TWI608103B - 目標核酸之檢測法 - Google Patents

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Description

目標核酸之檢測法
本發明係關於目標核酸之檢測方法、及其檢測所用的套組。
使用了核酸鹼基序列之互補性的目標核酸之檢測方法，以往由南方雜交法開始，進行了各種的改良，而至現在，特別是於in vitro之核酸放大法確立的同時，已能夠檢測更微量之目標核酸。
作為目標核酸之檢測方法，已開發有與放射性同位素(RI)、發光劑(luminescent agent)、螢光劑(fluorophore)等之標誌結合，使用了包含具有與目標核酸之互補性的核酸之檢測探針的檢測方法。以釋出能量相異之複數個RI來標誌的情況、或以放出光之波長相異之複數個發光劑(或螢光劑)來標誌的情況時，能夠多項目檢測。進一步地，作為Q探針(Quenching Probe)法，判定Single Nucleotide Polymorphism(SNP)之方法亦已確立(專利文獻1)。
又，相反地，亦有將目標核酸以放射性同位素等來標誌化，藉由黏著於與目標核酸具有互補性之固定於固相面之寡核苷酸探針，能夠同時檢測複數個目標核酸之量，即所謂DNA晶片、微陣列等之利用了核酸鹼基序列之互補性的目標核酸之檢測方法(專利文獻2)。
另一方面，作為核酸放大法，可列舉Polymerase Chain Reaction(PCR)(專利文獻3及專利文獻4)、Strand Displacement Amplification(SDA)(專利文獻5)、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA)(專利文獻6)、Rolling Circle Amplification(RCA)(非專利文獻1)、及Loop-mediated isothermal Amplification(LAMP)(專利文獻7)等。該等核酸放大法亦能夠檢測目標核酸。
進一步地，亦存在有如Ligase Chain Reaction(LCR)(專利文獻8)之使用了連接酶的核酸放大法。
目前，作為核酸放大方法而常用者為PCR法。PCR法係使用耐熱性聚合酶、及與目標核酸具有互補性之2個引子，藉由溫度控制來進行(1)雙股目標核酸之變性、(2)使引子對變性之目標核酸黏著、(3)由引子來進行伸長反應之3個步驟，並藉由重複該等3步驟，以指數函數形式來放大目標核酸的方法。將反應後之放大產物電泳，使用溴化乙菲錠(EtBr)、SYBR Green(SYBR(註冊商標)Green)等的嵌入，能夠檢測有無放大產物。又，上述伸長反應時，亦有藉由使用附加螢光劑之核酸鹼基來檢測放大產物之方法。
進一步地，亦已確立藉由使用螢光劑與消光劑(quencher)，定量地檢測目標核酸之放大的方法(專利文獻9)。具體而言係於PCR放大反應時添加以TaqMan(註冊商標)probe為代表之經鄰接附加螢光劑與消光劑 之寡核苷酸探針，來進行PCR反應。PCR之上述步驟(2)中，該探針亦黏著於目標核酸，隨著步驟(3)之伸長反應，該探針被聚合酶之5’→3’外核酸酶活性分解，藉由檢測由消光劑游離之螢光劑的放出光，而能夠檢測目標核酸。
使用如此之螢光劑與消光劑的組合之核酸檢測方法，以PCR放大為前提，提出各種構想(專利文獻10及專利文獻11)。兩者係在具有互補性之寡核苷酸探針的一方附加螢光劑、在另一方面附加消光劑，於PCR之黏著步驟(上述(2))中，係以檢測放大中之目標核酸為目的而構想。
LAMP法之特徵為對於目標核酸之6個區域設定4種引子(FIP、BIP、F3及B3)，利用鏈取代反應於一定溫度下放大。係混合包含目標核酸的試樣、引子、鏈取代型DNA合成酵素、基質等，在一定溫度(65℃附近)保溫藉以使反應進行，能夠以一個步驟來進行至檢測為止的步驟之方法。藉由進一步地追加使用圈環引子B(LB)及/或圈環引子F(LF)，可使放大所需要的時間縮短至1/2至1/3(專利文獻12)。由於放大效率高，故可將目標核酸在15分鐘~1小時放大至109~1010倍，又，由於極高的特異性，亦可由放大產物之有無，來判定作為目的之目標基因序列的有無。作為該方法之一，使核酸放大反應之副產物即焦磷酸離子作為不溶性鹽(鎂鹽)，來測定反應液之濁度，或使該焦磷酸離子與鈣黃綠素-錳錯體反應，檢測 游離之鈣黃綠素(螢光物質)之螢光藉以檢測放大產物之存在(專利文獻13)。再者，亦已確立使用了螢光探針之檢測方法(專利文獻14及專利文獻15)。
又，亦報告有使用經螢光標誌之引子與經消光劑標誌之探針，檢測經LAMP法放大之目標核酸的方法(非專利文獻2)。具體而言，係使用經螢光標誌之引子，藉由LAMP法來放大目標核酸，放大後，添加經消光劑標誌之探針，藉由使不貢獻目標核酸之放大的游離的螢光標誌引子與經消光劑標誌之探針黏著，而僅檢測由對目標核酸之放大有貢獻、亦即作為放大產物之一部分的螢光標誌引子之螢光劑所放出之光的方法。
上述任何核酸檢測方法均有優點亦有缺點，特別是反應或檢測需要高價格的精密機器，且包含各種步驟，因此其實施多需要熟練，該等核酸檢測技術係在專門進行核酸放大之特定研究室內進行。又，例如，於上述非專利文獻2記載之檢測方法中，必須於放大反應後添加消光劑，在開關反應容器之蓋子時，有因為放大產物之飛散而引起試樣間或實驗環境污染之虞。
近年來，於產業、醫療、研究等各種領域中，核酸放大試驗(Nucleic acid Amplification Test：NAT)的要求提高，而且試驗項目種類亦變充實，至今為止核酸放大試驗亦更加廣泛地普及中。例如，以確保醫藥品領域之血液製劑對各種病毒之安全性為目的而實施的試驗中，亦利用了核酸放大試驗。由如此的普及/一般化的趨勢看來，係要 求能夠將至今為止僅能夠在核酸放大專用之特定研究室內進行的核酸放大試驗擴及一般實驗室或田野研究、病房等各種場所或場面亦可進行、可簡便使用、且不會污染試驗環境之核酸檢測技術，更佳為可多項目同時檢測之技術。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2001-286300號公報
[專利文獻2]日本特表2001-521622號公報
[專利文獻3]日本特開昭61-274697號公報
[專利文獻4]日本特開昭62-000281號公報
[專利文獻5]日本特開平5-192195號公報
[專利文獻6]日本特開平2-005864號公報
[專利文獻7]日本專利第3313358號公報
[專利文獻8]日本特開平2-002934公報
[專利文獻9]日本特表平6-500021公報
[專利文獻10]日本特開平10-262700號公報
[專利文獻11]日本特表2004-511227號公報
[專利文獻12]國際公開第2002/024902號
[專利文獻13]日本特開2004-283161號公報
[專利文獻14]日本特開2001-272475號公報
[專利文獻15]國際公開第2009/051214號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92：4641-4645(1995)
[非專利文獻2]Journal of Medical Virology 81：966-972(2009)
本發明之課題為提供新穎之目標核酸的檢測方法。更具體而言，係提供相較於習知技術更簡便且便宜地檢測目標核酸之方法、及檢測所用之套組等。
本發明者等人為了解決上述課題，新開發能夠於密閉系統簡易地放大及檢測核酸之方法。具體而言，發現了於使用經螢光標誌之引子與經消光劑標誌之探針而檢測藉由LAMP法放大之目標核酸的方法中，能夠於放大反應前添加螢光標誌引子與淬熄劑標誌探針，故藉由使兩者之融解溫度(melting temperature：以下Tm)產生差距，隨反應溫度條件不同，即使淬熄劑標誌探針存在下，亦使螢光標誌引子更選擇性地容易黏著於目標核酸。之後，藉由使溫度下降，使無法與目標核酸結合之螢光標誌引子與淬熄劑標誌探針變得能夠黏著，結果藉由進行淬熄，螢光標誌被消光，僅有可與目標核酸結合之螢光標誌引子的螢光標誌能夠檢測。
本發明者等人進一步發現上述方法不僅能夠與LAMP法之放大組合，亦可與其他任何核酸放大方法組合，又即使不包含目標核酸之放大步驟，亦即將螢光標誌引子僅作為單純的探針利用，亦能夠實施，而可解決本發明之課題，完成了本發明。
亦即，本發明之構成係如以下[1]至[13]。
[1]一種檢測核酸之方法，其係檢測存在於試樣中之1種類以上的目標核酸之方法，且包含以下步驟：(1)於試樣中添加經螢光劑標誌，且與目標核酸具有互補性之寡核苷酸的螢光標誌引子或探針、與經消光劑標誌，且與該螢光標誌引子或探針具有互補性，融解溫度(Tm)比該螢光標誌引子或探針低的寡核苷酸之淬熄劑標誌探針；(2)將該試樣保溫於該螢光標誌引子或探針之融解溫度(Tm)以下、且比該淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)高的溫度；(3)將該試樣保溫於該淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)以下的溫度；(4)計測結合於目標核酸之螢光標誌引子或探針的螢光。
[2]如[1]記載之檢測方法，其係在前述步驟(2)之保溫當中放大目標核酸。
[3]如[2]記載之檢測方法，其係在等溫條件下進行 前述目標核酸之放大。
[4]如[1]-[3]中任一項記載之檢測方法，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸的鹼基長度比前述螢光標誌引子或探針之寡核苷酸的鹼基長度更短。
[5]如[1]-[3]中任一項記載之檢測方法，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸係包含修飾鹼基。
[6]如[1]-[5]中任一項記載之檢測方法，其中將前述螢光標誌引子或探針固定於固相面來使用。
[7]如[1]-[6]中任一項記載之檢測方法，其中為了檢測2種以上之目標核酸，係使用發光波長不同之2種以上之螢光標誌引子或探針與各自所相對應之淬熄劑標誌探針之組合。
[8]如[1]-[7]中任一項記載之檢測方法，其中前述步驟(4)中之螢光計測係以目視判定。
[9]如[1]-[7]中任一項記載之檢測方法，其中前述步驟(4)中之螢光計測係以螢光檢測機器來判定。
[10]一種目標核酸檢測用套組，其係用於如[1]-[9]中任一項記載之檢測方法之套組，且包含1種或複數種之經螢光劑標誌，且與目標核酸具有互補性之寡核苷酸的螢光標誌引子或探針；與經對應於各自之螢光劑的消光劑標誌，且與該螢光標誌引子或探針具有互補性，融解溫度(Tm)比該螢光標誌引子或探針低之寡核苷酸的淬熄劑標誌探針之組合。
[11]如[10]記載之目標核酸檢測用套組，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸的鹼基長度比前述螢光標誌引子或探針之寡核苷酸的鹼基長度更短。
[12]如[10]記載之目標核酸檢測用套組，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸係包含修飾鹼基。
[13]如[10]~[12]中任一項記載之目標核酸檢測用套組，其中進一步包含核酸放大用試藥。
[14]如[10]~[13]中任一項記載之目標核酸檢測用套組，其中前述螢光標誌引子或探針係被固定於固相面。
遵循非專利文獻2之方法，於放大反應前添加螢光標誌引子與淬熄劑標誌探針時，放大反應不會正常引發，難以檢測目標核酸。但是，於本發明中，藉由使螢光標誌引子或探針(以下、螢光標誌引子/探針)與淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)錯開，即使在淬熄劑標誌探針存在下，亦能夠優先地使目標核酸與螢光標誌引子黏著。
該本發明之效果並不僅是相對於包含放大步驟之非專利文獻2的方法，在不含放大步驟之其他態樣中亦有效地發揮。
本發明因為不需要於放大反應後添加淬熄劑標誌探針，因此並無因放大產物之飛散所造成之試樣間或實驗環境的污染之虞。又，相較於習知之雜交法，不包含洗淨步驟等，溫度管理亦較為簡便，且不要求精密度，因此能夠 以更簡便，便宜，不需特別之工藝、機器，而檢測目標核酸。
以下詳細說明本發明。
「試樣」意指可認為包含檢測對象之「目標核酸」之混合物。試樣係來自包含人類之生體(例如血液、唾液、體液、體組織等)、環境(例如、土壤、海水、環境水(溫泉水、浴槽水、冷卻塔水等))、或人工物或自然物(例如麵包等加工食品、優格等發酵食品、或米或小麥等栽培植物、微生物、病毒)者，通常係使用經核酸萃取操作者。亦可依需要追加核酸純化操作。
「目標核酸」意指欲藉由本發明檢測之核酸分子。核酸之種類可為去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及該等之混合物或結合物。又，其構成鹼基為天然存在之核苷酸、例如鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)，但亦可包含其以外之天然及人工修飾鹼基。此處「修飾鹼基」，意指上述5個核苷酸接受化學修飾之鹼基。係有甲基胞苷、假尿苷、4-硫代尿苷、二氫尿苷、Q核苷酸、次黃嘌呤(肌苷(I))等，但不限定於此。本發明中之目標核酸，在檢測時必須為單股，但形成雙股或高次構造之核酸亦可藉由熱變性、鹼變性處理等轉換為單股後來使用。本發明之目標核酸亦包含經施加該變性處理之態樣。或藉由以RNA為模板 之反轉錄反應所製造之cDNA亦包含於「目標核酸」中。
「寡核苷酸」意指腺苷、胸苷、胞苷、鳥苷、尿苷等核苷或具有修飾鹼基之核苷經磷酸二酯鍵連結而成的直鏈狀寡聚物，表示DNA、RNA、該等之結合物。隨情況不同亦可為胜肽核酸(PNA)。
「互補性」意指聚核苷酸或寡核苷酸鎖與其他鏈黏著而形成雙股構造，不僅意味著各鏈之各核苷酸以華生-克利克型之鹼基對合，亦意味著具有去氧肌苷(dI)、2-胺基嘌呤鹼基之修飾核苷酸之對合等非華生-克利克型的鹼基對合。
「螢光劑」意指被一定波長之激發光照射時，藉由吸收其能量使電子激發，當其回到基態時將多餘能量作為電磁波(放出光)放出之分子、或官能基。具體的例子可列舉螢光素(fluorescein)、及其衍生物(螢光素亞磷醯胺(fluorescein phosphoramidite,FAM)、螢光素異硫氰酸酯(FITC)等)、玫紅(rhodamine)、及其衍生物(德州紅等)、Cy色素(Cy3、Cy5等)等，但不限定於此等。
「消光劑」意指具有能夠吸收由螢光劑放出之放出光能量的適切能階之分子或官能基。亦能夠以如能夠使用四甲基玫紅(TAMRA)作為螢光素亞磷醯胺(FAM)之消光劑的方式，將螢光劑作為消光劑來使用。但是作為消光劑更適合者為吸收螢光劑之放出光，且即使被激發，本身亦不發出放出光的分子或官能基。可列舉例如DABCYL、 Black Hole Quencher(BHQTM(Biosearch technologies公司))、EclipseTM Dark Quencher(Epoch Biosciences公司)等，但不限定於此等。
「保溫」意指在某特定溫度下放置試樣。熱傳導之手段可列舉水浴、空氣浴、金屬浴等，但不限定於此等。
融解溫度(Tm)意指加熱雙股DNA之溶液時，DNA分子之1/2解離成為單股時之溫度。本發明中係以50mM Na+濃度(Na+=50×10-3)與0.5mM寡核苷酸濃度(Ct=0.5×10-6)之值，藉由最接近鹼基對法(Nearest Neighbor method)之以下計算式來算出(Nucl.Acids Res.(1990)18(21)：6409-6412)。
Tm={(1000△H)/(-10.8+△S+Rln(Ct/4))}-273.15+16.6log[Na+]
此處，△H為雜交中之最接近焓變化之合計[kcal/mol]、△S為雜交中之最接近熵變化之合計[cal/mol．K]、R為氣體常數(1.987cal/deg．mol)、Ct表示寡核苷酸之合計莫耳濃度[mol/l]、及Na+表示莫耳濃度[mol/l]。
融解溫度(Tm)係隨著寡核苷酸之鹼基序列及其長度而變化，鳥嘌呤及胞嘧啶之含量愈多，其長度愈長，融解溫度(Tm)愈高。因此，雖藉由鹼基序列及其長度來決定黏著溫度，但藉由使反應溶液中含有融解溫度調整劑，亦可調整融解溫度。
核酸放大法所用之融解溫度調整劑的例子，可列舉甲 醯胺、苄鹼(N,N,N，-三甲基甘胺酸)、脯胺酸、二甲基亞碸、三甲基胺N-氧化物、及四烷基銨鹽等。
「螢光標誌引子或探針(以下、螢光標誌引子/探針)」意指「螢光劑」所結合之「寡核苷酸」，為與目標核酸具有互補性者。於不放大目標核酸之態樣中，僅作為「探針」使用，但在放大目標核酸之態樣中，可作為「引子」使用。「螢光標誌引子/探針」可使用螢光劑所結合之(單)核苷酸、例如Alexa FluorTM核苷酸(Invitrogen)來合成，亦可使螢光劑與合成的寡核苷酸之5’末端或3’末端結合。惟，使用「螢光標誌引子/探針」進行目標核酸之放大時，亦即，以作為「引子」之態樣使用時，螢光劑不可與3’末端結合。更佳為螢光劑與5’末端結合之「寡核苷酸」。「螢光標誌引子/探針」之鹼基序列長度雖無特殊限定，但為15base以上、較佳為20base以上、更佳為25base以上。進一步地，「螢光標誌引子/探針」之鹼基序列長度，考慮與目標核酸之黏著、及其後之放大反應溫度條件，較佳為設計成「螢光標誌引子/探針」之融解溫度(Tm)成為30~70℃、較佳成為50~65℃。
「淬熄劑標誌探針」意指「消光劑」所結合之「寡核苷酸」。「淬熄劑標誌探針」可使用消光劑所結合之核苷酸來合成、亦可使消光劑與合成之寡核苷酸的5’末端或3’末端結合，但較佳為在「淬熄劑標誌探針」與「螢光標誌引子/探針」黏著後，使消光劑與「螢光標誌引子/探針」之螢光劑的放出光(螢光)被消光劑有效地消去的位置 結合。於伴隨有目標核酸之放大反應的態樣中，較佳為將「淬熄劑標誌探針」之寡核苷酸3’末端以不引起伸長反應的方式阻斷。更佳為，「螢光標誌引子/探針」在5’末端與螢光劑結合之「寡核苷酸」的情況時，成為對應於3’末端與消光劑結合之「寡核苷酸」的「淬熄劑標誌探針」為佳。
「淬熄劑標誌探針」之寡核苷酸鹼基序列係與「螢光標誌引子/探針」之鹼基序列具有互補性，且其長度較佳為比螢光標誌引子/探針短2、3、4、5、6、7、8、9、10鹼基或其以上之序列，更佳為該較短的現象係由「淬熄劑標誌探針」之5’末端鹼基相較於「螢光標誌引子/探針」之3’端鹼基為少所造成。或著亦可使用即使鹼基序列之長度相同，亦具有具Tm值下降效果之修飾鹼基的核苷酸，藉以實質地使「淬熄劑標誌探針」之融解溫度(Tm)比「螢光標誌引子/探針」之融解溫度(Tm)低。具有具Tm值下降效果之修飾鹼基的核苷酸，係指例如具有肌苷之核苷酸。更佳為以成為室溫(例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)以上的方式來設計「淬熄劑標誌探針」寡核苷酸之鹼基序列。為了滿足該條件，寡核苷酸長度較佳為7鹼基以上、更佳為9鹼基以上。
本發明中，螢光標誌引子/探針與淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)必須相異，淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)比螢光標誌引子/探針之融解溫度(Tm)低。更具體而言，較佳為低5℃、更佳為低10℃、又更佳為低15℃ 、又更佳為低20℃、又更佳為低30℃、又更佳為低35℃、又再更佳為低40℃或45℃以上。
「添加」於試樣中，意指於試樣中添加螢光標誌引子/探針、淬熄劑標誌探針等試藥的態樣，此外亦包含於該試藥中添加試樣之態樣。
「螢光標誌引子/探針」與「淬熄劑標誌探針」添加時的使用比率，以莫耳分子數之比計，為1：1、1：2或1：10以上即可，較佳為1：2以上即可。
「固定於固相面」意指反應中，使「螢光標誌引子/探針」不平均分布。具體而言係指於玻璃、耐綸膜、半導體晶圓、微珠等表面固定「螢光標誌引子/探針」，但不限定於此。固定方法可使用公知技術直接將「螢光標誌引子/探針」之寡核苷酸部位固定於玻璃等之表面、亦可透過生物素-抗生物素等之結合，或透過連結分子而間接地固定。
「使用螢光標誌引子/探針放大目標核酸」意指使用螢光標誌引子/探針作為引子，藉由聚合酶來進行伸長反應，以放大目標核酸。再者，所屬技術領域中具有通常知識者當可得知，在本發明之包含放大目標核酸之步驟的態樣中，當然可將其以外之目標核酸放大所必要之試藥、例如引子或聚合酶、dNTP等，依所實施之放大方法加入「螢光標誌引子/探針」及「淬熄劑標誌探針」與試樣中。
「在等溫條件進行放大」意指於保持在一定溫度之狀態下放大目標核酸。作為等溫放大法，可列舉Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids(ICAN)法、SDA法、RCA法、SMart Amplification Process version 2(SMAP2)法(Nature Methods 4：257-262(2007))及LAMP法。
「UV照射」意指照射波長為10nm-400nm程度之電磁波，但該電磁波亦可不經嚴密的波長控制，只要係螢光劑之激發光即可。
「目視判定」係指在短時間、例如UV照射起5秒、15秒、30秒、或1分鐘以內以肉眼進行判定有無其螢光劑之放出光。隨情況不同亦可與色譜比較。
「目視判定」時，「UV照射」之激發係最適合，可同時檢測多項目至3~4項目左右為止，「螢光檢測機器」之測定時，亦可使用光二極體陣列檢測器等，進行更多項目之同時檢測。
「套組」意指用於本發明之檢測方法的試藥。於「螢光標誌引子/探針」或「淬熄劑標誌探針」以外，亦可包含檢測所必要之試藥、道具及器具等。進一步亦可包含該「套組」之使用說明書或色譜。又，在伴隨有核酸放大之態樣中，亦可進一步包含核酸放大所必要之試藥。
本發明之檢測方法中，在螢光標誌引子/探針之融解溫度(Tm)以下、且在比淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)高之溫度下靜置，使目標核酸與螢光標誌引子/探針優先黏著，接著在淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)以下的溫度下靜置，使未與目標核酸黏著之螢光標誌引子/ 探針與淬熄劑標誌探針黏著，藉以使未與目標核酸黏著之螢光標誌引子探針之螢光劑與淬熄劑標誌探針之消光劑鄰接，接著將試樣保持在淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)以下的溫度下，計測與目標核酸結合之螢光標誌引子探針之螢光，藉以檢測目標核酸。
本發明之檢測方法，其特徵在於使「螢光標誌引子/探針」與「淬熄劑標誌探針」之融解溫度(Tm)錯開，控制此等之融解溫度與反應溫度的關係，使「螢光標誌引子/探針」與「目標核酸」優先於「螢光標誌引子/探針」與「淬熄劑標誌探針」來黏著，藉以檢測「目標核酸」。而且，不需要於放大反應後添加檢測所必要的螢光標誌引子/探針與淬熄劑標誌探針，因此其操作相較於習知技術為簡單、且亦可防止放大產物之擴散所造成的污染。
以下詳細揭示本發明之各態樣，但本發明不限定於此等。
本發明之最基本的態樣係如圖1所示。最初若添加「螢光標誌引子/探針」及「淬熄劑標誌探針」，以後可在不追加任何試藥之下，以封閉系檢測目標核酸。假設將螢光標誌引子/探針之Tm值設為65℃、將淬熄劑標誌探針之Tm值設為35℃、將反應溫度設為60℃(步驟1)時，螢光標誌引子/探針雖與目標核酸結合，但淬熄劑標誌探針不結合。之後，將淬熄劑標誌探針設為Tm值以下(30℃)時(步驟2)，會發生不與目標核酸結合之「螢光標誌引子/探針」與「淬熄劑標誌探針」之黏著。藉由UV 照射，發出放出光(螢光)者僅有與「目標核酸」結合之「螢光標誌引子/探針」之螢光劑，由結合於「淬熄劑標誌探針」之「螢光標誌引子/探針」的螢光劑所發出之螢光則無法檢測。因此，試樣之螢光強度係依賴於試樣中之「目標核酸」量。
本發明中包含放大目標核酸之步驟的態樣係如圖2所示。如習知技術之日本專利3016759號公報或日本專利3999653號公報所記載之核酸放大檢測法，於PCR之黏著階段時亦混有螢光標誌探針與目標核酸或消光標誌探針黏著者，因此螢光強度雖與放大之目標核酸量成比例，但並非顯示放大之目標核酸量本身，又，螢光標誌探針與消光標誌探針亦可能會阻礙後續之伸長反應，故缺乏精確性。另一方面，圖2之本態樣時，因為螢光標誌引子/探針係被併入放大之雙股產物中，可更精確地僅檢測最終所放大之目標核酸的量。
將本發明應用於所謂DNA晶片或微陣列之態樣如圖3所示。
圖3A係於探針之態樣(不包含放大目標核酸之步驟的態樣)中使用螢光標誌引子/探針之示意圖。此時，螢光標誌引子/探針之寡核苷酸的3’末端亦可固定。
固定化之態樣之例子如圖3B所示。
(1)螢光標誌引子/探針之寡核苷酸的3’末端係經固定化。此時，對應之淬熄劑標誌探針較佳為於5’末端與消光劑結合。
(2)螢光標誌引子/探針之寡核苷酸的3’末端透過所結合之螢光劑而經固定化。此時，對應之淬熄劑標誌探針較佳為於5’末端與消光劑結合。
(3)螢光標誌引子/探針之寡核苷酸的5’末端與螢光劑結合，且3’末端經固定化。此時，對應之淬熄劑標誌探針較佳為於3’末端與消光劑結合。
圖3C係包含目標核酸之放大步驟的態樣。此時，較佳為螢光標誌引子/探針之寡核苷酸的3’區域不經固定。包含核酸放大之步驟的態樣時，目標核酸之螢光標誌引子/探針之結合會更安定。
結合於微陣列之核酸係以放射性同位素、螢光劑等予以標誌，與未標誌之經固定化的寡核苷酸等黏著。之後，將未結合之標誌核酸藉由洗淨去除後，可檢測藉由黏著而結合於微陣列之核酸的標誌，藉以檢測核酸。但是，如參照圖3之態樣可知，藉由使用結合於固相面之螢光標誌引子/探針，不需進行試樣全體之螢光標誌化，且不需要洗淨之步驟，因此可更簡便地檢測目標核酸。
本發明藉由使用複數種類之螢光標誌引子/探針、亦即與以發出各相異放出光之螢光劑標誌之複數種類的螢光標誌引子/探針對應之淬熄劑標誌探針，可同時檢測複數種類之目標核酸。螢光標誌引子/探針之螢光劑藉由吸收來自外部的能量，使電子激發，當其回到基底狀態時，多餘之能量係作為電磁波(放出光)而放出。激發狀態與基底狀態之能階的差係隨著其螢光劑而有特異性，因此即使 相異之螢光劑由外部同時吸收能量，各螢光劑係發出螢光劑特異性之波長的放出光(電磁波)、亦即「不同色之光」。此放出光係僅藉由對應之淬熄劑標誌探針之消光劑而被吸收消光，不受其他淬熄劑標誌探針之影響。因此，若著眼於螢光劑之放出光的「波長」、亦即「色」，則能夠同時檢測複數種類之目標核酸。若使用分光光度計等，則可各檢測該等之放出光，於肉眼亦可作為混合色或中間色來檢測。
本發明之檢測方法可應用於各種細菌、真菌、病毒等病原體之檢測。細菌可列舉Mycoplasma pneumoniae、退伍軍人桿菌屬菌、沙門氏桿菌屬菌、腸管出血性大腸菌、結核菌、曲狀桿菌(Campylobacter jejuni及Campylobacter coli)、百日咳菌(Bordetella pertussis)等。真菌可列舉念珠菌屬菌(Candida)、麴菌屬菌(Aspergillus)、隱球菌屬菌(Cryptococcus)等。病毒可列舉流行性感冒A(H1N1)pdm病毒、流行性感冒A(H1N1)病毒、H5亞型流行性感冒病毒、SARS冠狀病毒、單純皰疹病毒1型及2型(Herpes Simplex Virus type1/2；HSV-1/2)、以及諾羅病毒Genogroup I(GI)及Genogroup II(GII)等。其他，作為寄生動物，可列舉瘧原蟲、隱孢子蟲原蟲、梨形鞭毛蟲原蟲等。又，不僅檢測病原體本身，亦可檢測病原性相關聯之基因，例如毒素基因(例如腸毒素(verotoxin；以下VT)基因1型(VT1)及2型(VT2))或藥劑耐性基因、或對宿主之感 染(侵入．固著．增殖)相關聯之基因等。進一步地亦可應用於Cytochrome基因等之單鹼基多型(Single Nucleotide Polymorphism；SNP)之檢測、或用於牛胚性判別之判定的雄特異性基因序列之檢測等。為了檢測此等，首先設計對檢測對象之特異性核酸序列具有互補性之寡核苷酸序列的螢光標誌引子/探針，接著設計對應之淬熄劑標誌探針，來實施本發明之檢測方法即可。
特別是檢測本發明之複數種類之目標核酸的態樣，係有效於一次檢測識別人類流行性感冒病毒(A型(包含H1N1、H3N2、H1N2、H2N2、H9N1、H5N1)、B型及C型)或肝炎病毒(A型、B型及C型)等之近似種病毒。又，亦有效於一次檢測識別性感染症之原因的淋菌、梅毒螺旋體菌、砂眼披衣菌等之有無。進一步地，亦有效於一次檢測識別感染性胃腸炎之原因的諾羅病毒或輪狀病毒等之有無。或亦有效於一次檢測識別作為輸血用血液之篩選檢査的愛滋病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)及C型肝炎病毒(HCV)之有無。
本發明之套組係用以將存在於試樣中之1種類以上的目標核酸放大、或不經放大而檢測所用用之目標核酸檢測用套組，且係包含：1種類或複數種類之以螢光劑標誌之具有與目標核酸之互補性的寡核苷酸之螢光標誌引子/探針、與以消光劑標誌之具有與該螢光標誌引子/探針之互補性，且融解溫度(Tm)比該螢光標誌引子/探針更低之寡核苷酸的淬熄劑標誌探針之組合之目標核酸檢測用套 組。
前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸的鹼基長度，為比前述螢光標誌引子/探針之寡核苷酸的鹼基長度短、或者可列舉前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸包含修飾鹼基者。
前述螢光標誌引子/探針亦可固定於固相面。又，本發明之套組可含有用以放大目標核酸之其他試藥，且可依需要任意含有通常之核酸檢測所用之其他試藥。
以下藉由實施例具體地說明本發明，但本發明不限定於此等實施例。
[實施例] 實施例1. Tm值影響確認 (1)測定模板
製造將砂眼披衣菌之隱性質體(cryptic plasmid)區域的一部分(序列編號21)次選殖之質體DNA(以下CT質體)作為測定用模板。
(2)引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之合成
以砂眼披衣菌之隱性質體區域為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的LAMP反應用之引子。所設計之引子當中，將使LB之5’末端以FAM螢光標誌者作為螢光標誌引子/探針，將於互補鏈之3’末端標誌BHQ1者作為淬熄劑標誌探針。又，對於淬熄劑標誌探針，亦設計將5’末端側刪除3~10鹼基，使Tm值下降之淬熄劑標誌探 針。引子之合成係委託Operon Biotechnology公司，對於螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針，係委託日本Bioservice公司。淬熄劑標誌探針之Tm值係顯示最接近鹼基對法(Nearest Neighbor method)之計算值。
<砂眼披衣菌引子>
CT-FIP：5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列編號1)
CT-BIP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號2)
CT-F3：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號3)
CT-B3：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號4)
CT-LF：5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列編號5)
CT-LB：5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號6)
<砂眼披衣菌螢光標誌引子/探針>
FAM-CT-LB：5’-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號7)
<砂眼披衣菌 淬熄劑標誌探針>
CT-LBc-Q1-0：5’-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號8)Tm=60.6℃
CT-LBc-Q1-3：5’-CTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號9)Tm=53.9℃
CT-LBc-Q1-5：5’-TCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號10)Tm=49.7℃
CT-LBc-Q1-6：5’-CGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號11)Tm=46.5℃
CT-LBc-Q1-7：5’-GTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號12)Tm=37.5℃
CT-LBc-Q1-9：5’-AACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號13)Tm=32.6℃
CT-LBc-Q1-10：5’-ACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號14)Tm=26.7℃
(3)LAMP反應試藥組成及濃度
LAMP最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。淬熄劑標誌探針係以未添加作為對照組，而添加CT-LBc-Q1-0(序列編號8)、CT-LBc-Q1-3(序列編號9)、CT-LBc-Q1-5(序列編號10)、CT-LBc-Q1-6(序列編號11)、CT-LBc-Q1-7(序列編號12)、CT-LBc-Q1-9(序列編號13)或CT-LBc-Q1-10(序列編號14)之任一者。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM dATP(GeneACT公司)
．2.1mM dCTP(GeneACT公司)
．2.1mM dGTP(GeneACT公司)
．2.1mM dTTP(GeneACT公司)
．38.4U Bst DNA Polymerase(New England Biolab公司)
．引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針
0.8μM CT-FIP(序列編號1)
0.8μM CT-BIP(序列編號2)
0.1μM CT-F3(序列編號3)
0.1μM CT-B3(序列編號4)
0.4μM CT-LF(序列編號5)
0.4μM FAM-CT-LB(序列編號7)
0.8μM CT-LBc-Q1-0(序列編號8)、CT-LBc-Q1-3(序列編號9)、CT-LBc-Q1-5(序列編號10)、CT-LBc-Q1-6(序列編號11)、CT-LBc-Q1-7(序列編號12)、CT-LBc-Q1-9(序列編號13)或CT-LBc-Q1-10(序列編號14)
(4)放大
將蒸餾水(DW)或CT質體104複本添加於1反應中，使用即時濁度測定裝置LA-320C(Teramecs公司)，進行65℃、120分鐘放大反應。
(5)判定
以LA-320C進行放大反應(LA-320C中，核酸之放大反應係藉由其副產物焦磷酸鎂之生成所造成之吸光度的變化、亦即濁度之變化來監測。Tt值：濁度測定數據之演算值由反應開始到達指定判定值之時間、濁度曲線：濁度之即時測定數據圖)之確認，同時對放大後反應管照射UV，以發出綠色螢光(FAM)者為陽性、以未觀察到螢光者為陰性。
不使用淬熄劑標誌探針時，於20.7分鐘觀察到CT質體104複本之放大。相對於此，添加淬熄劑標誌探針者，藉由淬熄劑標誌探針放大的時間相異，CT-LBc-Q1-0(序列編號8)為92.4分(+71.7分)、CT-LBc-Q1-3(序列編號9)為41.5分(+20.8分)、CT-LBc-Q1-5(序列編號10)為27.8分(+7.1分)、CT-LBc-Q1-6(序列編號11)為25.5分(+4.8分)、CT-LBc-Q1-7(序列編號12)為22.8分(+2.1分)、CT-LBc-Q1-9(序列編號13)為20.7分(+0.0分)、CT-LBc-Q1-10(序列編號14)為20.6分(-0.1分)。又，不管使用何種淬熄劑標誌探針，均在添加有CT質體之管中確認了來自FAM之螢光即綠 色，於添加了DW之管中無法確認到螢光(表1)。
「Tt(DW)」表示添加DW、「Tt(CT)」表示將CT質體104複本添加於1反應而進行反應時之Tt值。
不添加CT-LBc-Q1時，即使添加DW，螢光標誌亦不被淬熄，因此可確認到螢光。添加CT-LBc-Q1(Q1-0)者，均在添加DW時即消光，又，添加CT質體者，不受CT-LBc-Q1之Tm值影響而可確認到螢光。
如[表1]所示，淬熄劑標誌探針之Tm值愈大，放大時間愈延遲，但Tm值在32.6℃以下時其影響就消失。因此暗示淬熄劑標誌探針之Tm較佳為32.6℃以下。
實施例2. LAMP法之放大後添加淬熄劑標誌探針情況 (1)測定模板
製造將砂眼披衣菌之隱性質體區域的一部分(序列編號21)次選殖之質體DNA(以下稱為CT質體)作為測定用模板。
(2)引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之合成
以砂眼披衣菌之隱性質體區域為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的引子。設計之引子當中，將使LB之5’末端以FAM螢光標誌者作為螢光標誌引子/探針，將於互補鏈之3’末端標誌BHQ1者作為淬熄劑標誌探針。引子合成係委託Operon Biotechnology公司、關於螢光標誌引子及淬熄劑標誌探針則委託日本Bioservice公司。
<砂眼披衣菌引子>
CT-FIP：5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列編號1)
CT-BIP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號2)
CT-F3：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號3)
CT-B3：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號4)
CT-LF：5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列編號5)
CT-LB：5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號6)
<砂眼披衣菌 螢光標誌引子>
FAM-CT-LB：5’-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號7)
<砂眼披衣菌 Quencher標誌探針>
CT-LBc-Q1-0：5’-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號8)
(3)LAMP反應試藥組成及濃度
LAMP最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM dATP(GeneACT公司)
．2.1mM dCTP(GeneACT公司)
．2.1mM dGTP(GeneACT公司)
．2.1mM dTTP(GeneACT公司)
．38.4U Bst DNA Polymerase(New England Biolab公司)
．引子及螢光標誌引子/探針
0.8μM CT-FIP(序列編號1)
0.8μM CT-BIP(序列編號2)
0.1μM CT-F3(序列編號3)
0.1μM CT-B3(序列編號4)
0.4μM CT-LF(序列編號5)
0.4μM FAM-CT-LB(序列編號7)
又，放大反應後添加以下試藥。
．淬熄劑標誌探針
0.8μM CT-LBc-Q1-0(序列編號8)
(4)放大
將DW或CT質體104複本添加於1反應中，使用LA-320C，進行65℃、120分鐘放大反應。
(5)判定
與實施例1同樣地以LA-320C進行放大反應之確認(表2、圖4)。
添加DW之反應管中，未檢出Tt值，無觀察到濁度上昇。另一方面，添加了CT質體之反應管，確認了Tt值為18.7分、及濁度之上昇。由該等可確認只有包含CT質體亦即目標核酸之反應管中，會發生放大反應。
對於各反應管之螢光，對添加DW之反應管(Tube No.1)及添加CT質體之反應管(Tube No.2)一起檢測螢光(圖5)。接著，於室溫在各反應管中添加CT-LBc-Q1-0(序列編號8)時，添加DW之反應管(Tube No.3)被消光。相對於此，添加CT質體之反應管(Tube No. 4)保持有螢光。
實施例3. 使用了LAMP法之砂眼披衣菌與淋菌的同時放大檢測方法 (1)測定模板
製造將砂眼披衣菌之隱性質體區域的一部分(序列編號21)次選殖之質體DNA(以下稱為CT質體)作為內部標準物質模板。又，製造將淋菌mtrA區域之一部分(序列編號32)次選殖之質體DNA(以下稱為NG質體)作為目標核酸模板。
(2)砂眼披衣菌引子、TAMRA標誌圈環引子(螢光標誌引子/探針)及BHQ2標誌淬熄探針(淬熄劑標誌探針)之合成
以砂眼披衣菌之隱性質體區域為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的引子。引子之合成係委託Operon Biotechnology公司。又，TAMRA標誌圈環引子及BHQ2標誌淬熄探針之合成係委託J-Bios公司。
<砂眼披衣菌引子>
CT-FIP：5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列編號1)
CT-BIP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號2)
CT-F3：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號3)
CT-B3：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號4)
CT-LB：5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號6)
<砂眼披衣菌 TAMRA標誌圈環引子>
TAM-CT-LF：5’-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列編號15)
<砂眼披衣菌 BHQ2標誌淬熄探針>
CT-LFc-Q2：5’-GGGGTTATCTT-(BHQ2)-3’(序列編號16)
(3)淋菌引子、FAM標誌圈環引子(螢光標誌引子/探針)及BHQ1標誌淬熄探針(淬熄劑標誌探針)之合成
以淋菌之mtrA區域為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的引子。引子之合成係委託Operon Biotechnology公司。又，FAM標誌圈環引子及BHQ1標誌淬熄探針之合成係委託J-Bios公司。
<淋菌引子>
NG-FIP：5’-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’(序列編號17)
NG-BIP：5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3’(序列編號18)
NG-F3：5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’(序列編號19)
NG-B3：5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’(序列編號20)
NG-LF：5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’(序列編號22)
<淋菌 FAM標誌圈環引子>
FAM-NG-LB：5’-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’(序列編號23)
<淋菌 BHQ1標誌淬熄探針>
NG-LBc-Q1：5’-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3’(序列編號24)
(4)LAMP反應試藥組成及濃度
LAMP最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM ATP
．2.1mM CTP
．2.1mM GTP
．2.1mM TTP
．38.4U Bst DNA聚合酶(New England Biolab公司)
．砂眼披衣菌引子、TAMRA標誌圈環引子及BHQ2標誌淬熄探針
0.8μM CT-FIP(序列編號1)及CT-BIP(序列編號2)
0.1μM CT-F3(序列編號3)及CT-B3(序列編號4)
0.4μM CT-LB(序列編號6)及TAM-CT-LF(序列編號15)
0.8μM CT-LFc-Q2(序列編號16)
．淋菌引子、FAM標誌圈環引子及BHQ1標誌淬熄探針
0.8μM NG-FIP(序列編號17)及NG-BIP(序列編號18)
0.1μM NG-F3(序列編號19)及NG-B3(序列編號20)
0.4μM NG-LF(序列編號22)及FAM-NG-LB(序列編號23)
0.8μM NG-LBc-Q1(序列編號24)
(5)放大
添加DW、或CT質體104複本、或NG質體104複本、或CT質體104複本及NG質體104複本，使用LA-320C，進行65℃、60分鐘放大反應。
(6)判定
來自砂眼披衣菌之核酸(CT)被放大時，在UV照射下可目視到紅色(TAMRA)，來自淋菌之核酸(NG)被放大時可目視到綠色(FAM)。上述放大反應後，照射UV確認螢光之結果(圖6)，DW(陰性檢體)為無色(Tube No.1-4)；淋菌陽性檢體可目視到綠色(Tube No.5-8)；砂眼披衣菌陽性檢體可目視到紅色(Tube No.9-12)；兩陽性檢體可目視到黃色(紅色+綠色)(Tube No.13-16)。
實施例4. 砂眼披衣菌、淋菌及人工核酸之多項目同時放大檢測 (1)測定模板
製造將砂眼披衣菌之隱性質體區域的一部分(序列編號21)次選殖之質體DNA(以下CT質體)、將淋菌之mtrA區域之一部分(序列編號32)次選殖之質體DNA(以下NG質體)、將人工核酸序列(序列編號33)次選殖之質體DNA(以下ARITA2質體)作為測定用模板。
(2)引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之合成
以砂眼披衣菌之隱性質體區域、淋菌之mtrA區域及人工核酸序列為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的LAMP反應用之引子。設計之引子當中，將使砂眼披衣菌LF之5’末端以TAMRA、使淋菌LB之5’末端以FAM、使人工核酸序列LB之5’末端以Alexa FluorTM 350(以下Alexa350)進行螢光標誌者作為螢光標誌引子，將於砂眼披衣菌LF互補鏈之3’末端標誌BHQ2、於淋菌LB互補鏈之3’末端標誌BHQ1、於人工核酸序列LB互補鏈之3’末端標誌BHQ0者作為淬熄劑標誌探針。引子之合成係委託Operon Biotechnology公司、關於螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針係委託日本Bioservice公司。
<砂眼披衣菌引子>
CT-FIP：5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列編號1)
CT-BIP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號2)
CT-F3：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號3)
CT-B3：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號4)
CT-LB：5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號6)
<砂眼披衣菌 螢光標誌引子/探針>
TAM-CT-LF：5’-(TAMRA)-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列編號15)
<砂眼披衣菌 淬熄劑標誌探針>
CT-LFc-Q2：5’-ACGTGCGGGGTTATCTT-(BHQ2)-3’(序列編號16)
<淋菌 引子>
NG-FIP：5’- CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’(序列編號17)
NG-BIP：5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3’(序列編號18)
NG-F3：5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’(序列編號19)
NG-B3：5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’(序列編號20)
NG-LF：5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’(序列編號22)
<淋菌 螢光標誌引子/探針>
FAM-NG-LB：5’-(FAM)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’(序列編號23)
<淋菌 淬熄劑標誌探針>
NG-LBc-Q1：5’-CGTTTTGTCG-(BHQ1)-3’(序列編號24)
<人工核酸 引子>
ARITA2-FIP：5’-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3’(序列編號25)
ARITA2-BIP：5’-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3’(序列編號26)
ARITA2-F3：5’-GGACAATCGAAGCCAGAA-3’(序列編號27)
ARITA2-B3：5’-ATCACGGATCGTATGTGG-3’(序列編號28)
ARITA2-LF：5’-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3’(序列編號29)
<人工核酸 螢光標誌引子/探針>
Ale-ARITA2-LB：5’-(Alexa350)-AACGATCGCACTAAGCAT-3’(序列編號30)
<人工核酸 淬熄劑標誌探針>
ARITA2-LBc-Q0：5’-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ0)-3’(序列編號31)
(3)LAMP反應試藥組成及濃度
LAMP最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM dATP(GeneACT公司)
．2.1mM dCTP(GeneACT公司)
．2.1mM dGTP(GeneACT公司)
．2.1mM dTTP(GeneACT公司)
．38.4U Bst DNA Polymerase(New England Biolab公司)
．引子及螢光標誌引子/探針
0.6μM CT-FIP(序列編號1)、NG-FIP(序列編號17)
0.6μM CT-BIP(序列編號2)、NG-BIP(序列編號18)
0.1μM CT-F3(序列編號3)、NG-F3(序列編號19)
0.1μM CT-B3(序列編號4)、NG-B3(序列編號20)
0.3μM CT-LB(序列編號6)、NG-LF(序列編號22)
0.1μM ARITA2-FIP(序列編號25)、ARITA2-BIP(序列編號26)
0.02μM ARITA2-F3(序列編號27)、ARITA2-B3(序列編號28)
0.1μM ARITA2-LF(序列編號29)
0.4μM TAM-CT-LF(序列編號15)、FAM-NG-LB(序列編號23)、Ale-ARITA2-LB(序列編號30)
又，放大反應後係添加以下之試藥。
．淬熄劑標誌探針
0.8μM CT-LFc-Q2(序列編號16)、NG-LBc-Q1(序列編號24)、ARITA2-LBc-Q0(序列編號31)
(4)放大
將DW、CT質體104複本、NG質體104複本或ARITA2質體102複本當中之1種或複數種添加於1反應中，使用LA-320C，進行65℃、120分鐘放大反應。
(5)判定
與實施例1同樣地，以LA-320C進行放大反應之確認(表3、圖7)。
添加了DW之(CT、NG及ARITA2質體全部)之反應管中，未檢測到Tt值，未觀察到濁度上昇。另一方面，添加了CT質體、NG質體或ARITA2質體1種、2種組合、或3種全部之反應管中，分別得到Tt值，又，確認 有濁度之上昇。由該等可確認僅有含有CT質體、NG質體或ARITA2質體1種或複數種之反應管中會發生。於放大結束後之反應管中添加CT-LFc-Q2(序列編號16)、NG-LBc-Q1(序列編號24)、ARITA2-LBc-Q0(序列編號31)0.8μM，95℃加熱5分後，冷卻至室溫後，照射UV來觀察螢光(圖8)。
添加了DW之反應管中無放大產物，因此無法確認到有螢光(Tube No.1)。添加CT質體之反應管中，確認有紅色螢光(Tube No.2)。同樣地，NG質體添加反應管中可確認有綠色螢光(Tube No.3)、ARITA2質體添加反應管中可確認有藍色螢光(Tube No.4)。添加二種質體之反應管中係顯示各自螢光色之中間色，添加CT質體與NG質體之反應管中可確認黃色螢光(Tube No.5)、添加CT質體與ARITA2質體之反應管中可確認紫色螢光(Tube No.6)、添加NG質體與ARITA2質體之反應管中可確認水藍色螢光(Tube No.7)。又，添加三種質體之反應管中可確認白色螢光(Tube No.8)。
實施例5. 使用了探針之目標核酸(砂眼披衣菌)之檢測 (1)試樣之調製
試樣係使用反應後之LAMP反應液。關於LAMP反應條件，將各試藥組成與終濃度如以下所示，作為模板，係以每一反應104複本的方式來添加CT質體，或者添加DW以取代模板，使LAMP最終反應溶液為30μL，使用 LA-320C，進行65℃、40分鐘放大反應。又，將所得之反應液在80℃進行5分鐘加熱處理藉以進行Bst DNA Polymerase之失活處理，使得後續進行之螢光標誌引子/探針之檢測時不引起放大反應。如此方式所得之LAMP反應液，亦即試樣當中，以使CT質體為模板而調製者為陽性檢體、以添加DW而調製者為陰性檢體。
<LAMP反應試藥組成及終濃度>
LAMP最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM dATP(GeneACT公司)
．2.1mM dCTP(GeneACT公司)
．2.1mM dGTP(GeneACT公司)
．2.1mM dTTP(GeneACT公司)
．38.4U Bst DNA Polymerase(New England Biolab公司)
<砂眼披衣菌引子>
．0.8μM CT-FIP：5’- CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列編號1)
．0.8μM CT-BIP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號2)
．0.1μM CT-F3：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號3)
．0.1μM CT-B3：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號4)
．0.4μM CT-FL：5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列編號5)
．0.4μM CT-BL：5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號6)
(2)螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之合成
所設計之引子當中，將使BL之5’末端以FAM進行螢光標誌者作為螢光標誌引子/探針、以於互補鏈之3’末端標誌BHQ1者作為淬熄劑標誌探針。再者，螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針係委託日本Bioservice公司。
<砂眼披衣菌 螢光標誌引子/探針>
FAM-CT-BL：5’-(FAM)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號7)
<砂眼披衣菌 淬熄劑標誌探針>
CT-BLc-Q1-0：5’-TGTCTTCGTAACTCGCTCC-(BHQ1)-3’(序列編號8)
(3)螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針對試樣之添加
分別對於(1)中調製之陽性檢體與陰性檢體添加0.4μM螢光標誌引子/探針(序列編號7)，進行95℃、5分鐘加熱處理，以進行模板變性。接著冷卻至室溫，使模板與螢光標誌引子黏著。
冷卻至室溫後，添加0.8μM淬熄劑標誌探針(序列編號8)並攪拌後，於UV下確認其螢光(圖9)。
(4)判定
陽性檢體、陰性檢體，均在螢光標誌引子/探針之添加前無法檢測到螢光(Tube No.1,2)，螢光標誌引子/探針之FAM-CT-BL(序列編號7)的添加後可檢測到螢光(Tube No.3,4)。將此等在95℃加熱5分後，冷卻至室溫，添加淬熄劑標誌探針之CT-BLc-Q1-0(序列編號8)後，陰性檢體中因為不存在LAMP產物，故FAM-CT-BL(序列編號7)與CT-BLc-Q1-0(序列編號8)結合，因而螢光被消光(淬熄，Quenching)(Tube No.5)。相對於此，陽性檢體中，以CT質體為模板而被放大之LAMP產物與FAM-CT-BL(序列編號7)結合，且不與CT-BLc-Q1-0(序列編號8)，因此保持螢光(Tube No.6)。
因此實施例5顯示圖1所示之本案發明的最基本的態樣係能夠實施。
使用了實施例6. SMart Amplification Process version 2(以下、SMAP2)法之砂眼披衣菌的放大檢測(LAMP法以外之等溫放大法SMAP2法中添加淬熄劑標誌探針時的核酸放大與放大產物之檢測) (1)測定模板
製造將砂眼披衣菌之隱性質體區域的一部分(序列編號21)次選殖之質體DNA(以下稱為CT質體)作為作為測定用模板。
(2)引子、螢光標誌引子及淬熄劑標誌探針之合成
以砂眼披衣菌之隱性質體區域的一部分作為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的SMAP2反應用之引子(FP、TP、OP1、OP2及BP引子共5條)。設計之引子當中，將由TP引子而會黏著於放大產物中產生之圈環部分的BP引子之5’末端以Alexa350進行螢光標誌者作為螢光標誌引子/探針。進一步，將於BP引子之互補鏈之3’末端標誌BHQ0者作為淬熄劑標誌探針。引子之合成係委託Operon Biotechnology公司、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針係委託日本Bioservice公司。
<砂眼披衣菌 SMAP2引子>
CT-FP：5’-TTTATATATATATAAAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’(序列編號34)
CT-TP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號35)
CT-OP1：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號36)
CT-OP2：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號37)
<砂眼披衣菌 螢光標誌引子/探針>
Ale-CT-BP：5’-(Alexa350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號38)
<砂眼披衣菌 淬熄劑標誌探針>
CT-BPc-Q0：5’-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3’(序列編號39)
(3)SMAP2反應試藥組成及濃度
SMAP2最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM dATP(GeneACT公司)
．2.1mM dCTP(GeneACT公司)
．2.1mM dGTP(GeneACT公司)
．2.1mM dTTP(GeneACT公司)
．38.4U Bst DNA Polymerase(New England Biolab公司)
．引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針
1.33μM CT-FP(序列編號34)
1.33μM CT-TP(序列編號35)
0.17μM CT-OP1(序列編號36)
0.17μM CT-OP2(序列編號37)
0.67μM Ale-CT-BP(序列編號38)
1.33μM CT-BPc-Q0(序列編號39)
(4)放大
將DW或CT質體106複本添加於1反應中，使用即時濁度測定裝置LoopampEXIATM(Teramecs公司)，進行65℃、45分鐘放大反應。
(5)判定
以LoopampEXIATM進行放大反應之確認( LoopampEXIATM中，核酸之放大反應係藉由其副產物之焦磷酸鎂生成所致之吸光度變化、亦即濁度的變化來監測。Tt值：濁度測定數據之演算值由反應開始至到達指定之判定值的時間、濁度曲線：濁度之即時測定數據的圖)(表4、圖10)。
添加了DW之反應管中，未檢測到Tt值，未觀察到濁度之上昇。另一方面，添加有CT質體之反應管中，Tt值為23.2分、及確認到濁度之上昇。由此等可確認僅有含有CT質體、亦即目標核酸之反應管中會發生放大反應。
於放大反應結束後之各反應管照射UV以觀察螢光之結果(圖11)，添加了DW之反應管(Tube No.1)中未觀察到螢光，於添加了CT質體之反應管(Tube No.2)中觀察到螢光。
實施例6顯示了本案發明中不僅是LAMP法，即使在各種的核酸之等溫放大反應中亦可實施。
實施例7. 單項目放大、二項目或三項目同時放大反應系 中之螢光波長檢測 (1)測定模板
製造將砂眼披衣菌之隱性質體區域的一部分(序列編號21)次選殖之質體DNA(以下CT質體)、將淋菌之mtrA區域的一部分(序列編號32)次選殖之質體DNA(以下NG質體)、將人工核酸序列(序列編號33)次選殖之質體DNA(以下ARITA2質體)作為作為測定用模板。
(2)引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之合成
以砂眼披衣菌之隱性質體區域、淋菌之mtrA區域及人工核酸序列作為標靶，設計不具有與類緣菌之交叉反應性的LAMP反應用之引子。所設計之引子當中，將使砂眼披衣菌BL之5’末端以Alexa350螢光標誌、將淋菌BL之5’末端以TAMRA螢光標誌、將人工核酸序列BL之5’末端以FAM螢光標誌者作為螢光標誌引子/探針；將於砂眼披衣菌BL互補鏈之3’末端標誌BHQ0、於淋菌BL互補鏈之3’末端邀至BHQ2、於人工核酸序列BL互補鏈之3’末端標誌BHQ1者作為淬熄劑標誌探針。引子之合成係委託Operon Biotechnology公司、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針係委託日本Bioservice公司。
<砂眼披衣菌引子>
CT-FIP：5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC- 3’(序列編號1)
CT-BIP：5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’(序列編號2)
CT-F3：5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’(序列編號3)
CT-B3：5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’(序列編號4)
CT-LF：5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’(序列編號5)
<砂眼披衣菌 螢光標誌引子/探針>
Ale-CT-LB：5’-(Alexa350)-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’(序列編號40)
<砂眼披衣菌 淬熄劑標誌探針>
CT-LBc-Q0：5’-AACTCGCTCC-(BHQ0)-3’(序列編號41)
<淋菌引子>
NG-FIP：5’-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’(序列編號17)
NG-BIP：5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATA TCCAGC-3’(序列編號18)
NG-F3：5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’(序列編號19)
NG-B3：5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’(序列編號20)
NG-LF：5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’(序列編號22)
<淋菌 螢光標誌引子/探針>
TAM-NG-LB：5’-(TAMRA)-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’(序列編號42)
<淋菌 淬熄劑標誌探針>
NG-LBc-Q2：5’-CGTTTTGTCG-(BHQ2)-3’(序列編號43)
<人工核酸 引子>
ARITA2-FIP：5’-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3’(序列編號25)
ARITA2-BIP：5’-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3’(序列編號26)
ARITA2-F3：5’-GGACAATCGAAGCCAGAA-3’(序列 編號27)
ARITA2-B3：5’-ATCACGGATCGTATGTGG-3’(序列編號28)
ARITA2-LF：5’-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3’(序列編號29)
<人工核酸 螢光標誌引子/探針>
FAM-ARITA2-LB：5’-(FAM)-AACGATCGCACTAAGCAT-3’(序列編號44)
<人工核酸 淬熄劑標誌探針>
ARITA2-LBc-Q1：5’-ATGCTTAGTGCGATCGTT-(BHQ1)-3’(序列編號45)
(3)LAMP反應試藥組成及濃度
LAMP最終反應溶液30μL中之各試藥濃度係如成為以下之方式來調製。
．30mM Tris-HCl(pH8.8)
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
．0.15% Tween20
．2.1mM ATP
．2.1mM CTP
．2.1mM GTP
．2.1mM TTP
．38.4U Bst DNA聚合酶(New England Biolab公司)
關於引子，係將以下3種類之引子與螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之組的1種或複數種添加於1反應中。
引子與螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之組的組合，在單項目放大中，係砂眼披衣菌、淋菌、人工核酸3種；2項目同時放大中，係砂眼披衣菌與淋菌、砂眼披衣菌與人工核酸、淋菌與人工核酸3種；3項目同時放大中，係砂眼披衣菌與淋菌與人工核酸1種。
<砂眼披衣菌引子與螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針>
0.67μM CT-FIP(序列編號1)
0.67μM CT-BIP(序列編號2)
0.17μM CT-F3(序列編號3)
0.17μM CT-B3(序列編號4)
0.33μM CT-LF(序列編號5)
0.67μM Ale-CT-LB(序列編號40)
1.33μM CT-LBc-Q0(序列編號41)
<淋菌引子與螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針>
1.20μM NG-FIP(序列編號17)
1.20μM NG-BIP(序列編號18)
0.17μM NG-F3(序列編號19)
0.17μM NG-B3(序列編號20)
0.67μM NG-LF(序列編號22)
0.67μM TAM-NG-LB(序列編號42)
1.33μM NG-LBc-Q2(序列編號43)
<人工核酸 引子與螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針>
0.20μM ARITA2-FIP(序列編號25)
0.20μM ARITA2-BIP(序列編號26)
0.03μM ARITA2-F3(序列編號27)
0.03μM ARITA2-B3(序列編號28)
0.13μM ARITA2-LF(序列編號29)
0.67μM FAM-ARITA2-LB(序列編號44)
1.33μM ARITA2-LBc-Q1(序列編號45)
(4)放大
將DW、CT質體103複本、NG質體103複本或ARITA2質體103複本當中之1種或複數種添加於1反應中，使用LoopampEXIATM進行65℃、45分鐘放大反應。
(5)判定
以LoopampEXIATM進行放大反應之確認。
放大反應結束後，對反應管照射UV，進行螢光之觀 察。
又，將使放大反應後之反應液以稀釋液稀釋100倍者，使用分光螢光光度計RF-5300PC(SHIMADZU公司製)來照射對應於各螢光標誌之激發光，進行螢光波長之掃描。
<稀釋液之組成>
．30mM Tris-HCl pH8.8
．15mM KCl
．15mM(NH4)2SO4
．12mM MgSO4
對應於各螢光標誌之激發光，係使用以下波長。
．Alexa350 350nm
．TAMRA 555nm
．FAM 495nm
1)單項目 砂眼披衣菌之放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(表5由模板CT“-”，可知未檢測到Tt值；由圖12之DW放大曲線，可知濁度無上昇)，且在UV照射下無法確認到螢光(圖13 Tube No.1)，但添加了CT質體之反應管中可觀察到核酸放大(表5模板CT“+”之Tt值13.3分；由圖12之CT放大曲線可知濁度有上昇)、且在UV照射下可 確認有來自Ale-CT-LB(序列編號40)之藍色螢光(圖13 Tube No.2)。於螢光波長亦相同地，照射對應於Alexa350之激發光時，在模板(-)(添加了DW)之反應液中(圖14A)，僅在350nm附近確認到激發光與在398nm附近確認到水的拉曼分光波峰。另一方面，在模板(+)(添加了CT質體)之反應液中(圖14B)，於350nm附近確認到激發光、與在398nm附近確認到水之拉曼分光峰值，此外在443nm附近確認到來自Ale-CT-LB螢光波峰。
2)單項目 淋菌之放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(表6由模板NG“-”可知未檢測到；由圖15之DW的放大曲線，可知濁度無上昇)，且在UV照射下無法確認到螢光(圖16 Tube No.1)，但添加了NG質體之反應管中觀察到核酸放大(表6由模板NG“+”，得知Tt值11.6分；由圖15之NG的放大曲線可知濁度有上昇)，且在UV照射下可確認到來自TAM-NG-LB(序列編號42)之紅色螢光(圖 16 Tube No.2)。於螢光波長亦相同地，照射對應於TAMRA之激發光時，模板(-)(添加DW)之反應液中(圖17A)，在555nm附近僅確認到激發光。另一方面，在模板(+)(添加了NG質體)之反應液中(圖17B)，在555nm附近確認到激發光、與在580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰。
3)單項目 人工核酸之放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(表7由模板ARITA2“-”，可知未檢測到Tt值；由圖18之DW放大曲線可知濁度無上昇)，且於UV照射下無法確認到有螢光(圖19 Tube No.1)，但是添加了ARITA2質體之反應管中觀察到核酸放大(由表7模板ARITA2“+”可知，另Tt值雖在反應時間內無檢測到，但由圖18之ARITA2放大曲線確認濁度有上昇，故判斷核酸有放大)，且可確認到來自FAM-ARITA2-LB(序列編號44)之綠色螢光(圖19 Tube No.2)。
螢光波長中，照射對應於FAM之激發光時，模板(- )(添加DW)之反應液(圖20A)與模板(+)(添加ARITA2質體)之反應液(圖20B)，均在495nm附近觀察到激發光、在522nm附近觀察到來自FAM-ARITA2-LB之螢光波峰，但模板(-)之反應液中確認到更小(螢光強度低於20)之波峰(背景)、模板(+)之反應液中確認到更大(螢光強度超過80)之波峰。
4)二項目 砂眼披衣菌與淋菌之同時放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(由表8模板CT“-”及NG“-”可知未檢測到Tt值；由圖21之DW放大曲線，可知濁度無上昇)，且於UV照射下無法確認到螢光(圖22 Tube No.1)，但僅添加CT質體、僅添加NG質體或添加了CT質體與NG質體之反應管中可見核酸之放大(表8僅模板CT“+”、僅模板NG“+”、模板CT“+”及NG“+”之Tt值分別為12.8分、13.6分、12.2分；由圖21之CT、NG、CT+NG之放大曲線可知均有濁度上昇)，且於UV照射下分別可確認到來自Ale-CT-LB(序列編號40)之藍色螢光(圖22 Tube No.2)、來自 TAM-NG-LB(序列編號42)之紅色螢光(圖22 Tube No.3)、來自Ale-CT-LB與TAM-NG-LB之紫色螢光(圖22 Tube No.4)。
於螢光波長中，CT及NG均為模板(-)(添加DW)之反應液中(圖23A)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到有激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近僅確認到有激發光。
僅CT模板(+)(僅添加CT質體)之反應液中(圖23B)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光的波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近僅確認到有激發光。
僅NG模板(+)(僅添加NG質體)之反應液中(圖23C)，照射了對應於Alexa350之激發光時，僅於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰。
CT及NG均為模板(+)(添加了CT質體與NG質體)之反應液中(圖23D)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到Alexa350之激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm 附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光、與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰。
5)二項目 砂眼披衣菌與人工核酸之同時放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(由表9模板CT“-”及ARITA2“-”可知未檢測到Tt值；由圖24之DW濁度曲線，可知濁度無上昇)，且在UV照射下無法確認到螢光(圖25 Tube No.1)，但僅添加CT質體、僅添加ARITA2質體或添加了CT質體與ARITA2質體之反應管中，可見到核酸之放大(表9僅模板CT“+”、僅模板ARITA2“+”、模板CT“+”及ARITA2“+”之Tt值分別為12.0分、28.2分、13.6分；由圖24之CT、ARITA2、CT+ARITA2的濁度曲線可知濁度均有上昇)，且於UV照射下分別可確認到來自Ale-CT-LB(序列編號40)之藍色螢光(圖25 Tube No.2)、來自FAM-ARITA2-LB(序列編號44)之綠色螢光(圖25 Tube No.3)、來自Ale- CT-LB與FAM-ARITA2-LB之水藍色螢光(圖25 Tube No.4)。
螢光波長中，CT及ARITA2均為模板(-)(添加DW)之反應液中(圖26A)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射對應於FAM之激發光時，於495nm附近僅確認到激發光。
僅CT模板(+)(僅添加CT質體)之反應液中(圖26B)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
僅ARITA2模板(+)(僅添加ARITA2質體)之反應液中(圖26C)，照射了對應於Alexa350之激發光時，僅於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光之充分大(螢光強度超過80之)波峰。
CT及ARITA2均為模板(+)(添加了CT質體與ARITA2質體)之反應液中(圖26D)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到激發光與於 398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光、與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分大(螢光強度超過80之)波峰。
6)二項目 淋菌與人工核酸之同時放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(由表10模板NG“-”及ARITA2“-”可知未檢測到Tt值；由圖27之DW濁度曲線，可知濁度無上昇)，且在UV照射下無法確認到螢光(圖28 Tube No.1)，但於僅添加NG質體、僅添加ARITA2或添加了NG質體與ARITA2質體之反應管中，可觀察到核酸放大(表10僅模板NG“+”、僅模板ARITA2“+”、模板NG“+”及ARITA2“+”之Tt值分別為12.0分、29.0分、11.9分；由圖27之NG、ARITA2、NG+ARITA2之濁度曲線，可知濁度均有上昇)，且於UV照射下分別可確認到來自TAM-NG-LB(序列編號42)之紅色螢光(圖28 Tube No.2)、來自FAM-ARITA2-LB( 序列編號44)之綠色螢光(圖28 Tube No.3)、來自TAM-NG-LB與FAM-ARITA2-LB之黃色螢光(圖28 Tube No.4)。
螢光波長中，NG及ARITA2G均為模板(-)(添加DW)之反應液中(圖29A)，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光；照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
僅NG模板(+)(僅添加NG質體)之反應液中(圖29B)，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
僅ARITA2模板(+)(僅添加ARITA2質體)之反應液中(圖29C)，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近僅確認到激發光，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分大(螢光強度超過80)之波峰。
NG及ARITA2均為模板(+)(添加了NG質體與ARITA2質體)之反應液中(圖29D)，照射了對應於 TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分大(螢光強度超過80)之波峰。
7)三項目 砂眼披衣菌、淋菌及人工核酸之放大反應系在放大反應後之螢光波長測定結果
於添加了DW之反應管中未觀察到核酸放大(由表11模板CT“-”、NG“-”及ARITA2“-”可知未檢測到Tt值；由圖30之DW濁度曲線可知濁度無上昇)，且在UV照射下無法確認到螢光(圖31 Tube No.1)，但CT質體、NG質體、ARITA2質體添加1種、添加2種之組合、或3種全部添加之反應管中可觀察到核酸放大(表11僅模板CT“+”、僅模板NG“+”、僅模板ARITA2“+”、模板CT“+”及NG“+”、模板CT“+”及ARITA2“+”、模板NG“+”及ARITA2“+”、模板CT“+”與NG“+”及ARITA2“+”之Tt值分別為14.3分、13.5分、35.6分、12.3分、14.2分、13.5分、12.4分；由圖30CT、NG、ARITA2、CT+NG、 CT+ARITA2、NG+ARITA2、CT+NG+ARITA2之濁度曲線可知濁度均有上昇)，且在UV照射下分別可確認到來自Ale-CT-LB(序列編號40)之藍色螢光(圖31 Tube No.2)、來自TAM-NG-LB(序列編號42)之紅色螢光(圖31 Tube No.3)、來自FAM-ARITA2-LB(序列編號44)之綠色螢光(圖31 Tube No.4)、來自Ale-CT-LB與TAM-NG-LB之紫色螢光(圖31 Tube No.5)、來自Ale-CT-LB與FAM-ARITA2-LB之水藍色螢光(圖31 Tube No.6)、來自TAM-NG-LB與FAM-ARITA2-LB之黃色螢光(圖31 Tube No.7)、來自Ale-CT-LB與TAM-NG-LB及FAM-ARITA2-LB之白色螢光(圖31 Tube No.8)。
螢光波長中，CT、NG及ARITA2全部之模板(-)(添加DW)之反應液中(圖32A)，照射了對應於Alexa350之激發光時，僅於350nm附近確認到激發光、與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近僅確認到激發光，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
僅CT模板(+)(添加CT質體)之反應液中(圖32B)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附 近僅確認到激發光，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
僅NG模板(+)(僅添加NG質體)之反應液中(圖32C)，照射了對應於Alexa350之激發光時，僅於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光，此外於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
僅ARITA2模板(+)(僅添加ARITA2質體)之反應液中(圖32D)，照射了對應於Alexa350之激發光時，僅於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近僅確認到激發光，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分大(螢光強度超過80)之波峰。
CT及NG均為模板(+)(添加了CT質體與NG質體)之反應液(圖32E)中，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到Alexa350之激發光與於 398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光、與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰，但照射了對應於FAM之激發光時，僅於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的小(螢光強度低於20之)波峰(背景)。
CT及ARITA2均為模板(+)(添加CT質體與ARITA2質體)之反應液中(圖32F)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近僅確認到激發光，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光、與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分大(螢光強度超過80)之波峰。
NG及ARITA2均為模板(+)(添加NG質體與ARITA2質體)之反應液中(圖32G)，照射了對應於Alexa350之激發光時，僅於350nm附近確認到激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分 大(螢光強度超過80)之波峰。
CT、NG及ARITA2均為模板(+)(添加了CT質體、NG質體及ARITA2質體)之反應液中(圖32H)，照射了對應於Alexa350之激發光時，於350nm附近確認到Alexa350之激發光與於398nm附近確認到水的拉曼分光之波峰，此外於443nm附近確認到來自Ale-CT-LB之螢光波峰，照射了對應於TAMRA之激發光時，於555nm附近確認到激發光、與於580nm附近確認到來自TAM-NG-LB之螢光波峰，進一步地，照射了對應於FAM之激發光時，於495nm附近確認到激發光、與於522nm附近確認到來自FAM-ARITA2-LB之螢光的充分大(螢光強度超過80)之波峰。
本案發明，於單項目或多項目之放大反應系中由1種類之模板放大核酸時，係檢測來自每項目之檢測所用之1種螢光標誌的螢光；於多項目之放大反應系中由複數種類之模板來放大核酸時，係檢測來自各項目檢測所用之複數種螢光標誌的螢光。以目視進行檢測時，必須為以人類之 三原色型色覺能夠識別之範圍的螢光色光，例如，如實施例所示，使用藍、紅、綠色螢光標誌為原色，利用加法混合所表現之色調，除了之前的三原色以外，加上紫、黃、水藍色、白色之七色，且包含不發出螢光之情況(無色，亦即無螢光)全部8種之色即為上限。另一方面，以螢光測定機器進行檢測時，可使用能夠以機器識別之種類的螢光標誌，因此能夠同時檢測更多之項目，又，亦可藉由發光強度來定量。
實施例7顯示了，本案發明不論是單項目、多項目，為了檢測等溫放大反應中之核酸的放大，能夠實施以螢光檢測機器來計測螢光。
[產業上之可利用性]
本發明可提供相較於習知技術更簡便且價格便宜地檢測目標核酸之方法。又，藉由將本發明應用於微陣列，可無需標誌目標核酸來檢測基因表現。進一步地，藉由與習知之核酸放大技術組合，亦能夠以1步驟之試藥添加，一次檢測多項目之目標核酸。此外，不需使用特別之機器，能夠以目視進行該檢測。因此該發明不僅在以往的研究室內，在醫院中之感染菌、病毒鑑定、藥劑感受性之確認、一鹼基多型檢測之治療效果預測、食品製造販賣中的安全性確認等，可成為極有效的工具。
[圖1]本發明之基本態樣之示意圖。
[圖2]經加入放大目標核酸之步驟的本發明之示意圖。
[圖3A]將本發明應用於微陣列時之示意圖(不放大目標核酸的態樣)。
[圖3B]顯示將本發明應用於微陣列時之螢光標誌引子/探針的固定化例子之示意圖。
[圖3C]將本發明應用於微陣列時之示意圖(包含目標核酸之放大步驟的態樣)。
[圖4]顯示實施例2中使用螢光標誌引子/探針之目標核酸的即時濁度曲線。
[圖5]顯示實施例2中CT-LBc-Q1-0(序列編號8)添加前後之螢光檢測。
[圖6]顯示實施例3中之標準反應，砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、淋菌之判別結果。
[圖7]顯示實施例4中添加各目標核酸時之即時濁度曲線。
[圖8]顯示實施例4中於放大反應後添加淬熄劑標誌探針，95℃、5分鐘加熱後冷卻至室溫後之UV照射時反應管。
[圖9]顯示實施例5中之UV照射時反應管。
[圖10]顯示實施例6中使用螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸的即時濁度曲線。
[圖11]顯示實施例6中放大反應後UV照射時反應 管。
[圖12]顯示實施例7中使用單項目 砂眼披衣菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖13]顯示實施例7中使用單項目 砂眼披衣菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後之UV照射時反應管。
[圖14]顯示實施例7中使用單項目 砂眼披衣菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後之螢光波長。
[圖15]顯示實施例7中使用單項目 淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖16]顯示實施例7中使用單項目 淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的UV照射時反應管。
[圖17]顯示實施例7中使用單項目 淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後之螢光波長。
[圖18]顯示實施例7中使用單項目 人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖19]顯示實施例7中使用單項目 淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應 後的UV照射時反應管。
[圖20]顯示實施例7中使用單項目 人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的螢光波長。
[圖21]顯示實施例7中使用二項目 砂眼披衣菌與淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖22]顯示實施例7中使用二項目 砂眼披衣菌與淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的UV照射時反應管。
[圖23]顯示實施例7中使用二項目 砂眼披衣菌與淋菌之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的螢光波長。
[圖24]顯示實施例7中使用二項目 砂眼披衣菌與人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖25]顯示實施例7中使用二項目 砂眼披衣菌與人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的UV照射時反應管。
[圖26]顯示實施例7中使用二項目 砂眼披衣菌與人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的螢光波長。
[圖27]顯示實施例7中使用二項目 淋菌與人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核 酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖28]顯示實施例7中使用二項目 淋菌與人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應後的UV照射時反應管。
[圖29]顯示實施例7中使用二項目 淋菌與人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的放大反應後之螢光波長。
[圖30]顯示實施例7中使用三項目 砂眼披衣菌與淋菌及人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的即時濁度曲線。
[圖31]顯示實施例7中使用三項目 砂眼披衣菌與淋菌及人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的UV照射時反應管。
[圖32]顯示實施例7中使用三項目 砂眼披衣菌與淋菌及人工核酸之引子、螢光標誌引子/探針及淬熄劑標誌探針之目標核酸放大反應的螢光波長。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-F3：合成引子/探針
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-B3：合成引子/探針
<400> 20
<210> 21
<211> 428
<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-LF：Synthesized Primer/Probe
<400> 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAM-NG-LB：合成引子/探針
<400> 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-LBc-Q1：合成引子/探針
<400> 24
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-FIP：合成引子/探針
<400> 25
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-BIP：合成引子/探針
<400> 26
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-F3：合成引子/探針
<400> 27
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-B3：合成引子/探針
<400> 28
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-LF5：合成引子/探針
<400> 29
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ale-ARITA2-LB：合成引子/探針
<400> 30
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-LBc-Q0：合成引子/探針
<400> 31
<210> 32
<211> 451
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 32
<210> 33
<211> 569
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 33
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-FP：合成引子/探針
<400> 34
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-TP：合成引子/探針
<400> 35
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-OP1：合成引子/探針
<400> 36
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-OP2：合成引子/探針
<400> 37
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ale-CT-BP：合成引子/探針
<400> 38
<210> 39
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-BPc-Q0：合成引子/探針
<400> 39
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ale-CT-LB：合成引子/探針
<400> 40
<210> 41
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT-LBc-Q0：合成引子/探針
<400> 41
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAM-NG-LB：合成引子/探針
<400> 42
<210> 43
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-LBc-Q2：合成引子/探針
<400> 43
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAM-ARITA2-LB：合成引子/探針
<400> 44
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARITA2-LBc-Q1：合成引子/探針
<400> 45

Claims (8)

  1. 一種檢測核酸之方法，其係檢測存在於試樣中之1種類以上的目標核酸之方法，且包含以下步驟：(1)於試樣中添加A)經螢光劑標誌，且與目標核酸具有互補性之寡核苷酸的螢光標誌引子或探針、與經消光劑標誌，且與該螢光標誌引子或探針具有互補性，融解溫度(Tm)比該螢光標誌引子或探針低的寡核苷酸之淬熄劑標誌探針；或組合添加B)經發光波長不同之螢光劑標誌，且分別與不同的複數個目標核酸具有互補性之寡核苷酸的複數種類的螢光標誌引子或探針、與經對應於各自之螢光劑的消光劑標誌，且與該複數種類之螢光標誌引子或探針分別具有互補性，融解溫度(Tm)分別比該複數種類之螢光標誌引子或探針低的寡核苷酸之淬熄劑標誌探針；(2)將該試樣保溫於該螢光標誌引子或探針之融解溫度(Tm)以下、且比該淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)高的溫度，於保溫當中以等溫條件使用鏈取代反應進行該目標核酸的放大；(3)將該試樣保溫於該淬熄劑標誌探針之融解溫度(Tm)以下的溫度，使該淬熄劑標誌探針與未結合於前述目標核酸之該螢光標誌引子或探針黏著，藉由消光劑將未結合於前述目標核酸之該螢光標誌引子或探針所放出的螢 光有效地消去；(4)計測結合於目標核酸之螢光標誌引子或探針的螢光。
  2. 如申請專利範圍第1項之檢測方法，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸的鹼基長度比前述螢光標誌引子或探針之寡核苷酸的鹼基長度更短。
  3. 如申請專利範圍第1項之檢測方法，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸係包含修飾鹼基。
  4. 如申請專利範圍第1~3項中任一項之檢測方法，其中將前述螢光標誌引子或探針固定於固相面來使用。
  5. 一種目標核酸檢測用套組，其係用於如申請專利範圍第1項之檢測方法之套組，且包含1種或複數種之經螢光劑標誌，且與目標核酸具有互補性之寡核苷酸的螢光標誌引子或探針；與經對應於各自之螢光劑的消光劑標誌，且與該螢光標誌引子或探針具有互補性，融解溫度(Tm)比該螢光標誌引子或探針低之寡核苷酸的淬熄劑標誌探針之組合。
  6. 如申請專利範圍第5項之目標核酸檢測用套組，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸的鹼基長度比前述螢光標誌引子或探針之寡核苷酸的鹼基長度更短。
  7. 如申請專利範圍第5項之目標核酸檢測用套組，其中前述淬熄劑標誌探針之寡核苷酸係包含修飾鹼基。
  8. 如申請專利範圍第5~7項中任一項之目標核酸檢測用套組，其中前述螢光標誌引子或探針係被固定於固相 面。
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