CN111074011B - 检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域,更具体地,涉及新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测。本发明提供了一种用于检测上述病毒的组合物;同时,还提供了含该组合物的试剂盒,所述组合物的用途,以及用于检测引起呼吸道感染的病毒并分型的方法。本发明的组合物结合荧光探针法能够在一管同时检测三种引起呼吸道感染的病毒并进行分型,具有成本低、通量高、耗时短,并且操作简便,避免由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染的优势。

Description

检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及 其用途
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域;具体地,属于引起呼吸道感染的病毒的检测领域;更具体地,本发明能够同时检测新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒和乙型流感病毒,并对其分型。
背景技术
由呼吸道感染引起的呼吸道疾病是生活中常见的疾病,致病病原体主要包括病毒、细菌、支原体、衣原体等。其中,常见的病毒病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒,它们也是季节性流感的最主要病原体;而另一类引起呼吸道感染的病毒为冠状病毒。
流感病毒的囊膜有两种非常重要的糖蛋白:血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),一般流感病毒表面会分布有500个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突,根据流感病毒中HA和NA的抗原性,将此作为甲型流感病毒分型的依据。在甲型流感病毒可以感染人和哺乳动物以及禽类,H1N1、H2N2、H3N2亚型主要感染人类,其它亚型主要是感染禽类、猪、马以及水生哺乳动物。在禽流感病毒中能够感染人类的亚型有H5N1、H7N1、H7N2、H7N4、H7N9、H9N2、H10N8等12种。乙型流感病毒主要在人群中流行,没有亚型分类,三个分支分别是李系、山形系和维多利亚系,其流行规模比甲型流感病毒要小。流感病毒的遗传物质是单股负链RNA(ss-RNA),ss-RNA与核蛋白相结合,缠绕成核糖核蛋白复合体,以密度极高的形式存在,除了核糖核蛋白复合体,还有负责RNA转录的RNA聚合酶。流感病毒的RNA主要由8个节段组成,第一、二、三个节段编码的是RNA聚合酶,第四个节段编码血凝素;第五个节段编码核蛋白,第六个节段编码神经氨酸酶;第七个节段编码基质蛋白,第八个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白。
目前为止感染人的冠状病毒总共7种,其中冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1为常见感染人呼吸道后病症较轻,一般不会引起重症,但如果是新型冠状病毒2019-nCoV、冠状病毒MERSr-CoV、冠状病毒SARSr-CoV感染,则患者感染症状就非常严重,且极易产生重症。
新型冠状病毒(新冠病毒)是属于β属的新型冠状病毒,世界卫生组织将其命名为“新型冠状病毒(2019-nCoV)”。2019-nCoV有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60~140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。根据最新研究成果发现,2019-nCoV与其实验室之前从中华菊头蝠中分离到的一个蝙蝠冠状病毒毒株RaTG13相似度非常高,整体基因组相似度达96.2%另外,研究显示其与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21)同源性也达85%以上。
呼吸道感染的病原体种类极其繁杂,一种临床表现可由多个病原体引起,同时一个病原体也可以造成多种临床表现,为临床早期诊断带来了很大困难。
大部分引起呼吸道感染的病毒越早治疗效果越好,比如:流感患者一旦发病,应尽快开始服用奥司他韦,理想情况是症状出现48小时内开始;奥司他韦用于预防时,也应在接触流感患者48小时之内服用。早诊断、早治疗是提高流感患者治愈率、降低病死率的关键。
而对于新冠病毒而言,除早发现、早治疗外,还需要及时控制传染源,从而阻断病毒大流行和大爆发。
因此,区分呼吸道感染是由新冠病毒引发还是由甲流或者乙流引发,进而为后续的防控、治疗以及采取针对性的措施提供指导,是呼吸道疾病防控的重中之重。
因此,本领域需求一种能够检测并区分新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的相关产品。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种能够检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物,所述组合物同时包括:
如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;和以下两组中的至少一组:
第一组:如SEQ ID NO:7所示的甲型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的甲型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:9所示的甲型流感病毒探针;
第二组:如SEQ ID NO:10所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:11所示的乙型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:12所示的乙型流感病毒探针,
其中,所述各探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中,“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的,并且不会影响彼此的检测,即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5,这些荧光基团的吸光值不接近,能选择不同的检测通道,因而不会互相干扰。
在一个优选的实施方式中,所述组合物进一步包括:SEQ ID NO:4所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:5所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ ID NO:6所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针。
通过包括额外的SEQ ID NO:4~6,本发明的组合物能够进一步增加新冠病毒检测的准确性,最大程度的避免漏检等假阴性情况。
在一个具体的实施方案中,所述组合物包括:如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ IDNO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;和
如SEQ ID NO:7所示的甲型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的甲型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:9所示的甲型流感病毒探针。
上述实施方案,可以在根据实际临床不需求检测乙型流感病毒的时候使用,仅同时检测新型冠状病毒和甲型流感病毒,从而节约了成本。
在一个具体的实施方案中,所述组合物包括如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ IDNO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;和
如SEQ ID NO:10所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:11所示的乙型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:12所示的乙型流感病毒探针。
上述实施方案,可以在根据实际临床不需求检测甲型流感病毒的时候使用,仅同时检测新型冠状病毒和乙型流感病毒,从而节约了成本。
在一个具体的实施方案中,所述组合物包括如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ IDNO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;
如SEQ ID NO:7所示的甲型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的甲型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:9所示的甲型流感病毒探针;和
如SEQ ID NO:10所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:11所示的乙型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:12所示的乙型流感病毒探针。
上述实施方案,在需求检测三种病毒的时候使用,能够更加全面的检测引起感染的病毒,同时每种病毒使用一套引物,节约了成本。
在一个具体的实施方案中,所述组合物包括如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ IDNO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;
SEQ ID NO:4所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:5所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ ID NO:6所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;
如SEQ ID NO:7所示的甲型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的甲型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:9所示的甲型流感病毒探针;和
如SEQ ID NO:10所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:11所示的乙型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:12所示的乙型流感病毒探针。
上述实施方案,在需求检测三种病毒并要求较高的检测准确性时使用,能够获得更高的检测准确性,避免假阴性。
所述引起呼吸道感染的病毒包括:新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
进一步地,所述组合物包括:用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
在一个具体的实施方案中,所述组合物还包括:如SEQ ID NO:13所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:14所示的内标下游引物,和如SEQ ID NO:15所示的内标探针。
在本发明中,荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE,但不限于此。
在一个具体的实施方案中,如SEQ ID NO:3和6所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM;如SEQ ID NO:9所示的甲型流感病毒探针的荧光报告基团为HEX;如SEQ ID NO:12所示的乙型流感病毒探针的荧光报告基团为ROX。
在一个具体的实施方案中,如SEQ ID NO:15所示的内标探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地,所述组合物中引物的用量为50~150nM;所述组合物中探针的用量为25~75nM。
在一个具体的实施方案中,本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地,本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面,本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测引起呼吸道感染的病毒并分型的试剂盒中的用途。
所述引起呼吸道感染的病毒包括:新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
第三方面,本发明提供了一种检测引起呼吸道感染的病毒并分型的试剂盒,所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地,所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地,所述组合物中引物的用量为50~150nM;所述组合物中探针的用量为25~75nM;所述dNTP的用量为0.2~0.3mM。
进一步地,所述逆转录酶的浓度为5U/μL~15U/μL,例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV);所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL~15U/μL,例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中,所述试剂盒除上述的本发明的组合物之外,还进一步包括以下组份和用量:
第四方面,提供了一种用于检测引起呼吸道感染的病毒并分型的方法,所述方法包括以下步骤:
1)释放待测样本的核酸;
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR;
3)获得并分析结果。
在本发明中,用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等,但不限于此。
进一步地,所述荧光定量PCR的反应条件为:
逆转录,温度为50℃,时间25~35分钟,1次循环;预变性,温度为94℃,时间2~10分钟,1次循环;变性,温度为94℃,时间为10~20秒,退火,温度为60℃,时间为20~40秒,45~50次循环。
使用本发明的组合物,能够同时检测3种引起呼吸道感染的病毒并进行分型,分流一部分由于普通季节性感冒引起发热的患者,减少医疗资源的浪费,降低患者和社会的心理负担。
同时,本发明可以快速确诊新型冠状病毒2019-nCoV,为新冠病毒的早诊断、早治疗、早隔离提供分子证据,为疾病的防控做充分的准备;对传染性和危害性大的新型冠状病毒2019-nCoV可以做到及时控制传染源,阻断病毒大流行和大爆发。
本发明的组合物,结合荧光探针法,能够使用一个管在一次试验中同时,其成本低,通量高。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息,并且操作简便,结果读取过程通过CT值即可以判定。检测全过程均在单管封闭条件下进行,避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
并且使用本发明的组合物耗时少,从样本到获得结果总时长为约120min,极大的提升了检测效率。
附图说明
图1为本发明组合物的FAM通道2019-nCoV阳性检测结果;
图2为本发明组合物的HEX通道甲型流感病毒阳性检测结果;
图3为本发明组合物的ROX通道乙型流感病毒阳性检测结果;
图4为本发明组合物的CY5通道内标阳性检测结果;
图5~8为本发明组合物的一个实施方案检测病毒的重复性结果;
图9~12为本发明组合物的另一个实施方案检测病毒的重复性结果;
图13为本发明组合物的灵敏度结果;
图14~15为本发明组合物的特异性结果;
图16为本发明组合物与对比引物的实验结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示:
表1
其中,新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM;甲型流感病毒的荧光报告基团为HEX;乙型流感病毒的荧光报告基团为ROX,内标的荧光报告基团为CY5,探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2猝灭基团。
实施例2、检测引起呼吸道感染的病毒并分型的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。磁珠法提取病毒核酸,在样本处理室进行如下操作:
2.1 取适量1.5 mL灭菌离心管,分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本,每管加入300μL RNA提取溶液1;
2.2 每管加入200μL待测样本或阴性对照、阳性对照;盖上管盖,震荡混匀10秒钟,瞬时离心;
2.3 每管加入100μL RNA提取溶液2-mix(充分混匀后吸取),震荡混匀10秒钟后,室温静置10分钟;
2.4 瞬时离心后将离心管置于分离器上,3分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物);
2.5 每管加入600μL RNA提取溶液3和200μL RNA提取溶液4,震荡混匀5秒钟,瞬时离心后将离心管再次置于分离器上;
2.6 约3分钟后,上清液分为两层,将吸头插入离心管底部,从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃,静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃;
2.7 每管加入50μL PCR-mix,用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物,反复几次尽量将其完全洗脱,然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至0.2mL PCR反应管中,盖上管盖,转移到扩增检测区。
实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置:
PCR扩增程序如下进行设置:
结果分析:
1)目的检测信号为FAM,HEX(或VIC)及ROX,内参检测信号为CY5;
2)Baseline的设置:Baseline一般设置为3-15个循环,具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为:选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域,起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动,终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置:设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点;
3)先分析内标在CY5通道是否检测扩增曲线,且Ct≤39,若有,表示本次检测有效,继续进行后续分析:
A)若FAM通道检测到典型的S型扩增曲线,且Ct<39,表示新型冠状病毒2019-nCoV检测结果为阳性;
B)若HEX通道检测到典型的S型扩增曲线,且Ct<39,表示甲型流感病毒检测结果为阳性;
C)若ROX通道检测到典型的S型扩增曲线,且Ct<39,表示乙型流感检测结果为阳性;
4)若内标在CY5通道没有检测到Ct或Ct>39,表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应,需重新准备实验。
实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果
使用本发明表1的组合物,按照实施例2所述的方法,对各个靶标阳性质粒进行检测,以模拟临床样本,在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测,结果如图1~4所示。各通道均能检测到良好的扩增曲线,表明本发明的组合物能对引起呼吸道感染的病毒进行检测并分型。
实施例4、本发明不同组合物的测试阳性对照的重复性结果
使用本发明表1的组合物,按照实施例2所述的方法,对各个靶标LOD(灵敏度)阳性质粒进行检测,以模拟临床样本,在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测,该组合结果最好,20次重复均能检测出,如图5-图8所示。
只使用其中一套新冠靶点的引物(即仅使用SEQ ID NO:1~3)与甲流以及乙流引物组合进行实验。该组合结果为HEX、ROX、CY5通道20次重复均能检测出,FAM通道20次重复有18次能检测出来,结果如图9-图12所示。
实施例5、本发明组合物的灵敏度
用不同浓度的质粒模板进行实验,检测本发明组合物的灵敏度
使用本发明表1的组合物,按照实施例2所述的方法,对各个靶标LOD(灵敏度)阳性质粒进行检测,以模拟临床样本,在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测,各通道检测灵敏度为200拷贝/ml,结果表明在浓度为200拷贝/ml,本发明的组合物仍能够检测出病毒,结果如图13所示,说明本发明的组合物的灵敏度能够达到200拷贝/ml。
实施例6、本发明组合物的特异性
采用一些相似的其它病毒进行实验,表明本发明的组合物不会检测出其它病毒而出现假阳性,结果如图14-15所示,本发明组合物与其它冠状病毒OC43/OC43/NL63/229E/MERS/SARS/HKU1,以及常见病毒腺病毒ADV、合胞病毒RSV、鼻病毒HRV,均无非特异扩增,表明本发明组合物有良好的特异性。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
在引物和探针设计过程中,发明人还设计了其余的引物和探针同样用于检测病毒,其具体序列如下所示(靶点均为ORF-1ab):
上述组合物按照实施例2所示的方法进行检测,从图16中可以看出,对比例的引物不能很好的对阳性质粒进行检测,证明对比例的引物不能够用于检测引起呼吸道感染的病毒。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccccaaaatg ctgttgttaa aatt 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttcaagccag attcattatg gtatt 25
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tccagcatgt cacaattcag aagtaggac 29
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cccgcactct tgaaactgct c 21
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tagattgtta gtagccaaat cagatgtg 28
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctgtgcgtgt tttacagaag gccgc 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gttgctcgaa atcaaagaca cagaa 25
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cttgtaacct tgcacttcta tcacagt 27
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttgcacctaa tatgatggta acaaacaata cct 33

Claims (9)

1.一种能够检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物,所述组合物同时包括:
如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;
如SEQ ID NO:4所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:5所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ ID NO:6所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;
如SEQ ID NO:7所示的甲型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的甲型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:9所示的甲型流感病毒探针;和
如SEQ ID NO:10所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:11所示的乙型流感病毒下游引物,和如SEQ ID NO:12所示的乙型流感病毒探针,
其中,所述各探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物进一步包括用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中,内标上游引物的序列如SEQ ID NO:13所示,内标下游引物的序列如SEQ ID NO:14所示,且如内标探针的序列如SEQ ID NO:15所示。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其中,所述组合物的各成分存在于同一个包装中。
5.权利要求1~4中任一项所述的组合物在制备检测引起呼吸道感染的病毒并分型的试剂盒中的用途。
6.一种用于检测引起呼吸道感染的病毒并分型的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1~4中任一项所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中,所述组合物中引物的用量为50~150nM;所述组合物中探针的用量为25~75nM。
9.一种用于非诊断目的的检测引起呼吸道感染的病毒并分型的方法,所述方法包括以下步骤:
1)释放待测样本的核酸;
2)使用如权利要求1~4中任一项所述的组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR;
3)获得并分析结果。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111074011B (zh) * 2020-03-23 2020-07-14 圣湘生物科技股份有限公司 检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN111304372B (zh) * 2020-04-29 2020-08-14 圣湘生物科技股份有限公司 检测2019新型冠状病毒突变的组合物、用途及试剂盒
CN111254228B (zh) * 2020-05-06 2020-09-11 上海思路迪医学检验所有限公司 一种检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒
CN111593142A (zh) * 2020-05-28 2020-08-28 山东艾克韦生物技术有限公司 一种同时检测包括SARS-CoV-2的九种呼吸道病毒的检测试剂盒
CN111549183B (zh) * 2020-06-08 2021-09-17 国药集团武汉血液制品有限公司 一种同时检测新冠肺炎康复者恢复期血浆中SARS-CoV-2病毒及其他病原体的方法
CN111534643B (zh) * 2020-07-10 2020-10-09 上海科技大学 一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用
CN112126713A (zh) * 2020-07-16 2020-12-25 上海之江生物科技股份有限公司 一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途
CN112063756A (zh) * 2020-09-17 2020-12-11 中山大学达安基因股份有限公司 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
CN112176106A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 华芯生物科技(武汉)有限公司 一种呼吸道病原微生物检测用引物及其应用
CN114457198B (zh) * 2022-04-11 2022-07-12 潍坊华卓生物科技有限公司 一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172529A (zh) * 2019-05-21 2019-08-27 上海星耀医学科技发展有限公司 一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1548054A (zh) * 2003-05-08 2004-11-24 陆爱丽 预防或治疗sars冠状病毒的药物
CN102181579B (zh) * 2011-04-11 2013-06-12 深圳国际旅行卫生保健中心 呼吸道病毒检测试剂盒及检测方法
CN104342503B (zh) * 2014-10-29 2016-11-30 福建国际旅行卫生保健中心 一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法
CN110343784B (zh) * 2019-07-08 2022-04-08 北京市疾病预防控制中心 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
CN111074011B (zh) * 2020-03-23 2020-07-14 圣湘生物科技股份有限公司 检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172529A (zh) * 2019-05-21 2019-08-27 上海星耀医学科技发展有限公司 一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法

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