CN110172529A - 一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明公开了一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法，特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰、可靠性高，可用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。

Description

一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法。
背景技术
呼吸道病毒(Viruses associated with respiratory infections)是指主要以呼吸道为侵入门户，首先在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道及其他器官损害的病毒的总称。临床上的急性呼吸感染中有90～95％是由这群毒引起的。呼吸道病毒多为单链RNA(ssRNA)病毒，一般具有包膜及刺突，主要经呼吸道传播，定位于呼吸道，可反复感染，人群流行率高。其中，流行性感冒病毒(influenza virus)和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)为临床常见的、重要的呼吸道病毒。
流行性感冒病毒，简称流感病毒，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒可分为甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)、乙型流感病毒(Influenza B virus，IBV)和丙型流感病毒(Influenza C virus，ICV)三种类型。其中，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行；乙型流感病毒的抗原变异较小，仅在人类之间传播，通常只引起流感的局部爆发，乙型流感通常伴有肌炎及胃肠道症状，在某些年份可成为强势株。相较于甲型流感病毒，乙型流感病毒更容易引起较为严重的合并症；丙型流感病毒的抗原稳定，且致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。
呼吸道合胞病毒肺炎(respiratory syncytial virus pneumonia)简称合胞病毒肺炎，是由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)引起的一种小儿常见的间质性肺炎，多发生于婴幼儿。呼吸道合胞病毒形态为球形，基因组为线性、不分节段的单链RNA(ssRNA)，病毒体有包膜，膜上有刺突，由糖蛋白组成，无血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)。根据病毒表面蛋白抗原的变异，可将RSV分为两种类型：RSV A型和RSV B型。该病的诊断主要根据病毒学及血清学检查结果。
在流感病毒流行期结合临床症状诊断流感并不困难，但要确诊或流行监测时必须进行实验室检查，主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。近年来，分子生物学方法不断被应用到流感病毒的快速检测中，流感病毒的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了流感病毒实验室诊断的发展方向。
当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了PCR高敏感性、DNA杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，具有简便、微量、快速、高特异、高敏感等优点。因此，荧光定量PCR法是临床早期诊断病毒感染的最有价值的方法之一。
TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整或与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。
目前，没有对甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒进行联合检测的试剂盒。因此，提供一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法，特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰、可靠性高，可用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和外源性内参的特异性引物和探针；
所述甲型流感病毒的特异性引物序列如下：
IAV-F：5’-TTTGTGTTCACGCTCACCG-3’；SEQ ID NO.1；
IAV-R：5’-AGGGTCCCCATTCCCATTG-3’；SEQ ID NO.2；
所述甲型流感病毒的特异性探针序列如下：
IAV-P：5’-FAM-GCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGC-BHQ-3’；SEQ ID NO.3；
所述乙型流感病毒的特异性引物序列如下：
IBV-F：5’-CATGGCAAAGAGCCCTTGACT-3’；SEQ ID NO.4；
IBV-R：5’-CAGGCTCACTTTTGTTGTGAG-3’；SEQ ID NO.5；
所述乙型流感病毒的特异性探针序列如下：
IBV-P：5’-HEX-ACCCTGGTCAAGACCGCCTAAAC-BHQ-3’；SEQ ID NO.6；
所述呼吸道合胞病毒的特异性引物序列如下：
RSV-F：5’-CCACTTTGGAAAGGACCAGCA-3’；SEQ ID NO.7；
RSV-R：5’-TCACCTGCCATCTGTTTTCCAT-3’；SEQ ID NO.8；
所述呼吸道合胞病毒的特异性探针序列如下：
RSV-P：5’-ROX-CATAAATTTACTGGGTTAATAGGTATG-BHQ-3’；SEQ ID NO.9；
所述外源性内参的特异性引物序列如下：
IR-F：5’-CCACTTTGGAAAGGACCAGCA-3’；SEQ ID NO.10；
IR-R：5’-TCACCTGCCATCTGTTTTCCAT-3’；SEQ ID NO.11；
所述外源性内参的特异性探针序列如下：
IR-P：5’-CY5-GCTAACTTCGGCAGTAAGTGTGAC-BHQ-3’；SEQ ID NO.12。
进一步，一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：反应液、外源性内参、阴性对照和阳性对照。
进一步，所述反应液含有pH8.3的Tris-HCl 20mM，KCl 100mM，明胶0.2mg/mL，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4mM，逆转录酶0.3U/μL，Taq DNA聚合酶0.2U/μL，UNG酶0.1U/μL，特异性引物和特异性探针的混合液。
进一步，所述特异性引物和特异性探针的混合液含有：甲型流感病毒的特异性上游和下游引物各0.5μM，乙型流感病毒的特异性上游和下游引物各0.5μM，呼吸道合胞病毒的特异性上游和下游引物各0.5μM，外源性内参的特异性上游和下游引物各0.5μM，甲型流感病毒的特异性探针0.25μM，乙型流感病毒的特异性探针0.25μM，呼吸道合胞病毒的特异性探针0.25μM和外源性内参的特异性探针0.25μM。
进一步，所述外源性内参为含有与该外源性内参基因序列相同的特定基因片段的慢病毒，所述外源性内参基因序列如下：
5’-CCACTTTGGAAAGGACCAGCAGCTAACTTCGGCAGTAAGTGTGACGGATGTGAATACAGATAAGTGAGTCTAGAAATAGTCCAGGCAAGGAACCAAATACATCGGATGCATATTTATGGAAAACAGATGGCAGGTGA-3’；SEQ ID NO.13。
进一步，所述阴性对照为无呼吸道病毒的健康人血清。
进一步，所述阳性对照为含有甲型流感病毒核酸序列片段的慢病毒、乙型流感病毒核酸序列片段的慢病毒和呼吸道合胞病毒核酸序列片段的慢病毒；
所述甲型流感病毒核酸序列片段如下：
5’-TTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAATGCCCTAAATGGGAATGGGGACCCT-3’；SEQ ID NO.14；
所述乙型流感病毒核酸序列片段如下：
5’-CATGGCAAAGAGCCCTTGACTACCCTGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAAAGAGAAAATTAGAGTCAAGAATAAAGACTCACAACAAAAGTGAGCCTG-3’；SEQ ID NO.15；
所述呼吸道合胞病毒核酸序列片段如下：
5’-TGTTATTAATCACAGAAGATGCTAATCATAAATTTACTGGGTTAATAGGTATGTTATATGCTATGTCTAGATTAGGAAGAGAAGACACCATAAAAATACTCAAAGATGCGGGATATCATGTTAAGGCAAATG-3’；SEQ IDNO.16。
为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP；而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶在50℃以上即失去活性，这样经过热循环不会破坏病人呼吸道病毒核酸。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从呼吸道病毒阳性病人样本血清中提取的核酸因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。
将人造的内参RNA(慢病毒)引入反应体系，以指示每个PCR检测管的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。
本发明试剂盒将常规荧光PCR的三种组分进行混合，在确定试剂稳定性后，以单检测管形式体现在试剂盒中，不需使用人员进行试剂配制等实验操作，方便、简便，减少污染，易于操作。
本发明通过对呼吸道病毒中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒基因组全序列比对分析，分别获得针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的序列特异性引物和荧光探针，通过检测人鼻咽拭子样本，确定该试剂盒的各种检测指标，确定该试剂盒检测的特异性、灵敏度，为呼吸道病毒感染的确诊、病情程度判断、疗效评价、新药开发等提供一个方便、廉价的检测手段。
进一步，一种呼吸道病毒核酸的联合检测方法，具体步骤如下：
(1)加样：向含有30μL反应液的检测管内加入20μL临床样本核酸提取液，反应体积为50μL；
(2)荧光RT-PCR扩增反应程序如下：
(3)在第八步采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光信号。
本发明提供的试剂保存于-20℃，冻融次数应小于3次。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阴性对照和阳性对照；扩增检测方法如下：
a、按反应样本数(反应样本数＝待检样品数+对照品2个)n取相应数量的含反应液的检测管，室温下复融，低速离心数秒；
b、取样本提取物、对照品提取物各20μL，分别加入检测管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上；
c、反应程序为：50℃反应15min，然后95℃保温2min，再按95℃10s→60℃45s，循环45次，并于60℃分别采集FAM、HEX、ROX和CY5荧光通道的信号；
d、PCR程序运行完成后，按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。
以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，在四通道(FAM、HEX、ROX和CY5)下检测反应扩增产物的荧光强度：
(一)质量控制：
阴性对照CY5通道检测Ct值均应小于40，其余三个通道检测Ct值均为40或空白；阳性对照FAM、HEX、ROX和CY5通道检测Ct值均应小于40。
若检测结果未达到以上要求，则该次检测无效，应检查仪器、试剂和扩增条件等方面的误差，重复实验，直到达到质量控制的标准。
(二)样本检测：
①当CY5通道检测Ct值小于40时，其余三个通道检测Ct值均为40或空白：三种呼吸道病毒呈阴性；FAM通道检测Ct值小于40：甲型流感病毒呈阳性；HEX通道检测Ct值小于40：乙型流感病毒呈阳性；ROX通道检测Ct值小于40：呼吸道合胞病毒呈阳性。
②当CY5通道检测Ct值为40或空白时，其余三个通道中至少有一个通道检测Ct值小于40，则该通道检测对应病原体阳性；
③当CY5通道检测Ct值为40或空白时，其余三个通道检测Ct值均为40或空白，则该孔检测无效，应当检查仪器、试剂、样本、操作等方面的原因，重复检测，如①所示。
本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以呼吸道病毒核酸为模板，采用病毒基因序列特异性引物、探针，辅以逆转录酶、UNG酶和Taq DNA聚合酶，并加入非竞争性内参，不需配制反应液，经一步法荧光RT-PCR实验，可对三种呼吸道病毒进行快速分类鉴定检测；从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法，特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰、可靠性高，可用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明甲型流感病毒荧光检测曲线图(FAM通道)；
图2附图为本发明采用已上市甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检测结果；
图3附图为本发明乙型流感病毒荧光检测曲线图(HEX通道)；
图4附图为本发明呼吸道合胞病毒荧光检测曲线图(ROX通道)；
图5附图为本发明采用已上市呼吸道合胞病毒(RSV)A、B分型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒
(1)呼吸道病毒核酸的提取
使用上海复星长征医学科学有限公司生产的核酸提取及纯化试剂对人鼻咽拭子样本进行核酸提取。
(2)荧光RT-PCR扩增
a、加样：
向含有30μL反应液的检测管内加入20μL核酸提取液，反应体积为50μL；
b、一步法RT-PCR反应程序：
c、在第八步采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光信号。
(3)检测：本发明适用于ABI 7500荧光定量PCR仪进行病毒核酸鉴定检测。
(4)结果判断：
A、质量控制：
阴性对照CY5通道检测Ct值均应小于40，其余三个通道检测Ct值均为40或空白；阳性对照FAM、HEX、ROX和CY5通道检测Ct值均应小于40。
若检测结果未达到以上要求，则该次检测无效，应检查仪器、试剂和扩增条件等方面的误差，重复实验，直到达到质量控制的标准。
B、样本检测：
仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析；以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值；在四通道(FAM、HEX、ROX和CY5)下检测反应扩增产物的荧光强度：
①当CY5通道检测Ct值小于40时，其余三个通道检测Ct值均为40或空白：三种呼吸道病毒呈阴性；FAM通道检测Ct值小于40：甲型流感病毒呈阳性；HEX通道检测Ct值小于40：乙型流感病毒呈阳性；ROX通道检测Ct值小于40：呼吸道合胞病毒呈阳性。
②当CY5通道检测Ct值为40或空白时，其余三个通道中至少有一个通道检测Ct值小于40，则该通道检测对应病原体阳性；
③当CY5通道检测Ct值为40或空白时，其余三个通道检测Ct值均为40或空白，则该孔检测无效，应当检查仪器、试剂、样本、操作等方面的原因，重复检测，如①所示。
实施例2临床检测
用上述方法对74例临床样品进行荧光PCR定性检测，其中甲型流感病毒患者18例(含甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒均呈阳性的患者1例)，荧光检测结果见图1，临床普遍使用的胶体金检测方法检测出甲型流感病毒患者16例；经已上市的硕世生物科技股份有限公司生产的甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(货号：JC10202N)对两种方法检测结果不一致的2例样本进行荧光PCR确认检测：2例样本均为甲型流感病毒阳性(见图2)，表明本发明方法的检测效率高；乙型流感病毒患者21例，荧光检测结果见图3，与临床普遍使用的胶体金检测方法检测结果符合率100％(21/21)；呼吸道合胞病毒患者19例(含甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒均呈阳性的患者1例)，荧光检测结果见图4，临床普遍使用的胶体金检测方法检测出呼吸道合胞病毒患者18例，经已上市的上海之江生物科技股份有限公司生产的呼吸道合胞病毒(RSV)A、B分型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)(货号：Z-RR-0326-02)对两种方法检测结果不一致的1例样本进行荧光PCR确认检测：该样本为呼吸道合胞病毒阳性(见图5)；甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒阴性患者17例。
本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、可重复度高，可对人鼻咽拭子样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的定性鉴定、检测。本发明使用上海复星长征医学科学有限公司生产的核酸提取及纯化试剂对人鼻咽拭子样本进行核酸提取，保证了模板的纯度。同时，利用一步法荧光RT-PCR技术，在核酸提取结束后直接将核酸加入到反应体系中，cDNA的合成和PCR反应在一管，无需增加额外步骤；并使用UNG酶避免扩增产物污染。该操作既确保了扩增结果的准确性，灵敏度，又缩短了时间、减少了污染，提高了荧光PCR检测方法的简便性，不仅可用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的分类定性检测，也可作为临床实验室对呼吸道病毒感染的辅助诊断方法、临床治疗效果的监测手段及个体化治疗用药提供参考依据。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 上海星耀医学科技发展有限公司
<120> 一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒及检测方法
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ctatgtctag attaggaaga gaagacacca taaaaatact caaagatgcg ggatatcatg 120
ttaaggcaaa tg 132

Claims (8)

1.一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和外源性内参的特异性引物和探针；
所述甲型流感病毒的特异性引物序列如下：
IAV-F：5’-TTTGTGTTCACGCTCACCG-3’；SEQ ID NO.1；
IAV-R：5’-AGGGTCCCCATTCCCATTG-3’；SEQ ID NO.2；
所述甲型流感病毒的特异性探针序列如下：
IAV-P：5’-FAM-GCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGC-BHQ-3’；SEQ ID NO.3；
所述乙型流感病毒的特异性引物序列如下：
IBV-F：5’-CATGGCAAAGAGCCCTTGACT-3’；SEQ ID NO.4；
IBV-R：5’-CAGGCTCACTTTTGTTGTGAG-3’；SEQ ID NO.5；
所述乙型流感病毒的特异性探针序列如下：
IBV-P：5’-HEX-ACCCTGGTCAAGACCGCCTAAAC-BHQ-3’；SEQ ID NO.6；
所述呼吸道合胞病毒的特异性引物序列如下：
RSV-F：5’-CCACTTTGGAAAGGACCAGCA-3’；SEQ ID NO.7；
RSV-R：5’-TCACCTGCCATCTGTTTTCCAT-3’；SEQ ID NO.8；
所述呼吸道合胞病毒的特异性探针序列如下：
RSV-P：5’-ROX-CATAAATTTACTGGGTTAATAGGTATG-BHQ-3’；SEQ ID NO.9；
所述外源性内参的特异性引物序列如下：
IR-F：5’-CCACTTTGGAAAGGACCAGCA-3’；SEQ ID NO.10；
IR-R：5’-TCACCTGCCATCTGTTTTCCAT-3’；SEQ ID NO.11；
所述外源性内参的特异性探针序列如下：
IR-P：5’-CY5-GCTAACTTCGGCAGTAAGTGTGAC-BHQ-3’；SEQ ID NO.12。
2.根据权利要求1所述的一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：反应液、外源性内参、阴性对照和阳性对照。
3.根据权利要求2所述的一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，所述反应液含有pH8.3的Tris-HCl 20mM，KCl 100mM，明胶0.2mg/mL，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4mM，逆转录酶0.3U/μL，Taq DNA聚合酶0.2U/μL，UNG酶0.1U/μL，特异性引物和特异性探针的混合液。
4.根据权利要求3所述的一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，所述特异性引物和特异性探针的混合液含有：甲型流感病毒的特异性上游和下游引物各0.5μM，乙型流感病毒的特异性上游和下游引物各0.5μM，呼吸道合胞病毒的特异性上游和下游引物各0.5μM，外源性内参的特异性上游和下游引物各0.5μM，甲型流感病毒的特异性探针0.25μM，乙型流感病毒的特异性探针0.25μM，呼吸道合胞病毒的特异性探针0.25μM和外源性内参的特异性探针0.25μM。
5.根据权利要求2所述的一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，所述外源性内参为含有与该外源性内参基因序列相同的特定基因片段的慢病毒，所述外源性内参基因序列如下：
5’-CCACTTTGGAAAGGACCAGCAGCTAACTTCGGCAGTAAGTGTGACGGATGTGAATACAGATAAGTGAGTCTAGAAATAGTCCAGGCAAGGAACCAAATACATCGGATGCATATTTATGGAAAACAGATGGCAGGTGA-3’；SEQID NO.13。
6.根据权利要求2所述的一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无呼吸道病毒的健康人血清。
7.根据权利要求2所述的一种呼吸道病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有甲型流感病毒核酸序列片段的慢病毒、乙型流感病毒核酸序列片段的慢病毒和呼吸道合胞病毒核酸序列片段的慢病毒；
所述甲型流感病毒核酸序列片段如下：
5’-TTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAATGCCCTAAATGGGAATGGGGACCCT-3’；SEQ ID NO.14；
所述乙型流感病毒核酸序列片段如下：
5’-CATGGCAAAGAGCCCTTGACTACCCTGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAAAGAGAAAATTAGAGTCAAGAATAAAGACTCACAACAAAAGTGAGCCTG-3’；SEQ ID NO.15；
所述呼吸道合胞病毒核酸序列片段如下：
5’-TGTTATTAATCACAGAAGATGCTAATCATAAATTTACTGGGTTAATAGGTATGTTATATGCTATGTCTAGATTAGGAAGAGAAGACACCATAAAAATACTCAAAGATGCGGGATATCATGTTAAGGCAAATG-3’；SEQ IDNO.16。
8.一种呼吸道病毒核酸的联合检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)加样：向含有30μL反应液的检测管内加入20μL临床样本核酸提取液，反应体积为50μL；
(2)荧光RT-PCR扩增反应程序如下：
(3)在第八步采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光信号。
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