CN103571865A - 内含a型流感病毒m基因装甲rna标准物质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种A型流感病毒核酸检测装甲RNA标准物质。该标准物质是利用MS2噬菌体装甲RNA技术，将A型流感病毒M基因用MS2噬菌体的衣壳蛋白包装而成，本发明制备的标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，适用于A型流感病毒以M基因为靶标的核酸检测方法的质量控制，以及检测试剂和实验室能力的评价。

Description

内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质

技术领域

本发明属于疫病检测技术领域，涉及一种内含A型流感病毒M基因的装甲RNA标准物质，可用于针对A型流感病毒M基因建立的核酸检测方法和试剂的质量控制和评价。

背景技术

A型流感病毒感染范围很广，能引起人和动物流感的流行和大流行，历史上多次流感的暴发均由A型流感病毒引起，如2004年东南亚发生的高致病性禽流感和2009年席卷全球的甲型H1N1流感等。几乎所有的动物流感均由A型流感引起，主要有禽流感，猪流感，马流感等。由于流感的发生对动物和人类健康构成了巨大威胁，因此全球对它高度关注，虽然各国对动物流感防制策略不尽相同，但都把动物流感的快速诊断和及时监测作为首要步骤。核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为A型流感病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。

A型流感病毒（Influenza Virus）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），为单股负链RNA病毒，其基因组由8个RNA节段组成，其中第7片段M基因最为保守，是流感病毒通用核酸检测的主要靶基因。目前，国内外针对A型流感病毒M基因建立了多种核酸检测方法，其中应用最多是RT-PCR和荧光RT-PCR方法，市场上也有多种不同厂家生产的核酸检测试剂盒，这些试剂盒在检测特异性、灵敏度等方面均有不同，直接影响检测结果的一致性和准确性。此外，目前A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂使用的质控样品多选择灭活的全病毒、质粒DNA和体外转录cRNA制备，灭活的全病毒存在生物安全隐患，裸露核酸又极易被广泛存在的核酸酶降解，且不能实现核酸提取过程的有效监控，难以保证检测结果的准确性。因此，研制一种既稳定又没有传染性可用于A型流感病毒通用核酸检测的质控样品和标准物质对于其检测方法和试剂的标准化、规范化使用及临床检测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用MS2噬菌体装甲RNA技术，制备了一种内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，该标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，可用于多种A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂盒的质量控制。

本发明提供的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质是通过如下方案制备：

1）获得用于A型流感病毒核酸检测的M基因序列，如序列表中SEQ ID NO：1所示；

所述M基因可以通过合成或者RT-PCR扩增获得，该片段覆盖了目前多数A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域。

2）将包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的序列及通过步骤1）获得的M基因序列克隆于原核表达载体；

具体的：将MS2噬菌体基因组中5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列克隆于原核表达载体pET32a中，在其下游插入M基因的cDNA序列，获得表达载体pET32a-ACP-IVM。

3）将原核表达载体转入表达菌株中，诱导表达，然后采用超声波裂解，离心，收集上清液，获得表达产物；

具体的：将pET32a-ACP-IVM质粒转化表达菌株BL21（DE3），阳性菌落接种到含氨苄霉素(100mg/L)LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.6时加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）至终浓度1mmol/L，诱导5h，收集菌体采用超声波裂解处理(200W，间隔10s，共超声作用30次)，12000r/min离心20min，收集上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到表达产物。

4）经Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化，去除残留质粒DNA，得到内含A型流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒（VLPs）。

5）将内含流感病毒M基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT-PCR方法定值，稀释分装，即得内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质。

发明人发现装甲RNA VLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。因此，要去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。现有技术中通常使用蔗糖密度梯度离心对表达产物进行纯化，但该方法无法去除DNA，因此，本发明采用了Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化结合的方式，解决了上述技术问题。

具体的：将获得的表达产物用Cellufine sulfate树脂柱纯化，以去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。取10倍柱体积的平衡缓冲液（含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5）平衡Cellufine sulfate树脂柱，流速3mL/min；将表达上清液上柱结合，上样流速3mL/min，之后利用平衡缓冲液冲洗约10个柱体积；用洗涤缓冲液I（含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5）洗脱30个柱体积以上。用洗脱缓冲液II（含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5）洗脱，分管收集作为VLPs溶液。

VLPs溶液中加入固体聚乙二醇（PEG6000）至终浓度为10％(W／V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴4h以上使VLPs形成沉淀，4℃11000r/min离心10min，用适量RNase free dH2O悬浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中残留的质粒DNA，加入等体积的氯仿CH₃Cl抽提后4℃11000r/min离心10min，回收含VLPs的水相，即为内含流感病毒M基因的装甲RNA（AR-IVM）悬浮液。

本发明所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质中没有质粒DNA的残留。

进一步地，将内含流感病毒M基因的装甲RNA溶液通过荧光定量RT-PCR方法定值后，稀释分装后作为标准物质使用，内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质的浓度为10⁶copies/μL。

本发明还要保护内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质在A型流感病毒核酸检测中作为标准物质的应用。

本发明制备的装甲RNA标准物质的显著优点是：

1）该装甲RNA内部包含的M基因片段，覆盖了目前多数A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域，如国家标准GB/T27539-2011《A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》，2009年WHO CDC和我国卫生部推荐的《A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》等。因此该标准物质可用于现有A型流感病毒通用核酸检测方法和试剂的质量控制

2）该装甲RNA标准物质纯度高，无质粒DNA残留，具有良好的质控性能。装甲RNA VLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。研究中，我们试图通过超速离心、病毒沉淀以及DNase消化的方法纯化VLPs，结果发现残留质粒DNA均无法彻底去除。为此，我们进行了多种方法的尝试，包括硅粉吸附、超速离心以及Cellufine Sulfate亲和层析法等试验，结果证实，采用Cellufine Sulfate亲和树脂柱纯化，聚乙二醇沉淀，加入DNase消化后可彻底去除残留质粒DNA。

3）该装甲RNA标准物质内部的M基因由MS₂噬菌体的衣壳蛋白包裹，可耐受RNase降解，相比于体外转录的裸露RNA更加稳定，易于保存。

4）该装甲RNA模拟了天然病毒的结构，可与临床样本一样参与核酸提取和扩增等环节，实现对检测过程的全程质控，确保检测结果的真实可靠；

5）该装甲RNA无生物传染性，易于制备和运输，相比于增殖的病毒粒子，更适合临床推广使用；

6）该装甲RNA标准物质对其内部所含的目的核酸通过荧光定量RT-PCR方法进行了定值，可用于检测样品的定量分析及检测方法和试剂检测极限的评价。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为A型流感病毒M基因RT-PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

M：DNA Mark DL2000；Lane1和2：阳性扩增产物；Lane3：阴性对照。

图2内含A型流感病毒M基因装甲RNA PCR和RT-PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图；

Lane1和5：阴性对照，Lane2、3和4：分别为1μL、2μL、4μL装甲RNA样品的RT-PCR结果，M：DL5000DNA Marker，Lane6、7和8：分别为1μL、2μL、4μL装甲RNA样品未反转录的PCR结果。

图3内含A型流感病毒M基因装甲RNA实时荧光RT-PCR鉴定结果。

图4荧光RT-PCR对A型流感病毒装甲RNA标准物质均匀性检测结果。

图5国家标准GB/T27539-2011《A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》检测10倍系列稀释装甲RNA标准物质的结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的

试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1、内含A型流感病毒M基因装甲RNA的获得及鉴定

1、材料

流感病毒A/Swine/2003（H1N1）由本实验室保存。根据GenBank公布的MS2噬菌体基因组序列（登录号分别为EF112445），人工合成MS2噬菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点序列约1781bp，序列中还引入了BamHⅠ/KpnⅠ酶切位点，如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2、方法

1）引物设计

根据GenBank公布的SIV基因组序列（登录号为GU047344），利用oligo6软件设计引物。引物对SIVCF/SIVCR用于扩增SIV最为保守的M基因，片段大小758bp，扩增引物中引入了BamHⅠ/NotⅠ酶切位点，扩增片段覆盖了目前多数SIV通用核酸检测方法和试剂盒检测的区域。引物对SIVPF/SIVPR用于鉴定检测SIV M基因，该引物对位于M基因内部，扩增片段大小约496bp。同时参照国家标准GB/T27539-2011《动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》合成SIV M基因实时荧光RT-PCR检测用引物和探针。所有引物及探针序列和PCR扩增片段大小见表1。

表1基因克隆和鉴定用引物和探针

2）A型流感病毒M基因的扩增

提取流感病毒A/Swine/2003（H1N1）基因组RNA作为模板，RT-PCR扩增M基因片段，RT-PCR体系为：PFU DNA Polymerase10X Buffer with MgSO₄5μL，10μM引物SIVCF2μL，10μM引物SIVCR2μL，2.5mmol/L dNTPs4μL，10U/μL AMV反转录酶0.4μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.6μL，RNA模板2μL，PFU DNA Polymerase（2–3u/μL）1μL，RNasefree dH₂O补足50μL。RT-PCR反应条件为42℃反转录45min；95℃变性5min；94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec min，35个循环；72℃7min。PCR扩增产物经过电泳、回收、纯化后进行测序。

3）装甲RNA表达载体的构建

将合成的MS2噬菌体基因组序列经BamH I/Kpn I消化，定向克隆于pET32a表达载体中，转化Trans10感受态细胞，经双酶切鉴定筛选获得阳性质粒，命名为pET32a-ACP，随后将M基因经限制性内切酶BamH I/Not I消化，定向克隆于pET32a-ACP表达载体中，转化Trans10感受态细胞，经双酶切鉴定筛选获得阳性重组质粒，命名为pET32a-ACP-IVM，送北京英骏生物技术有限公司测序鉴定。

4）装甲RNA VLPs的诱导表达

将pET32a-ACP-IVM质粒转化表达菌株BL21（DE3），阳性菌落接种到含氨苄霉素(100mg/L)LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.6时加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）至终浓度1mmol/L，诱导5h，收集菌体采用超声波裂解处理(200W，间隔10s，共超声作用30次)，12000r/min离心20min，收集上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到表达产物。

5）装甲RNA VLPs的纯化

将获得的表达产物用Cellufine sulfate病毒纯化树脂柱纯化，以去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。具体过程为：取10倍柱体积的平衡缓冲液（含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5）平衡Cellufine sulfate柱，流速3mL/min；将表达上清液上柱结合，上样流速3mL/min，之后利用平衡缓冲液冲洗约10个柱体积；用洗涤缓冲液I（含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5）洗脱30个柱体积以上。用洗脱缓冲液II（含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5）洗脱，分管收集作为VLPs溶液。

5）装甲RNA VLPs的DNase处理

VLPs溶液中加入固体聚乙二醇（PEG6000）至终浓度为10％(W／V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴4h以上使VLPs形成沉淀，4℃11000r/min离心10min，用适量RNase freedH2O悬浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中残留的质粒DNA，加入等体积的氯仿CH₃Cl抽提后4℃11000r/min离心10min，回收含VLPs的水相，即为内含流感病毒M基因的装甲RNA病毒样颗粒悬浮液。

6）装甲RNA VLPs的鉴定

为鉴定所制备的装甲RNA病毒样颗粒含有流感病毒M基因RNA且没有质粒DNA残留，将制备的装甲RNA VLPs悬液，利用

Mini Kit提取RNA，将提取的RNA分作两份：一份进行RT-PCR扩增；另外一份不经反转录，直接进行PCR扩增。取扩增产物12μL在1.5%琼脂糖凝胶中120V电泳25min，置紫外凝胶成像系统中观察电泳结果。同时，提取RNA分作两份进行实时荧光RT-PCR鉴定，一份加入反转录酶，一份不加反转录酶。

3、结果

1）A型流感病毒M基因的扩增

选取A型流感病毒最为保守的M基因片段作为目标区域，以引物对SIVCF/SIVCR扩增，PCR产物电泳可见约758bp的特异性片段，与预期的目的片段大小相符，如图1所示。测序结果表明扩增产物是A型流感病毒的M基因，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2）装甲RNA病毒样颗粒（VLPs）表达载体的构建

将MS2噬菌体基因组中5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列（ACP基因片段），定向克隆于表达载体pET32a中，提取质粒经Kpn I和BamH I双酶切鉴定阳性质粒，琼脂糖凝胶电泳结果可见约1781bp的目的条带和约5kb的载体条带，与预期大小相符。然后将M基因定向克隆于表达载体pET32a-ACP中，经限制性酶切消化鉴定，获得阳性表达载体pET-32a-ACP-IVM，测序结果表明M基因正确克隆到载体上。

3）装甲RNA VLPs的鉴定

将利用Cellufine sulfate亲和层析法纯化和PEG6000沉淀的VLPs加入DNase作用后，分别取1μL、2μL和4μL装甲RNA悬浮液，利用Mini Kit提取RNA，利用检测引物分别进行直接PCR和RT-PCR。电泳结果显示RT-PCR扩增后出现相应大小的目的条带，而直接PCR扩增没有出现目的条带（图2所示）。实时荧光RT-PCR检测结果进一步证实，加入反转录酶可出现典型扩增曲线，而不加反转录酶则不会出现扩增曲线（图3所示）。这些结果表明所制备的装甲RNA病毒样颗粒包裹了流感病毒M基因RNA片段，且没有质粒DNA的残留，可用于装甲RNA标准物质的制备。

实施例2、内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质的制备

1.内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质的定值

将实施例1中获得的装甲RNA病毒样颗粒所含M基因的拷贝数进行定值，定值方法为将扩增获得的流感病毒的M基因，克隆于PGEM－Teasy载体中，之后按照Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7(Cat#P1300、Lot#125575)试剂盒进行体外转录获得M基因cRNA，用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值，通过分子量计算出其拷贝数，经10倍系列稀释制成一系列外标品。将实施例1中获得的装甲RNA病毒样颗粒提取RNA后与系列外标品，用国家标准GB/T27539-2011规定的A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法同时进行检测。将系列外标品检测获得的Ct值作为定量参数对不同稀释度所含模板拷贝数的对数值做线性回归，绘制标准曲线，并获得标准回归方程，将待测装甲RNA病毒样颗粒测定的Ct值引入标准曲线线性回归方程，计算获得其核酸拷贝数。

2.标准物质的稀释、分装和保存

根据上述的定值结果，用PBS将实施例1中获得的装甲RNA病毒样颗粒稀释至10⁶copies/μL，充分混匀后分装入冻存管中，每支0.5mL，置-80℃保存

实施例3、标准物质的验证

1、标准物质的均匀性检验

随机分别抽取10管制备好的标准物质，提取RNA，应用国家标准GB/T27539-2011《动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》在相同条件下一次进行检测，检测结果见图4。将获取的Ct值数据采用单因子方差分析进行统计处理，结果其变异系数为3.25%，均小于5%，表明样品中目的核酸片段含量是均匀的。

2、标准物质的稳定性检验

1）不同保存条件的稳定性试验

随机分别抽取制备的标准物质，在以下每种条件下放置10支：1，室温20-25℃，相对湿度20%-50%，14天取出进行测试；2，冰箱冷藏温度2-8℃，3个月取出进行测试；3，-20℃，6个月后取出进行测试；4，对照，-80℃，其余标准品均置于-80℃长期放置保存作为对照。采用国家标准GB/T27539-2011《动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》进行，将检测组与对照组（-80℃）数据作t检验分析表明检测组与对照组差异均无统计学意义（P>0.5）,该标准物质在-20℃和4℃可至少保存3个月以上，室温保存期至少14天，该标准物质具有具有良好的稳定性。

2）RNase攻击试验

随机抽取制备好的标准物质20管，另取2管SIV基因组裸露RNA，作为对照。分两组进行试验，一组加入RNase A（1μg/mL）37℃放置60min，另一组不做处理。之后同时提取RNA进行实时荧光RT-PCR检测，观察标准物质的耐RNase特性。结果裸露RNA经RNase A处理后，检测为无Ct值且无扩增曲线；装甲RNA标准物质RNase处理组和对照组实时荧光RT-PCR检测数据作t检验分析，结果表明差异均无统计学意义（P>0.5），说明制备的装甲RNA标准物质能够抵抗RNase的降解。

实施例4、标准物质在国家标准规定的核酸检测技术中的实际应用

1．应用方法

GB/T27539-2011《动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》。

2.引物和探针

依据GB/T27539-2011《动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》合成相应的引物和探针，上游引物5’-GTC TTC TAA CCG AGG TCG AAA C-3’(SEQ IDNO：10)，下游引物5’-AAG ATC TGT GTT CTT TCC TGC AAA-3’(SEQ ID NO：11)，探针5’-(FAM)-CCC TCA AAG CCG AGA TCG C–(TAMRA)-3’（SEQ ID NO：12）。

3.A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测

样品：内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，灭活的流感病毒A/Swine/2003（H1N1），PBS溶液，临床样品。

核酸提取：按照GB/T27539-2011的规定的核酸提取方法提取RNA，将提取好的RNA溶于11μLDEPC水中。

荧光RT-PCR反应液配制：按照GB/T27539-2011的规定的方法配制，每个反应需要荧光RT-PCR反应液20μL，组成10×PCR Buffer1.25μL，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物（10μmol/L）0.5μL，探针（10μmol/L）0.4μL，MgCl2（25mmol/L）0.75μL，dNTPs（25mmol/L）0.1μL，Taq酶0.25μL，RT-PCR反转录酶颗粒0.25颗，补H2O（RNase-free）至15μL

加样：荧光RT-PCR扩增反应体系为25μL，每个样品测试反应体系需要15μL荧光RT-PCR反应液，之后每管分别加入提取的RNA溶液10μL，

上机反应：将PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。按如下循环条件设置反应：

第一阶段，反转录42℃/30min；

第二阶段，预变性92℃/3min；

第三阶段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；

第四阶段，92℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

结果判定：阴性无Ct值并且无扩增曲线。阳性Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线。有效原则Ct>30的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

4.A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测极限测定

将实施例2制备的装甲RNA标准物质，按照国家标准GB/T27539-2011的核酸提取方法提取RNA，然后经10倍系列稀释制成一系列标准品（（10⁷-10⁰copies/10μL），按国标规定的A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法对系列标准品进行检测，测定其检测极限。

5.标准物质检测结果及质控性能评价

实施例2中制备的装甲RNA标准物质和灭活的流感病毒A/Swine/2003（H1N1）检测后出现典型的扩增曲线且Ct值均小于30，PBS等阴性样品无Ct值并且无扩增曲线，与预期结果相符。表明该装甲RNA标准物质可实现对样品核酸提取和检测过程的全程质量控制，可作为阳性质控样品应用到国家标准规定的A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法中。

6.A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测极限测定

按国标规定的A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法，对10倍系列稀释制成一系列标准品进行检测，检测结果见图5，结果表明该检测方法的检测限约10copies/反应，实施例5、标准物质在世界卫生组织（WHO）规定的核酸检测技术中的实际应用

1.应用方法

世界卫生组织（WHO）推荐的《A型流感病毒实时荧光RT-PCR技术》。

2.引物和探针的合成

依据WHO推荐美国CDC提供的A型流感病毒实时荧光RT-PCR技术合成，序列为(5’-3’)：

InfA Forward：GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C（SEQ ID NO：13）

InfA Reverse：AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA（SEQ ID NO：14）

InfA Probe：(FAM)-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-(BHQ1)（SEQ IDNO：15）

3.A型流感病毒实时荧光RT-PCR检测

样品：内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，灭活的流感病毒A/Swine/2003（H1N1），PBS溶液，临床样品。

核酸提取：同实施例4核酸提取方法或使用其它商品化的RNA提取试剂盒。

荧光RT-PCR反应液配制：每个反应需要荧光RT-PCR反应液20μL，组成为无核酸酶去离子水5.5μL，上游引物（40μM）0.5μL，下游引物（40μM）0.5μL，探针（10μM）0.5μL，RT-PCR酶混合物0.5μL，RT-PCR反应液12.5μL，总体积20.0μL

加样：荧光RT-PCR扩增反应体系为25μL，每个样品测试反应需要20μL荧光RT-PCR反应液，之后每管分别加入提取的RNA溶液10μL，

上机反应：将PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。按如下循环条件设置反应：

第一阶段，反转录50℃/30min；

第二阶段，预变性95℃/2min；

第三阶段，95℃/15s，55℃/30s，45个循环；在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果

结果判定：阴性无Ct值并且无扩增曲线。阳性Ct值≤40，且出现典型的扩增曲线，。有效原则Ct>40的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

4.标准物质检测结果及质控性能评价

实施例2中制备的装甲RNA标准物质和灭活的流感病毒A/Swine/2003（H1N1）检测后出现典型的扩增曲线且Ct值均小于30，PBS等阴性样品无Ct值并且无扩增曲线，与预期结果相符。表明该装甲RNA标准物质可实现对样品核酸提取和检测过程的全程质量控制，可作为阳性质控样品应用到WHO规定的A型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法中。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (5)

1.一种内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于：它是通过如下方法制备：

1）获得用于A型流感病毒核酸检测的M基因序列，如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2）将包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的序列及通过步骤1）获得M基因序列克隆于原核表达载体；

3）将原核表达载体转入表达菌株中，诱导表达，然后采用超声波裂解，离心，收集上清液，获得表达产物；

4）经Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化，去除残留质粒DNA，得到内含A型流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒。

5）将内含流感病毒M基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT-PCR方法定值，稀释分装，即得。

2.根据权利要求1所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于：步骤4）中，具体过程为：取平衡缓冲液平衡Cellufine sulfate树脂柱，将表达产物上柱结合，用洗涤缓冲液I洗脱，再用洗脱缓冲液II洗脱，收集含装甲RNA病毒颗粒的溶液；然后用固体聚乙二醇进行沉淀，再利用DNase I消化残留的质粒DNA，得到内含流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒，其中，平衡缓冲液为含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗涤缓冲液I为含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗脱缓冲液II为含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。

3.根据权利要求1或2所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于：内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质中没有质粒DNA的残留。

4.根据权利要求3所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质，其特征在于，内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质的浓度为10⁶copies/μL。

5.权利要求1-4中任一所述的内含A型流感病毒M基因装甲RNA标准物质在A型流感病毒核酸检测中作为标准物质的应用。

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