KR20110028188A - 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 일반 인플루엔자 ａ와 신종 인플루엔자의 동시 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 조성물, 및 이들을 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 새로운 인플루엔자 바이러스의 출현을 조기 진단하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 2종의 인플루엔자 바이러스 A를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출 방법 및 검출 방법을 제공한다.
인플루엔자 바이러스 A, 신종 인플루엔자 A(H1N1/2009), 하나의 반응용기(single-tube), 프라이머, 프로브, 단일 단계 역전사 중합 효소 연쇄 반응(single-step RT-PCR), 실시간 다중 역전사 중합 효소 연쇄 반응(real-time multiplex RT-PCR)

Description

실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 일반 인플루엔자 Ａ와 신종 인플루엔자의 동시 검출방법{Simultaneous detection method for Influenza A and new influenza A with real-time multiplex reverse transcription(RT)-PCR}
본 발명은 인플루엔자 바이러스 A 및 신종 인플루엔자 A를 진단하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 조성물, 및 이들을 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 NP(nuleocapsid) 와 M (matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 HA (hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형까지, NA(Neuraminidase) 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류 된다 (참고문헌: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987). 사람에서는 인플루엔자 A 및 B형 바이러스가 질환을 유발하는 것으로 알려져 있는데 특히, A형 감염에 의해서 유행기간 동안 매년 약 10,000 여명의 사망자가 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다 (참고문 헌: Fleming DM et al., Br. Med. J. 311:290-291, 1995).
인플루엔자 바이러스를 진단하기 위해, 바이러스의 분리, 단백 항원이나 유전자를 검출하는 방법 및 혈청학적 검사법 등이 이용되고 있다. 이 중 가장 기준이 되는 방법은 바이러스 분리로서, 이후에 간접면역형광법이나 혈구응집억제시험법 등을 이용하여 동정을 하지만 최근에는 인플루엔자 바이러스 특이 유전자를 검출하는 역전사중합효소연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)법 등을 이용한 분자생물학적인 진단법이 많이 사용된다. 유전자 검출법을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 형 및 아형을 구분하기 위해서 NP, M, HA 유전자에 특이적인 프라이머를 제작하여 이용하는 다양한 RT-PCR 방법이 수행 될 수 있다 (참고문헌: Fouchier RAM., J. Clin. Microbiol., 38(11): 4096-4101). 최근 여러 가지 아형의 유전자를 동시에 특이적으로 검출할 수 있도록 제작된 프라이머를 이용하는 싱글-스텝 싱글-튜브 멀티플렉스 (single-step single-tube multiplex) RT-PCR 진단법이 일부 연구진에 의해 보고되었다 (참고문헌: Stockton J et al., J. Clin. Microbiol., 36(10): 2990-2995; Poddar SK, J. Virol. Methods, 99:63-70, 2002; Wright KE et al., J Clin. Microbiol., 33(5): 180-1184, 1995; Zambon et al., Options for the Control of Influenza III. Elsevier, Amsterdam pp 607-614, 1996).
한편 인플루엔자 바이러스에 대한 연구 결과에 따르면, 각각 사람과 조류에 대해 감염성인 바이러스가 중간 숙주, 예를 들어, 돼지에서 재조합 및 증폭됨에 의해 사람에 대해 감염성을 갖는 새로운 바이러스가 출현될 수 있음이 이미 알려졌다 (참고문헌: Claas ECJ et al., Lancet, 351:472-477, 1998). 특히, 1997년과 1999년 홍콩에서의 A/H5N1형 발생과 같이 최근에는 조류에만 감염될 수 있는 바이러스가 중간 숙주 없이 사람에게 직접 감염이 될 수 있다는 사실이 확인된 바 있다. 또한 1999년 이탈리아에서의 A/H7N1형, 2003년 네덜란드에서의 A/H7N7형 및 2003년 겨울 아시아 일부 국가에서의 A/H5N1형 조류 독감 바이러스에 의한 인체 감염 발생이 보고되었으며 국내에서도 2003년 12월부터 2004년 3월까지 철새에 의해 유입된 것으로 추정되는 A/H5N1형이 발생한 바 있으나 인체 감염 사례는 보고되지 않았다 (참고문헌: 보건복지부, 2004 조류 인플루엔자 백서, pp 3-21, 2004).
또한, 신종 돼지 인플루엔자 A(H1N1)(swine Influenza)는 '돼지 독감' 또는 '돼지 인플루엔자'로 불리는 호흡기질환으로 세계보건기구(WHO)에서는 신종 인플루엔자 A(H1N1)를 "Influenza A(H1N1)"로 2009년 4월 30일 기준으로 명명하였다. 이러한 신종 돼지 인플루엔자 A 바이러스는 2009년 4월 처음 발견되었으며, 사람, 돼지, 조류에서 감염을 일으킬 수 있으며, 감염 경로는, 주로 감염된 환자의 기침이나 재채기를 통한 호흡기 감염과 접촉 감염이 있다. 모든 호흡기 분비물, 체액,(설사, 대변 포함)이 잠재적으로 감염성을 가지는 것으로 보고되었다.
이와 같이, 점점 다양해지는 인체 감염 인플루엔자 바이러스 중 기존의 인플 루엔자 A, 예를 들어 계절성 인플루엔자(H1N1, H3N2), 조류 인플루엔자(H5N1), 기타(H5N1, H2N2, H9N2 등) 외에 swine influenza A H1N1형 바이러스를 신속 정확하게 진단할 수 있는 방법이 요구된다. 따라서 국내외적으로 인체 감염 가능성이 큰 swine influenza A H1N1형을 포함한 인플루엔자 A 바이러스에 대한 신속 간편한 진단법이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 swine influenza A H1N1형과 기존의 인플루엔자 A를 신속하고 간편하게 동시에 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, swine influenza A H1N1형 바이러스를 포함한 2종 이상의 인플루엔자 바이러스를 동시에 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 단일 튜브(single-tube) 내에서 신종 인플루엔자 A를 포함한 2종 이상의 인플루엔자 A 바이러스(계절성 인플루엔자 A (H1N1, H3N2), 조류 인플루엔자 A, 기타 H5N1, H2N2, H9N2 형 등)를 스크리닝(screening)해냄과 동시에 신종 인플루엔자 A 바이러스를 특이적으로 구분할 수 있는, 단일 단계(single-step) 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 구현이 가능한 인플루엔자 A 바이러스 진단용 프라이머와 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A 진단용 키트 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하는 인플루엔자 바이러스 A 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하는 인플루엔자 바이러스 A의 진단으로 항바이러스 약제의 처방 치료 후 인플루엔자 바이러스 A의 존재 여부를 모니터링 해냄으로써 치료 및 처방을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
일 양태로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명에서의 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머는, 신종 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA(hemagglutinin) 유전자 및 기존의 인플루엔자 A의 M(matrix) 유전자에 특이적인 프라이머로, 바람직하게 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스(전향) 및 안티센스(후향) 핵산으로 구성될 수 있다. 여기서, 기존의 인플루엔자 A 바이러스는 계절성 인플루엔자 A 바이러스 H1N1형 또는 H3N2형, 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1형, 또는 기타 인플루엔자 A 바이러스 H5N1형, H2N2형, 또는 H9N2형 등을 포함한다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 프라이머 쌍은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다.
본 발명자들은 인플루엔자 바이러스의 당단백질에 해당되는 유전자 중 변이가 심한 지역을 아형 (subtype)별로 구분하여 다중(multiplex) RT-PCR을 실시할 경우, 동일한 검체로부터 하나의 시험관 내에서 여러 인플루엔자 바이러스를 동시에 진단 및 구분할 수 있으며, 특정 인플루엔자 바이러스의 감염 여부를 보다 확정적으로 진단할 수 있다는 점에 착안하여 국내 및 국외 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 분리주에 대한 HA 유전자 및 기존의 인플루엔자 A의 분리주에 대한 M 유전자의 염기서열을 종합적으로 분석하여, 이의 염기서열로부터 상응되는 프라이머를 제작하였다. 이때, 제작된 프라이머를 각각 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 5에 기재하였다. 구체적인 서열은 다음과 같다:
서열번호 1(5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3') 및 서열번호 2(5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3')는 기존의 인플루엔자 A의 M 유전자의 증폭을 위 한 프라이머 세트로 서열번호 1이 포워드 프라이머이고 서열번호 2가 리버스 프라이머에 해당된다. 여기서, 기존의 인플루엔자 A 바이러스는 계절성 인플루엔자 A 바이러스 H1N1형 또는 H3N2형, 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1형, 또는 기타 인플루엔자 A 바이러스 H5N1형, H2N2형, 또는 H9N2형 등을 포함한다.
서열번호 4 (5'-GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA-3') 및 서열번호 5(5'-CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC-3')는 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA 유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트로 서열번호 4가 포워드 프라이머이고 서열번호 5가 리버스 프라이머에 해당된다.
본 발명의 프라이머 서열은 인플루엔자 바이러스 A의 아형 (subtype) 특이적으로 작용하도록 고안된 것이기 때문에, 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1) 이외의 다른 A형 바이러스는 M 유전자에 대한 특이 신호 즉, FAM 형광 신호만 나타날 것으로 판단되기 때문에 본 발명을 사용할 경우 간과되는 새로운 인플루엔자 A 바이러스 출현은 없을 것으로 판단된다.
본 발명에서의 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 기존의 다양한 인플루엔자 A의 M 유전자 또는/및 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA 유전자 발현 유무를 확인하여 인플루엔자 바이러스 A의 발병 여부 및 발병 후 항바이러스 약제 치료과정에서의 예후를 확인하는 것이다.
다른 양태로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A 진단용 키트 및 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단용 키트 및 진단용 조성물은, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단용 키트 및 진단용 조성물은 역전사 반응 및 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A 진단용 키트 및 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진단용 키트 및 진단용 조성물은, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 인플루엔자 바이러스 A의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 표소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트 및 진단용 조성물은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트 또는/및 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트를 포함한다. 또한, 바람직하게는 내부 대조군으로서 서열번호 7(5'-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-3') 및 서열번호 8(5'-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3')의 인터널 콘트롤 프라이머 를 추가로 포함할 수도 있다.
또한, 바람직하게는 본 발명의 진단용 키트 및 진단용 조성물은 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA 유전자 및 인플루엔자 A의 M 유전자와 특이적 결합을 이룰 수 있는 프로브를 포함한다.
본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 quencher 물질로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응액에 첨가한다. 또한, Cycling 프로브를 이용한 실시간 PCR은 RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 프로브와 RNAse H로 구성된 고감도의 검출방법이다. 이 역시 프로브의 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 quencher 물질로 표식한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명자들은 실시간 PCR을 수행하여 그 증폭 산물을 검출하는 경우에는 그 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 DNA 및 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 오염의 위험이 적음에 착안하여, 실시간 PCR을 수행하고자 형광표식 프로브를 제작하였다. 보다 구체적으로 하기와 같은 서열로 기재되며, 표식한 5' 말단의 형광물질 및 3' 말단의 quencher 물질은 다음과 같다:
각각 인플루엔자 A의 M 유전자에 특이적인 프로브는 서열번호 3(5'-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-3')으로 기재되며 프로브의 5' 말단은 FAM으로 3' 말단은 TAMRA로 표식하였고, 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA 유전자에 특이적인 프로브는 서열번호 6(5'-TTY TCC AAT TGT GAT YGG ATG TAT ATT MTG-3')로 기재되며 프로브의 5' 말단은 Cy5으로 3' 말단은 BHQ3으로 표식하였다.
또한, 인터널 콘트롤을 위한 Rnase P에 특이적인 프로브는 서열번호 9(5'-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-3')로 기재되며 프로브의 5' 말단은 HEX로 3' 말단은 TAMRA로 표식하였다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
다른 양태로, 본 발명은 a) 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브들을 포함하는 반응 조성물에 DNA 중합 효소 및 역전사 효소를 포함하는 효소 조성물을 혼합하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 RNA를 첨가하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 제조된 검체 RNA를 포함하는 반응액을 역전사 반응 및 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 "검체"란 임플루엔자 바이러스 감염에 의해 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1 HA 유전자 및/또는 인플루엔자 A유전자 발현 수준이 차이나는 혈액, 혈청, 침 또는 가래와 같은 시료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기에서 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트 및 HA 유전자에 특이적인 프로브 외에, 인플루엔자 A의 M 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트 및 M 유전자에 특이적인 프로브를 포함할 수 있으며, 위에서 언급한 바와 같이 이를 이용해 다중(multiplex) RT-PCR을 실시하여 동일한 검체로부터 하나의 시험관 내에서 여러 인플루엔자 바이러스를 동시에 진단 및 구분할 수 있으며, 특정 인플루엔자 바이러스의 감염 여부를 보다 확정적으로 진단할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명자들은 다중(multiplex) RT-PCR을 실시하여 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1) 및 인플루엔자 A(보다 구체적으로, H3N2,H1N1)를 동시에 진단하였다(표 7).
또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 진단 방법에서 바람직하게 Rnase P는 인터널 콘트롤(internal control)로 사용되어, RNA 추출과정의 유효성에 대한 판단 기준을 제공한다. 본 발명의 바람직한 인터널 콘트롤 프라이머의 서열은 서열번호 7(5'-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-3') 및 서열번호 8(5'-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3')이며, 프로브의 서열은 서열번호 9(5'-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-3')로 기재된다. 본 발명의 진단 방법에는 바람직하게 인터널 콘트롤 프라이머 및 프로브를 포함하여 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 인터널 콘트롤 프라이머 및 프로브를 사용하였다.
상기 c) 단계에서 RNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 PCR , 실시간 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 포함될 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 대조군에서의 RNA 발현량과 인플루엔자 바이러스 감염 의심 환자에서의 RNA 발현량을 확인할 수 있고, RNA로의 유의한 발현량 정도를 대조군과 비교함으로써 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 실시간 PCR 방법을 이용하여 검체(비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체)내에 존재하는 인플루엔자 A와 돼지 인플루엔자 A H1N1(2009)를 검출 및 구분하여 분석하였다. 분석을 위해 사용한 시약인 AdvanSureTM 인플루엔자 A/H1N1(2009) 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR)은 WHO 사이트(rev.:30 April 2009, http://www.who.int)에 공개된 CDC 프로토콜에 기초하여 제작한 것이다. 이 시약을 이용하면, 검체에서 추출된 RNA를 이용하여 한 튜브에서 역전사반응 (RT : Reverse-transcription)과 다중 (multiplex) PCR 반응을 동시에 진행시킬 수 있다. 이 시약은 RT-PCR Premix, NIP 프라이머/프로브 혼합액(NIP primer/probe mixture), 양성대조액(Positive Control), 음성대조액(Negative Control)으로 구성되며, 보다 자세한 사항은 실험예에 기재하였다. 본 발명자들은 인플루엔자 A 특이 유전자(matrix protein, M유전자)와 인플루엔자 A(H1N1/2009) 특이 유전자(Hemagglutinin, HA) 의 각 RNA 유전자부위를 역전사(RT:reverse transcription) 반응을 통해 cDNA가 합성되도록 하였다. cDNA는 특이적인 프라이머에 의해 실시간으로 반응 산물이 형성되며, 이와 동시에 각 유전자에 특이적인 Taqman 프로브가 분해됨으로써 형광이 형성되게 되고, 형성된 형광을 real-time PCR cycler로 측정함으로써 인플루엔자 A 감염 여부를 진단하였다.
본 발명은 새로운 인플루엔자 바이러스 A의 출현을 조기 진단하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 2종 이상의 인플루엔자 바이러스 A를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출 방법을 제공한다. 또한 치료 과정에서 새로운 인플루엔자 바이러스 A를 모니터링 함으로써 완치 여부를 판단할 수 있는 정보를 제공한다.
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세히 기술한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
하기 실험은 비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasla swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA)) 를 대상으로 한 것으로 인플루엔자 A(common)와 돼지 인플루엔자 A(H1N1/2009)의 검출 및 구분을 수행하였다.
실험예 1. 필요 용액 및 검체의 준비
(1) 필요 용액 준비
하기 표 1의 시약을 준비하였다. 이들은 사용 전에 4 ℃ 또는 상온에 방치하여 해동시켰으며, 상온의 경우 30분 이상 방치하지 않는 것이 바람직하다.
번호 시약명 구성성분
1 RT-PCR Premix
:무색의 액체		 One-step RT-PCR premix
2 NIP 프라이머/프로브
혼합액
(NIP primer/probe
mixture)
: 무색 또는 엷은 분홍색의 액체 		인플루엔자 A_M 프라이머
Rnase P 프라이머
H1N1(2009) 프라이머
인플루엔자 A_M probe, FAM labeled
Rnase P probe, HEX labeled
H1N1(2009) probe, CY5 labeled
3 양성대조액
(Positive Control)
: 무색의 액체		 Positive control containing infA_M, Rnase P and H1N1(2009) 프라이머/pro-
be binding sequences
Salmon sperm DNA
4 음성대조액
(Negative Control)
: 무색의 액체		 Negative control containing Rnase P 프라이머/probe binding sequences
Salmon sperm DNA
(2) 검체의 준비
비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체를 사용하였다. 검체를 단기간(1일 이내) 보관할 경우 2~8 ℃에서 냉장보관하고, 장기보관 시는 -15℃ 이하에서 냉동 보관하는 것이 바람직하다.
실험예 2. 인플루엔자 바이러스 진단 방법
채취한 검체에서 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA는 1pg ~ 2㎍가 적절하다. RT-PCR Premix가 8㎕씩 분주되어 있는 200㎕ PCR 튜브를 시료와 양성대조액, 음성대조액을 더한 수 만큼 준비하였다. 미리 분주되어 제공된 각 RT-PCR Premix 튜브에 NIP 프라이머/프로브 혼합액 7㎕와 추출한 시료 혹은 양 ·음성대조액을 5㎕씩 첨가하였다. 1회 진단하는데 사용한 사용량은 하기와 같다.
검체 및 시약명 1 테스트당 사용량(㎕)
RT-PCR Premix
(미리 분주되어 제공)		 8
NIP 프라이머/프로브 혼합액 7
투입검체양 추출한 시료(RNA)
혹은
양성대조액
혹은
음성대조액		 5
합 계 20
뚜껑을 닫고 원심분리 한 후 잘 섞어 주었다. 혼합하지 않을 경우 base line 형성에 영향을 미치므로 반드시 섞어준 후 spin down을 하여 PCR반응을 진행하는 것이 바람직하다. 원심분리한 후 실시간 PCR 싸이클러(real-time PCR cycler)에 넣어 반응을 진행하였다. 구체적인 실시간 PCR 반응 조건은 하기와 같다.
진행 온도 시간 반복 회수(회)
Reverse-transcription Step 1 45℃ 30분 1회
Step 2 94℃ 5분
PCR 반응 Step 1 94℃ 5초 10회
Step 2 53℃ 30초
Step 3 94℃ 5초 35회
(*Signal detection 반응 구간)
Step 4* 53℃ 30초
PCR반응 결과는 실시간 PCR 싸이클러에 의해 실시간으로 측정하였다. 반응이 완료되면 다음표와 같이 한계값(Cut-off value)을 입력하였다.
기기명 FAM
(인플루엔자 A)		 HEX
(Rnase P)		 CY5
(H1N1/2009)
SLAN 0.04 0.04 0.04
실험예 3. 결과 판정
(1) 각 대조군 별 Ct값
대조군을 대상으로 반응하였을 때의 Ct값은 다음과 같았다.
*Ct값(threshold cycle : 한계값을 통과하는 사이클 수)
항목 FAM
(인플루엔자 A)		 HEX
(Rnase P)		 CY5
(H1N1/2009)
양성대조액 18.3 ±2.0 17.6 ±2.0 18.3 ±2.0
음성대조액 No Ct 17.6 ±2.0 No Ct
(2) 양성 판정 기준 Ct값
시료의 Ct값이 다음 이상인 경우 양성으로 판정하였다.
기기 FAM
(인플루엔자 A)		 HEX
(Rnase P)		 CY5
(H1N1/2009)
SLAN 35 35 35
(3) 결과 분석
각 반응별로 FAM, HEX, CY5 파장의 시그널 형성을 확인하여 다음 표와 같이 반응 유효성과 양성, 음성을 분석하였다.
항목 FAM
(인플루엔자 A) 		HEX
( Rnase P) 		CY5
( H1N1
/2009) 		결과 해석
양성대조액 + + + 반응유효
음성대조액 - + - 반응유효
시료1 + + + H1N1 감염
혹은
인플루엔자 A와 H1N1동시감염
시료2 + - +
시료3 + + - 인플루엔자 A 감염
시료4 + - -
시료5 - + - 음성
시료6 - + + 재시험 2회 재시험 실시
→재시험결과가 처음 결과와 같을 경우 sequencing /virus 배양 / 혈청반응 검사 등을 추가적으로 수행하여 결과 최종 판정함.
시료7 - - +
시료8 - - - 2회 재시험 실시
→재시험결과가 시료 8의 결과와 같을 경우 음성으로 최종 판정함.
도 1은 검체가 돼지 인플루엔자 A(H1N1)인 경우 실시간 PCR을 수행하였을 때의 결과 곡선 패턴을 나타낸 도면이다.
도 2는 검체가 계절성 인플루엔자 A인 경우 실시간 PCR을 수행하였을 때의 결과 곡선 패턴을 나타낸 도면이다. 상단은 H3N2형 인플루엔자 바이러스인 경우이며, 하단은 H1N1형 인플루엔자 바이러스인 경우이다.
도 3은 검체가 음성대조군인 경우 실시간 PCR을 수행하였을 때의 결과 곡선 패턴을 나타낸 도면이다.
<110> LG life sciences <120> PRIMER FOR DETECTION OF INFLUENZA VIRUS, KIT COMPRISING THE PRIMER, AND DETECTION METHOD THEREOF <130> PA090363/KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza A forward primer <400> 1 gtgctataaa caccagccty cca 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza A reverse primer <400> 2 cgggatattc cttaatcctg trgc 24 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza A probe <400> 3 ttytccaatt gtgatyggat gtatattmtg 30 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> swine influenza A H1N1 forward primer <400> 4 gaccratcct gtcacctctg ac 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> swine influenza A H1N1 reverse primer <400> 5 agggcattyt ggacaaakcg tcta 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> swine influenza A H1N1 probe <400> 6 tgcagtcctc gctcactggg cacg 24 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rnase P forward primer <400> 7 agatttggac ctgcgagcg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rnase P reverse primer <400> 8 gagcggctgt ctccacaagt 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rnase P probe <400> 9 ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (12)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머 세트, 및 서열번호 4 및 서열번호 5에 기재된 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 인플루엔자 바이러스 A 진단용 프라이머 세트.
  2. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 3 또는 서열번호 6에 기재된 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
  4. 　제2항에 있어서, Hot start Taq DNA 중합효소, 역전사 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 A진단용 조성물.
  5. 제2항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 A 진단용 키트.
  6. a) 제2항 또는 제3항의 조성물에 Hot start Taq DNA 중합 효소 및 역전사 효소를 포함하는 효소 조성물을 혼합하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 RNA를 첨가하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 제조된 검체 RNA를 포함하는 반응액을 역전사 반응 및 실시간 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A 진단을 위한 정보의 제공방법.
  7. 제6항에 있어서, 2종 이상의 인플루엔자 바이러스 A를 하나의 반응 용기에서 동시에 진단함을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 인플루엔자는 돼지 인플루엔자 A 바이러스 H1N1형, 계절성 인플루엔자 A 바이러스 H1N1형 또는 H3N2형, 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1형, 또는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1형, H2N2형, 또는 H9N2형 등인 기타 인플루엔자 바이러스 A 진단을 위한 정보의 제공방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 a) 단계에 있어 서열번호 7 및 서열번호 8의 인터널 콘트롤 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 A 진단을 위한 정보의 제공방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 a) 단계에 있어 서열번호 9에 기재된 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법.
  11. 인체 유래 유전자 RNA를 인터널 콘트롤로 사용함으로써 RNA 추출과정의 유효성 판정의 기준 제공방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 검체는 혈액, 혈청, 침 또는 가래 (Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasla swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA)) 인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 A 진단을 위한 정보의 제공방법.
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