ES2433667T3

ES2433667T3 - Método de amplificación de ácidos nucleicos, y reactivo y kit de reactivos para la utilización en el método

Info

Publication number: ES2433667T3
Application number: ES08839845T
Authority: ES
Inventors: Toshihiro Yonekawa; Tsugunori Notomi; Hidetoshi Kanda; Norimitsu Hosaka
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2013-12-12
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: CN101903520B; US8557523B2; HK1146086A1; US20100233715A1; EP2218780A4; JP5313157B2; CN101903520A; EP2218780B1; WO2009051214A1; JPWO2009051214A1; US20140308663A1; JP2013135696A; EP2218780A1

Abstract

Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno, quecomprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en unamisma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antes de laamplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del molde de ácido nucleico diana,evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción deamplificación del ácido nucleico diana, en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleicodiana por lo menos en la región de diseño del cebador, en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñadopara hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleicodiana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado parahibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno,en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que seha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácidonucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes: (a) la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentracióndel cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferioral de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de unmaterial de estándar interno y un ácido nucleico diana, y (b) la concentración de un nucleótido de sustrato se fija en un valor superior al de la solución de reacción deamplificaciónutilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material deestándar interno y, en el que, como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizadopara la amplificación del ácido nucleico diana se utilizan el cebador (1) y/o el cebador (2), en el que, al seleccionarsesucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de lasecuencia diana de un ácido nucleico molde hacia el extremo 3'-terminal del ácido nucleico de molde, el cebador (1)comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5'hacia el lado 3', y en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuartasecuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 5'-terminal delácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.

Description

Método de amplificación de ácidos nucleicos, y reactivo y kit de reactivos para la utilización en el método

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para amplificar un ácido nucleico en una muestra, en el que un ácido nucleico diana y un material de estándar interno se amplifican bajo condiciones isotérmicas en una misma solución de reacción, así como un reactivo de ensayo o kit de reactivos utilizado para la reacción.

Antecedentes de la técnica

Se ha desarrollado una diversidad de métodos para la amplificación de ácidos nucleicos como técnicas que permiten la detección de cantidades muy reducidas de ácidos nucleicos en una muestra. En particular, se ha utilizado un método en el que se lleva a cabo una amplificación isotérmica eficiente (por ejemplo el método LAMP) en una amplia diversidad de campos de ensayo a modo de técnica que permite la detección simple y rápida utilizando un aparato eficaz en cuanto a costes sin una función de control de la temperatura.

La presentes inventores han informado de que pueden cuantificarse los ácidos nucleicos en un intervalo de concentraciones de entre 103 y 109 copias/ensayo utilizando un sistema de detección LAMP que no implica la utilización de un material de estándar interno (Y. Mori et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 59:145157, 2004). Debido a que esta técnica no utiliza un material de estándar interno, los resultados obtenidos con dicha técnica son cantidades relativas de ácidos nucleicos diana.

Desde entonces se ha informado de un método de cuantificación que implica la utilización de un material de estándar interno en el método LAMP (H. Tani et al., Analytical Chemistry 79(15):5608-5613, 2007). Este método implica la utilización de un material de estándar interno que presenta una secuencia similar a la del ácido nucleico diana, para amplificar simultáneamente el ácido nucleico diana y el material de estándar interno. Debido a que el intervalo cuantificable de concentraciones de dicho método es de tan sólo 104 a 108 copias/ensayo, resulta necesario diluir una muestra y repetir los ensayos una pluralidad de veces para someter a ensayo ácidos nucleicos de un intervalo amplio de concentraciones. APPLIED BIOSYSTEMS: 2007 MOLECULAR AND CELL BIOLOGY CATALOGUE (1 de septiembre de 2006, página 125) y "Taqman Exogenous Internal Positive Control Reagents VIC Probe Protocol" (2001, página 1, obtenido de Internet: URL: http://www.savethefrogs.com/chytrid/images/ABI-Exo-IPC-protocol.pdf [obtenido el ] dan a conocer los reactivos exógenos de control positivo interno. El documento WO nº 2006/034215 A2 da a conocer un método de desactivación de reacción multiplex en modo múltiple. Nurmi et al. (Anal. Chem. 74:3525-3532, 2002) dan a conocer una RT-PCR cuantitativa en tiempo real de alto rendimiento utilizando sondas de lantánidos y un ensayo de hibridación de temperatura dual. Hoorfar et al. (J. Clin. Microbiol. 42(5):1863-1868, 2004) dan a conocer consideraciones prácticas para el diseño de controles internos de amplificación para ensayos de PCR diagnósticos.

Exposición de la invención

En un sistema de detección que implica la utilización de un material de estándar interno, un producto de amplificación del material de estándar interno afecta a la reacción de amplificación del ácido nucleico diana. De esta manera, no puede someterse a ensayo con exactitud un ácido nucleico diana y esta desventaja se considera que es un problema habitual de las técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que proporcionan una elevada eficiencia de amplificación. La presente invención pretende superar dicha desventaja y proporcionar un metodo que permita una amplificación estable de un material de estándar interno, manteniendo simultáneamente un valor de ensayo exacto para el ácido nucleico diana y un reactivo utilizado para el mismo.

Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos con el fin de conseguir el objetivo anteriormente indicado. Como resultado, han encontrado que la influencia de un producto de amplificación de estándar interno impuesto en una reacción de amplificación de un ácido nucleico diana puede evitarse al no realizar una reacción de amplificación de un material de estándar interno simultáneamente a la reacción del ácido nucleico diana; es decir, llevando a cabo una reacción de amplificación de un material de estándar interno antes de la reacción del ácido nucleico diana. Lo anteiror ha conducido a completar la presente invención.

Concretamente, la presente invención proporciona (1) a (8), a continuación.

(1) Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno, que comprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en una misma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antesde la amplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del ácido nucleico diana de molde, evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción de amplificación del ácido nucleico diana,

en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador, en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñado para hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado para hibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno, en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que se ha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácido nucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes:

(a): la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentración del cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de un material de estándar interno y el ácido nucleico diana, y

(b): la concentración del nucleótido de sustrato se fija a un valor superior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material de estándar interno, y en el que como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se utiliza el cebador (1) y/o (2), en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 3'-terminal del ácido nucleico diana, el cebador (1) comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3', y

en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuarta secuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 5'-terminal del ácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2 complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.

(2): El método de amplificación de ácidos nucleicos según (1) comprende las etapas de:

(a): añadir una solución que contiene un material de estándar interno con una concentración o número de copia conocido a una muestra que contiene un ácido nucleico diana,

(b): llevar a cabo una reacción de amplificación utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación de un ácido nucleico diana (en lo sucesivo denominado "cebador de estándar interno") y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana (en lo sucesivo denominado "cebador de ácido nucleico diana") bajo determinadas condiciones, y

(c): llevar a cabo un ensayo por medios que permiten distinguir entre la reacción de amplificación del material de estándar interno y la reacción de amplificación del ácido nucleico diana.

(3): El método de amplificación de ácidos nucleicos según (1) comprende las etapas de:

(c): llevar a cabo un ensayo en tiempo real por medios que permiten distinguir entre la reacción de amplificación del estándar interno y la reacción de amplificación del ácido nucleico diana y determinar la concentración o número de copia inicial del ácido nucleico diana en una muestra basándose en los resultados del ensayo y en la cantidad de material de estándar interno añadida.

(4): El método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de entre (1) y (3), en el que se cuantifica el ácido nucleico diana.

(5): El método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de entre (1) y (3), que comprende detectar

la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana.

(6): El método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de entre (1) y (5), en el que la reacción de amplificación es el método LAMP.

(7): Un reactivo o kit de reactivos de ensayo utilizado para llevar a cabo el método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de entre (1) y (6), que comprende por lo menos los reactivos indicados a continuación:

(a): un material de estándar interno de concentración o número de copia conocido, que presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador,

(b): un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación del ácido nucleico diana bajo determinadas condiciones, y

(c): un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana.

(8): El reactivo o kit de reactivos de ensayo según (7), que comprende además los reactivos siguientes:

a) una sonda oligonucléotida utilizada para detectar un material de estándar interno, y b) una sonda oligonucleótida utilizada para detectar un ácido nucleico diana.

Según la presente invención, se lleva a cabo una reacción de amplificación de un material de estándar interno antes de la reacción de un ácido nucleico diana, de manera que un material de estándar interno puede amplificarse establemente, manteniendo simultáneamente un valor de ensayo exacto del ácido nucleico diana. Según técnicas cualitativas, puede realizarse un seguimiento específicamente de la eficiencia de extracción y purificación de diversas muestras o de la influencia de componentes de las muestras sobre la reacción de amplificación. Según las técnicas de cuantificación, además pueden someterse a ensayo cantidades absolutas de ácidos nucleicos en un amplio intervalo, de 7 dígitos o más.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es un gráfico que muestra los resultados conseguidos mediante el método LAMP utilizando un ácido nucleico diana (es decir, un plásmido de NG) a cada concentración de entre 10 1 y 10 7 copias/ensayo un ácido nucleico de estándar interno (es decir, un plásmido de CT) y el ensayo de la inhibición de la fluorescencia por una sonda de inhibición conjuntamente con la amplificación del ácido nucleico diana mediante el ensayo en tiempo real Mx3000P. La fig. 2 es un gráfico que muestra una curva de estándares obtenida utilizando el plásmido de NG. La fig. 3 es un gráfico que muestra los resultados conseguidos mediante el método LAMP utilizando un ácido nucleico diana (es decir, un plásmido de NG) a cada concentración de entre 101 y 107 copias/ensayo y un ácido nucleico de estándar interno (es decir, un plásmido de CT) y el ensayo de la inhibición de la fluorescencia por una sonda de inhibición conjuntamente con la amplificación de un ácido nucleico de estándar interno mediante el ensayo en tiempo real Mx3000P. La fig. 4 es un gráfico que muestra los resultados conseguidos mediante el método LAMP utilizando un ácido nucleico diana (es decir, un plásmido VHB) a cada concentración de entre 101 y 108 copias/ensayo y un ácido nucleico de estándar interno (es decir, el plásmido Arita2) y el ensayo de la inhibición de la fluorescencia por una sonda de inhibición conjuntamente con la amplificación del ácido nucleico diana mediante el ensayo en tiempo real Mx3000P. La fig. 5 es un gráfico que muestra una curva de estándares obtenida utilizando el plásmido VHB. La fig. 6 es un gráfico que muestra los resultados conseguidos mediante el método LAMP utilizando un ácido nucleico diana (es decir, el plásmido VHB) a cada concentración de entre 101 y 108 copias/ensayo y un ácido nucleico de estándar interno (es decir, el plásmido Arita2) y el ensayo de la inhibición de la fluorescencia por una sonda de inhibición conjuntamente con la amplificación de un ácido nucleico de estándar interno mediante el ensayo en tiempo real Mx3000P. La fig. 7 es un gráfico que muestra los cambios en los tiempos de amplificación para un ácido nucleico diana (el plásmido VHB) y un ácido nucleico de estándar interno (el plásmido Arita2) a concentraciones de molde del material de estándar interno de 102, 104 y 106 copias/ensayo. La fig. 8 es un gráfico que muestra los cambios en los tiempos de amplificación para un ácido nucleico diana (el plásmido VHB) y un ácido nucleico de estándar interno (el plásmido Arita2) utilizando un cebador de estándar interno a concentraciones de 31 y cebadores a concentraciones menores (30,25, 30,3 y 30,5). La fig. 9 es un gráfico que muestra los cambios en los tiempos de amplificación para un ácido nucleico diana (el plásmido VHB) y un ácido nucleico de estándar interno (el plásmido Arita2) utilizando un componente reactivo A31 y un componente reactivo A31.2 a concentración elevada. La fig. 10 es un gráfico que muestra los resultados de la amplificación de un ácido nucleico de estándar interno (plásmido de CT; I.C.) y un molde a concentración elevada del plásmido de NG (NG_H) en la misma solución de reacción.

La fig. 11 es un gráfico que muestra los resultados de la amplificación de un ácido nucleico de estándar interno (plásmido de CT; I.C.) y un molde a concentración baja del plásmido de NG (NG_L) en la misma solución de reacción.

Mejores modos de llevar a cabo la invención

El método de amplificación de ácidos nucleicos de la presente invención comprende llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación de un ácido nucleico diana. La condición de llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes que la amplificación de un ácido nucleico diana implica que se inicia una reacción de amplificación del material de estándar interno antes de iniciar una reacción de amplificación del ácido nucleico diana. Con este fin, resulta necesario diseñar un cebador de estándar interno que permita realizar la amplificación anticipadamente (es decir, por adelantado). La expresión "cebador de estándar interno" se refiere a un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno. En general, todavía no se han establecido condiciones especiales para el diseño de un cebador utilizado para llevar a cabo la amplificación anticipadamente. De esta manera, un cebador utilizado para llevar a cabo la amplificación anticipadamente se selecciona de entre cebadores que se han diseñado mediante técnicas convencionales utilizando software específico o similares, y el cebador seleccionado se diseña a modo de cebador de estándar interno.

La amplificación de un material de estándar interno también puede llevarse a cabo después de la amplificación de un ácido nucleico diana, es decir una reacción de amplificación del material de estándar interno puede iniciarse después de iniciarse una reacción de amplificación del ácido nucleico diana de molde. Con este fin, resulta necesario diseñar un cebador de estándar interno que permita realizar la amplificación retrasadamente (es decir, después). De esta manera, un cebador utilizado para llevar a cabo la amplificación retrasadamente se selecciona de entre cebadores que se han diseñado mediante técnicas convencionales utilizando software específico o similares, y el cebador seleccionado se diseña a modo de cebador de estándar interno.

En un método de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, en general la amplificación tiende a realizarse antes ya que la concentración de ácido nucleico diana es elevada. De esta manera, resulta necesario elevar la concentración del material de estándar interno para amplificar el material de estándar interno de manera más anticipada. En contraste, resulta necesario reducir la concentración del material de estándar interno para amplificar el material de estándar interno de manera más retrasada.

En la presente invención, concretamente, la concentración del material de estándar interno en la solución de reacción de amplificación se fija en 10 veces o más la de la solución de reacción de amplificación utilizada para el ensayo mediante la amplificación simultánea de un material de estándar interno y el ácido nucleico diana, con el fin de amplificar el material de estándar interno de manera más anticipada (es decir, por adelantado). Dicha concentración preferentemente se fija para que sea 100 veces superior o más. En contraste, la concentración del material de estándar interno en la solución de reacción de amplificación puede fijarse en un valor inferior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para el ensayo mediante la amplificación simultánea de un material de estándar interno y el ácido nucleico diana, con el fin de amplificar el material de estándar interno de manera retrasada (es decir, después). Dicha concentración preferentemente puede fijarse para que sea 0,1 veces más baja

o menos, y más preferentemente 0,01 veces más baja o menos.

El material de estándar interno utilizado en la presente invención no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que el ácido nucleico relevante presente una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador. Entre los ejemplos de dicho ácido nucleico se incluyen un ácido nucleico natural y un ácido nucleico de síntesis parcial o totalmente artificial.

Mediante la reducción de la concentración del cebador de estándar interno de la presente invención a un nivel más bajo que un nivel general (es decir, un sistema de detección de un solo ácido nucleico), puede reducirse la cantidad del producto de amplificación de estándar interno y puede mejorarse la exactitud del ensayo del ácido nucleico diana. Mediante la elevación de la concentración de un nucleótido de sustrato para la síntesis de ácidos nucleicos a un nivel más alto que un nivel general, puede suplementarse un sustrato que es consumido en la reacción de amplificación del material de estándar interno y puede resolverse el problema del retraso de la amplificación del ácido nucleico diana. Lo anterior permite la detección con una sensibilidad más alta en un periodo de tiempo más corto.

Según la presente invención, concretamente, la concentración del material de estándar interno en la solución de reacción de amplificación se fija en un valor más bajo que la de la solución de reacción de amplificación que se utiliza para el ensayo mediante la amplificación simultánea de un material de estándar interno y el ácido nucleico diana, con el fin de amplificar el material de estándar interno de manera anticipada (es decir, por adelantado). Dicha concentración se fija preferentemente en 1 vez más bajo, y más preferentemente en 0,5 veces o menos. De esta manera, puede reducirse la cantidad del producto de amplificación del material de estándar interno y puede mejorarse la exactitud del ensayo del ácido nucleico diana.

Además, en la presente invención, la concentración de un nucleótido de sustrato para la síntesis de ácidos nucleicos se fija en un valor más alto que en la solución de reacción de amplificación que se utiliza para el ensayo mediante la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar un material de estándar interno, con el fin de amplificar el material de estándar interno de manera anticipada (es decir, por adelantado). Dicha concentración se fija preferentemente en 1 vez más alta, y más preferentemente en 1,1 veces o más. De esta manera, puede suplementarse un sustrato que se consume en la reacción de amplificación del material de estándar interno y puede resolverse el problema de retraso en la amplificación del ácido nucleico diana. Lo anterior permite la detección con una sensibilidad más alta en un periodo de tiempo más corto.

El experto en la materia podrá regular adecuadamente las condiciones para la reacción de los componentes reactivos indicados anteriormente, de manera que se amplifique el material de estándar interno antes que el ácido nucleico diana.

El cebador del estándar interno de la presente invención se ha diseñado para hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleico diana bajo condiciones restrictivas y el ácido nucleico diana se ha diseñado para hibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero para no hibridarse con el material de estándar interno bajo condiciones restrictivas tal como se ha indicado anteriormente.

Bajo condiciones restrictivas, se forma un híbrido específico pero no se forma un híbrido no específico. Concretamente, un oligonucleótido con elevada homología con un ácido nucleico (es decir, una homología de 80% o superior, preferentemente de 90% o superior, y más preferentemente de 95% o superior) experimenta hibridación. Más concretamente, la hibridación se lleva a cabo en presencia de NaCl 0,5 a 1 M a una temperatura de entre 42ºC y 68ºC, en presencia de formamida al 50% a 42ºC, o en una solución acuosa a una temperatura de entre 65ºC y 68ºC, seguido del lavado con solución 0,1x a 2x SSC a una temperatura de entre la ambiente y 68ºC.

En una realización, el método de amplificación de ácidos nucleicos de la presente invención comprende las etapas de:

(b): realizar una reacción de amplificación utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido para la amplificación de un material de estándar interno que permite la amplificación del material de estándar interno anticipadamente (es decir, por adelantado) respecto a la amplificación del ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana, y

En otra realización, el método de amplificación de ácidos nucleicos de la presente invención comprende las etapas de:

(b): realizar una reacción de amplificación utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido que se utiliza para la amplificación de un material de estándar interno que permite la amplificación del material de estándar interno anticipadamente (es decir, por adelantado) respecto a la amplificación del ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana, y

Las muestras utilizadas en la presente invención no se encuentran particularmente limitadas, con la condición de que las muestras pueden comprender ácidos nucleicos. Entre los ejemplos de las mismas se incluyen especímenes derivados de organismos tales como seres humanos y otros animales, especímenes derivados de plantas, alimentos y entornos, sustancias que contienen ácidos nucleicos parcial o totalmente de síntesis artificial y soluciones de cultivo de las mismas. Dichas muestras pueden someterse a pretratamiento, tal como aislamiento, extracción, concentración o purificación.

En la presente invención, la expresión "ácido nucleico diana" se refiere a un ácido nucleico que debe detectarse que se somete a amplificación. La expresión "secuencia diana" se refiere a una secuencia de nucleótidos diana en el ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede ser cualquier ácido nucleico que deba amplificarse, sin limitación particular. Entre los ejemplos de ácidos nucleicos diana se incluyen diversos tipos de genes de animales y plantas, diversos genes víricos y diversos genes de microorganismo, tales como genes bacterianos, de mohos y de levaduras, con independencia de si son de ADN o de ARN. Los ácidos nucleicos diana puede ser naturales o de síntesis artifical, y un ejemplo de los mismos es APN. Además, entre los ejemplos se incluyen ácidos nucleicos de cadena sencilla y ácidos nucleicos de doble cadena. En la presente invención, la expresión "ácido nucleico de molde" se refiere a una diana de detección original que comprende en su molécula una secuencia diana y que sirve como base para el diseño del cebador.

Antes del pretratamiento, tal como aislamiento, extracción, concentración o purificación, se añade el material de estándar interno a la muestra, lo resultante se somete a pretratamiento y el ácido nucleico diana seguidamente se somete a ensayo mediante el método de la presente invención. De esta manera puede llevarse a cabo el seguimiento de la eficiencia del pretratamiento. Al añadir el material de estándar interno a una muestra que ha sido sometida a pretratamiento y se someten a ensayo cualitativo los ácidos nucleicos diana, puede observarse la influencia de los componentes de la muestra sobre la reacción de amplificación y puede distinguirse una reacción falsamente negativa. Además, una diversidad de ácidos nucleicos diana de concentraciones conocidas puede someterse al método de la presente invención para preparar una curva estándar previamente, y los resultados del ensayo de muestras de ensayo desconocidas se comparan con la curva de estándares resultante. De esta manera, pueden cuantificarse los ácidos nucleicos diana en las muestras de ensayo desconocidas.

En la presente invención, un método para detectar un ácido nucleico no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que este método permita distinguir la reacción de amplificación del material de estándar interno de la reacción de amplificación del ácido nucleico diana. Por ejemplo, pueden utilizarse métodos que impliquen la utilización de una sonda marcada fluorescentemente o marcada radioactivamente.

En la presente invención, el método para la amplificación de ácidos nucleicos no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que sea un método para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que rinda una elevada eficiencia de amplificación. Según la presente invención, se utiliza preferentemente la técnica de amplificación que implica la utilización de un cebador con la estructura X1c + X2, es decir, el método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP).

En lo sucesivo, se describe una técnica de amplificación que implica la utilización de un cebador que presenta la estructura X1c + X2. El cebador con la estructura X1c + X2 se diseña de la manera siguiente:

(a): en el caso de que una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia F2c se seleccionen sucesivamente del lado 3' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 3'-terminal de la cadena molde del ácido nucleico, se utiliza un cebador que comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3', y

(b): en el caso de que una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuarta secuencia arbitraria R2 se seleccionen sucesivamente del lado 5' de la secuencia diana de una cadena molde del ácido nucleico hacia el extremo 5'terminal del ácido nucleico diana, se utiliza un cebador que comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2 complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.

Los cebadores (a) y (b) pueden utilizarse a modo de pareja. Alternativamente, puede utilizarse un cebador (a) o (b) como pareja en combinación con un cebador general.

Puede llevarse a cabo una reacción de amplificación utilizando una ADN polimerasa de tipo de desplazamiento de cadena como polimerasa bajo condiciones isotérmicas. Ello se debe a que un cebador presenta una estructura X1c

+ X2, un producto de extensión del cebador comprende una secuencia complementaria (subrayada) de X1c+(X2+)X1, y el producto de extensión experimenta hibridación intracadena y forma una reacción de cadena sencilla en el ácido nucleico de doble cadena sintetizado. Concretamente, se proporciona un nuevo origen para el desplazamiento de cadena en un producto de extensión mediante hibridación intracadena sin disociar la doble cadena a temperatura elevada. Respecto a la descripción general de esta reacción, puede hacerse referencia a la descripción del método LAMP, posteriormente.

Entre los ejemplos de ADN polimerasa de tipo de desplazamiento de cadena indicada anteriormente se incluyen la ADN polimerasa Bst, la ADN polimerasa Bca (Exo-), el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa Vent, la ADN polimerasa Vent (Exo-) (resultante de la eliminación de la actividad de exonucleasa de la ADN polimerasa Vent), la ADN polimerasa DeepVent, la ADN polimerasa DeepVent (Exo-) (resultante de la eliminación de la actividad de exonucleasa de la ADN polimerasa DeepVent), la ADN polimerasa del fago c29, la ADN polimerasa del fago MS-2, la ADN polimerasa Z-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) y la ADN polimerasa KOD (Toyobo Co., Ltd.).

Se describe el método LAMP a continuación. El "método LAMP" fue desarrollado por Notomi et al. (Nucleic Acids Research 28(12):e63, 2000) y es un método de amplificación de ácidos nucleicos que permite la síntesis isotérmica de cadenas complementarias en la que el nucleótido molde se aparea con el extremo 3'-terminal del mismo, el sitio apareado se utiliza como origen para la síntesis de la cadena complementaria, y se utiliza en combinación un cebador que se hibrida con el bucle resultante. Según el método LAMP, el extremo 3'-terminal del cebador siempre se aparea con una región derivada de una muestra. De esta manera, un mecanismo de comprobación resultante de un enlace complementario de secuencias de nucleótidos funciona de manera repetida. Ello permite una reacción de amplificación de secuencias génicas de elevada especificidad.

En el método LAMP, se utilizan cebadores que comprenden por lo menos 4 tipos de oligonucleótidos que reconocen secuencias de nucleótidos en 6 regiones en total de una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de molde (un "cebador interno F" (en lo sucesivo denominado "CIF"), un cebador interno B (en lo sucesivo denominado "CIB"), un cebador externo F (en lo sucesivo denominado "F3") y un cebador externo B (en lo sucesivo denominado "B3")). A medida que transcurre la reacción de amplificación, se forma un nucleótido en forma de H que presenta un extremo 3'-terminal que sirve como origen para la síntesis de la propia cadena y se forman estructuras de bucle en ambos extremos. En el caso de que se utilicen cebadores que presenten una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos en la región de cadena sencilla de la estructura de bucle 5'-terminal de la estructura de H (es decir, un cebador de bucle F (en lo sucesivo denominado "CF") y/o un cebador de bucle B (en lo sucesivo denominado "CB")), además se incrementa el número de orígenes para la síntesis de ácidos nucleicos y ello puede acortar el tiempo de reacción y mejorar la sensibilidad de detección.

Resulta necesario un cebador interno para llevar a cabo el método LAMP. En el caso de que se seleccione una secuencia arbitraria X2c situada en el lado 3' y una secuencia arbitraria X1c situada más próxima en el lado 5' en cada cadena de ADN molde, un cebador interno comprende una secuencia X2 complementaria a la secuencia X2c y una secuencia X1c idéntica a la secuencia X1c desde el lado 3' hacia el lado 5' en ese orden (e sdecir, un cebador interno presenta la estructura X1c + X2). En términos de funciones, X2 del cebador interno se hibrida específicamente con el molde y proporciona un origen para la síntesis de cadena complementaria, y X1c proporciona una secuencia complementaria para un producto de amplificación (extensión) para formar un bucle. El bucle resultante sirve como nuevo origen para la síntesis de cadena complementaria.

La expresión "cebador externo" se refiere a dos tipos de cebador (un cebador complementario a cada una de las dobles cadenas) que presenta una secuencia complementaria a una secuencia arbitraria X3c situada en el exterior del cebador interno (es decir, más próximo al lado 3' del molde) y capaz de hibridarse con el mismo.

Con el fin de facilitar la hibridación de un cebador con un ácido nucleico molde, las longitudes de cada una de las secuencias X1 (X1c), X2 (X2c) y X3 (X3c) preferentemente son de 5 a 100 nucleótidos, y más preferentemente de 10 a 50 nucleótidos.

El cebador interno y el cebador externo resultan necesarios para cada una de las dobles cadenas (F y R) y se diseñan dos tipos de cebadores internos (F1c+F2 y R1c+R2) y dos tipos de cebadores externos (F3 y R3).

Preferentemente se seleccionan secuencias arbitrarias, de manera que el producto de amplificación resultante del método LAMP preferentemente provoca la hibridación intramolecular, en lugar de la hibridación intermolecular, y forma una estructura de horquilla terminal. Con el fin de causar preferentemente la hibridación intramolecular, por ejemplo, resulta importante considerar la distancia entre la secuencia F1c y la secuencia F2c y la distancia entre la secuencia R1 y la secuencia R1c al seleccionar secuencias arbitrarias. Más concretamente, las secuencias se seleccionan de manera que la distancia entre ellas sea de entre 0 y 500 nucleótidos, preferentemente de entre 0 y 100 nucleótidos, y más preferentemente de entre 10 y 70 nucleótidos. Los valores numéricos representan el número de nucleótidos, excluyendo las secuencias F1c, F2c, R1 y R2.

La expresión "cebador de bucle" se refiere a dos tipos de cebadores (siendo cada cebador complementario a cada doble cadena) que comprenden en el extremo 3'-terminal una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia en un bucle formada mediante hibridación de secuencias complementarias generadas en la misma cadena de un producto de amplificación del método LAMP. El cebador externo y el cebador de bucle no son indispensables para el método LAMP; sin embargo, la utilización de estos cebadores permite llevar a cabo una reacción de amplificación (extensión) más eficiente.

Preferentemente se lleva a cabo una secuencia de reacciones en presencia de un tampón que permite alcanzar un nivel de pH preferible en la reacción enzimática, una sal que resulta necesaria para mantener la actividad catalítica de un enzima o para la hibridación, un agente protector de enzima y, según la necesidad, un regulador de la temperatura de fusión (Tf). Se utiliza un tampón que presenta acciones tamponadoras bajo condiciones neutras a débilmente alcalinas, tal como Tris-HCl. El nivel de pH puede ajustarse según el tipo de ADN polimerasa utilizado. Como sal se añade, por ejemplo KCl, NaCl, MgCl2 o (NH4)2SO4, de manera que se mantenga la actividad enzimática y para modificar la temperatura de fusión (Tf) del ADN, según se requiera. Como protector del enzima se utiliza albúmina de suero bovino o azúcar. Como regulador de la temperatura de fusión (Tf), en general pueden utilizarse betaína, prolina, dimetilsulfóxido o formamida.

La reacción LAMP se produce mediante la adición de los componentes (i), (ii) y (iii), posteriormente, al ácido nucleico molde y llevando a cabo la incubación a una temperatura a la que pueda formarse un cebador interno para formar un enlace estable de pareja de nucleótidos con una secuencia complementaria en el ácido nucleico molde y una polimerasa de tipo de desplazamiento de cadena pueda mantener la actividad enzimática. La incubación se lleva a cabo a una temperatura de entre 50ºC y 75ºC, y preferentemente entre 55ºC y 70ºC, durante 1 minuto a 10 horas, y preferentemente durante 5 minutos a 4 horas.

(i): Dos tipos de cebadores internos, o adicionalmente dos tipos de cebadores externos, o adicionalmente, dos tipos de cebadores de bucle,

(ii): polimerasa de tipo de desplazamiento de cadena,

(iii) nucleótido de sustrato.

La síntesis de la cadena de nucleótidos desde el cebador externo debe iniciarse tras iniciarse la síntesis de la cadena de nucleótidos desde el cebador interno. Con este fin, se fija una concentración de cebador interno más elevada que la concentración del cebador externo, por ejemplo. Concretamente, la concentración del cebador interno puede fijarse en 2 a 50 veces, y preferentemente 4 a 25 veces más elevada que la concentración del cebador externo.

Diversos reactivos que resulta necesarios para llevar a cabo el método de la presente invención pueden empaquetarse anticipadamente para preparar un kit. Por ejemplo, se proporcionan en forma de kit reactivos necesarios, tales como un material de estándar interno, un cebador de estándar interno, un cebador del ácido nucleico diana, cuatro tipos de dNTP que sirvan como sustratos para la síntesis de ácidos nucleicos, ADN polimerasa, transcriptasa inversa, tampón, sal, protector y sonda de marcaje.

Concretamente, el reactivo de ensayo o kit de reactivos de la presente invención incluye por lo menos los reactivos indicados a continuación:

(b): un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación del ácido nucleico diana, y

El reactivo de ensayo o kit de reactivos de la presente invención puede incluir además los reactivos indicados a continuación:

(a): una sonda oligonucleótida utilizada para detectar un material de estándar interno, y

(b): un cebador oligonucleótido utilizado para detectar un ácido nucleico diana.

Ejemplos

Se describen a continuación ejemplos de la presente invención, aunque la presente invención no se encuentra limitada a estos ejemplos.

Ejemplo 1: cuantificación de Neisseria gonorrhoeae mediante el método LAMP

(1): Molde de ensayo

Se preparó ADN plasmídico como molde de material de estándar interno mediante subclonación de parte de la región del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis (en lo sucesivo denominado "plásmido de CT"). Además, se preparó ADN plasmídico como molde de ácido nucleico diana mediante subclonación de parte de la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae (en lo sucesivo denominado "plásmido de NG"). Secuencia del molde del estándar interno (plásmido de CT): (SEC ID nº 1)

(2): Síntesis de cebador de estándar interno y sonda de inhibición

Se diseñaron cebadores con diana en la región del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis y que no presentaban reactividad cruzada con especies relacionadas. La síntesis de los cebadores se encargó a Operon Biotechnologies. La síntesis de las sondas de inhibición se encargó a J-Bio21. CT-FIP: (SEC ID nº 2) 5’-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3’ CT-BIP: (SEC ID nº 3) 5’-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3’ CT-F3: (SEC ID nº 4) 5’-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3’ CT-B3: (SEC ID nº 5) 5’-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3’ CT-LF: (SEC ID nº 6) 5’-AAGATAACCCCGCACGT-3’ CT-LB: (SEC ID nº 7) 5’-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3’ CT-Pr (marcaje TAMRA): (SEC ID nº 8) 5’-ATAACCCCGCACGTGCTTCGAGCAACC-3’

(3): Síntesis de cebador de ácido nucleico diana y sonda de inhibición

Se diseñaron cebadores con diana en la región mtrA de Neisseria gonorrhoeae y que no presentaban reactividad cruzada con especies relacionadas. La síntesis de los cebadores se encargó a Operon Biotechnologies. La síntesis de las sondas de inhibición se encargó a J-Bio21. NG-FIP: (SEC ID nº 9) 5’-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3’ NG-BIP: (SEC ID nº 10) 5’-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC -3’ NG-F3: (SEC ID nº 11) 5’-GCGGTTATCTCTGCATCG-3’ NG-B3: (SEC ID nº 12) 5’-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3’ NG-LF: (SEC ID nº 13) 5’-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3’ NG-LB: (SEC ID nº 14) 5’-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3’ NG-Pr (marcaje BODIPY-FL): (SEC ID nº 15) 5’-CACATTTATGGTCAAACAGTG CGGCAAC-3’

(4): Composición y concentración de reactivo de reacción LAMP

Las concentraciones de reactivos en 30 ml de la solución final de reacción LAMP se ajustaron a los niveles siguientes:

•: Tris-HCl 30 mM (pH 8,8)

•: KCl 15 mM

•: (NH4)2SO4 15 mM

•: MgSO4 12 mM

•: Tween-20 al 0,15%

•: dATP 2 mM

•: dCTP 2 mM

•: dGTP 2 mM

•: dTTP 2,1 mM

•: 38,4 U de ADN polimerasa Bst (New England Biolab)

•: 107 copias del plásmido de CT

•: Cebador estándar interno

CT-FIP 0,8 mM (SEC ID nº 2) y CT-BIP (SEC ID nº 3)

CT-F3 0,1 mM (SEC ID nº 4) y CT-B3 (SEC ID nº 5)

CT-LF 0,4 mM (SEC ID nº 6) y CT-LB (SEC ID nº 7)

•: sonda de estándar interno CT-Pr 0,067 mM (SEC ID nº 8)

•: Cebador de ácido nucleico diana

NG-FIP 0,8 mM (SEC ID nº 9) y NG-BIP (SEC ID nº 10)

NG-F3 0,1 mM (SEC ID nº 11) y NG-B3 (SEC ID nº 12)

NG-LF 0,4 mM (SEC ID nº 13) y NG-LB (SEC ID nº 14)

• sonda de ácido nucleico diana NG-Pr 0,067 mM (SEC ID nº 15)

(5): Detección y determinación del valor cuantitativo

La detección se llevó a cabo mediante el método de la sonda de inhibición. La inhibición de la fluorescencia causada por la amplificación de un material de estándar interno y un ácido nucleico diana se detectó en tiempo real utilizando un sistema Mx3000P (Stratagene). Se determinaron los valores cuantitativos basándose en el hecho de que el valor Tt (el tiempo para que la intensidad de fluorescencia variable con la amplificación alcanzase un nivel determinado) depende de la cantidad inicial de molde.

(6): Evaluación cuantitativa de ácido nucleico diana

Se añadió una serie de dilución de 101 a 107 copias de plásmidos de NG al reactivo de reacción LAMP a modo de ácidos nucleicos diana. La reacción LAMP se llevó a cabo a 63ºC durante 60 minutos, la inhibición de la fluorescencia se sometió a ensayo en tiempo real mediante el método de la sonda de inhibición y se preparó una curva estándar.

Como resultado, la sensibilidad de detección mínima era de 10 copias de plásmido de NG en cada ensayo (fig. 1) y el intervalo del ensayo cuantitativo era de 101 a 107 copias/ensayo (mostrando la curva estándar un coeficiente de correlación R de 0,9994) (fig. 2). Se alcanzó una buena reproducibilidad para tanto los plásmidos de NG como los plásmidos de CT (figs. 1 y 3) y todos los procedimientos de amplificación para las 101 a 107 copias de plásmidos de NG por ensayo se completaron en 60 minutos.

Ejemplo 2: cuantificación de VHB mediante el método LAMP

(1): Molde de ensayo

Se preparó ADN plasmídico mediante subclonación de un ácido nucleico artificial a modo de molde de material de estándar interno (en lo sucesivo denominado "plásmido Arita2"). Además, se preparó ADN plasmídico como molde de ácido nucleico diana mediante subclonación de parte de la región S del VHB (en lo sucesivo denominado "plásmido de VHB"). Secuencia del molde del estándar interno (plásmido Arita2): (SEC ID nº 16)

(2): Síntesis de cebador de estándar interno y sonda de inhibición

5 Se diseñaron cebadores con diana en el ácido nucleico artificial Arita2. La síntesis de los cebadores se encargó a Operon Biotechnologies. La síntesis de las sondas de inhibición se encargó a J-Bio21.

Las sondas de inhibición (SI) son sondas marcadas con fluorescencia que han sido desarrolladas por el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) basándose en el principio de que una sonda de

10 hibridación se hibrida con una secuencia diana y la fluorescencia resulta inhibida por la guanina presente en la secuencia diana (ver las patentes JP nº 3437816 y nº 3985959). Arita2-FIP: (SEC ID nº 17) 5’-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3’ Arita2-BIP: (SEC ID nº 18)

15 5’-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3’ Arita2-F3: (SEC ID nº 19) 5’-GGACAATCGAAGCCAGAA-3’ Arita2-B3: (SEC ID nº 20) 5’-ATCACGGATCGTATGTGG-3’ Arita2-LF: (SEC ID nº 21) 5’-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3’ Arita2-LB: (SEC ID nº 22) 5’-AACGATCGCACTAAGCAT-3’

20 Arita2-Pr (marcaje TAMRA): (SEC ID nº 23) 5’-GCTAGCTAAGTGCCATCCATTCTGCGTACC-3’

(3): Síntesis de cebador de ácido nucleico diana y sonda de inhibición

Se diseñaron sondas con diana en la región S del VHB. La síntesis de los cebadores se encargó a Operon Biotechnologies. La síntesis de las sondas de inhibición se encargó a J-Bio21. VHB-FIP: (SEC ID nº 24) 5’-CCGCAGACACATCCAGCGATAAACCTCCAATCACTCACCAA-3’ HBV-BIP: (SEC ID nº 25) 5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTCCTGGAATTAGAGGACA-3’ HBV-F3: (SEC ID nº 26) 5’-CAAAATTCGCAGTCCC-3’ HBV-B3: (SEC ID nº 27) 5’-GCAGGTCTTGCATGGTCC-3’ HBV-LF: (SEC ID nº 28) 5’-CAGCGATAGCCAGGACA-3’ HBV-LB: (SEC ID nº 29) 5’-TCTGGACTATCAAGGTATGTTGC-3’ HBV-Pr (marcaje BODIPY-FL): (SEC ID nº 30) 5’-GTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCC-3’

(4): Composición y concentración de reactivo de reacción LAMP

•: Tris-HCl 25 mM (pH 8,8)

•: KCl 12,8 mM

•: (NH4)2SO4 12,8 mM

•: MgSO4 9,7 mM

•: Tween-20 al 0,10%

•: dATP 1,79 mM

•: dCTP 1,79 mM

•: dGTP 1,79 mM

•: dTTP 1,79 mM

•: 28,8 U de ADN polimerasa Bst (New England Biolab)

•: 106 copias del plásmido Arita2

•: Cebador estándar interno

Arita2-FIP 0,4 mM (SEC ID nº 17) y Arita2-BIP (SEC ID nº 18) Arita2-F3 0,05 mM (SEC ID nº 19) y Arita2-B3 (SEC ID nº 20) Arita2-LF 0,4 mM (SEC ID nº 21) y Arita2-LB (SEC ID nº 22)

•: sonda de estándar interno Arita2-Pr 0,067 mM (SEC ID nº 23)

•: Cebador de ácido nucleico diana

VHB-FIP 1,6 mM (SEC ID nº 24) y VHB-BIP (SEC ID nº 25) VHB-F3 0,2 mM (SEC ID nº 26) y VHB-B3 (SEC ID nº 27) VHB-LF 0,8 mM (SEC ID nº 28) y VHB-LB (SEC ID nº 29)

•: sonda de ácido nucleico diana VHB-Pr 0,067 mM (SEC ID nº 30)

(5): Detección y determinación del valor cuantitativo

La detección se llevó a cabo mediante el método de la sonda de inhibición. La inhibición de la fluorescencia causada por la amplificación de un material de estándar interno y un ácido nucleico diana se detectó en tiempo real utilizando un sistema Mx3000P (Stratagene). Se determinaron los valores cuantitativos basándose en el hecho de que el valor Tt depende de la cantidad inicial de molde.

(6): Evaluación cuantitativa de ácido nucleico diana

Se añadió una serie de dilución de 101 a 108 copias de plásmidos de VHB al reactivo de reacción LAMP a modo de ácidos nucleicos diana. La reacción LAMP se llevó a cabo a 63ºC durante 60 minutos, la inhibición de la fluorescencia se sometió a ensayo en tiempo real mediante el método de la sonda de inhibición y se preparó una curva estándar.

Como resultado, la sensibilidad de detección mínima era de 10 copias de plásmido de VHB en cada ensayo (fig. 4) y el intervalo del ensayo cuantitativo era de 101 a 108 copias/ensayo (mostrando la curva estándar un coeficiente de correlación R de 0,9996) (fig. 5). Se alcanzó una buena reproducibilidad para tanto los plásmidos de VHB como los plásmidos Arita2 (figs. 4 y 6) y todos los procedimientos de amplificación para las 101 a 108 copias de plásmidos de VHB por ensayo se completaron en 60 minutos.

Ejemplo 3: Influencia de los cambios de concentración de material de estándar interno sobre la detección del VHB

5 Con el fin de examinar la concentración del material de estándar interno necesaria para antes de la amplificación, se determinó que las cantidades del material de estándar interno (plásmido Arita2) eran 102 copias, 104 copias ó 106 copias por ensayo en la detección del VHB.

(1) Composición y concentración de reactivo de reacción LAMP

10 Se utilizaron la composición y concentración del reactivo de reacción utilizadas en el Ejemplo 2, excepto por la cantidad de molde del material de estándar interno.

(2) Cantidad de molde de plásmido de VHB y detección del mismo

15 Se fijaron las cantidades de los moldes de plásmido de VHB en dos niveles: 101 copias y 108 copias por ensayo, y la reacción LAMP se llevó a cabo a 63ºC durante 60 minutos. La inhibición de la fluorescencia de cada cantidad de molde causada por la amplificación de los plásmidos de VHB y un material de estándar interno (plásmido Arita2) se detectó en tiempo real utilizando un sistema Mx3000P (Stratagene) y se determinó el valor Tt.

(3) Resultados

El valor Tt determinado en (2) se muestra en la Tabla 1 y en la fig. 7 como tiempo de amplificación. En el caso de que la concentración del material de estándar interno fuese baja (es decir, 102 copias/ensayo), se amplificó el molde

25 de plásmido de VHB altamente concentrado (108 copias/ensayo) antes de amplificar el material de estándar interno. En consecuencia, se retrasó significativamente la reacción de amplificación del material de estándar interno. La diferencia en el tiempo de amplificación de los materiales de estándar interno entre moldes de plásmido de VHB a dos concentraciones diferentes llegaba a ser de 5,67 minutos. A concentración elevada del material de estándar interno (es decir, 106 copias/ensayo), no se retrasó la reacción de amplificación del material de estándar interno y los

30 tiempos de amplificación de los materiales de estándar interno eran sustancialmente constantes, con independencia de las concentraciones de los moldes de plásmido de VHB. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, para amplificar con rapidez el material de estándar interno en un periodo de tiempo dado con independencia de la cantidad de molde de ácido nucleico diana, resulta necesario fijar la cantidad del molde de material de estándar interno en un nivel elevado. En el presente caso, resulta adecuado seleccionar una cantidad de 106 copias/ensayo.

35 Tabla 1: Tiempo de amplificación del ácido nucleico diana y del material de estándar interno para cada cantidad de molde de material de estándar interno (minutos)

Cantidad de molde (copias/ensayo): Cantidad de molde de estándar interno (copias/ensayo)

106 104 102

101 copias de VHB 108 copias de VHB: 33,9 27,4 22,4 5,90 5,57 5,54

Arita2 (101 copias de VHB): 5,38 6,84 8,33

Arita2 (108 copias de VHB): 5,41 8,41 14,0

Ejemplo 4: Influencia de los cambios de concentración de material de estándar interno sobre la detección del VHB

40 Se examinó la concentración del cebador de estándar interno adecuado para la amplificación anticipada, mediante la modificación de las concentraciones del cebador de estándar interno a x1 (es decir, la concentración utilizada en un sistema que no lleva a cabo la amplificación anticipada de un material de estándar interno), X0,25, X0,3 y X0,5 en el tiempo de la detección del VHB.

(1) Composición y concentración de reactivo de reacción LAMP

[0067] · X1 cebador de estándar interno

50 Arita2-FIP 1,3 !M (SEC ID nº 17) y Arita2-BIP (SEC ID nº 18) Arita2-F3 0,17 !M (SEC ID nº 19) y Arita2-B3 (SEC ID nº 20) Arita2-LF 1,3 !M (SEC ID nº 21) y Arita2-LB (SEC ID nº 22)

Se utilizaron la composición y concentración del reactivo de reacción utilizadas en el Ejemplo 2, excepto por la 55 cantidad de cebador de estándar interno.

(2): Cantidad de molde de plásmido de VHB y detección del mismo

Se fijaron las cantidades de los moldes de plásmido de VHB en dos niveles: 101 copias y 108 copias de los mismos por ensayo, y la reacción LAMP se llevó a cabo a 63ºC durante 60 minutos. La inhibición de la fluorescencia de cada cantidad de molde causada por la amplificación de los plásmidos de VHB y un material de estándar interno se detectó en tiempo real utilizando un sistema Mx3000P (Stratagene) y se determinó el valor Tt.

(3): Resultados

El valor Tt determinado en (2) se muestra en la Tabla 2 y en la fig. 8 como tiempo de amplificación. Con una cantidad grande de cebador de estándar interno (x1), el tiempo de amplificación del plásmido de VHB resultó más prolongado globalmente, y un retraso del tiempo de amplificación en torno al nivel de sensibilidad de detección resultó significativo. Con una cantidad del cebador de estándar interno excesivamente baja (X0,25), el tiempo de amplificación del material de estándar interno variaba según la concentración del plásmido de VHB, resultando difícil completar la reacción de amplificación dentro del periodo de tiempo dado. Por consiguiente, en el presente caso, resulta adecuado seleccionar una concentración de cebador de estándar interno de X0,3.

Tabla 2: Tiempo de amplificación del ácido nucleico diana y del material de estándar interno para cada cantidad de molde de estándar interno (minutos)

Cantidad de molde: Cantidad de cebador de estándar interno

(copias/ensayo): x1 x0,5 x0,3 x0,25

101 copias de VHB: 52,6 34,2 33,9 21,3

108 copias de VHB: 11,4 6,7 5,9 5,3

106 copias de Arita2 (101 copias de VHB): 3,70 4,45 5,38 6,45

106 copias de Arita2 (108 copias de VHB): 3,65 4,43 5,41 7,57

Ejemplo 5: Influencia de la concentración de los componentes reactivos de reacción sobre la detección del VHB

Se examinaron las concentraciones de los componentes reactivos de reacción adecuados para la amplificación anticipada de un material de estándar interno mediante la modificación de las concentraciones de los componentes reactivos de reacción, incluyendo las de los nucleótidos de sustrato en el tiempo de detección del VHB y se examinó la influencia de las mismas.

(1) Composición y concentración de reactivo de reacción LAMP

Se preparó un componente reactivo Ax1 que incluye nucleótidos de sustrato (a una concentración que se utiliza generalmente en un sistema de detección de único ácido nucleico diana) y un componente reactivo x1,2, el cual es un concentración de 1,2 veces de Ax1.

· Componente de reacción Ax1

Tris-HCl 25 mM (pH 8,8)

KCl 10 mM

(NH4)2SO4 10 mM

MgSO4 8 mM

Tween-20 al 0,10%

dATP 1,4 mM

dCTP 1,4 mM

dGTP 1,4 mM

dTTP 1,4 mM

28,8 U de ADN polimerasa Bst (New England Biolab)

En la presente memoria se utilizaron el material de estándar interno (plásmido Arita2), el cebador de estándar interno, la sonda de estándar interno, el cebador del ácido nucleico diana y la sonda del ácido nucleico diana, excepto por el componente reactivo A, y las concentraciones de los mismos utilizados en el Ejemplo 2.

(2) Cantidad de molde de plásmido de VHB y detección del mismo

Se fijaron las cantidades de los moldes de plásmido de VHB en tres niveles: 101 copias, 104 copias y 108 copias de los mismos por ensayo, y la reacción LAMP se llevó a cabo a 63ºC durante 60 minutos. La inhibición de la fluorescencia de cada cantidad de molde causada por la amplificación de los plásmidos de VHB y un material de estándar interno se detectó en tiempo real utilizando un sistema Mx3000P (Stratagene) y se determinó el valor Tt.

(3) Resultados

El valor Tt determinado en (2) se muestra en la Tabla 3 y en la fig. 9 como tiempo de amplificación. Al utilizar la solución de reacción del componente reactivo Ax1, se amplificó un molde de plásmido de VHB altamente concentrado (108 copias/ensayo) antes de la amplificación del material de estándar interno. Sin embargo, al utilizar la solución de reacción 31.2, en primer lugar se amplificó el material de estándar interno y se amplificó dentro de un

10 periodo de tiempo determinado, con independencia de la concentración del molde de plásmido de VHB.

De esta manera, resulta preferible fijar la concentración de un componente reactivo de reacción que incluye nucleótidos de sustrato a un nivel más alto, con el fin de llevar a cabo la amplificación anticipada de un material de estándar interno. En el presente caso, resulta adecuada una concentración de x1,2.

15 Tabla 3: Tiempo de amplificación (minutos) del ácido nucleico diana y del material de estándar interno para cada cantidad de componente reactivo de reacción

Cantidad de molde (copias/ensayo): Componente reactivo A

x1 x1,2

101 copias de VHB: 26,3 31,5

104 copias de VHB 108 copias de VHB: 14,4 17,5 6,10 6,50

Arita2 106 (101 copias de VHB): 6,33 5,35

Arita2 106 (104 copias de VHB): 6,36 5,26

Arita2 106 (108 copias de VHB): 6,83 5,43

Ejemplo 6: Detección de Neisseria gonorrhoeae mediante el método LAMP

(1) Composición y concentración de reactivo de reacción LAMP

En la presente memoria se utilizaron la composición y concentración del reactivo de reacción utilizadas en el Ejemplo 1.

(2) Detección

La reacción LAMP se llevó a cabo a 63ºC durante 60 minutos designando como el ácido nucleico diana el plásmido de NG a alta concentración o el plásmido de NG a baja concentración, y se detectó la inhibición de la fluorescencia

30 en tiempo real mediante el método de sondas de inhibición.

(3) Resultado

Tal como se muestra en las figs. 10 y 11, el material de estándar interno (plásmido de CT) y el ácido nucleico diana

35 (plásmido de NG) pudieron amplificarse en el mismo sistema de reacción y el tiempo de amplificación para el material de estándar interno era constante, con independencia de las concentraciones de los moldes de ácido nucleico diana.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Eiken Kagaku Kabushiki Kaisya

<120> Método de amplificación de ácidos nucleicos y reactivo de medición y kit de reactivos del mismo

45 <130> PH-3716-PCT

<150> JP2007-271902

<151> 2007-10-19

50 <160> 30

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1 55 <211> 428

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 1

<210> 2

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Description of Secuencia artificial: ADN sintético

<400> 2 20 caagcaggac tacaagctgc agcgtttgta ctccgtcac 39

<210> 3

<211> 37

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

30 <400> 3 gcgggcgatt tgccttaact cggtcaacga agaggtt 37

<210> 4

<211> 18 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 4 atgtcggagt ctgagcac 18

<210> 5 45 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 5 cctcagaagt ttatgcactt tc 22

<210> 6

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Description of Art ificial Sequence:synthetic ADN

<400> 6 aagataaccc cgcacgt 17

<210> 7

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 7 ggagcgagtt acgaagaca 19

<210> 8

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 8 ataaccccgc acgtgcttcg agcaacc 27

<210> 9

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 9 cgtggctcaa cacatgaccc aagcgtccgg tcggca 36

<210> 10

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 10 acggagaaag tttacaaccg gacacaaaac aggctcatat ccagc 45

<210> 11

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 11 gcggttatct ctgcatcg 18

<210> 12

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 12 ggtgtcgtag cggaaac 17

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 13 cgggaaaaat acaatatcgc cc 22

<210> 14

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 14 cgacaaaacg gcacatttat gg 22

<210> 15

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 15 cacatttatg gtcaaacagt gcggcaac 28

<210> 16

<211> 600

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 16

<210> 17

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 17 cgcttggata gtcggatgca agggtcaatg gtac 34

<210> 18

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 18 acggtgtatg cttcggtgtg cgaacctatc agc 33

<210> 19

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 19 ggacaatcga agccagaa 18

<210> 20

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 20 atcacggatc gtatgtgg 18

<210> 21

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 21 gctagctaag tgccatcc 18

<210> 22

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 22 aacgatcgca ctaagcat 18

<210> 23

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 23 gctagctaag tgccatccat tctgcgtacc 30

<210> 24

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 24 ccgcagacac atccagcgat aaacctccaa tcactcacca a 41

<210> 25

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 25 catcctgctg ctatgcctca tcttcttgtt cctggaatta gaggaca 47

<210> 26

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético <400> 26 caaaattcgc agtccc 16

<210> 27

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 27 gcaggtcttg catggtcc 18

<210> 28

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 28 cagcgatagc caggaca 17

<210> 29

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 29 tctggactat caaggtatgt tgc 23

<210> 30

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 30 gttggttctt ctggactatc aaggtatgtt gccc 34

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un material añadido de estándar interno, que comprende amplificar un ácido nucleico diana y el material de estándar interno bajo condiciones isotérmicas en una misma solución de reacción, en el que la amplificación del material de estándar interno se lleva a cabo antes de la amplificación del ácido nucleico diana con independencia de la concentración del molde de ácido nucleico diana, evitando de esta manera la influencia de un producto de amplificación de estándar interno sobre la reacción de amplificación del ácido nucleico diana, en el que el material de estándar interno presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador, en el que un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se ha diseñado para hibridarse específicamente con el material de estándar interno pero no para hibridarse con el ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se ha diseñado para hibridarse específicamente con el ácido nucleico diana pero no con el material de estándar interno, en el que se utiliza el cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno que se ha diseñado para causar la amplificación del material de estándar interno antes que la amplificación del ácido nucleico diana, y en el que la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo bajo las condiciones siguientes:

(a)

la concentración del material de estándar interno se fija en 10 veces superior o más y la concentración del cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno se fija en un valor inferior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación simultánea de un material de estándar interno y un ácido nucleico diana, y

(b)

la concentración de un nucleótido de sustrato se fija en un valor superior al de la solución de reacción de amplificación utilizada para un ensayo que implica la amplificación del mismo ácido nucleico diana sin utilizar el material de estándar interno y,

en el que, como cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación del material de estándar interno o utilizado para la amplificación del ácido nucleico diana se utilizan el cebador (1) y/o el cebador (2), en el que, al seleccionarse sucesivamente una primera secuencia arbitraria F1c y una segunda secuencia arbitraria F2c del lado 3' de la secuencia diana de un ácido nucleico molde hacia el extremo 3'-terminal del ácido nucleico de molde, el cebador (1) comprende una secuencia idéntica a F1c y una secuencia F2 complementaria a F2c en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3', y en el que, en el caso de que se seleccionen sucesivamente una tercera secuencia arbitraria R1 y una cuarta secuencia arbitraria R2 del lado 5' de la secuencia diana de un ácido nucleico diana hacia el extremo 5'-terminal del ácido nucleico diana, el cebador (2) comprende una secuencia R1c complementaria a R1 y una secuencia R2 complementaria a R2 en ese orden desde el lado 5' hacia el lado 3'.
2. Método de amplificación de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a)

añadir una solución que contiene un material de estándar interno con una concentración o número de copia conocido a una muestra que contiene un ácido nucleico diana,

(b)

llevar a cabo una reacción de amplificación utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido que se utiliza para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación del material de estándar interno antes de llevar a cabo la amplificación del ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un ácido nucleico diana, y

(c)

llevar a cabo un ensayo por medios que permiten distinguir entre la reacción de amplificación del material de estándar interno y la reacción de amplificación del ácido nucleico diana.
3. Método de amplificación de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a)

añadir una solución que contiene un material de estándar interno con una concentración o número de copia conocido a una muestra que contiene un ácido nucleico diana,

(b)

llevar a cabo una reacción de amplificaicón utilizando una solución de reacción de amplificación que contiene un cebador oligonucleótido utilizado para la amplificación de un material de estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación de un ácido nucleico diana y un cebador oligonucleótido para la amplificación de un ácido nucleico diana, y

(c)

llevar a cabo un ensayo en tiempo real por medios que permiten distinguir entre la reacción de amplificación del material de estándar interno y la reacción de amplificación del ácido nucleico diana y determinar la concentración o número de copia inicial del ácido nucleico diana en una muestra basándose en los resultados del ensayo y en la cantidad de material de estándar interno añadida.
4. Método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se cuantifica el ácido nucleico diana.
5. Método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que 5 comprende detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana.
6. Método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la reacción de amplificación es el método LAMP.

10 7. Reactivo de ensayo o kit de reactivos utilizado para llevar a cabo el método de amplificación de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende por lo menos los reactivos siguientes:

(a)

un material de estándar interno de concentración o número de copia conocido, que presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la del ácido nucleico diana por lo menos en la región de diseño del cebador,

(b)

un cebador oligonucleótido y/o cebador (2) según la reivindicación 1 para la amplificación de un material de

15 estándar interno que permite llevar a cabo la amplificación de un material de estándar interno antes de la amplificación del ácido nucleico diana, y

(c) un cebador oligonucleótido para la amplificación de un ácido nucleico diana.
8. Reactivo o kit de reactivos de ensayo según la reivindicación 7, que comprende además los reactivos 20 siguientes:

(a)

una sonda oligonucleótida para detectar un material de estándar interno, y

(b)

una sonda oligonucleótida para detectar un ácido nucleico diana.