CN104388582A - A型通用流感病毒的数字pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

A型通用流感病毒的数字pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒，包括逆转录酶、数字PCR缓冲液PCR MasterMix、A型流感病毒基因标准品，数字PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；特异性探针A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；并采用数字PCR检测方法，方法简单，时间快结果准确。

Description

A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒机检测方法，可应用于A型通用流感病毒引起的实验室应急检测。
背景技术
目前，原有的定量PCR对原有的样本核酸只能进行相对定量，需要依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，是对起始样品的绝对定量。依靠Ct值常不能很好分辨：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。而目前的荧光检测方法周期长，且对病毒是否为阳性的检测存在不确定结果，导致多次检测，或检测结果不准确。
发明内容
本发明要解决上述现有技术存在的问题，提供一种能够直接数出DNA分子的个数的方法，大大提高了检测灵敏度、精确性，适合重大传染病的早期筛查。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒，包括逆转录酶、数字PCR缓冲液PCRMasterMix、A型流感病毒基因标准品，数字PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，上游引物、下游引物和特异性探针序列如下：
上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
特异性探针A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’；
其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；
其中A型流感病毒基因标准品序列如下：
GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT。
其中数字PCR检测试剂盒中组分含有：
这种A型通用流感病毒的数字PCR检测方法，按照以下步骤进行：
(1)打开两份病毒核酸样品放入试管中，分别放入水浴42℃，金属浴65℃中，提取病毒核酸待检样本RNA；
(2)在试管中加入10ul的逆转录酶，10ul的逆转录酶由5ul的RNA模版、3ul的dH2O、1ul的Oligo或Random6引物、1ul的dNTP组成，将待检样本RNA逆转录为cDNA；
(3)在65℃环境中放置5min，然后在冰上快速冷却；该步通过RNA模板变性增强反转录效果
(4)加入4.5ul的dH2O、4ul的5*buffer、1ul的RTase和0.5ul的TNase抑制剂；
(5)轻轻混合均匀，在42℃的环境中放置30～60min；
(6)在95℃5min灭活酶，冰中保存；
(7)体系加入样本模板cDNA，每个20ul反应体系中含10ul数字PCR缓冲液PCRMasterMix，250nM探针，900nM引物，反应温度为：先95℃10min，再94℃30s→58℃60s，这样不停地循环变换温度40次；然后放在98℃的温度下10min，4℃保存或分析。温度变换的作用是荧光信号嵌入到病毒核酸中，使紫外读取仪能识别病毒，如果是阴性样品，随着仪器温度的升降，探针中荧光信号并不能嵌入，所以仪器判读结果为无信号。
(8)通过仪器读取20000个微孔中的荧光值。
这种数字PCR原理是微滴化处理，将每个样品分形成20,000个液滴，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器孔中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
为了进一步完善PCR仪器对于检测病毒量少的样本，ct值介于30～40之间的阳性不确定情况，本实验大大提高微量检测能力，进一步完善检测下限，给出更可靠的数据，进一步完善检测精确度，使样本核酸载量不再依靠标准品来推算，避免得出结果值波动幅度，明确定量样品中的核酸数量。
本发明有益的效果是：本发明提供的检测试剂和方法不但对于A型通用流感病毒灵敏度高，而且检测快速(通常只需4-5小时)，能够及时满足疾病防控需求，提高检测灵敏度、可重复性。实验结果变异系数CV值小于10％，实验做了40份标本，均取得明显的效果。可以弥补荧光定量PCR检测限不足，筛查并快速判定可疑样本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
这种A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒，包括逆转录酶、数字PCR缓冲液PCRMasterMix、A型流感病毒基因标准品，数字PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，上游引物、下游引物和特异性探针序列如下：
上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
特异性探针A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’，
其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；
其中A型流感病毒基因标准品序列如下：
GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT。
其中数字PCR检测试剂盒中组分含有：
这种A型通用流感病毒的数字PCR检测方法，按照以下步骤进行：
(1)打开两份病毒核酸样品放入试管中，分别放入水浴42℃，金属浴65℃中，提取待检样本RNA；
(2)在试管中加入10ul的逆转录酶，10ul的逆转录酶由5ul的RNA模版、3ul的dH2O、1ul的Oligo或Random6引物、1ul的dNTP组成，将待检样本RNA逆转录为cDNA；
(3)在65℃环境中放置5min，然后在冰上快速冷却；
(4)加入4.5ul的dH2O、4ul的5*buffer、1ul的RTase和0.5ul的TNase抑制剂；
(5)轻轻混合均匀，在42℃的环境中放置30～60min；
(6)在95℃5min灭活酶，冰中保存。
(7)体系加入样本模板cDNA，每个20ul反应体系中含10ul数字PCR缓冲液PCRMasterMix，250nM探针，900nM引物，反应温度为：先95℃10min，再94℃30s→58℃60s，这样不停地循环变换温度40次；然后放在98℃的温度下10min，4℃保存或分析。
(8)通过仪器读取20000个微孔中的荧光值。仪器购自上海thermofisher公司，型号为QuantStudio3D。
标本数40份，结果对于病毒载量大于200c/ul的样品，数字PCR方法与荧光定量PCR方法结果一致性为98％，对于病毒载量小于200c/ul的样品，荧光定量PCR方法ct值介于32～40之间，判定样品可疑。数字PCR方法可以精确计算出样本中的病毒载量。
参照附表：本实施例中，咽拭子40个
通过数字PCR方法检测出来的数据，可以精确计算出样本中的病毒载量，从而可以明确确定病毒是否为阳性，不存在不确定结果。
虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了描述，但是，本专业普通技术人员应当了解，在权利要求书的范围内，可作形式和细节上的各种各样变化。

Claims (3)

1.一种A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒，包括逆转录酶、数字PCR缓冲液PCRMasterMix、A型流感病毒基因标准品，其特征是：所述数字PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针序列如下：
上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
特异性探针A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’，
其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；
所述A型流感病毒基因标准品序列如下：
GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT。
2.根据权利要求1所述的A型通用流感病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征是：所述数字PCR检测试剂盒中组分含有：
3.一种A型通用流感病毒的数字PCR检测方法，按照以下步骤进行：
(1)打开两份病毒核酸样品放入试管中，分别放在水浴42℃、金属浴65℃中，提取病毒核酸待检样本RNA；
(2)在试管中加入10ul的逆转录酶，10ul的逆转录酶由5ul的RNA模版、3ul的dH2O、1ul的Oligo或Random6引物、1ul的dNTP组成，将待检样本RNA逆转录为cDNA；
(3)在65℃环境中放置5min，然后在冰上快速冷却；
(4)加入4.5ul的dH2O、4ul的5*buffer、1ul的RTase和0.5ul的TNase抑制剂；
(5)轻轻混合均匀，在42℃的环境中放置30～60min；
(6)在95℃5min灭活酶，冰中保存；
(7)体系加入样本模板cDNA，每个20ul反应体系中含10ul数字PCR缓冲液PCRMasterMix，250nM探针，900nM引物，反应温度为：先95℃10min，再94℃30s→58℃60s，这样不停地循环变换温度40次；然后放在98℃的温度下10min，4℃保存或分析；
(8)通过仪器读取20000个微孔中的荧光值。
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