CN105200164A - 巴泰病毒实时荧光定量rt-pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。所述检测方法包括使用以下引物、探针对待检测样本进行PCR扩增的步骤，上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’，探针：BATV-Probe-NS:FAM5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’。本发明建立了专门针对巴泰病毒的特异、快捷，更加敏感、有效的分子检测方法，建立实时荧光定量RT-PCR反应体系，进行体系的特异性与稳定性验证。本发明方法为今后进一步开展BATV的分布监测、临床诊断及其相关研究提供了快速便捷的技术手段，从而更好地了解该病毒。

Description

巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
巴泰病毒(Bataivirus,BATV)是布尼亚病毒科(Bnuyavirus)布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)布尼亚姆韦拉(Bunyamwera)血清组的成员，主要分布于亚洲和欧洲，以库蚊和按蚊为主要传播媒介，具有广泛的动物宿主，感染后可引起人类发热和病毒性脑炎症状。巴泰病毒于1955年首先分离自马来西亚的库蚊，随后陆续在欧亚的多个国家和地区的多种昆虫和哺乳动物中也分离到该病毒，并在人、马、牛等家畜血清中检测到该病毒抗体。我国于1998年首次从云南省的菲律宾按蚊种分离到一株巴泰病毒，且该病毒在当地发热病人中的抗体阳性率为4.17％。
目前，对BATV的检测主要采用病毒分离和病毒核酸的普通PCR检测。病毒分离耗时且对标本质量要求高，普通PCR快捷特异，但易造成污染且检测敏感性低。
本发明所建立的针对BATV的检测方法是基于RNA为模板的一步法TaqmanReal-timePCR，是一种利用反应体系中实时荧光信号的动态变化，最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。可直接用于多种被检标本提取RNA后的直接检测，不仅缩短了检测时间、实现了对模板的定量、具有更高的灵敏度和特异性，且自动化程度高、低污染，更避免了病毒分离培养中因细胞传代老化敏感性下降和因病毒的无CPE增殖现象所产生的实验误差。为今后进一步开展BATV的分布监测、临床诊断及其相关研究提供了快速便捷的技术手段。
发明内容
根据本发明的巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测用引物对，包括：
巴泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；
下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’。
根据本发明的巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测用探针，其序列如SEQIDNo.3所示：
TaqMan探针：BATV-Probe-NS:FAM5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’(SEQIDNo.3)TAMRA，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据巴泰病毒S片段最为保守的保守区域设计的，既可用于检测巴泰病毒，也可用于定量检测样本中巴泰病毒的核酸拷贝数。
根据本发明的巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法包括使用以下引物、探针对待检测样本进行PCR扩增的步骤，
巴泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；
下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’，
TaqMan探针：BATV-Probe-NS:FAM5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’(SEQIDNo.3)TAMRA，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
根据本发明的巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括：
巴泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；
下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’，
TaqMan探针：BATV-Probe-NS:FAM5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’(SEQIDNo.3)TAMRA，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
巴泰病毒25uL实时荧光定量RT-PCR检测反应体系，包括：2×ReactionMix12.5μL、EnzymeMix1μL、10μM上下游引物与5μM探针各1μL、RNA模板1μL、Nuclease-freewater7.5μL。
巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系的最佳扩增条件为：先45℃10min；然后95℃10min；最后95℃15s和60℃60s40个循环。所述巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有荧光定量PCR反应仪。
本发明具有以下优点：
1、首次建立了巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，检测方法可以直接用于任何标本提取核酸后的巴泰病毒定量检测。
2、本发明与其他巴泰病毒检测方法相比，灵敏度更高，操作更加简便且可有效防止污染，检测结果更加直观准确，使检测效率得到很大提高。
3、本检测方法不仅能够快速评价标本中巴泰病毒的感染状况，同时也为该病毒在与疾病关系方面的进一步研究提供了有效工具。
综上所述，本发明的目的就是利用TaqManReal-timePCR技术建立了专门针对巴泰病毒的特异、快捷，更加敏感、有效的分子检测方法。通过序列比对挑选出巴泰病毒基因组中S片段上高度保守的序列，在此序列上设计一对引物及一条TaqMan探针，建立实时荧光定量RT-PCR反应体系，进行体系的特异性与稳定性验证。本发明方法为今后进一步开展BATV的分布监测、临床诊断及其相关研究提供了快速便捷的技术手段，从而更好地了解该病毒。
附图说明
图1为对巴泰病毒的特异性检测的扩增曲线；
图2为巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度的病毒基因拷贝数定量分析标准曲线；
图3显示巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度定量分析标准曲线。
具体实施方式
实施例1
本发明所建立的针对巴泰的检测方法是基于RNA为模板的一步法TaqmanReal-timePCR，是一种利用反应体系中实时荧光信号的动态变化，最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。可直接用于多种被检标本提取RNA后的直接检测。本发明还涉及上述检测方法建立所包含的所有内容。
该方法具体步骤为：
(1)引物与探针的设计
TaqManPCR引物、探针序列信息见表1。
表1BATV检测体系特异引物与探针序列信息
(2)荧光素的选择
荧光发射基团选用较为常用的FAM基团，荧光淬灭基团选用TAMRA基团。
(3)引物与探针的合成
引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探针由上海生工生物工程有限公司合成并标记，探针5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
(4)样品的制备与体系的建立
将巴泰病毒的毒株接种到白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)，3天后细胞出现明显病变，收集细胞培养上清，用QIAGEN公司的QIAampViralRNAMiniKit从巴泰病毒的细胞培养上清中提取病毒RNA，参照试剂盒说明进行操作。病毒培养与RNA提取在BSL-2级生物安全实验室中进行。使用并参照ABI公司AgPath-IDTMOne-stepRT-PCRKit试剂盒说明建立的PCR反应体系为配制设定组分浓度的25μL体系，具体组分构成见表2。
表2.PCR反应体系组分构成表
组分 体积(μL)
2×Reaction Mix 12.5
Enzyme Mix 1
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
探针(5μM) 1
样本RNA 2
无核酸酶水 补足至25
设置反应条件为：
(5)巴泰实时荧光定量RT-PCR检测体系的验证
用黄病毒科黄病毒属登革热病毒血清1-4型、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒基因1、3型、蜱传脑炎病毒和库蚊黄病毒，布尼亚病毒科Tahyna病毒，披膜病毒科甲病毒属盖塔病毒，呼肠孤病毒科版纳病毒、辽宁病毒等共4科9种13株病毒的RNA作为阴性对照样本，与巴泰病毒RNA在建立的反应体系中进行引物与探针的特异性验证。巴泰病毒的RNA成功扩增Ct值≤35，其他11个阴性对照毒株的RNA均无阳性扩增信号。对提取的巴泰病毒RNA进行10倍稀释得10-1-10-4的4个不同稀释度的病毒RNA，分别进行4次平行重复实验验证体系的重复稳定性，4次重复实验所得Ct值的标准差均<0.5，变异系数均<2.5％。具体实验数据见表3。
表3.BATV检测体系重复稳定性结果
(6)阳性质粒标准品RNA的体外转录
合成BATVS片段基因高度保守区域(198-343)作为检测目的基因，并克隆至PGEM-Teasy载体中，基因合成与质粒克隆由北京梓熙生物科技有限公司完成。用TaKaRa公司GoTaqGreenMasterMix试剂盒对克隆质粒中含有目的基因的M13引物进行PCR扩增，用QIAgen公司GelExtractionKit试剂盒回收纯化PCR产物，利用紫外核酸蛋白定量仪对回收的线性化DNA模板定量，用Promega公司RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystemT7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录。上述操作均按照试剂盒说明进行。对克隆质粒中目的片段进行普通PCR扩增后回收纯化(TaKaRa公司GoTaqGreenMasterMix，QIAgen公司GelExtractionKit)，利用紫外核酸蛋白定量仪对回收的线性化DNA模板定量，用RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystemT7(Promega公司)进行RNA体外转录。均按照试剂盒说明进行操作。
(7)建立相应的定量分析模型
对阳性质粒体外转录的RNA进行定量，按照公式(6.02x1023)×(转录产物浓度ng/μl)/(转录产物分子量)＝copies/μL计算RNA拷贝数。对已知浓度RNA进行10倍系列稀释得到1×101～1×104copies/μL4个样品浓度。按照上述的反应体系与反应条件进行RT-PCR扩增。对扩增所得结果进行分析，根据101～104copies/μL不同浓度样品的拷贝数和循环阈值(Ct)绘制标准曲线。获得检测体系标准曲线方程为Y＝-4.191*LOG(X)+37.44，R2＝0.994，扩增效率Eff＝73.2％。通过所得标准曲线知所建立的巴泰病毒荧光定量RT-PCR检测方法的最低检测限为10copies/反应。本试验中设计的引物和探针经Blast分析验证表明引物和探针具备检测巴泰病毒的广谱性和特异性。试验中对4科9种13株病毒的RNA作为对照样本和巴泰病毒共同检测，结果只有巴泰病毒得到阳性结果，其他病毒无扩增信号，表明了试验检测的特异性。建立的定量标准曲线模型，显示检测方法的最低检测限为10copies/反应，表明了检测试验极具灵敏性。在4次平行重复实验Ct值的标准差(S.D.)均<0.5，变异系数(CV)均<2.5％，表明该检测体系具有良好的稳定性。

Claims (4)

1.巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测用引物对，其特征在于，包括：
巴泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；
下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’。
2.巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测用探针，其特征在于，所述探针为BATV-Probe-NS:FAM5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’TAMRA，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
3.一种巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括使用以下引物、探针对待检测样本进行PCR扩增的步骤，
其中，引物为：
巴泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；
下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’，
探针：5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’，其5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
4.巴泰病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：
其中，引物为：
巴泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5’-TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3’；
下游引物：BATV-R-NS:5’-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3’，
探针：5’-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3’，其5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
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