JPWO2009051214A1 - 核酸増幅法、それに用いる試薬及び試薬キット - Google Patents
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Abstract
Description
Y. Mori, et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 59, 145−157, 2004 H. Tani, et al., Analytical Chemistry, 79(15), 5608−5613, 2007
(b)一定の条件下で標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー(以下、内部標準プライマーという。)と標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー(以下、標的核酸プライマーという。)を含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
(c)前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。
(b)一定の条件下で標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー(以下、内部標準プライマーという。)と標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー(以下、標的核酸プライマーという。)を含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
(c)前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。
(b)一定の条件下で標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準プライマー、
(c)標的核酸プライマー。
(a)標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
(b)標的核酸の増幅よりも早いタイミングで(先行して)前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
(c)前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。
(a)標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
(b)標的核酸の増幅よりも早いタイミングで(先行して)前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
(c)前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。
(b)鋳型核酸鎖上の標的配列の5'側から当該鋳型核酸鎖上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3'側にこの順で含むプライマー。
(ii)鎖置換型ポリメラーゼ
(iii)基質ヌクレオチド
アウタープライマーからのヌクレオチド鎖合成は、インナープライマーからのヌクレオチド鎖合成よりも後に開始される必要がある。これを達成する方法として、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く設定する方法などが挙げられる。具体的には、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも、2〜50倍、好ましくは4〜25倍高く設定することにより実施することができる。
(a)少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有する、濃度又はコピー数既知の内部標準物質、
(b)標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
(c)標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)内部標準物質検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ、
及び、
(b)標的核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ。
(1)測定鋳型
内部標準物質鋳型として、クラミジア トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下、CTプラスミドという。)を作製した。また、標的核酸鋳型として、淋菌mtrA領域の一部をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下、NGプラスミドという。)を作製した。
CTCGAGAAGA TTTATCGTAC GCAAATATCA TCTTTGCGGT TGCGTGTCCT GTGACCTTCA 60
TTATGTCGGA GTCTGAGCAC CCTAGGCGTT TGTACTCCGT CACAGCGGTT GCTCGAAGCA 120
CGTGCGGGGT TATCTTAAAA GGGATTGCAG CTTGTAGTCC TGCTTGAGAG AACGTGCGGG 180
CGATTTGCCT TAACCCCACC ATTTTTCCGG AGCGAGTTAC GAAGACAAAA CCTCTTCGTT 240
GACCGATGTA CTCTTGTAGA AAGTGCATAA ACTTCTGAGG ATAAGTTATA ATAATCCTCT 300
TTTCTGTCTG ACGGTTCTTA AGCTGGGAGA AAGAAATGGT AGCTTGTTGG AAACAAATCT 360
GACTAATCTC CAAGCTTAAG ACTTCAGAGG AGCGTTTACC TCCTTGGAGC ATTGTCTGGG 420
CGATCAAC 428
(2)内部標準プライマー及びQuenchingプローブの合成
クラミジア トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Quenchingプローブの合成は、J−Bio21社に依頼した。
CT−BIP:(配列番号3)5'-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3'
CT−F3:(配列番号4)5'-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3'
CT−B3:(配列番号5)5'-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3'
CT−LF:(配列番号6)5'-AAGATAACCCCGCACGT-3'
CT−LB:(配列番号7)5'-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3'
CT−Pr(TAMRA標識):(配列番号8)5'-ATAACCCCGCACGTGCTTCGAGCAACC-3'
(3)標的核酸プライマー及びQuenchingプローブの合成
淋菌のmtrA領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Quenchingプローブの合成は、J−Bio21社に依頼した。
NG−BIP:(配列番号10)5'-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC -3'
NG−F3:(配列番号11)5'-GCGGTTATCTCTGCATCG-3'
NG−B3:(配列番号12)5'-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3'
NG−LF:(配列番号13)5'-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3'
NG−LB:(配列番号14)5'-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3'
NG−Pr(BODIPY−FL標識):(配列番号15)5'-CACATTTATGGTCAAACAGTG CGGCAAC-3'
(4)LAMP反応試薬組成及び濃度
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・15mM KCl
・15mM (NH4)2SO4
・12mM MgSO4
・0.15% Tween20
・2.1mM dATP
・2.1mM dCTP
・2.1mM dGTP
・2.1mM dTTP
・38.4U Bst DNAポリメラーゼ(New England Biolab社)
・107コピー CTプラスミド
・内部標準プライマー
0.8μM CT−FIP(配列番号2)及びCT−BIP(配列番号3)
0.1μM CT−F3(配列番号4)及びCT−B3(配列番号5)
0.4μM CT−LF(配列番号6)及びCT−LB(配列番号7)
・0.067μM 内部標準プローブCT−Pr(配列番号8)
・標的核酸プライマー
0.8μM NG−FIP(配列番号9)及びNG−BIP(配列番号10)
0.1μM NG−F3(配列番号11)及びNG−B3(配列番号12)
0.4μM NG−LF(配列番号13)及びNG−LB(配列番号14)
・0.067μM 標的核酸プローブNG−Pr(配列番号15)
(5)検出及び定量値の算出
検出はQuenching Probe法により行った。内部標準物質及び標的核酸の増幅に伴う蛍光の消光をMx3000P(STRATAGENE社)を用いてリアルタイムに検出した。定量値は、Tt値(増幅によって変化する蛍光強度が特定の値に達する時間)が初期鋳型量に依存することに基づき算出した。
NGプラスミド101から107コピーまでの希釈系列を標的核酸とし、上記LAMP反応試薬に添加した。63℃で60分間LAMP反応を行い、Quenching Probe法による蛍光の消光をリアルタイムに測定し、検量線を作成した。
(1)測定鋳型
内部標準物質鋳型として、人工核酸をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下、Arita2プラスミドという。)を作製した。また、標的核酸鋳型として、HBV S領域の一部をサブクローニングしたプラスミドDNA(以下、HBVプラスミドという。)を作製した。
ATTCGAAGGG TGATTGGATC GGAGATAGGA TGGGTCAATC GTAGGGACAA TCGAAGCCAG 60
AATGCAAGGG TCAATGGTAC GCAGAATGGA TGGCACTTAG CTAGCCAGTT AGGATCCGAC 120
TATCCAAGCG TGTATCGTAC GGTGTATGCT TCGGAGTAAC GATCGCACTA AGCATGGCTC 180
AATCCTAGGC TGATAGGTTC GCACATAGCA TGCCACATAC GATCCGTGAT TGCTAGCGTG 240
ATTCGTACCG AGAACTCACG CCTTATGACT GCCCTTATGT CACCGCTTAT GTCTCCCGAT 300
ATCACACCCG TTATCTCAGC CCTAATCTCT GCGGTTTAGT CTGGCCTTAA TCCATGCCTC 360
ATAGCTACCC TCATACCATC GCTCATACCT TCCGACATTG CATCCGTCAT TCCAACCCTG 420
ATTCCTACGG TCTAACCTAG CCTCTATCCT ACCCAGTTAG GTTGCCTCTT AGCATCCCTG 480
TTACGTACGC TCTTACCATG CGTCTTACCT TGGCACTATC GATGGGAGTA TGGTAGCGAG 540
TATGGAACGG ACTAACGTAG GCAGTAAGCT AGGGTGTAAG GTTGGGACTA AGGATGCCAG 600
(2)内部標準プライマー及びQuenchingプローブの合成
人工核酸Arita2をターゲットとしたプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Quenchingプローブの合成は、J−Bio21社に依頼した。
Arita2−BIP:(配列番号18)5'-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3'
Arita2−F3:(配列番号19)5'-GGACAATCGAAGCCAGAA-3'
Arita2−B3:(配列番号20)5'-ATCACGGATCGTATGTGG-3'
Arita2−LF:(配列番号21)5'-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3'
Arita2−LB:(配列番号22)5'-AACGATCGCACTAAGCAT-3'
Arita2−Pr(TAMRA標識):(配列番号23)5'-GCTAGCTAAGTGCCATCCATTCTGCGTACC-3'
(3)標的核酸プライマー及びQuenchingプローブの合成
HBVのS領域をターゲットとしたプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、Quenchingプローブの合成は、J−Bio21社に依頼した。
HBV−BIP:(配列番号25)
5'-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTCCTGGAATTAGAGGACA-3'
HBV−F3:(配列番号26)5'-CAAAATTCGCAGTCCC-3'
HBV−B3:(配列番号27)5'-GCAGGTCTTGCATGGTCC-3'
HBV−LF:(配列番号28)5'-CAGCGATAGCCAGGACA-3'
HBV−LB:(配列番号29)5'-TCTGGACTATCAAGGTATGTTGC-3'
HBV−Pr(BODIPY−FL標識):(配列番号30)5'-GTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCC-3'
(4)LAMP反応試薬組成及び濃度
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・12.8mM KCl
・12.8mM (NH4)2SO4
・9.7mM MgSO4
・0.10% Tween20
・1.79mM dATP
・1.79mM dCTP
・1.79mM dGTP
・1.79mM dTTP
・28.8U Bst DNAポリメラーゼ(New England Biolab社)
・106コピー Arita2プラスミド
・内部標準プライマー
0.4μM Arita2−FIP(配列番号17)及びArita2−BIP(配列番号18)
0.05μM Arita2−F3(配列番号19)及びArita2−B3(配列番号20)
0.4μM Arita2−LF(配列番号21)及びArita2−LB(配列番号22)
・0.067μM 内部標準プローブArita2−Pr(配列番号23)
・標的核酸プライマー
1.6μM HBV−FIP(配列番号24)及びHBV−BIP(配列番号25)
0.2μMHBV−F3(配列番号26)及びHBV−B3(配列番号27)
0.8μMHBV−LF(配列番号28)及びHBV−LB(配列番号29)
・0.067μM 標的核酸プローブHBV−Pr(配列番号30)
(5)検出及び定量値の算出
検出はQuenching Probe法により行った。内部標準物質及び標的核酸の増幅に伴う蛍光の消光をMx3000P(STRATAGENE社)を用いてリアルタイムに検出した。定量値は、Tt値が初期鋳型量に依存することに基づき算出した。
HBVプラスミド101から108コピーまでの希釈系列を標的核酸とし、上記LAMP反応試薬に添加した。63℃で60分間LAMP反応を行い、Quenching Probe法による蛍光の消光をリアルタイムに測定し、検量線を作成した。
先行増幅に必要な内部標準物質の濃度を調べるため、HBV検出において内部標準物質(Arita2プラスミド)の鋳型量をテストあたり102コピー、104コピー、または106コピーとして検討した。
内部標準物質の鋳型量以外の反応試薬組成、濃度は実施例2と同様とした。
HBVプラスミド鋳型量をテスト当たり101コピー、108コピーの2濃度とし、63℃で60分間LAMP反応を行った。各鋳型量についてのHBVプラスミド、内部標準物質(Arita2プラスミド)の増幅に伴う蛍光の消光をMx3000P(STRATAGENE社)を用いてリアルタイムに検出し、Tt値を求めた。
(2)で求めたTt値を増幅時間として表1及び図7に示した。内部標準物質が低濃度(102コピー/テスト)の場合、高濃度(108コピー/テスト)のHBVプラスミド鋳型が内部標準物質より先に増幅し、その影響を受けて内部標準物質の増幅反応は大きく遅れた。また、HBVプラスミド鋳型2濃度間の内部標準物質の増幅時間の差は5.67分と大きかった。一方、内部標準物質が高濃度(106コピー)の場合には、内部標準物質の増幅の遅れはなく、また、HBVプラスミド鋳型濃度によらず内部標準物質の増幅時間はほぼ一定となった。したがって、内部標準物質を早く、かつ、標的核酸鋳型量に関わらず一定の時間で増幅させるためには、内部標準物質鋳型量を高く設定する必要があり、本検討の場合、106コピー/テストを選択するのが適当である。
先行増幅に適した内部標準プライマー濃度を調べるため、HBV検出において内部標準プライマー濃度を×1(内部標準物質を先行増幅させない系で使用する濃度)、×0.25、×0.3、×0.5と変化させて検討した。
・×1内部標準プライマー
1.3μM Arita2−FIP(配列番号17)及びArita2−BIP(配列番号18)
0.17μM Arita2−F3(配列番号19)及びArita2−B3(配列番号20)
1.3μM Arita2−LF(配列番号21)及びArita2−LB(配列番号22)
なお、内部標準プライマー量以外の反応試薬組成、濃度は実施例2と同様とした。
HBVプラスミド鋳型量をテスト当たり101コピー、108コピーの2濃度とし、63℃で60分間LAMP反応を行った。各鋳型量についてのHBVプラスミド、内部標準物質の増幅に伴う蛍光の消光をMx3000P(STRATAGENE社)を用いてリアルタイムに検出し、Tt値を求めた。
(2)で求めたTt値を増幅時間として表2及び図8に示した。内部標準プライマー量が多い場合(×1)、HBVプラスミドの増幅時間は全体的に遅くなり、感度付近の増幅時間遅延が顕著であった。また、内部標準プライマー量を低減しすぎると(×0.25)、HBVプラスミドの濃度によって内部標準物質の増幅時間が乖離し、一定時間での増幅が困難となった。したがって、本検討の場合、内部標準プライマー濃度として×0.3を選択するのが適当である。
内部標準物質の先行増幅に適した反応試薬成分濃度を調べるため、HBV検出において、基質ヌクレオチドを含む反応試薬成分を変化させ、その影響について検討した。
基質ヌクレオチドを含む試薬成分A×1(単一の標的核酸の検出系で通常使用する濃度)と、その1.2倍濃度の試薬成分×1.2を調製した。
LAMP最終反応溶液30μL中の各試薬濃度を以下のとおりとする。
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
8mM MgSO4
0.10% Tween20
1.4mM dATP
1.4mM dCTP
1.4mM dGTP
1.4mM dTTP
28.8U Bst DNAポリメラーゼ(New England Biolab社)
なお、試薬成分A以外の内部標準物質(Arita2プラスミド)、内部標準プライマー、内部標準プローブ、標的核酸プライマー、標的核酸プローブとその濃度は実施例2と同様とした。
HBVプラスミド鋳型量をテスト当たり101コピー、104コピー、108コピーの3濃度とし、63℃で60分間LAMP反応を行った。各鋳型量についてのHBVプラスミド、内部標準物質の増幅に伴う蛍光の消光をMx3000P(STRATAGENE社)を用いてリアルタイムに検出し、Tt値を求めた。
(2)で求めたTt値を増幅時間として表3及び図9に示した。試薬成分A×1反応液では、高濃度のHBVプラスミド鋳型(108コピー/テスト)が内部標準物質より先に増幅したが、×1.2反応液では、内部標準物質の増幅が先になり、かつ、HBVプラスミド鋳型の濃度に関わらず、一定時間での内部標準物質の増幅が可能となった。
(1)LAMP反応試薬組成及び濃度
実施例1と同様の反応試薬組成及び濃度とした。
高濃度のNGプラスミドまたは低濃度のNGプラスミドを標的核酸として63℃、60分間LAMP反応を行い、Quenching Probe法による蛍光の消光をリアルタイムに検出した。
図10、11に示したとおり、内部標準物質(CTプラスミド)と標的核酸(NGプ ラスミド)の同一反応系での増幅が可能であり、標的核酸の鋳型濃度に関わらず、内部標準物質の増幅時間は一定であった。
Claims (15)
- 内部標準物質を用いる核酸増幅法であって、内部標準物質が標的核酸よりも先行して又は遅延して増幅することを特徴とする前記核酸増幅法。
- 内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法であって、以下の工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅法。
(a)標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
(b)標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
(c)前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により測定する工程。 - 内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法であって、以下の工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅法。
(a)標的核酸を含む試料に濃度又はコピー数既知の内部標準物質を含む溶液を添加する工程、
(b)標的核酸の増幅よりも早いタイミングで前記内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む増幅反応液を使用して増幅反応を行う工程、
(c)前記内部標準物質の増幅反応と前記標的核酸の増幅反応を識別可能な手段により、リアルタイム測定し、その結果及び内部標準物質の添加量から、試料中の初期標的核酸濃度又はコピー数を算出する工程。 - 標的核酸の定量を行うことを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 標的核酸の有無を検出することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 内部標準物質が、少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが、内部標準物質と特異的にハイブリダイズし、標的核酸とハイブリダイズしないように設計され、かつ、標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸と特異的にハイブリダイズし、内部標準物質とハイブリダイズしないように設計されていることを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法であって、標的核酸の増幅より早いタイミングで内部標準物質の増幅が起こるように設計されている内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 以下の条件設定により内部標準物質を標的核酸よりも先行して増幅させることを特徴とする、請求項1から8のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
(a)内部標準物質を標的核酸と同時に増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、内部標準物質の濃度を高く設定すること、及び/又は、内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの濃度を低く設定すること、
及び/又は、
(b)内部標準物質を使用せずに同一の標的核酸を増幅させて測定する際の増幅反応液に比べて、基質ヌクレオチド濃度を高く設定すること。 - 増幅反応を等温条件で行う請求項1から9のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 増幅反応が、以下のプライマー(a)及び/又は(b)を用いるものである請求項1から9のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
(a)鋳型核酸上の標的配列の3'側から該鋳型核酸上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5'側から3'側にこの順で含むプライマー、
(b)鋳型核酸上の標的配列の5'側から該鋳型核酸上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3'側にこの順で含むプライマー。 - 増幅反応がLAMP法である請求項1から9のいずれか1項に記載の核酸増幅法。
- 請求項1から12のいずれか1項に記載の核酸増幅法を実施するために用いることを特徴とする測定試薬又は試薬キット。
- 内部標準物質が標的核酸よりも先行して増幅する核酸増幅法を実施するために用いられ、少なくとも以下の試薬を含むことを特徴とする請求項13記載の測定試薬又は試薬キット。
(a)少なくともプライマー設計領域内において標的核酸と異なる塩基配列を有する、濃度又はコピー数既知の内部標準物質、
(b)標的核酸の増幅よりも早いタイミングで内部標準物質を増幅させうる内部標準物質増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
(c)標的核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー。 - さらに、以下の試薬を含むことを特徴とする請求項14記載の測定試薬又は試薬キット。
(a)内部標準物質検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ、
及び、
(b)標的核酸検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ。
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