CN105132586A - 含猪圆环病毒2型orf2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用。本发明利用腺病毒重组技术，制备了一种内含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒，将该重组腺病毒用做核酸扩增检测方法(NAT)的标准样品，该标准样品具有稳定、制备简单、无生物安全风险的特性，病毒粒子结构与猪原核病毒大体类似，可全程质控病毒DNA提取和扩增检测过程，具有一定量值等特性，适用于猪圆环病毒2型核酸扩增检测方法的质量控制，以及检测试剂和实验室相关能力的评定。

Description

含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用
技术领域
本发明属于动物疫病检测技术领域，涉及一种含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,PCV2)呈世界性分布，在家猪和野猪体内均有发现。目前认为PCV2是全球范围内危害养猪业的一种重要病原，可引起猪的多种疾病，称为PCV2相关性疾病(PCV2-associateddiseases,PCVAD)。PCVAD包括断奶仔猪多系统消耗综合症(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)，猪皮炎和肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)和繁殖障碍等疾病。PCV2感染可造成猪群免疫力下降，可导致多种疫苗免疫失败，并导致猪只死亡率增加，据报道PCV2感染可导致猪场猪只死亡率的增加从2-3％到14-30％不等，对养猪业影响巨大。使用快速、灵敏的PCV2病毒检测方法用于养猪场疫情监测非常重要。
PCV2属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是一种小而无囊膜、二十面体、共价闭合、环状的为单股DNA病毒，基因组大小1.7kb。PCV2主要的保守序列位于ORF2基因，而且PCV1和PCV2基因序列最大的差异也位于ORF2基因内，故目前检测PCV2的NAT方法均以ORF2作为靶标进行设计。目前，基于核酸扩增检测方法(NAT)的特异和高效，国内外报道了很多NAT方法和试剂用于猪场PCV2快速检测。但由于NAT检测方法属于相对复杂的生物测定方法，对于同样的样品，因DNA提取方法效率的不同，寡核苷酸引物、探针的效率不同，不同品牌TaqDNA聚合酶扩增效率的不同都会给检测结果带来差异，甚至出现不同的结果，进而影响结果的判定。
为保证检测质量，评估不同NAT检测方法效力和实验室检测能力，研制均匀、稳定，可进行量值传递的标准样品用于PCV2的检测质控非常必要。但有关PCV2NAT检测的标准样品的研究鲜有报道。目前用于PCV2NAT检测的质控品为灭活病毒和质粒DNA制备，或制备复杂且需要生物安全设施，或虽制备简单，但不能质控DNA提取过程，而且易造成气溶胶污染。因此均存在明显不足之处，不能满足实际需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用腺病毒重组技术，制备了一种内含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒，将该重组腺病毒用做核酸扩增检测方法(NAT)的标准样品，该标准样品具有稳定、制备简单、无生物安全风险的特性，病毒粒子结构与猪原核病毒大体类似、可用于针对猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒的质量控制和评价。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在猪圆环病毒核酸扩增检测中作为标准样品的应用。
本发明所述的含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒为二十面体病毒粒子结构，与猪圆环病毒2型结构基本一致，而且腺病毒背景清楚，使用安全方便，在猪圆环病毒核酸扩增检测中作为标准样品使用可全程质控病毒DNA提取和扩增检测。
本发明提供的含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒是通过如下方法制备：
1)获得用于猪圆环病毒2型检测的ORF2基因序列，如序列表中SEQIDNO：1所示；
所述ORF2基因可以通过合成或者RT-PCR扩增获得，克隆于质粒载体上，例如pMD19-T，该片段是猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒检测的区域。
2)将通过步骤1)获得的PCV2ORF2基因的序列克隆于腺病毒穿梭载体上，例如pacAd5CMVK-NpA，获得重组穿梭质粒，例如CMV-PCV2-ORF2；
在本发明的一个实施方案中：使用KpnI和HindIII对重组质粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭载体pacAd5CMVK-NpA双酶切后，经连接转化构建CMV-PCV2-ORF2重组穿梭质粒，将构建好的质粒经PCR与酶切鉴定，由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。
3)将步骤2)获得的重组穿梭质粒与骨架质粒使用限制性内切酶线性化，纯化后共转染HEK293T细胞，经连续传代获得稳定增殖的重组腺病毒；
在本发明的一个具体实施方案中：应用PacI对重组腺病毒穿梭质粒CMV-PCV2-ORF2与骨架质粒pacAd59.2-100线性化，经胶回收纯化后，共转染HEK293T细胞。同时，对穿梭质粒CMV-GFP与骨架质粒pacAd59.2-100进行相同操作，作为转染对照组；正常的HEK293T作为细胞对照。当转染细胞出现70％以上CPE，且对照组GFP出现大量荧光时，收集各组细胞，记为P0代。经反复冻融3次后，分装保存于﹣80℃。将P0代pacAd5CMV-PCV2-ORF2接种于HEK293细胞中进行连续传代，对第7代重组腺病毒进行鉴定。
4)对所述重组腺病毒鉴定后，于HEK293细胞上进行大量培养，收集病毒，加入冻干保护剂，分装，真空状态下冷冻干燥；
具体地，将第7代pacAd5CMV-PCV2-ORF2接毒细胞、转染对照pacAd5CMV-GFP接毒细胞以及正常HEK293细胞，分别1000g/min离心5min，弃去上清，200μLPBS重悬细胞，分别提取DNA和RNA。对于提取的RNA，利用DNaseI消化其中可能残留的病毒DNA。采用PCR和RT-PCR分别进行扩增鉴定，扩增产物由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。
进一步地，将大量培养的第7代pacAd5CMV-ORF2接毒细胞反复冻融3次后，1000g/min离心10min去除沉淀，按照1％加入海藻糖作为冻干保护剂，无菌条件下按照0.5mL/瓶分装于西林瓶中，真空状态下冷冻干燥24h。
5)将含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒经均匀性、稳定性检验后，通过荧光定量PCR方法和TCID50测定进行定值，即得内含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒标准样品。
具体地，将内含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒冻干后，抽样分别通过荧光PCR和TCID50测定，结果经单因子方差分析，结果显示对于Ct值，F(20,9)＝2.21，<F0.05(2.39)；对于TCID50值，F(10,9)＝1.75，<F0.05(3.02)对于表明样品中被检物是均匀的。不同条件下放置3个月，采用成对双样本均数-t检验进行统计分析结果显示，对于Ct值数据，t值分别为1.59和0.87；对于TCID50数据，t值分别为0.55和0.59。均<t0.05(2.13)表明冻干后样品稳定性良好；定值研究表明标准样品PCV2ORF2基因含量为8.17×109GEq/mL。在HEK293细胞上的TCID50为3.56×107/0.05mL。
本发明制备的含猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒标准样品显著优点是：
1)PCV2主要的保守序列位于ORF2基因，而且PCV1和PCV2基因序列最大的差异也位于ORF2基因内，故目前检测PCV2的NAT方法均以ORF2作为靶标进行设计。该重组腺病毒基因组包含完整的猪圆环病毒2型ORF2基因片段，覆盖了目前所有猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒检测区域。因此该标准样品可用于现有猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂的质量控制。
2)该重组腺病毒制备方式与猪圆环病毒2型相似，可通过接种细胞制备。由于PCV2在细胞上不导致病变，测定不致细胞病变的病毒TCID50较繁琐且受人为因素影响较大，将不致细胞病变病毒的具有检测意义的核酸片段重组到对人和动物危害较小的病毒载体，重组后的病毒能够对特定细胞出现致细胞病变作用，这样对重组病毒的滴度测定间接反映了插入的核酸片段的量。
3)该重组腺病毒标准样品中猪圆环病毒2型的ORF2基因重组于腺病毒基因组DNA中，相比于质粒中裸露的DNA更加易于保存。
4)该重组腺病毒标准样品具有病毒的结构，与阳性被检样品中病毒粒子状态相近，可全程质控病毒DNA提取和扩增检测全过程。且具有一定量值，非常适于作为PCV2检测的标准样品。
5)由于作为载体的腺病毒背景清晰，不存在生物安全问题，非常适合实际检测中使用。
6)本标准样品通过了均匀性和稳定性检验，而且不仅对其内部所含的目的核酸进行了定值，还对其在细胞上的感染性TCID50进行了测定，可用于临床检测样品的定性、定量分析及检测方法和试剂分析灵敏度的评价。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为猪圆环病毒ORF2基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图。
M：DNAMarkDL2000；Lane1：扩增产物；Lane2：阴性对照。
图2为重组穿梭载体CMV-PCV2-ORF2KpnI/HindIII酶切产物和PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
M1：DNAMarkerDL15000；M2:DNAMarkerDL2000；Lane1：CMV-PCV2-ORF2双酶切产物；Lane2：CMV-PCV2-ORF2PCR鉴定结果。
图3穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293T细胞后各组细胞变化特征(400×)。
(a)：对照转染组pacAd5CMV-GFP转染HEK293T细胞10天后的绿色荧光；(b)：转染组pacAd5CMV-PCV2-ORF2转染HEK293T细胞10天后产生的细胞病变；(c)：HEK293Tcells正常对照。
图4稳定性检验中不同条件下不同天数检测Ct值和TCID50变化情况。
(a)：Ct值变化情况；(b)：TCID50变化情况。
图5荧光定量PCR检测10-1～10-5稀释的标准样品DNA结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1、内含猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒的获得及鉴定
1、材料
猪圆环病毒2型QD/2014株核酸及HEK293T、HEK293细胞株由本实验室保存。转染试剂TransfectionReagent购自Mirus公司；复制缺陷型腺病毒表达系统AdenoviralExpressionSystem，购自CellBiolabs公司；pMD19-T及感受态细胞Top10，购自TaKaRa公司。
2、方法
1)引物设计
根据GenBank公布的PCV2国内分离株基因序列(AY424401.1)，利用oligo7软件设计1对引物。用于扩增PCV2的完整ORF2基因，片段大小702bp，扩增引物中引入了KpnI和HindIII酶切位点。同时在多重序列比对基础上设计合成PCV2实时荧光PCR检测用引物和探针。所有引物及探针序列和PCR扩增片段大小见表1。
表1基因克隆和鉴定用引物和探针
2)PCV2ORF2基因的扩增与克隆
以PCV2QD/2014株基因组DNA作为模板，经PCR扩增ORF2基因片段，PCR扩增体系为：PFUDNAPolymerase1μL，10×PCRBuffer5μL，10μmol/L引物PCV2ORF2-F2.5μL，10μmol/L引物PCV2ORF2-R2.5μL，2.5mmol/LdNTPs4μL，DNA模板10μL，灭菌纯化水补至50μL。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收纯化后，克隆于pMD19-T，经鉴定命名为pMD19-T-ORF2，由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。
3)重组腺病毒穿梭载体的构建
使用KpnI和HindIII对重组质粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭载体pacAd5CMVK-NpA分别进行双酶切，酶切产物经胶回收纯化后，连接转化构建CMV-PCV2-ORF2重组穿梭质粒，将构建好的穿梭载体鉴定后，送北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。
4)重组腺病毒在细胞HEK293T中的包装与增殖
应用PacI对重组腺病毒穿梭质粒CMV-PCV2-ORF2与骨架质粒pacAd59.2-100线性化，经胶回收纯化后，共转染HEK293T细胞。同时，对穿梭质粒CMV-GFP与骨架质粒pacAd59.2-100进行相同操作，作为转染对照组；正常的HEK293T作为细胞对照。当转染细胞出现70％以上CPE，且对照组GFP出现大量荧光时，收集各组细胞，记为P0代。经反复冻融3次后，分装保存于﹣80℃。将P0代pacAd5CMV-PCV2-ORF2接种于HEK293细胞中进行连续传代，对第7代重组腺病毒进行鉴定。
5)含PCV2ORF2基因的重组腺病毒的鉴定
将第7代pacAd5CMV-PCV2-ORF2接毒细胞、转染对照pacAd5CMV-GFP接毒细胞以及正常HEK293细胞，分别1000g/min离心5min，弃去上清，200μLPBS重悬细胞，分别提取DNA和RNA。对于提取的RNA，利用DNaseI消化其中可能残留的病毒DNA。使用表1扩增引物分别进行PCR和RT-PCR鉴定，RT反应条件为42℃60min,70℃15min；PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。。扩增产物由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。
3、结果
1)PCV2ORF2基因PCR扩增与克隆结果
选取猪圆环病毒2型ORF2基因片段作为目标区域，以引物对PCV2ORF2-F/PCV2ORF2-R进行扩增，PCR产物电泳可见约702bp的特异性片段，与预期的目的片段大小相符，如图1所示。PCR产物克隆于pMD19-T后命名为pMD19-T-ORF2，插入片度测序结果表明扩增产物是PCV2的完整ORF2基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。
2)重组腺病毒穿梭载体的构建
使用KpnI和HindIII对重组质粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭载体pacAd5CMVK-NpA分别进行双酶切，酶切产物连接转化后获得CMV-PCV2-ORF2重组穿梭质粒，重组穿梭质粒CMV-PCV2-ORF2经HindIII和KpnI双酶切后，得到大小为702bp的目的片段，如图2所示，与预期相符。插入片度测序结果表明扩增产物是PCV2的完整ORF2基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。
3)重组腺病毒在细胞HEK293T中的包装与增殖
重组穿梭质粒与骨架质粒共转染24h后，对照转染组的pacAd5CMV-GFP可见少量荧光5天后，荧光持续加强，10天到最高峰，之后开始减弱；pacAd5CMV-ORF2在共转染5天后，转染的细胞发生明显细胞病变(CPE)，表现为细胞皱缩，细胞变圆，堆积，10天后，CPE更为明显；而正常HEK293T细胞无上述细胞变化，如图3所示。将P0代pacAd5CMV-ORF2、接种于HEK293细胞中进行连续传代，10～12h开始出现CPE，20-48h，90％细胞出现CPE。
4)含PCV2ORF2基因的重组腺病毒的鉴定结果
将第7代pacAd5CMV-PCV2-ORF2接毒细胞、转染对照pacAd5CMV-GFP接毒细胞以及正常HEK293细胞，取细胞沉淀，分别提取DNA和RNA。经PCR和RT-PCR鉴定结果显示：pacAd5CMV-GFP对照与正常HEK293细胞提取的DNA和RNA经(RT-)PCR扩增均无扩增条带，而pacAd5CMV-PCV2-ORF2感染细胞提取的DNA和RNA经(RT-)PCR扩增均有约702bp的扩增条带，扩增产物核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。
实施例2、内含PCV2ORF2基因重组腺病毒标准样品的制备与检验
1、材料
第7代pacAd5CMV-ORF2,由本实验室制备。海藻糖，购自北京中科三环公司。
2、方法
1)内含PCV2ORF2基因重组腺病毒标准样品的分装与冻干
将大量培养的第7代pacAd5CMV-ORF2接毒细胞反复冻融3次后，1000g/min离心10min去除沉淀，按照1％加入海藻糖作为冻干保护剂，无菌条件下按照0.5mL/瓶分装于西林瓶中，真空状态下冷冻干燥24h。
2)标准样品的均匀性检验
随机抽取10管制备的标准品，提取DNA，每份DNA均作103倍稀释。应用建立的PCV2荧光PCR方法在在一次试验中分别测试10份DNA样品，每个样品设3个重复。采用Roche最大二阶导数法获取Ct值；同时测定10管标准品的TCID50，每个测2次。对获得的2组数据分别用单因子方差分析进行统计处理。
3)标准样品的稳定性检验
在以下每种条件下放置6瓶：(1)室温20℃～25℃；(2)冷藏温度2℃～8℃；(3)-20℃。定期取样提取DNA作1000倍稀释后保存于-80℃。3个月后，应用建立的PCV2荧光PCR方法在一次试验中进行测试，采用Roche最大二阶导数法获取Ct值；同时测定标准品的TCID50。将室温和冷藏温度保存条件下样品测定的数据分别与-20℃保存条件下样品测得的数据进行比较，并采用成对双样本均数-t检验进行统计分析。
3、结果
1)含PCV2ORF2基因的重组腺病毒标准样品的分装与冻干
重组腺病毒分装后，以1％海藻糖作为冻干保护剂，真空状态下冷冻干燥24h得到了冻干的PCV2NAT检测标准样品候选物。
2)标准样品的均匀性检验结果
经单因子方差分析，结果显示对于Ct值，F(20,9)＝2.21，<F0.05(2.39)；对于TCID50,值，F(10,9)＝1.75，<F0.05(3.02)对于表明样品中被检物是均匀的。
3)标准样品的稳定性检验结果
不同条件下放置3个月，采用成对双样本均数-t检验进行统计分析结果显示，对于Ct值数据，t值分别为1.59和0.87；对于TCID50数据，t值分别为0.55和0.59。均<t0.05(2.13)表明冻干后样品稳定性良好；不同条件下不同天数检测Ct值和TCID50变化情况见图4。
实施例3、标准样品的定值与应用
1、材料
含PCV2ORF2基因NAT检测重组腺病毒标准样品冻干品，由本实验室制备；引物探针PCV2F，PCV2R和PCV2P，TAKARA公司合成。病毒DNA提取试剂盒，购自天根生物公司；dNTPs(2.5mmol/L)，购自TAKARA公司；TaqDNA聚合酶，购自Promega公司。
2、方法
1)含PCV2ORF2基因NAT检测重组腺病毒标准样品的定值(GEq/mL测定)
定值方法为将纯化的质粒pMD19-T-ORF2，通过测定其260nm和280nm的吸光度值，通过分子量计算出其拷贝数，进一步系列稀释制成一系列外标品。应用建立的PCV2荧光PCR方法来间接测定标准品的拷贝数。
2)含PCV2ORF2基因NAT检测重组腺病毒标准样品的定值(TCID50测定)
取冻干的pacAd5CMV-ORF2，用0.5mL灭菌水还原，做10倍梯度稀释(10-1～10-10)，测定pacAd5CMV-ORF2的TCID50。
3)应用研究
DNA提取：使用天根生物病毒DNA提取试剂盒分别提取标准样品，正常HEK293细胞以及PBS对照DNA。对于提取的标准样品DNA作10-1～10-5稀释，各个稀释度与原液一起上机检测。
荧光PCR反应液配制：每个反应需要荧光PCR反应液15μL，组成10×PCRBuffer2.5μL，引物PCV2F(10μmol/L)0.5μL，引物PCV2R(10μmol/L)0.5μL，探针PCV2P(10μmol/L)0.3μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，dNTPs(2.5mmol/L)1μL，补灭菌纯化水至14.75μL
加样：荧光PCR扩增反应体系为25μL，每个样品测试反应体系需要14.75μL荧光PCR反应液和0.25μLTaqDNA聚合酶，然后每管分别加入提取的DNA溶液10μL，
上机反应：将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。按如下循环条件设置反应：
第一阶段，预变性92℃/3min；
第二阶段，92℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
结果判定：阴性无Ct值并且无扩增曲线。阳性Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线。有效原则Ct>35的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。
3、结果
1)含PCV2ORF2基因NAT检测重组腺病毒标准样品GEq/mL测定
将104～108质粒GEq/ml的pMD19-T-ORF2与1000倍稀释的标准样品DNA同时采用荧光定量PCR检测，经线性回归，获得标准样品候选物PCV2ORF2基因含量为8.17×109GEq/mL。
2)含PCV2ORF2基因NAT检测重组腺病毒标准样品TCID50测定
取冻干的pacAd5CMV-ORF2，用0.5mL灭菌水还原，做10倍梯度稀释(10-1～10-10)，测定pacAd5CMV-ORF2的TCID50。在HEK293细胞上的TCID50为3.56×107/0.05mL。
3)应用研究结果
制备的标准样品DNA原液及各个稀释度DNA容液检测后出现典型的扩增曲线且Ct值均小于35，PBS对照HEK293细胞提取的DNA经检测无Ct值并且无扩增曲线，与预期结果相符。表明该装制备的标准样品可实现对样品DNA提取和扩增检测过程的全程质量控制，可作为阳性标准样品应用到PCV2荧光PCR检测方法中。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在猪圆环病毒核酸扩增检测中作为标准样品的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒是通过下述方法制备的：
1)获得用于猪圆环病毒2型NAT检测的ORF2基因序列，如序列表中SEQIDNO：1所示；
2)将步骤1)获得的PCV2ORF2基因的序列克隆于腺病毒穿梭载体上，获得含猪圆环病毒2型ORF2基因序列的重组穿梭质粒；
3)将步骤2)获得的重组穿梭质粒与骨架质粒使用限制性内切酶线性化，纯化后共转染细胞，经连续传代获得稳定增殖的重组腺病毒；
4)对所述重组腺病毒鉴定后，于HEK293细胞上进行大量培养，收集病毒，加入冻干保护剂，分装，真空状态下冷冻干燥；
5)对重组腺病毒经均匀性、稳定性检验后，通过荧光定量PCR方法和TCID50测定进行定值，即得含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒标准样品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述腺病毒穿梭载体为pacAd5CMVK-NpA。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述骨架质粒为pacAd59.2-100。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述转染细胞为HEK293T细胞。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述冻干保护剂为海藻糖。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，定值后，含猪圆环病毒2型ORF2基因含量为8.17×109GEq/mL，在HEK293细胞上的TCID50为3.56×107/0.05mL。
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