CN105821042A - 人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA标志物及其检测方法。本发明利用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，筛选获得了与人脐带血间充质干细胞基因组稳定性密切相关的miRNA，其RNA序列分别如SEQ ID NO.1‑5所示。本发明还提供了检测该miRNA的特异性引物及其检测方法，优化了人脐带血间充质干细胞检测方法的条件。通过检测本发明的特异miRNA标志物，可有效预估人脐带血来源的间充质干细胞传代扩增后的基因组稳定性，节约成本，降低其后续临床应用的风险，具有较好的临床应用价值和广阔的应用前景。

Description

人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA分子标志物及其应用。
背景技术
miRNA是一类内源性、高度保守、非蛋白编码的小分子RNA，长度通常为18-25nt。研究表明：miRNA可广泛参与发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和宿主的相互作用等各种生理和病理的调控过程。细胞中基因片段拷贝数变异、插入、缺失及染色体数目异常等基因组稳定性异常现象均可引起一些miRNA的异常表达或调控。
人脐带血间充质干细胞是目前为止在临床应用中最为广泛、最具有应用前景的一类成体干细胞。通常情况下，从人脐带血分离的间充质干细胞需要体外传代培养(通常需传代30次)，以扩增至足够数量细胞并应用于临床实践。此前，临床应用的间充质干细胞质检多集中在大规模传代培养后进行。发明人在前期研究(CellDeathandDisease(2013)4,e950)发现，同样来自正常供体的人脐带血间充质干细胞，在传代扩增培养后，其基因组稳定性却存在很大差异。部分间充质干细胞在正常传代30次后出现较大程度的基因拷贝数异常(CNV)甚至三染色体(Trisome)等基因组不稳定现象，给其临床应用带来巨大的潜在风险(比如成瘤)。因此，在大规模传代培养前对人脐带血间充质干细胞进行基因组稳定性评估具有重要意义，但现阶段缺乏合适的分子标记物用于质量评估。
发明内容
本发明的目的在于提供一组能够评估人脐带血间充质干细胞大规模传代后基因组稳定性的特异miRNA及其应用。本发明利用新一代高通量测序技术，结合生物信息学分析方法与实验验证，通过对三对传代早期(第3代)与晚期(第30代)的人脐带血间充质干细胞进行的全基因组miRNA-Seq分析，筛选得到了一组与人脐带血间充质干细胞传代基因组稳定性高度相关的一组miRNA分子标志物。其名称为miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p。其RNA序列分别如SEQIDNO.1-5所示。
miR-376a-5pGUAGAUUCUCCUUCUAUGAGUA(SEQIDNO.1)
miR-501-5pAAUCCUUUGUCCCUGGGUGAGA(SEQIDNO.2)
miR-24-2-5pUGCCUACUGAGCUGAAACACAG(SEQIDNO.3)
miR-136-3pCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU(SEQIDNO.4)
miR-127-3pUCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU(SEQIDNO.5)
本发明提供了上述miRNA分子标志物在人脐带血间充质干细胞质量监测中的应用。
本发明提供了上述miRNA分子标志物在制备评估人脐带血间充质干细胞基因组稳定性试剂盒中的应用。
进一步地，本发明提供了用于检测上述miRNA分子标志物的特异性引物对组合，含有以下引物对，
用于检测miR-376a-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.6-7所示；
用于检测miR-501-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.8-9所示；
用于检测miR-24-2-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.10-11所示；
用于检测miR-136-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.12-13所示；
用于检测miR-127-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.14-15所示。
miR-376a-5p
反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.6)
正向引物 GTAGATTCTCCTTCTATGAGTA(SEQ ID NO.7)
miR-501-5p
反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.8)
正向引物 AATCCTTTGTCCCTGGGTGAGA(SEQ ID NO.9)
miR-24-2-5p
反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.10)
正向引物 TGCCTACTGAGCTGAAACACAG(SEQ ID NO.11)
miR-136-3p
反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.12)
正向引物 CATCATCGTCTCAAATGAGTCT(SEQ ID NO.13)
miR-127-3p
反向引物 GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQ ID NO.14)
正向引物 TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT(SEQ ID NO.15)
本发明提供了上述特异性引物对组合在制备评估人脐带血间充质干细胞基因组稳定性试剂盒中的应用。
本发明提供了上述特异性引物对组合在人脐带血间充质干细胞质量监测中的应用。
更进一步地，本发明提供了一种检测人脐带血间充质干细胞基因组稳定性的试剂盒，含有以下任一对或多对特异性引物对，
用于检测miR-376a-5p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.6-7所示；
用于检测miR-501-5p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.8-9所示；
用于检测miR-24-2-5p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.10-11所示；
用于检测miR-136-3p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.12-13所示；
用于检测miR-127-3p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.14-15所示。
本发明的上述试剂盒通过实时荧光定量PCR的方法，利用试剂盒中的引物对对待测人脐带血间充质干细胞样品进行检测；待测人脐带血间充质干细胞样品在检测前需提取总RNA、RNA加尾、合成cDNA。
具体地，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：第一步95℃，10min；第二步95℃，10sec,60℃，30s，第二步需40个循环。
在本发明的一个实施例中，实时荧光定量PCR的反应体系为：
本发明的试剂盒在检测人脐带血间充质干细胞基因组稳定性中的应用，若检测到miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p任一分子标志物在传代早期的人脐带血间充质干细胞待测样本中的表达水平显著高于传代早期的正常对照样本，则待测细胞样本存在传代扩增后基因组不稳定性的风险，
所述正常对照样本为传代到晚期基因组稳定性正常的人脐带血间充质干细胞。
本发明所述的传代早期是指传代数不超过3代。
也即本发明的上述5个分子标志物miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p在待测样本中的表达水平与正常对照样本没有显著性差异，表明该间充质干细胞传代扩增后其基因组是稳定的，可以用于扩增培养。
本发明针对三对人脐带血间充质干细胞大规模传代扩增后基因组稳定性存在显著差异的细胞，进行高通量分析与生物信息分析技术，并结合细胞实验验证，提供了一组用于特异性评估人脐带血间充质干细胞大规模传代后基因组稳定性的miRNA分子标志物，本发明的特异miRNA可用于指导间充质干细胞的临床应用，进一步完善间充质干细胞质检手段，只要有一个分子标志物的表达水平显著高于正常对照样本，即可判断该间充质干细胞可能已经存在扩增后基因组不稳定性的风险。当然如果越多的分子标记物表达水平显著高于正常对照样本，该细胞传代后基因组不稳定性的可能性会越大，而且表达差异越大可能预示着不稳定性的风险也越大。本发明方法一方面对细胞传代扩增后的基因组稳定性质量进行预估，另一方面节约了大量扩增该细胞的成本(培养基成本很高)。
本发明检测miRNA的特异性引物对可用于制备评估间充质干细胞传代后基因组稳定性的试剂盒，如果待测样本中分子标志物表达水平与正常对照样本没有显著性差异，则说明该待测细胞的基因组是稳定的。反之，如果待测样本中分子标志物表达水平显著高于正常对照样本，则说明该待测细胞样本的基因组传代扩增后可能会不稳定，不适于扩增传代培养，因为基因组不稳定性间充质干细胞的临床应用，可能会带来诸如成瘤等的潜在风险。本发明提供的试剂盒可有效降低间充质干细胞临床应用的风险，具备较好的临床应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为细胞miRNA-Seq高通量组学数据的测序结果图，生物信息技术筛选的与人脐带血间充质干细胞传代稳定性关联的一组miRNA。N1、M1、S1和N2、M2、S2分别代表基因组稳定性存在差异(正常-N、中度异常-M、严重异常-S)的两组独立实验的6株人脐带血间充质干细胞第三代细胞。miRNA表达水平为比对上的序列数目进行标准化后的数值。通过对全基因组的miRNA进行实验组内样本间差异表达分析，筛选出以下miRNA分子标志物，包括miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p，在两组独立实验中，其表达水平均随基因组稳定性异常程度的加重而次序升高(p<0.05)。
图2A-图2E为本发明的miRNA与间充质干细胞基因组稳定性的相关性分析。根据传代后的人脐带血间充质干细胞出现CNV(基因拷贝数变异)的数目，定义N1和N2的基因组异常值为0，M1和M2的基因组异常值为0.5，S1和S2的基因组异常值为1。通过对图1筛选出的miRNA的表达量和基因组异常值进行Pearson相关系数的计算，发现这些miRNA的表达水平与基因组稳定性异常程度呈显著正相关(cor>0.85,p<0.01)。
图3为本发明的miRNA的功能分析。通过TargetScanHuman7.0数据库，对图1筛选出的miRNA分别进行靶基因预测，并对加权打分后得分最高的前200个靶基因进行生物功能预测。发现其中4个miRNA可能通过靶向调控相应的靶基因，参与调控细胞周期、细胞凋亡等与基因组稳定性密切相关的分子通路，进而影响间充质干细胞的基因组稳定性。
图4为qPCR技术验证与基因组稳定性相关的miRNA。利用另外一组人脐带血间充质干细胞，包括基因组稳定性正常(N)、中度异常(M)、以及严重异常(S)，对上述生物信息分析获得的miRNA利用qPCR技术进行验证，评估其表达变化与基因组稳定性的关系。将各个miRNA在基因组稳定性正常的样本中的表达量定义为1，相对表达量代表在M和S样本中各个miRNA的表达量相对于N样本中的倍数。T-test用于差异显著性分析，表示各个miRNA在M与S样本中的表达量相对于样本N中的差异(***,p-value<0.001；**,p-value<0.01,*,p-value<0.05)。
图5为qPCR技术检测基因组稳定性差异的一组间充质干细胞中各个miRNA的灵敏度分析。样本中miRNA产物是否易于扩增是评估qPCR检测灵敏度的重要方法。其中图5A-C分别表示各个miRNA(miR-376a-5p，miR-501-5p，miR-24-2-5p，miR-136-3p，及miR-127-3p)与U6在扩增后基因组稳定性正常(A)，中度异常(B)，以及严重异常(C)的间充质干细胞(P3)样本中qPCR扩增曲线图谱。从图中可以看出，利用优化的引物与扩增条件，Ct值介于17-23之间，表示各个miRNA可以很灵敏地利用现有条件在间充质干细胞样本中进行扩增、检测。
图6为利用qPCR溶解曲线分析各个miRNA在基因组稳定性存在差异的一组间充质干细胞样本中的特异性分析。图中可以看出，在现有优化的检测条件下，扩增产物非常单一，特异性好。其中，图6A，图6B，图6C分别表示miR-376a-5p在扩增培养后基因组稳定性正常，中度异常，以及严重异常的间充质干细胞(P3)样本中的溶解曲线图谱。
图7A，图7B，图7C分别表示miR-501-5p在扩增培养后基因组稳定性正常，中度异常，以及严重异常的间充质干细胞(P3)样本中的溶解曲线图谱。
图8A，图8B，图8C分别表示miR-24-2-5p在扩增培养后基因组稳定性正常，中度异常，以及严重异常的间充质干细胞(P3)样本中的溶解曲线图谱。
图9A，图9B，图9C分别表示miR-136-3p在扩增培养后基因组稳定性正常，中度异常，以及严重异常的间充质干细胞(P3)样本中的溶解曲线图谱。
图10A，图10B，图10C分别表示miR-127-3p在扩增培养后基因组稳定性正常，中度异常，以及严重异常的间充质干细胞(P3)样本中的溶解曲线图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1利用生物信息技术筛选出与人脐带血间充质干细胞传代基因组稳定性关联的miRNA
根据传代扩增后(第30代)间充质干细胞的基因组稳定性情况(前期工作中，发明人已经掌握了这些传代晚期间充质干细胞的基因组稳定性情况信息，文章发表在CellDeathandDisease(2013)4,e950)，选取两组有代表性的人脐带血间充质干细胞(购自天津昂赛细胞基因工程有限公司)。这两组共6株细胞均为传代早期(第3代)间充质干细胞，且每组中的3株细胞对应的传代晚期(第30代)细胞的基因组稳定性分别为正常(N)、中度异常(M)、严重异常(S)。对这样的6株细胞进行miRNA-Seq测序，结合这些细胞对应的传代晚期细胞的基因组稳定性情况，利用生物信息技术系统筛选与间充质干细胞传代稳定性密切关联的一组miRNA。
首先利用miRDeep2工具对6个样本的全基因组miRNA进行定量分析，并基于样本测序总量和序列长度进行miRNA表达量的标准化分析。之后基于标准化的表达量，利用DEGSeq软件包对全基因组miRNA进行独立实验组的样本间差异表达分析，筛选出表达水平随基因组稳定性异常程度的加重而次序升高的miRNA(统计学显著性p<0.05)。这样的miRNA在实验组1中有204个，在实验组2中有56个。取两组独立实验的共同结果，这样的miRNA有5个，分别为miR-376a-5p，miR-501-5p，miR-24-2-5p，miR-136-3p及miR-127-3p(见图1)。
这些miRNA可以指征新鲜分离的人脐带血间充质干细胞在传代扩增后其基因组稳定性程度，降低了临床应用风险，节约成本。筛选出的5个标志物分别为miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p。其RNA序列分别如SEQIDNO.1-5所示。
实施例2对实施例1筛选的miRNA与间充质干细胞基因组稳定性的相关性分析
根据传代后的人脐带血间充质干细胞出现CNV(基因拷贝数变异)的数目，定义实施例1中两组独立实验中基因组正常的克隆N1和N2的基因组异常值为0，基因组轻度异常的克隆M1和M2的基因组异常值为0.5，基因组严重异常的克隆S1和S2的基因组异常值为1。通过R语言工具包对实施例1筛选出的5个miRNA的表达量和基因组异常值进行Pearson相关性分析(见图2A、图2B、图2C、图2D、图2E)，相关系数计算值均大于0.85，且p值小于0.01。这说明实施例1筛选出的miRNA的表达水平与基因组稳定性的异常程度呈显著正相关关系。
实施例3生物信息技术分析miRNA与间充质干细胞基因组稳定性的关系
通过TargetScanHuman7.0数据库对实施例1筛选出的5个miRNA分别进行靶基因预测，并对预测结果中的14项靶基因特征进行加权打分，筛选出打分值最高的前200个靶基因，进行后续的GeneOntology和Pathway等功能分析。发现其中4个miRNA(miR-501-5p，miR-24-2-5p，miR-136-3p，及miR-127-3p)的靶基因参与调控细胞周期、细胞凋亡等与基因组稳定性密切相关的分子通路。所以它们可能通过靶向调控靶基因的表达水平，进而影响间充质干细胞的基因组稳定性。而不参与调控细胞周期、细胞凋亡通路的miR-376a-5p，可能通过靶向其他通路的参与基因来影响间充质干细胞的基因组稳定性(见图3)。
这些与基因组稳定性密切相关的miRNA将利用另一组传代早期(第3代)的间充质干细胞样本(其对应的传代晚期细胞基因组稳定性分别为正常、中度异常、严重异常。这组细胞在已发表文章中只是进行了基因组稳定性分析，但出于成本考虑未进行全基因组miRNA-Seq测序，故本发明用实验验证这些miRNA)进行实验验证。
实施例4利用miRNA分子标志物评估人脐带血间充质干细胞传代扩增后基因组稳定性方法的建立
1、样品：3例传代早期(第3代)的人脐带血间充质干细胞样本。这3例样本分别代表其对应的传代扩增后的基因组稳定性正常、中度异常，以及严重异常。
2、样品处理：按照Trizol试剂的标准操作方法抽提间充质干细胞总RNA。
3、检测：取2μg总RNA用于后续试验。
(1)RNA加尾在0.2mLPCR管中混匀以下各成分，然后37℃水浴1.5小时。RNA加尾反应体系如下：RNA(DNAfree)2μg，10×Poly(A)PolymeraseReactionBuffer1μL，ATP(10mM)1μL，E.coliPoly(A)Polymerase(5U/μl)0.2uL，加去核酸酶水补足至20μL。
(2)加反转录引物:加入0.5μl(1μg/μl)反转录引物，65度水浴放置10min后放置冰上至少5min，并一直置于冰上至RT反应；
(3)cDNA的合成(逆转录)
将上述0.2μl反应体系置于冰上，加入1μLQmir-RT。65℃加热10分钟，迅速置于冰上冷却5分钟以上。在冰上向上述反应体系中依次加入反应体系成分：逆转录反应体系：由(2)得到的产物10.5μL，5×ReactionBuffer4μL，RiboLockRNaseInhibitor(20U/μl)0.5μL，10mMdNTPMix2μL，RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase(200U/μl)1μL，Nuclease-freeWater2μL，总体积20μL。
将上述反应管放到PCR仪中，42℃，60min；72℃，10min；4℃保存。
(4)实时定量PCR
在CFX96实时定量PCR仪上进行的反应体系和反应程序如下：cDNA1μL，上、下游引物(1μM)各4μL，SYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(2×)9μL，总体积18μL。
实时定量PCR反应程序：95℃，10min；95℃10s，60℃，30s，共40个循环。
用于检测miR-376a-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.6-7所示；
用于检测miR-501-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.8-9所示；
用于检测miR-24-2-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.10-11所示；
用于检测miR-136-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.12-13所示；
用于检测miR-127-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.14-15所示。
4、检测结果：通过RT-PCR技术分别检测实施例1筛选的5个miRNA在人脐带血间充质干细胞样本中的表达量，将传代扩增后基因组稳定性正常的间充质干细胞中miRNA表达量标准化为1，纵坐标为相对表达量(见图4)。筛选miRNA标准如下：1)在上述获得的5个miRNA中，筛选差异倍数大于1.5倍；2)在基因组稳定性异常与正常的样本间存在显著差异(p值<0.05)；3)在基因组稳定异性严重异常的样本中高于中度异常样本。
本发明提供的针对上述5个miRNA的的特异性引物可以准确检测到人脐带血间充质干细胞稳定与异常程度。如果待测样本中分子标志物表达水平与正常对照样本没有显著性差异，则说明该待测细胞的基因组是稳定的。反之，如果待测样本中分子标志物表达水平显著高于正常对照样本，则说明该待测细胞样本的基因组传代扩增后可能会不稳定，不适于扩增传代培养。
5、灵敏度分析
通过优化扩增引物、反转录及扩增条件等，本发明提供的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测人脐带血来源的间充质干细胞中miR-376a-5p，miR-501-5p，miR-24-2-5p，miR-136-3p，及miR-127-3p的表达水平。通过qPCR扩增曲线,可以明显看出这几个miRNA易于扩增，Ct值介于17-23之间，显示灵敏度较好，表明可以利用qPCR方法检测评估间这些miRNA在间充质干细胞中的表达水平。(见图5A、图5B、图5C)。
6、特异性分析
在保证这些miRNA检测灵敏度的同时，本发明优化的miRNA检测条件也确保了其产物扩增的特异性，产物单一，因此，可以用来准确评估本发明筛选的5个miRNA在间充质干细胞扩增传代前的表达水平。分析qPCR过程中仪器自动生成的溶解曲线是评估扩增产物是否单一的标准方法，本申请中也是利用了溶解曲线图谱来评估扩增产物的特异性(见图6A-C,图7A-C,图8A-C,图9A-C,图10A-C)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA分子标志物，其特征在于，其为miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p，其RNA序列分别如SEQIDNO.1-5所示。
2.权利要求1所述的分子标志物在人脐带血间充质干细胞质量监测中的应用。
3.权利要求1所述的分子标志物在制备评估人脐带血间充质干细胞基因组稳定性试剂盒中的应用。
4.用于检测权利要求1所述分子标志物的特异性引物对组合，其特征在于，含有以下引物对，
用于检测miR-376a-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.6-7所示；
用于检测miR-501-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.8-9所示；
用于检测miR-24-2-5p的特异性引物对序列如SEQIDNO.10-11所示；
用于检测miR-136-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.12-13所示；
用于检测miR-127-3p的特异性引物对序列如SEQIDNO.14-15所示。
5.权利要求4所述的特异性引物对组合在制备评估人脐带血间充质干细胞基因组稳定性试剂盒中的应用。
6.权利要求4所述的特异性引物对组合在人脐带血间充质干细胞质量监测中的应用。
7.一种检测人脐带血间充质干细胞基因组稳定性的试剂盒，其特征在于，含有以下任一对或多对特异性引物对，
用于检测miR-376a-5p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.6-7所示；
用于检测miR-501-5p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.8-9所示；
用于检测miR-24-2-5p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.10-11所示；
用于检测miR-136-3p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.12-13所示；
用于检测miR-127-3p的特异性引物对，序列如SEQIDNO.14-15所示。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，通过实时荧光定量PCR的方法，利用试剂盒中的引物对对待测人脐带血间充质干细胞样品进行检测；待测人脐带血间充质干细胞样品在检测前需提取总RNA、RNA加尾、合成cDNA。
9.如权利要求7-8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃，10min；95℃10s，60℃，30s，共40个循环。
10.权利要求7-9任一所述的试剂盒在评估人脐带血间充质干细胞基因组稳定性中的应用，其特征在于，若检测到miR-376a-5p,miR-501-5p,miR-24-2-5p,miR-136-3p,miR-127-3p任一分子标志物在传代早期的人脐带血间充质干细胞待测样本中的表达水平显著高于传代早期的正常对照样本，则待测细胞样本存在传代扩增后基因组不稳定性的风险，
所述正常对照样本为传代到晚期基因组稳定性正常的人脐带血间充质干细胞。
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