 이후에 실시하는 형광 표지 프라이머/프로브에 의한 검출시에 증폭 반응이 일어나지 않도록 하였다. 이와 같이 하여 얻어진 LAMP 반응액 즉 시료 중, CT 플라스미드를 주형으로 하여 조제한 것은 양성 검체, DW 를 첨가하여 조제한 것은 음성 검체로 하였다.

＜LAMP 반응 시약 조성 및 최종농도＞

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM dATP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dCTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dGTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dTTP (GeneACT 사)

ㆍ38.4 U Bst DNA Polymerase (New England Biolab 사)

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머＞

ㆍ0.8 μM CT-FIP：5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 1)

ㆍ0.8 μM CT-BIP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 2)

ㆍ0.1 μM CT-F3：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 3)

ㆍ0.1 μM CT-B3：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 4)

ㆍ0.4 μM CT-FL：5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (배열 번호 5)

ㆍ0.4 μM CT-BL：5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 6)

(2) 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브의 합성

설계된 프라이머 중, BL 의 5' 말단을 FAM 으로 형광 표지한 것을 형광 표지 프라이머/프로브로 하고, 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ1 을 표지한 것을 ?처 표지 프로브로 하였다. 또한, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브에 대해서는 니혼 바이오 서비스사에 의뢰하였다.

＜클라미디아 트라코마티스 형광 표지 프라이머/프로브＞

FAM-CT-BL：5'-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 7)

＜클라미디아 트라코마티스 ?처 표지 프로브＞

CT-BLc-Q1-0：5'-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3' (배열 번호 8)

(3) 시료에 대한 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브의 첨가

(1) 에서 조제된 양성 검체와 음성 검체 각각에 대해 0.4 μM 형광 표지 프라이머/프로브 (배열 번호 7) 를 첨가하고, 95 ℃ 5 분간 가열 처리를 실시하여 주형의 변성을 실시하였다. 계속해서 실온까지 냉각시키고 주형과 형광 표지 프라이머를 어닐링시켰다.

실온까지 냉각시킨 후, 0.8 μM ?처 표지 프로브 (배열 번호 8) 를 첨가하여 교반 후, UV 하 그 형광을 확인하였다 (도 9).

(4) 판정

양성 검체, 음성 검체 모두, 형광 표지 프라이머/프로브의 첨가전에는 형광은 검출하지 못하고 (Tube No. 1, 2), 형광 표지 프라이머/프로브인 FAM-CT-BL (배열 번호 7) 의 첨가후에는 형광을 검출할 수 있었다 (Tube No. 3, 4). 이들을 95 ℃ 5 분 가열 후, 실온까지 냉각시키고 ?처 표지 프로브인 CT-BLc-Q1-0 (배열 번호 8) 을 첨가한 결과, 음성 검체에서는 LAMP 산물은 존재하지 않기 때문에, FAM-CT-BL (배열 번호 7) 는 CT-BLc-Q1-0 (배열 번호 8) 과 결합되기 때문에, 형광은 소광 (Quenching) 되었다 (Tube No. 5). 이에 비해, 양성 검체에서는, CT 플라스미드를 주형으로 하여 증폭된 LAMP 산물에 FAM-CT-BL (배열 번호 7) 이 결합되어 있고, CT-BLc-Q1-0 (배열 번호 8) 과는 결합되지 않기 때문에, 형광이 유지되었다 (Tube No. 6).

따라서 실시예 5 는 도 1 에 나타내는 본원 발명의 가장 기본적인 양태는 실시 가능함을 나타내고 있다.

실시예 6. SMart Amplification Process version 2 (이하, SMAP 2) 법을 이용한 클라미디아 트라코마티스의 증폭 검출 (LAMP 법 이외의 등온 증폭법 SMAP 2 법에 있어서의 ?처 표지 프로브를 첨가한 경우의 핵산 증폭과 증폭 산물의 검출)

(1) 측정 주형

(2) 프라이머, 형광 표지 프라이머 및 ?처 표지 프로브의 합성

클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역의 일부를 타겟으로 하고, 유연균과의 교차성을 갖지 않는 SMAP 2 반응용의 프라이머 (FP, TP, OP1, OP2 및 BP 프라이머의 합계 5 개) 를 설계하였다. 설계된 프라이머 중, TP 프라이머에 의해 증폭 산물에 발생하는 루프 부분에 어닐하는 BP 프라이머의 5' 말단을 Alexa 350 으로 형광 표지한 것을 형광 표지 프라이머/프로브로 하였다. 또한 BP 프라이머의 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ0 를 표지한 것을 ?처 표지 프로브로 하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하고, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브에 대해서는 니혼 바이오 서비스사에 의뢰하였다.

＜클라미디아 트라코마티스 SMAP 2 프라이머＞

CT-FP：5'-TTTATATATATATAAAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 34)

CT-TP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 35)

CT-OP1：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 36)

CT-OP2：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 37)

＜클라미디아 트라코마티스 형광 표지 프라이머/프로브＞

Ale-CT-BP：5'-(Alexa 350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 38)

＜클라미디아 트라코마티스 ?처 표지 프로브＞

CT-BPc-Q0：5'-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3' (배열 번호 39)

(3) SMAP 2 반응 시약 조성 및 농도

SMAP 2 최종 반응 용액 30 ㎕ 중의 각 시약 농도가 이하가 되도록 조제하였다.

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM dATP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dCTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dGTP (GeneACT 사)

ㆍ2.1 mM dTTP (GeneACT 사)

ㆍ38.4 U Bst DNA Polymerase (New England Biolab 사)

ㆍ프라이머, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브

1.33 μM CT-FP (배열 번호 34)

1.33 μM CT-TP (배열 번호 35)

0.17 μM CT-OP1 (배열 번호 36)

0.17 μM CT-OP2 (배열 번호 37)

0.67 μM Ale-CT-BP (배열 번호 38)

1.33 μM CT-BPc-Q0 (배열 번호 39)

(4) 증폭

DW 또는 CT 플라스미드 10⁶ copies 를 1 반응에 첨가하고, 리얼타임 탁도 측정 장치 LoopampEXIA^TM (테라멕스사) 를 사용하여 65 ℃ 45 분간 증폭 반응을 실시하였다.

(5) 판정

LoopampEXIA^TM 으로 증폭 반응의 확인을 실시하였다 (LoopampEXIA^TM 에서는, 핵산의 증폭 반응을 그 부산물인 피로인산 마그네슘의 생성에 의한 흡광도의 변화, 즉 탁도의 변화에 의해 모니터링한다. Tt 값：탁도 측정 데이터의 연산값이 반응 개시부터 소정의 판정값에 도달할 때까지의 시간, 탁도 곡선：탁도의 리얼타임 측정 데이터의 플롯) (표 4, 도 10).

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는, Tt 값은 검출되지 않고, 탁도의 상승은 보이지 않았다. 한편, CT 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 Tt 값이 23.2 분 및 탁도의 상승이 확인되었다. 이런 점들에서 CT 플라스미드, 즉 표적 핵산이 함유되는 반응 튜브에서만 증폭 반응이 일어났음이 확인되었다.

증폭 반응 종료후의 각 반응 튜브에 UV 를 조사하여 형광을 관찰한 결과 (도 11), DW 를 첨가한 반응 튜브 (Tube No. 1) 에서는 형광은 관찰되지 않고, CT 플라스미드를 첨가한 반응 튜브 (Tube No. 2) 에서는 형광을 확인하였다.

실시예 6 은 본원 발명이 LAMP 법뿐만 아니라, 다양한 핵산의 등온 증폭 반응에서도 실시 가능함을 나타내고 있다.

실시예 7. 단항목 증폭, 2 항목 혹은 3 항목 동시 증폭 반응계에 있어서의 형광 파장 검출

(1) 측정 주형

클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 영역, 임균의 mtrA 영역 및 인공 핵산 배열을 타겟으로 하고, 유연균과의 교차성을 갖지 않는 LAMP 반응용의 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머 중, 클라미디아 트라코마티스 BL 의 5' 말단을 Alexa 350 으로 형광 표지, 임균 BL 의 5' 말단을 TAMRA 으로 형광 표지, 인공 핵산 배열 BL 의 5' 말단을 FAM 으로 형광 표지한 것을 형광 표지 프라이머/프로브로 하고, 클라미디아 트라코마티스 BL 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ0 를 표지, 임균 BL 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ2 를 표지, 인공 핵산 배열 BL 상보 사슬의 3' 말단에 BHQ1 을 표지한 것을 ?처 표지 프로브로 하였다. 프라이머의 합성은 오페론 바이오 테크놀러지사에 의뢰하고, 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브에 대해서는 니혼 바이오 서비스사에 의뢰하였다.

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머＞

CT-FIP：5'-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3' (배열 번호 1)

CT-BIP：5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3' (배열 번호 2)

CT-F3：5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3' (배열 번호 3)

CT-B3：5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3' (배열 번호 4)

CT-LF：5'-AAGATAACCCCGCACGT-3' (배열 번호 5)

＜클라미디아 트라코마티스 형광 표지 프라이머/프로브＞

Ale-CT-LB：5'-(Alexa 350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3' (배열 번호 40)

＜클라미디아 트라코마티스 ?처 표지 프로브＞

CT-LBc-Q0：5'-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3' (배열 번호 41)

＜임균 프라이머＞

NG-FIP：5'-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3' (배열 번호 17)

NG-BIP：5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3' (배열 번호 18)

NG-F3：5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3' (배열 번호 19)

NG-B3：5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3' (배열 번호 20)

NG-LF：5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3' (배열 번호 22)

＜임균 형광 표지 프라이머/프로브＞

TAM-NG-LB：5'-(TAMRA)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3' (배열 번호 42)

＜임균 ?처 표지 프로브＞

NG-LBc-Q2：5'-CGTTTTGTCG-(BHQ2)-3' (배열 번호 43)

＜인공 핵산 프라이머＞

ARITA2-FIP：5'-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3' (배열 번호 25)

ARITA2-BIP：5'-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3' (배열 번호 26)

ARITA2-F3：5'-GGACAATCGAAGCCAGAA-3' (배열 번호 27)

ARITA2-B3：5'-ATCACGGATCGTATGTGG-3' (배열 번호 28)

ARITA2-LF：5'-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3' (배열 번호 29)

＜인공 핵산 형광 표지 프라이머/프로브＞

FAM-ARITA2-LB：5'-(FAM)-AACGATCGCACTAAGCAT-3' (배열 번호 44)

＜인공 핵산 ?처 표지 프로브＞

ARITA2-LBc-Q1：5'-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ1)-3' (배열 번호 45)

(3) LAMP 반응 시약 조성 및 농도

ㆍ30 mM Tris-HCl (pH 8.8)

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

ㆍ0.15 ％ Tween 20

ㆍ2.1 mM ATP

ㆍ2.1 mM CTP

ㆍ2.1 mM GTP

ㆍ2.1 mM TTP

ㆍ38.4 U Bst DNA 폴리머라아제 (New England Biolab 사)

프라이머에 대해서는, 이하 3 종류의 프라이머와 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브의 세트를 1 종류 혹은 복수 종류를 1 반응에 첨가하였다.

프라이머와 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브의 세트의 조합은 단항목 증폭에서는 클라미디아 트라코마티스, 임균, 인공 핵산의 3 가지 방법, 2 항목 동시 증폭에서는 클라미디아 트라코마티스와 임균, 클라미디아 트라코마티스와 인공 핵산, 임균과 인공 핵산의 3 가지 방법, 3 항목 동시 증폭에서는 클라미디아 트라코마티스와 임균과 인공 핵산의 1 가지 방법이다.

＜클라미디아 트라코마티스 프라이머와 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브＞

0.67 μM CT-FIP (배열 번호 1)

0.67 μM CT-BIP (배열 번호 2)

0.17 μM CT-F3 (배열 번호 3)

0.17 μM CT-B3 (배열 번호 4)

0.33 μM CT-LF (배열 번호 5)

0.67 μM Ale-CT-LB (배열 번호 40)

1.33 μM CT-LBc-Q0 (배열 번호 41)

＜임균 프라이머와 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브＞

1.20 μM NG-FIP (배열 번호 17)

1.20 μM NG-BIP (배열 번호 18)

0.17 μM NG-F3 (배열 번호 19)

0.17 μM NG-B3 (배열 번호 20)

0.67 μM NG-LF (배열 번호 22)

0.67 μM TAM-NG-LB (배열 번호 42)

1.33 μM NG-LBc-Q2 (배열 번호 43)

＜인공 핵산 프라이머와 형광 표지 프라이머/프로브 및 ?처 표지 프로브＞

0.20 μM ARITA2-FIP (배열 번호 25)

0.20 μM ARITA2-BIP (배열 번호 26)

0.03 μM ARITA2-F3 (배열 번호 27)

0.03 μM ARITA2-B3 (배열 번호 28)

0.13 μM ARITA2-LF (배열 번호 29)

0.67 μM FAM-ARITA2-LB (배열 번호 44)

1.33 μM ARITA2-LBc-Q1 (배열 번호 45)

(4) 증폭

DW, CT 플라스미드 10³ copies, NG 플라스미드 10³ copies 또는 ARITA2 플라스미드 10³ copies 중 1 종류 혹은 복수 종류를 1 반응에 첨가하고, LoopampEXIA^TM를 사용하여 65 ℃ 45 분간 증폭 반응을 실시하였다.

(5) 판정

LoopampEXIA^TM 으로 증폭 반응의 확인을 실시하였다.

증폭 반응 종료후, 반응 튜브에 UV 를 조사하여 형광의 관찰을 실시하였다.

또, 증폭 반응후의 반응액을 희석액으로 100 배로 희석한 것을 분광 형광 광도계 RF-5300PC (SHIMADZU 사 제조) 로 각 형광 표지에 대응된 여기광을 조사하여 형광 파장의 스캔을 실시하였다.

＜희석액의 조성＞

ㆍ30 mM Tris-HCl pH 8.8

ㆍ15 mM KCl

ㆍ15 mM (NH₄)₂SO₄

ㆍ12 mM MgSO₄

각 형광 표지에 대응되는 여기광으로서 이하의 파장을 사용하였다.

ㆍAlexa 350 350 ㎚

ㆍTAMRA 555 ㎚

ㆍFAM 495 ㎚

1) 단항목 클라미디아 트라코마티스의 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 5 주형 CT "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 12 의 DW 의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승 없음), UV 조사하에서 형광을 확인할 수 없지만 (도 13 Tube No.1), CT 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 5 주형 CT "＋" 의 Tt 값 13.3 분；도 12 의 CT 의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승 있음), UV 조사하에서는 Ale-CT-LB (배열 번호 40) 에서 유래하는 것으로 생각되는 청색의 형광을 확인할 수 있었다 (도 13 Tube No.2). 형광 파장에서도 마찬가지로, Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 14A), 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하였다. 한편, 주형 (＋) (CT 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 14B), 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하였다.

2) 단항목 임균의 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 6 주형 NG "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 15 의 DW 의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승 없음), UV 조사하에서 형광을 확인할 수 없지만 (도 16 Tube No.1), NG 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 6 주형 NG "＋" 로부터 Tt 값 11.6 분；도 15 의 NG의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승 있음), UV 조사하에서는 TAM-NG-LB (배열 번호 42) 에서 유래하는 것으로 생각되는 적색의 형광을 확인할 수 있었다 (도 16 Tube No.2). 형광 파장에서도 마찬가지로, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 17A), 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하였다. 한편, 주형 (＋) (NG 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 17B), 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하였다.

3) 단항목 인공 핵산의 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 7 주형 ARITA2 "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 18 의 DW 의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승 없음), UV 조사하에서 형광을 확인할 수 없지만 (도 19 Tube No.1), ARITA2 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 7 주형 ARITA2 "＋" 로부터 Tt 값은 반응 시간내에 검출되지 않았지만, 도 18 의 ARITA2 의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승을 확인하였기 때문에 핵산은 증폭된 것으로 판단하였다), FAM-ARITA2-LB (배열 번호 44) 에서 유래하는 것으로 생각되는 녹색의 형광을 확인할 수 있었다 (도 19 Tube No.2).

형광 파장에 있어서는, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액 (도 20A) 과 주형 (＋) (ARITA2 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액 (도 20 B) 은 모두, 495 ㎚ 부근에서 여기광, 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크가 보였지만, 주형 (－) 의 반응액에서는 보다 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 이며, 주형 (＋) 의 반응액에서 보다 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

4) 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 임균의 동시 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 8 주형 CT "－" 및 NG "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 21 의 DW 의 증폭 곡선으로부터 탁도의 상승은 없음), UV 조사하에서 형광은 확인할 수 없지만 (도 22 Tube No.1), CT 플라스미드만 첨가, NG 플라스미드만 첨가 혹은 CT 플라스미드와 NG 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 8 주형 CT 만 "＋", 주형 NG 만 "＋", 주형 CT "＋" 및 NG "＋" 의 Tt 값은 각각 12.8 분, 13.6 분, 12.2 분；도 21 의 CT, NG, CT＋NG 의 증폭 곡선으로부터 모두 탁도의 상승 있음), UV 조사하에서는 각각 Ale-CT-LB (배열 번호 40) 에서 유래하는 것으로 생각되는 청색의 형광 (도 22 Tube No.2), TAM-NG-LB (배열 번호 42) 에서 유래하는 것으로 생각되는 적색의 형광 (도 22 Tube No.3), Ale-CT-LB 와 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 자색의 형광 (도 22 Tube No.4) 을 확인할 수 있었다.

형광 파장에 있어서는, CT 및 NG 모두 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 23A), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하였다.

CT 만 주형 (＋) (CT 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 23B), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광을 확인했을 뿐이었다.

NG 만 주형 (＋) (NG 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 23C), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하였다.

CT 및 NG 모두 주형 (＋) (CT 플라스미드와 NG 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 23D), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 Alexa 350 을 위한 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하였다.

5) 2 항목 클라미디아 트라코마티스와 인공 핵산의 동시 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 9 주형 CT "－" 및 ARITA2 "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 24 의 DW 의 탁도 곡선으로부터 탁도의 상승 없음), UV 조사하에서 형광은 확인할 수 없지만 (도 25 Tube No.1), CT 플라스미드만 첨가, ARITA2 플라스미드만 첨가 혹은 CT 플라스미드와 ARITA2 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 9 주형 CT 만 "＋", 주형 ARITA2 만 "＋", 주형 CT "＋" 및 ARITA2 "＋" 의 Tt 값은 각각 12.0 분, 28.2 분, 13.6 분；도 24 의 CT, ARITA2, CT＋ARITA2 의 탁도 곡선으로부터 모두 탁도의 상승 있음), UV 조사하에서는 각각 Ale-CT-LB (배열 번호 40) 에서 유래하는 것으로 생각되는 청색의 형광 (도 25 Tube No.2), FAM-ARITA2-LB (배열 번호 44) 에서 유래하는 것으로 생각되는 녹색의 형광 (도 25 Tube No.3), Ale-CT-LB 와 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 옥색의 형광 (도 25 Tube No.4) 을 확인할 수 있었다.

형광 파장에 있어서는, CT 및 ARITA2 모두 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 26 A), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하였다.

CT 만 주형 (＋) (CT 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 26B), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인하였다.

ARITA2 만 주형 (＋) (ARITA2 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 26C), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

CT 및 ARITA2 모두 주형 (＋) (CT 플라스미드와 ARITA2 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 26D), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

6) 2 항목 임균과 인공 핵산의 동시 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 10 주형 NG "－" 및 ARITA2 "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 27 의 DW 의 탁도 곡선으로부터 탁도의 상승 없음), UV 조사하에서 형광은 확인할 수 없지만 (도 28 Tube No.1), NG 플라스미드만 첨가, ARITA2 플라스미드만 첨가 혹은 NG 플라스미드와 ARITA2 플라스미드를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 10 주형 NG 만 "＋", 주형 ARITA2 만 "＋", 주형 NG "＋" 및 ARITA2 "＋" 의 Tt 값은 각각 12.0 분, 29.0 분, 11.9 분；도 27 의 NG, ARITA2, NG＋ARITA2 의 탁도 곡선으로부터 모두 탁도의 상승 있음), UV 조사하에서는 각각 TAM-NG-LB (배열 번호 42) 에서 유래하는 것으로 생각되는 적색의 형광 (도 28 Tube No.2), FAM-ARITA2-LB (배열 번호 44) 에서 유래하는 것으로 생각되는 녹색의 형광 (도 28 Tube No.3), TAM-NG-LB 와 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 황색의 형광 (도 28 Tube No.4) 을 확인할 수 있었다.

형광 파장에 있어서는, NG 및 ARITA2G 모두 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 29A), TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인하였다.

NG 만 주형 (＋) (NG 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 29B), TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인하였다.

ARITA2 만 주형 (＋) (ARITA2 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 29C), TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

NG 및 ARITA2 모두 주형 (＋) (NG 플라스미드와 ARITA2 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 29D), TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

7) 3 항목 클라미디아 트라코마티스, 임균 및 인공 핵산의 증폭 반응계의 증폭 반응후의 형광 파장 측정 결과

DW 를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이지 않고 (표 11 주형 CT "－", NG "－" 및 ARITA2 "－" 로부터 Tt 값은 검출되지 않음；도 30 의 DW 의 탁도 곡선으로부터 탁도의 상승 없음), UV 조사하에서 형광은 확인할 수 없지만 (도 31 Tube No.1), CT 플라스미드, NG 플라스미드, ARITA2 플라스미드를 1 종류 첨가, 2 종류 조합하여 첨가, 혹은 3 종류 전부를 첨가한 반응 튜브에서는 핵산의 증폭이 보이고 (표 11 주형 CT 만 "＋", 주형 NG 만 "＋", 주형 ARITA2 만 "＋", 주형 CT "＋" 및 NG "＋", 주형 CT "＋" 및 ARITA2 "＋", 주형 NG "＋" 및 ARITA2 "＋", 주형 CT "＋" 와 NG "＋" 및 ARITA2 "＋" 의 Tt 값은 각각 14.3 분, 13.5 분, 35.6 분, 12.3 분, 14.2 분, 13.5 분, 12.4 분；도 30 의 CT, NG, ARITA2, CT＋NG, CT＋ARITA2, NG＋ARITA2, CT＋NG＋ARITA2 의 탁도 곡선으로부터 모두 탁도의 상승 있음), UV 조사하에서는 각각 Ale-CT-LB (배열 번호 40) 에서 유래하는 것으로 생각되는 청색의 형광 (도 31 Tube No.2), TAM-NG-LB (배열 번호 42) 에서 유래하는 것으로 생각되는 적색의 형광 (도 31 Tube No.3), FAM-ARITA2-LB (배열 번호 44) 에서 유래하는 것으로 생각되는 녹색의 형광 (도 31 Tube No.4), Ale-CT-LB 와 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 자색의 형광 (도 31 Tube No.5), Ale-CT-LB 와 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 옥색의 형광 (도 31 Tube No.6), TAM-NG-LB 와 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 황색의 형광 (도 31 Tube No.7), Ale-CT-LB 와 TAM-NG-LB 및 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 백색의 형광 (도 31 Tube No.8) 을 확인할 수 있었다.

형광 파장에 있어서는, CT, NG 및 ARITA2 모두 주형 (－) (DW 를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32A), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인하였다.

CT 만 주형 (＋) (CT 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32B), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인하였다.

NG 만 주형 (＋) (NG 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32C), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광에 더하여 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인하였다.

ARITA2 만 주형 (＋) (ARITA2 플라스미드만 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32D), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

CT 및 NG 모두 주형 (＋) (CT 플라스미드와 NG 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액 (도 32E) 에서는, Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 Alexa 350 을 위한 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인했지만, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 작은 (형광 강도 20 미만의) 피크 (백그라운드) 를 확인했을 뿐이었다.

CT 및 ARITA2 모두 주형 (＋) (CT 플라스미드와 ARITA2 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32F), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광만을 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

NG 및 ARITA2 모두 주형 (＋) (NG 플라스미드와 ARITA2 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32G), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크만을 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

CT, NG 및 ARITA2 모두 주형 (＋) (CT 플라스미드와 NG 플라스미드 및 ARITA2 플라스미드를 첨가하였다) 의 반응액에서는 (도 32H), Alexa 350 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 350 ㎚ 부근에서 Alexa 350 을 위한 여기광과 398 ㎚ 부근에서 물의 라먼 분광의 피크에 더하여 443 ㎚ 부근에서 Ale-CT-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, TAMRA 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 555 ㎚ 부근에서 여기광과 580 ㎚ 부근에서 TAM-NG-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 피크를 확인하고, 또한, FAM 에 대응되는 여기광을 조사한 경우, 495 ㎚ 부근에서 여기광과 522 ㎚ 부근에서 FAM-ARITA2-LB 에서 유래하는 것으로 생각되는 형광의 충분히 큰 (형광 강도 80 초과의) 피크를 확인하였다.

본원 발명은, 단항목 혹은 다항목의 증폭 반응계에서 1 종류의 주형으로부터 핵산이 증폭되는 경우에는, 항목 마다의 검출에 사용하는 1 종류의 형광 표지에서 유래하는 형광, 다항목의 증폭 반응계에서 복수 종류의 주형으로부터 핵산이 증폭되는 경우에는, 각 항목의 검출에 사용하는 복수 종류의 형광 표지에서 유래하는 형광을 검출하는 것이다. 육안으로 검출을 실시하는 경우에는, 인간의 삼색형 색각으로 식별 가능한 범위의 형광 색광일 필요가 있고, 예를 들어, 실시예로 나타낸 바와 같이, 청색, 적색, 녹색의 형광 표지를 원색에 사용하여 가법 혼합을 이용하여 표현되는 색조는, 앞의 3 가지 원색에 더하여, 자색, 황색, 옥색, 백색 7 가지 색, 이것에 형광을 발하지 않은 경우 (무색 즉 무형광) 를 포함하여 전부 8 종류의 색이 상한이 된다. 한편, 형광 측정 기기로 검출을 실시하는 경우에는, 기기에 의해 식별 가능한 종류의 형광 표지를 사용할 수 있기 때문에, 더 많은 항목을 동시에 검출할 수 있고, 또한 발광 강도에 의해 정량할 수도 있다.

실시예 7 은, 본원 발명이 단항목, 다항목에 관계없이 등온 증폭 반응에 있어서의 핵산 증폭을 검출하기 위해서, 형광 검출 기기에 의한 형광의 계측을 실시할 수 있음을 나타내고 있다.

산업상 이용 가능성

본 발명은 종래 기술보다 간편하고 저렴하게 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공할 수 있다. 또, 본 발명을 마이크로 어레이에 적용함으로써, 표적 핵산을 표지하지 않고 유전자 발현을 검출할 수 있다. 또한 종래의 핵산 증폭 기술과 조합함으로써, 1 단계의 시약 첨가로 다항목의 표적 핵산을 한 번에 검출할 수도 있다. 덧붙여, 그 검출을 특별한 기기를 사용하지 않고 육안으로 할 수 있는 것을 가능하게 한다. 따라서 이러한 발명은 종래의 연구실내 뿐만 아니라, 병원에서의 감염균, 바이러스의 동정, 약제 감수성의 확인, 1 염기 다형 검출에 의한 치료 효과 예측, 식품 제조 판매에서의 안전성 확인 등에 있어서 매우 유효한 툴이 될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> EIKEN CHEMICAL CO., LTD. <120> Detection Method of Target Nucleic Acid <130> W6550 <150> JP 2011/238174 <151> 2011-10-31 <160> 45 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-FIP: Synthesized Primer/Probe <400> 1 caagcaggac tacaagctgc agcgtttgta ctccgtcac 39 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-BIP: Synthesized Primer/Probe <400> 2 gcgggcgatt tgccttaact cggtcaacga agaggtt 37 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-F3: Synthesized Primer/Probe <400> 3 atgtcggagt ctgagcac 18 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-B3: Synthesized Primer/Probe <400> 4 cctcagaagt ttatgcactt tc 22 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LF: Synthesized Primer/Probe <400> 5 aagataaccc cgcacgt 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LB: Synthesized Primer/Probe <400> 6 ggagcgagtt acgaagaca 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-CT-LB: Synthesized Primer/Probe <400> 7 ggagcgagtt acgaagaca 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-0: Synthesized Primer/Probe <400> 8 tgtcttcgta actcgctcc 19 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-3: Synthesized Primer/Probe <400> 9 cttcgtaact cgctcc 16 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-5: Synthesized Primer/Probe <400> 10 tcgtaactcg ctcc 14 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-6: Synthesized Primer/Probe <400> 11 cgtaactcgc tcc 13 <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-7: Synthesized Primer/Probe <400> 12 gtaactcgct cc 12 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-9: Synthesized Primer/Probe <400> 13 aactcgctcc 10 <210> 14 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-LBc-Q1-10: 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tgcgtgtcct gtgaccttca 60 ttatgtcgga gtctgagcac cctaggcgtt tgtactccgt cacagcggtt gctcgaagca 120 cgtgcggggt tatcttaaaa gggattgcag cttgtagtcc tgcttgagag aacgtgcggg 180 cgatttgcct taaccccacc atttttccgg agcgagttac gaagacaaaa cctcttcgtt 240 gaccgatgta ctcttgtaga aagtgcataa acttctgagg ataagttata ataatcctct 300 tttctgtctg acggttctta agctgggaga aagaaatggt agcttgttgg aaacaaatct 360 gactaatctc caagcttaag acttcagagg agcgtttacc tccttggagc attgtctggg 420 cgatcaac 428 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-LF: Synthesized Primer/Probe <400> 22 cgggaaaaat acaatatcgc cc 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-NG-LB: Synthesized Primer/Probe <400> 23 cgacaaaacg gcacatttat gg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-LBc-Q1: Synthesized Primer/Probe <400> 24 ccataaatgt gccgttttgt cg 22 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARITA2-FIP: Synthesized Primer/Probe <400> 25 cgcttggata gtcggatgca agggtcaatg gtac 34 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARITA2-BIP: Synthesized Primer/Probe <400> 26 acggtgtatg cttcggtgtg cgaacctatc agc 33 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARITA2-F3: Synthesized Primer/Probe <400> 27 ggacaatcga agccagaa 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARITA2-B3: Synthesized Primer/Probe <400> 28 atcacggatc gtatgtgg 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARITA2-LF5: Synthesized Primer/Probe <400> 29 gctagctaag tgccatcc 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ale-ARITA2-LB: Synthesized Primer/Probe <400> 30 aacgatcgca ctaagcat 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARITA2-LBc-Q0: Synthesized Primer/Probe <400> 31 atgcttagtg cgatcgtt 18 <210> 32 <211> 451 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 32 gacattctgg acaaactggt cgatctcgcc caattgacgg gcagtgcgga tgtgcagtgc 60 cttttgggcg gacaatggtc ggtacggcat gaaaccttgc aatgcgaagg gctggtacac 120 attgttacgg cgggcagcgg ttatctctgc atcgacggcg aaacttcccc gcgtccggtc 180 ggcacgggcg atattgtatt tttcccgcgc ggcttgggtc atgtgttgag ccacgacgga 240 aaatacggag aaagtttaca accggacata cgacaaaacg gcacatttat ggtcaaacag 300 tgcggcaacg ggctggatat gagcctgttt tgcgcccgtt tccgctacga cacccacgcc 360 gatttgatga acgggctgcc ggaaaccgtt tttctgaaca ttgcccatcc aagtttgcag 420 tatgtggttt caatgctgca actggaaagc g 451 <210> 33 <211> 569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized DNA <400> 33 gggtcaatcg tagggacaat cgaagccaga atgcaagggt caatggtacg cagaatggat 60 ggcacttagc tagccagtta ggatccgact atccaagcgt gtatcgtacg gtgtatgctt 120 cggagtaacg atcgcactaa gcatggctca atcctaggct gataggttcg cacatagcat 180 gccacatacg atccgtgatt gctagcgtga ttcgtaccga gaactcacgc cttatgactg 240 cccttatgtc accgcttatg tctcccgata tcacacccgt tatctcagcc ctaatctctg 300 cggtttagtc tggccttaat ccatgcctca tagctaccct cataccatcg ctcatacctt 360 ccgacattgc atccgtcatt ccaaccctga ttcctacggt ctaacctagc ctctatccta 420 cccagttagg ttgcctctta gcatccctgt tacgtacgct cttaccatgc gtcttacctt 480 ggcactatcg atgggagtat ggtagcgagt atggaacgga ctaacgtagg cagtaagcta 540 gggtgtaagg ttgggactaa ggatgccag 569 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-FP: Synthesized Primer/Probe <400> 34 tttatatata tataaagcgt ttgtactccg tcac 34 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-TP: Synthesized Primer/Probe <400> 35 gcgggcgatt tgccttaact cggtcaacga agaggtt 37 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-OP1: Synthesized Primer/Probe <400> 36 cctcagaagt ttatgcactt tc 22 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-OP2: Synthesized Primer/Probe <400> 37 atgtcggagt ctgagcac 18 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ale-CT-BP: Synthesized Primer/Probe <400> 38 ggagcgagtt acgaagaca 19 <210> 39 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims

시료중에 존재하는 1 종류 이상의 표적 핵산을 검출하는 방법으로서, 이하의 단계를 포함하는 핵산을 검출하는 방법：
(1) 시료에
A) 형광제로 표지된, 표적 핵산과 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 프라이머 또는 프로브와,
소광제로 표지된, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브와 상보성을 갖고, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브보다 융해 온도 (Tm) 가 낮은 올리고뉴클레오티드인 ?처 표지 프로브 ;
또는
B) 발광 파장이 서로 상이한 형광제로 표지된, 각각 상이한 복수의 표적 핵산과 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드인 복수 종류의 형광 표지 프라이머 또는 프로브와,
각각의 형광제에 대응되는 소광제로 표지된, 그 복수 종류의 형광 표지 프라이머 또는 프로브와 각각 상보성을 갖고, 그 복수 종류의 형광 표지 프라이머 또는 프로브보다 각각 융해 온도 (Tm) 가 낮은 올리고뉴클레오티드인 ?처 표지 프로브를 조합하여
첨가하고；
(2) 그 시료를 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 융해 온도 (Tm) 이하이고, 또한 그 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 보다 높은 온도에서 보온하고； 보온 동안에 등온 조건에서 사슬 치환 반응을 이용하여 그 표적 핵산의 증폭을 실시하고 ;
(3) 그 시료를 그 ?처 표지 프로브의 융해 온도 (Tm) 이하의 온도에서 보온하고；
(4) 표적 핵산에 결합된 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 형광을 계측한다.
제 1 항에 있어서,
상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다 짧은 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드가 수식 염기를 함유하고 있는 검출 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브를 고상면에 고정시켜 사용하는 검출 방법.
제 1 항에 기재된 검출 방법에 사용하기 위한 키트로서, 1 종류 또는 복수 종류의
형광제로 표지된, 표적 핵산과 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드인 형광 표지 프라이머 또는 프로브와；
각각의 형광제에 대응되는 소광제로 표지된, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브와 상보성을 갖고, 그 형광 표지 프라이머 또는 프로브보다 융해 온도 (Tm) 가 낮은 올리고뉴클레오티드인 ?처 표지 프로브의 조합을
포함하는 표적 핵산 검출용 키트.
제 5 항에 있어서,
상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다 짧은 표적 핵산 검출용 키트.
제 5 항에 있어서,
상기 ?처 표지 프로브의 올리고뉴클레오티드가 수식 염기를 함유하고 있는 표적 핵산 검출용 키트.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 프라이머 또는 프로브가 고상면에 고정되어 있는 표적 핵산 검출용 키트.
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