CN114457198B - 一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法，其解决了现有的甲型流感病毒及多分型检测手段存在检测时间长、灵敏度低、操作步骤繁琐且易发生交叉污染的技术问题，检测试剂盒包含FluA/H579反应试剂，FluA/H579反应试剂包含甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物、甲型流感病毒及H5、H7、H9探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂。本发明同时提供与甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒联合的多重荧光PCR检测方法。本发明可广泛应用于生物信息检测技术领域。

Description

一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本申请属于生物信息检测技术领域，更具体地说，是涉及一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
经过改革开放30多年的持续发展，鸡肉已成为我国第二大肉类生产和消费品，肉鸡产业已成为我国农村经济的支柱产业。然而，禽流感疫情是肉鸡乃至禽类面临的最大威胁。2004年首例禽流感在我国大陆暴发以来，我国禽类因禽流感的发病数和死亡数至少是362736羽和391501羽。
禽流感是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类的感染性疾病。禽流感病毒根据表面血凝素蛋白和神经氨酸酶的不同，可以分为不同亚型，目前发现有18种HA亚型和11种NA亚型。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性和低致病性禽流感的致死率较低；而高致病性禽流感由A型的H5、H7及H9亚型流感病毒引起，占我国发生禽流感次数的90%以上。
现阶段对禽流感的检测，主要通过临床症状、分离培养、免疫检测及PCR-电泳法等常规手段进行诊断及病原体排查。分离培养耗时耗力，需要严格的实验室环境、通常需要3天才能确诊；而免疫检测灵敏度低，且存在“窗口期”，感染后3-7天才能检测出相应的抗原或抗体；而PCR-电泳法则需要在PCR扩增结束后通过琼脂糖凝胶电泳的方法来进行结果判断，操作步骤繁琐，检测灵敏度不高且容易造成样本间的交叉污染以及实验环境污染。
发明内容
本发明就是为了解决上述背景技术的不足，提供了一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒联合多重荧光PCR检测方法，能对禽类病料样本及环境等样本中的病原体核酸进行检测，判断其禽类是否感染甲型流感病毒，且对高致病性甲型流感中的H5/H7/H9三个分型进行快速准确区分。
为此，本发明提供了一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，包含FluA/H579反应试剂，所述FluA/H579反应试剂包含甲型流感病毒及H5/H7/H9分型特异性引物、甲型流感病毒及H5/H7/H9探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂，所述甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物包括上游引物和下游引物，甲型流感病毒上游引物序列如SEQID NO:1所示，甲型流感病毒下游引物序列如SEQID NO:2所示，甲型流感探针序列如SEQID NO:3所示；H5分型上游引物序列如SEQID NO:4所示，H5分型下游引物序列如SEQID NO:5所示，H5探针序列如SEQID NO:6所示；H7分型上游引物序列如SEQID NO:7所示，H7分型下游引物序列如SEQIDNO:8所示，H7探针序列如SEQID NO:9所示；H9分型上游引物序列如SEQID NO:10所示，H9分型下游引物序列如SEQID NO:11所示，H9探针序列如SEQID NO:12所示。
优选的，甲型流感病毒及H5、H7、H9探针 5'端包括 FAM、HEX、ROX或CY5 的荧光报告基团，3'端包括 BHQ1或BHQ2 的荧光淬灭基团。
优选的，所述检测试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品包含甲型流感病毒质粒、H5分型质粒、H7分型质粒、H9分型质粒及冻干保护剂，所述阴性对照品为TE水。
优选的，甲型流感病毒及H5、H7、H9分型上下游引物浓度均为600nmol/L，甲型流感病毒及H5、H7、H9探针浓度为150nmol/L。
优选的，所述酶混合液包含5UHS-Taq酶和2.5U M-MLV酶。
优选的，所述缓冲液包含30mmol/L PH为8.8的Tris，120mmol/L KCl和1%DMSO、300μmol/L dNTPs和3.5mmol/L MgCl2。
优选的，所述冻干保护剂5%甘油、2.5%蔗糖和1%甘氨酸的混合物。
优选的，所述FluA/H579反应试剂和阳性对照品均为冻干粉状试剂。
本发明同时提供了一种甲型流感病毒及多分型的检测方法，具体步骤如下：
S1.对待测样本进行核酸提取；
S2.将甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物、甲型流感病毒及H5、H7、H9探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂混合，-20℃预冻，真空干燥，2-8℃避光保存；
S3.以甲型流感病毒质粒、H5分型质粒、H7分型质粒、H9分型质粒及冻干保护剂作为阳性对照品，-20℃预冻，真空干燥，2-8℃避光保存；以TE水作为阴性对照品；
S4. 分别使用甲型流感病毒及H5、H7、H9分型引物及探针进行多重荧光定量PCR检测；
S5.通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
所述甲型流感病毒及多分型的检测方法不用于疾病诊断或治疗。
优选的，PCR扩增条件为：50℃逆转录20min，93℃预变性2min；93℃变性10s，55℃荧光收集35s，循环40次。
本发明的有益效果为：
（1）本发明首次建立甲型流感病毒及H5、H7和H9分型的多重荧光PCR检测方法，本发明中的检测试剂盒为单管多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，可一次实现四个靶标基因的检测，从而直接实现甲型流感病毒的检测以及鉴定 H5、H7和H9分型，降低检测成本，极大缩短了检测时间，可快速即时检测，降低禽流感爆发风险，减少养殖户经济损失。
(2)本发明的检测试剂盒配合多重荧光PCR法检测，只需一次扩增即可得到检测结果，免去后续测序或电泳检测步骤，减少实验步骤并降低检测成本，能够在短时间内区分致病性禽流感分型，提高检测效率，具有极高的特异性和灵敏度，检测灵敏度可以达到100copies/mL。
（3）本发明中的检测试剂盒为冻干粉试剂盒，相较于普通液体试剂盒于-20℃保存而言，本发明的冻干粉试剂盒更加稳定，可在常温下长时间保存，具有良好常温保存稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中特异性结果图；
图2为实施例3中重复性结果图；
图3为实施例3中灵敏度结果图；
图4为实施例6中甲型流感病毒部分病料检测结果图；
图5 为实施例6中H5分型部分病料检测结果图；
图6 为实施例6中H7分型部分病料检测结果图；
图7 为实施例6中H9分型部分病料检测结果图。
具体实施方式
为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
下列实施例中，采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1 甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒
本实施例利用多重荧光PCR法的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，包括FluA/H579反应试剂、阳性对照品和阴性对照品。
（1）FluA/H579反应试剂：取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 96μL，0.5mol/L Trizma® Base 504μL，1 mol/L MgCl2 35μL，1mol/L KCl 1200μL，DMSO 100μL，dNTPs 135μL，50μmol/L的甲型流感病毒上下游引物各120µL，50μmol/L 甲型流感病毒探针30μL，50μmol/L的H5分型上下游引物各120µL，50μmol/L H5分型探针30μL，50μmol/L的H7分型上下游引物各120µL，50μmol/LH7分型探针30μL，50μmol/L的H9分型上下游引物各120µL，50μmol/LH9分型探针30μL，HS-Taq酶1μL，M-MLV酶0.5μL，甘油500μL，10%的蔗糖2500μL，10%的甘氨酸1000μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按25μL/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
其中，本发明利用生物信息学方法，根据病毒的发现时间与地点进行分类，而后获得其保守序列，具体如下：
甲型流感病毒基因序列如SEQID NO:13所示；H5分型基因序列如SEQID NO:14所示；H7分型基因序列如SEQID NO:15所示；H9分型基因序列如SEQID NO:16所示。
在此基础上，比对分析，设计甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物及探针，具体如下：
甲型流感病毒特异性引物，其上游引物为5'-acaagcccttccaaaatgtg-3'（SEQIDNO:1），其下游引物为5'-accgaatagccctctggttt-3'（SEQID NO:2）；
甲型流感探针为5'-FAM-aggaatgcggaatgtacctg-BHQ1-3'（SEQID NO:3）；
H5分型特异性引物，其上游引物为5'-ccaggggatttcaacgacta-3'（SEQID NO:4）；其下游引物为5'-ccaagaacttttggggatga-3'（SEQID NO:5）；
H5探针为5'-HEX-ttgagcagaacaaaccattttg-BHQ1-3'（SEQID NO:6）；
H7分型特异性引物，其上游引物为5'-ttgatgccaattgtgaagga-3'（SEQID NO:7）；其下游引物为5'-ataggcctcttccctttgga-3'（SEQID NO:8）；
H7探针为5'-ROX-actgctatcatggtggaggg-BHQ2-3'（SEQID NO:9）；
H9分型特异性引物，其上游引物为5'-atctgcatcggctaccaatc-3'（SEQID NO:10）；其下游引物为5'-tgctctgtgtggagcaattc-3'（SEQID NO:11）；
H9探针为5'-Cy5-aatgtccctgtgacacatgc-BHQ2-3'（SEQID NO:12）。
（2）阴性对照品：取10mL容量瓶，加入TE水定容至10mL，按500µL/支分装到离心管中，2-8℃保存备用。
（3）阳性对照品：取10mL容量瓶，分别加入5.0×105copies/mL甲型流感病毒、H5分型、H7分型、H9分型质粒各100µL，甘油500μL，10%的蔗糖2500μL，10%的甘氨酸1000μL。用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×103copies/mL的阳性对照品。将液体转移到10mL烧杯中，按50µL/支分装到离心管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将离心管取出，盖上管盖，2-8℃保存备用。
实施例2 一种甲型流感病毒及多分型的检测方法
本实施例甲型流感病毒及多分型的多重荧光PCR检测方法，包括以下具体步骤：
1.主要试剂盒：采用实施例1的检测试剂盒。
2.核酸提取：采用已备案的核酸提取试剂盒对待测样本进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6-2.0之间。
3.加样上机：
（1）阳性对照品溶解：取250μL阴性对照品加入至阳性对照品冻干粉中，混匀后备用。
（2）加样：取出FluA/H579反应试剂八联管，分别加入25μL待测样本核酸、25μL阳性对照品和25μL阴性对照品。将管盖或封膜密封后，稍微离心后置入荧光PCR扩增仪内。
（3）上机检测：
a.PCR扩增条件为：50℃逆转录20min，93℃预变性2min；93℃变性10s，55℃荧光收集35s，循环40次。
b.检测模式：
Figure 457710DEST_PATH_IMAGE001
4.有效性判断：阴性对照品应无Ct值或者为0，阳性对照品Ct值应≤38，否则，本次实验结果无效。
5.结果判读：
待测样本根据下表进行结果判读：
Figure 280172DEST_PATH_IMAGE002
实施例3 特异性、重复性和灵敏度检测
1.特异性检测
（1）特异性样本：准备8份特异性样本，其中，特异性样本1和特异性样本2为生理盐水样本、特异性样本3为经典呼肠孤病毒样本、特异性样本4为新型呼肠孤病毒样本、特异性样本5为鸡新城疫病毒样本、特异性样本6为鸭副黏病毒样本、特异性样本7为鹅副黏病毒样本、特异性样本8为小鹅瘟样本。
（2）实验过程：利用实施例1中的检测试剂盒，采用实施例2所述多重荧光PCR检测方法，分别检测以上8份特异性样本，检测结果如表1和图1所示：图1中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表CT值。
表1特异性样本1-8四个荧光通道的检测结果
Figure 547206DEST_PATH_IMAGE003
（3）实验结果：由表1和图1所知，8份特异性样本无扩增曲线，
检测结果皆为阴性，说明本发明的检测试剂盒对甲型流感病毒及H5、H7、H9分型具有较好的特异性，无交叉反应情况。
2.重复性检测
（1）重复性样本：取10mL容量瓶，分别加入5.0×107copies/mL甲型流感病毒、H5分型、H7分型、H9分型质粒各10µL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×104copies/mL的重复性样本。
（2）实验过程：利用实施例1中的检测试剂盒，采用实施例2所述多重荧光PCR检测方法，重复检测步骤（1）所配制重复性样本10次，检测结果见下表2和图2所示：图2中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表CT值。
表2重复性样本10次检测结果
Figure 746106DEST_PATH_IMAGE004
表2中①-⑩表示第一次检测-第十次检测的重复性样本的CT值。
（3）实验结果：由表2和图2可知，重复性样本的批内变异系数（CV值）＜5%，表明本发明的检测试剂盒的重复性好。
3.灵敏度检测
（1）灵敏度样本：取10mL容量瓶，分别加入5.0×107copies/mL甲型流感病毒、H5分型、H7分型、H9分型质粒各1mL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×106copies/mL的灵敏度样本1#。
取10mL容量瓶，加入灵敏度样本1#1mL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×105copies/mL的灵敏度样本2#。
取10mL容量瓶，加入灵敏度样本2#1mL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×104copies/mL的灵敏度样本3#。
取10mL容量瓶，加入灵敏度样本3#1mL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×103copies/mL的灵敏度样本4#。
取10mL容量瓶，加入灵敏度样本4#1mL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×102copies/mL的灵敏度样本5#。
（2）实验过程：采用实施例1的检测试剂盒，采用实施例2的多重荧光PCR检测方法，重复检测以上灵敏度样本，测试结果如表3和图3所示：图3中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表CT值。
表3灵敏度样本1#-5#四个荧光通道检测结果
Figure 274039DEST_PATH_IMAGE005
（3）实验结果：通过表3和图3可知，浓度为5.0×102copies/mL灵敏度样本5#仍然检测为阳性，说明本发明中的试剂盒及多重荧光PCR法的检测灵敏度为5.0×102copies/mL。
实施例4 甲型流感病毒及H5、H7、H9分型引物探针之间干扰性检测
（1）干扰样本：准备8份干扰样本，其中，干扰样本1为浓度为5.0×105copies/mL的甲型流感病毒临床样本，干扰样本2为浓度为5.0×105copies/mL的含有甲型流感P基因片段的质粒样本，干扰样本3为浓度为5.0×105copies/mL的H5分型临床样本，干扰样本4为浓度为5.0×105copies/mL的含有H5分型H基因片段的质粒样本，干扰样本5为浓度为5.0×105copies/mL的H7分型临床样本，干扰样本6为浓度为5.0×105copies/mL的含有H7分型H基因的质粒样本，干扰样本7为浓度为5.0×105copies/mL的H9分型临床样本，干扰样本8为浓度为5.0×105copies/mL的含有H9分型H基因的质粒样本。
（2）试剂配制：分别配制如下四种试剂，每种试剂有且只有1组引物及探针。
a.甲型流感病毒试剂：取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 96μL，0.5mol/L Trizma® Base 504μL，1 mol/L MgCl2 35μL，1mol/L KCl 1200μL，DMSO 100μL，dNTPs 135μL，50μmol/L的甲型流感病毒上下游引物各120µL，50μmol/L 甲型流感病毒探针30μL，HS-Taq酶1μL，M-MLV酶0.5μL，甘油500μL，10%的蔗糖2500μL，10%的甘氨酸1000μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按25μL/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
b.H5分型试剂：取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 96μL，0.5mol/LTrizma® Base 504μL，1 mol/L MgCl2 35μL，1mol/L KCl 1200μL，DMSO 100μL，dNTPs 135μL，50μmol/L的H5分型上下游引物各120µL，50μmol/L H5分型探针30μL，HS-Taq酶1μL，M-MLV酶0.5μL，甘油500μL，10%的蔗糖2500μL，10%的甘氨酸1000μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按25μL/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
c.H7分型试剂：取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 96μL，0.5mol/LTrizma® Base 504μL，1 mol/L MgCl2 35μL，1mol/L KCl 1200μL，DMSO 100μL，dNTPs 135μL，50μmol/L的H7分型上下游引物各120µL，50μmol/LH7分型探针30μL，HS-Taq酶1μL，M-MLV酶0.5μL，甘油500μL，10%的蔗糖2500μL，10%的甘氨酸1000μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按25μL/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
d.H9分型试剂：取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 96μL，0.5mol/LTrizma® Base 504μL，1 mol/L MgCl2 35μL，1mol/L KCl 1200μL，DMSO 100μL，dNTPs 135μL，50μmol/L的H9分型上下游引物各120µL，50μmol/LH9分型探针30μL，HS-Taq酶1μL，M-MLV酶0.5μL，甘油500μL，10%的蔗糖2500μL，10%的甘氨酸1000μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按25μL/孔分装到八联管中，放入冻干机中-20℃预冻6小时，然后真空干燥6小时。时间到后，将八联管取出，盖上管盖，2-8℃避光保存备用。
（3）实验过程：
a.核酸提取：采用已备案的核酸提取试剂盒对上述8份干扰样本进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6-2.0之间。
b.加样上机：将提取的8份25μL样本核酸分别加入上述四种试剂的八联管内，将管盖或封膜密封后，稍微离心后置入荧光PCR扩增仪内。PCR扩增条件和检测模式同实施例2，得到检测结果如表4所示：
表4 干扰样本1-8四个荧光通道的检测结果
Figure 267403DEST_PATH_IMAGE006
（3）实验结果：通过表4可知，甲型流感病毒试剂、H5分型试剂、H7分型试剂和H9分型试剂只能检测出各自对应的病毒样本阳性，对于其他样本皆为阴性，充分表明本发明的试剂盒中不同引物探针之间不存在相互干扰的情况。
实施例5 冻干粉试剂盒保存稳定性测试
（1）实验样本：取10mL容量瓶，分别加入5.0×103copies/mL甲型流感病毒、H5分型、H7分型、H9分型质粒各1mL，用TE水定容至10mL，得到浓度为5.0×102copies/mL的稳定性样本。
（2）实验过程：将实施例1制备的冻干粉检测试剂盒放置于室温，分别于放置后的第1、3、6、9、12个月，利用实施例2中多重荧光PCR检测方法，对上述稳定性样本检测，得出CT值，检测结果如表5所示：
表5 冻干粉试剂的稳定性测试结果
Figure 21732DEST_PATH_IMAGE007
（3）实验结果：通过表5可知，相较于普通液体试剂盒于-20℃保存而言，本发明的检测试剂盒保存在常温条件下的12个月后仍然能够稳定且准确检测出最低检测限样本为阳性，且CT值相差不大，表明本发明的冻干粉试剂检测试剂盒比起现有的普通液体试剂盒更具有良好的常温保存稳定性。
实施例6 临床样本检测应用
（1）临床样本：潍坊华英生物科技有限公司收集了70例具有相同感染症状的肉鸡病料样本。
（2）核酸提取：采用潍坊吉因生物科技有限公司生产的核酸提取试剂进行核酸提取，用紫外分光光度计检测RNA样本的纯度，70例样本OD260/OD280皆在1.6-2.0之间。
（3）检测方法：利用北京天恩泽基因科技有限公司生产的Influenza Virus A甲型流感（禽流感）病毒通用RT-PCR试剂盒（货号：13-15900y）、甲型流感（禽流感）H5、H7、H9亚型三重探针法荧光定量RT-PCR试剂盒（货号：15-15993）和仪器ABI7500检测上述70例临床样本，检测结果如表6所示。
利用实施例1中的试剂盒和仪器BL-08pro-4，采用实施例2中的多重荧光PCR检测方法进行检测，检测结果如图4-7所示：图中，纵坐标代表荧光值，横坐标代表CT值。根据实施例1中的判读标准，对结果进行判读并统计，结果如下表6所示。
表6 70例临床样本检测结果
Figure 758744DEST_PATH_IMAGE008
实验结果：如表6所示，两种试剂盒检测结果一致，说明本发明的试剂盒能准确检测出甲型流感病毒及H5分型、H7分型、H9阳性样本。
综上所述，本发明首次建立甲型流感病毒及H5、H7和H9分型的多重荧光PCR检测方法，本发明中的检测试剂盒单管多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，可一次实现四个靶标基因的检测，从而直接实现甲型流感病毒的检测以及鉴定 H5、H7和H9分型，降低检测成本，极大缩短了检测时间，可快速即时检测，降低禽流感爆发风险，减少养殖户经济损失。
本发明的检测试剂盒配合多重荧光PCR法检测，只需一次扩增即可得到检测结果，免去后续测序或电泳检测步骤，减少实验步骤并降低检测成本，能够在短时间内区分致病性禽流感分型，提高检测效率，具有极高的特异性和灵敏度，检测灵敏度可以达到100copies/mL。
本发明中的检测试剂盒为冻干粉试剂盒，相较于普通液体试剂盒于-20℃保存而言，本发明的冻干粉试剂盒更加稳定，可在常温下长时间保存，具有良好常温保存稳定性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 潍坊华卓生物科技有限公司 、潍坊吉因生物科技有限公司 、贝南生物科技（厦门）有限公司、潍坊华英生物科技有限公司、昌乐县宝都街道社区卫生服务中心
<120> 一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方法
<141> 2022-04-06
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaagccctt ccaaaatgtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accgaatagc cctctggttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggaatgcgg aatgtacctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaggggatt tcaacgacta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccaagaactt ttggggatga 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgagcagaa caaaccattt tg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgatgccaa ttgtgaagga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ataggcctct tccctttgga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
actgctatca tggtggaggg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atctgcatcg gctaccaatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgctctgtgt ggagcaattc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aatgtccctg tgacacatgc 20
<210> 13
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatgacaagc ccttccaaaa tgtgaataag atcacatacg gagcatgtcc caaatatgtg 60
aagcagaaca ccctgaagtt ggcaacagga atgcggaatg taccagagaa gcaaaccaga 120
ggcctattcg gtgcaatagc aggttttata ga 156
<210> 14
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggctggatgg ctcctcggaa accctatgtg tgacgaattc atcaatgtgc cggaatggtc 60
ttacatagtg gagaaggcca gtccagccaa tgacctctgt tacccagggg atttcaacga 120
ctatgaagaa ctgaaacacc tattgagcag aacaaaccat tttgagaaaa ttcagatcat 180
ccccaaaagt tcttggtcca atcatgatgc ctcatcaggg gtgagctcag catgtccata 240
c 249
<210> 15
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atagctccag accgtgcaag cttcctgaga gggaaatcta tgggaatcca gagtggagta 60
caggttgatg ccaattgtga aggagactgc tatcatggtg gagggacaat aataagtaac 120
ttgccatttc aaaacataga cagcagagca gtaggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 180
aagagtctgc tgctagcaac agggatgaag aatgttcctg agagtccaaa gggaagaggc 240
ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatgggtgg 308
<210> 16
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atggaagtag tatcactaat gactatacta ctagtagtaa cagtaagcaa tgcagataaa 60
atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tagacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180
gcaacaagct tgggacaccc tcttattcta gacacctgta ccgttgaagg attaatctat 246

Claims (8)

1.一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，其特征在于，包含FluA/H579反应试剂，所述FluA/H579反应试剂为冻干粉状试剂，所述FluA/H579反应试剂包含甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物、甲型流感病毒及H5、H7、H9探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂，所述甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物包括上游引物和下游引物，甲型流感病毒上游引物序列如SEQID NO:1所示，甲型流感病毒下游引物序列如SEQID NO:2所示，甲型流感探针序列如SEQID NO:3所示；H5分型上游引物序列如SEQID NO:4所示，H5分型下游引物序列如SEQID NO:5所示，
H5探针序列如SEQID NO:6所示；H7分型上游引物序列如SEQID NO:7所示，H7分型下游引物序列如SEQID NO:8所示，H7探针序列如SEQID NO:9所示；H9分型上游引物序列如SEQIDNO:10所示，H9分型下游引物序列如SEQID NO:11所示，H9探针序列如SEQID NO:12所示，甲型流感病毒及H5、H7、H9探针 5'端包括 FAM、HEX、ROX或CY5 的荧光报告基团，3'端包括BHQ1或BHQ2的荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品包含甲型流感病毒质粒、H5分型质粒、H7分型质粒、H9分型质粒及冻干保护剂，所述阴性对照品包含TE水，所述阳性对照品为冻干粉状试剂。
3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，其特征在于，甲型流感病毒及H5、H7、H9分型上下游引物浓度均为600nmol/L，甲型流感病毒及H5、H7、H9探针浓度为150nmol/L。
4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包含5UHs-Taq酶和2.5U M-MLV酶。
5.根据权利要求1所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包含30mmol/L pH为8.8的Tris，120mmol/L KCl和1%DMSO、300μmol/L dNTPs和3.5mmol/LMgCl2。
6.根据权利要求1或2所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂为5%甘油、2.5%蔗糖和1%甘氨酸的混合物。
7.一种利用权利要求1所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤如下：
S1.对待测样本进行核酸提取；
S2.将甲型流感病毒及H5、H7、H9分型特异性引物、甲型流感病毒及H5、H7、H9探针、缓冲液、酶混合液和冻干保护剂混合，-20℃预冻，真空干燥，2-8℃避光保存；
S3.以甲型流感病毒质粒、H5分型质粒、H7分型质粒、H9分型质粒及冻干保护剂作为阳性对照品，-20℃预冻，真空干燥，2-8℃避光保存；以TE水作为阴性对照品；
S4. 分别使用甲型流感病毒及H5、H7、H9分型引物及探针进行多重荧光定量PCR检测；
S5.通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
所述利用甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒的检测方法不用于疾病诊断或治疗。
8.根据权利要求7所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，PCR扩增条件为：50℃逆转录20min，93℃预变性2min；93℃变性10s，55℃荧光收集35s，循环40次。
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