CN102409109B

CN102409109B - 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法

Info

Publication number: CN102409109B
Application number: CN2011103827277A
Authority: CN
Inventors: 张严峻; 张磊; 严杰
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-11-25
Also published as: CN102409109A

Abstract

本发明涉及新型布尼亚病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及新型布尼亚病毒检测方法。目的是提供的试剂盒应使用方便、检测准确，检测方法应检测准确性高、检测效率高。技术方案是：一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸及混合制剂；上游引物序列为-FP:5’-TGGCCCTGGCTCTATAAACAT-3’；下游引物序列为-RP:5’-AATGGCAGCCCAAATGAATC-3’；特异性探针序列为P:5’-FAM-TCCAATGAYGCCAAGAAGTGGAA-BHQ1-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

Description

新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法

技术领域

本发明涉及一种病毒定量检测试剂盒以及病毒检测方法，尤其是新型布尼亚病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及新型布尼亚病毒检测方法，可应用于新型布尼亚病毒引起暴发疫情的实验室应急检测。

背景技术

河南、山东等地多次发生“蜱虫叮咬致死事件”，引起社会各界的广泛关注。通过调查，近年来在河南、湖北、山东、安徽等省相继发现并报告一些以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例，其中部分重症患者因多脏器损害，救治无效死亡。这引起政府卫生部门的高度重视。针对近年通过蜱虫叮咬引发的以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病，10月9日卫生部发布《发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)》，以指导临床医生和疾控人员做好相关诊断、报告、治疗、现场调查、实验室检测、疫情防控和公众健康教育等工作。为确定该类患者的致病原因，中国疾病预防控制中心于2010年5月在湖北、河南两省部分地区启动了发热伴血小板减少综合征病例监测。经对患者血液中分离到的病毒进行鉴定、全基因组基因序列分析、急性期和恢复期双份血清抗体中和试验等实验室检测，发现两省报告的大部分病例标本中存在新型布尼亚病毒感染。

随着世界各地由布尼亚病毒科病毒引起的新发或再发传染病爆发性流行，布尼亚病毒科病毒将受到越来越多的关注。流行病学研究发现，大多数新型布尼亚病毒感染病例分布在山区和丘陵地带的农村，主要通过蜱虫叮咬传播。同时，相关部门也已从病例所在地区的蜱中分离到该病毒，进一步证实蜱虫为新型布尼亚病毒重要传播媒介。我国山地、丘陵地区较广，蜱虫种类众多，蜱传病毒感染病例时有发生。随着经济的发展，山区丘陵地带的旅游业也日益发达，如果该地区蜱类宿主携带新型布尼亚病毒，其传播给人类的概率很大。

目前，对布尼亚病毒感染的治疗并无特效药，以对症治疗为主，临床主要以使用广谱强效抗病毒药物。此外，还要同时提高患者自身的免疫状态，达到抵抗病毒的功效。临床治疗手段的缺乏，强烈需要快速、有效的布尼亚病毒检测技术来加强对环境中该病毒的检测，提高对新型布尼亚病毒病的防制能力。采用现有的生物信息学分析手段，对国内各新型布尼亚病毒株基因组序列进行同源性分析，建立基于新型布尼亚病毒基因组特异性保守区域的荧光定量RT-PCR技术，可以有效用于新型布尼亚病毒感染疑似病例样本及媒介生物中所携带新型布尼亚病毒的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点。

本发明的另一目的是提供一种新型布尼亚病毒的检测方法，该方法应具有检测准确性高、检测效率高的特点。

本发明采用的技术方案是：

一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸以及包含DNA聚合酶、MMLV逆转录酶和RNA酶抑制剂的混合制剂；所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物-FP：5’-TGGCCCTGGCTCTATAAACAT-3’；

下游引物-RP：5’-AATGGCAGCCCAAATGAATC-3’；

特异性探针P：5’-FAM-TCCAATGAYGCCAAGAAGTGGAA-BHQ1-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

所述试剂盒中各组分的含量为：

混合制剂5ul，其中DNA聚合酶，逆转录酶、RNA酶抑制剂之比为1∶50∶5；

溶剂为RNase free dH₂O水 25μl。

所述PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR Reaction Buffer。

一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：

(1)提取待测样品RNA；

(2)以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成反应体系进行一步法PCR反应：特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂；所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物-FP：5’-TGGCCCTGGCTCTATAAACAT-3’；

下游引物-RP：5’-AATGGCAGCCCAAATGAATC-3’；

特异性探针P：5’-FAM-TCCAATGAYGCCAAGAAGTGGAA-BHQ1-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

(3)反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性，即则待测样品含有新型布尼亚病毒；若无典型的扩增曲线，判断为阴性。

所述步骤(2)中PCR反应体系中各成分的终浓度如下：

其余是作为溶剂的RNase free dH₂O(无RNA酶的水)水；

所述PCR缓冲液为One Step RT-PCR Reaction Buffer。

所述步骤(2)中PCR反应条件如下：50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，60℃30～35s，在60℃进行单点荧光检测，共进行45个循环。

本发明的有益效果是：所提供的荧光RT-PCR方法对新型布尼亚病毒具有较好的特异性；敏感性达到0.1TCID₅₀/ml；检测新型布尼亚病毒的阳性率高(80％)；从而为有效预防和治疗新型布尼亚病毒作出了积极贡献。

附图说明

图1是新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测特异性评价结果示意图。纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线Y表示阈值线。A曲线表示该体系对新型布尼亚病毒核酸检测扩增结果；B-G各曲线表示该检测体系对其他病毒(登革病毒、乙脑病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒)及空白对照的扩增检测结果。

图2是新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR灵敏度检测结果示意图。

纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线Y表示阈值线。图中从A至E的各扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、1、0.1TCID₅₀/ml浓度新型布尼亚病毒进行扩增检测的结果。

图3是新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR临床样本检测结果示意图。

纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线Y表示阈值线。图中A、B、D、E、F各扩增曲线分别表示采用本扩增体系对不同临床样本的扩增检测结果；图中C曲线表示采用本扩增体系对新型布尼亚病毒核酸(阳性对照)的扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

新型布尼亚病毒是新发现的布尼亚科成员。布尼亚科病毒的粒子通常为具有包膜的球形，直径约80～120nm，表面具有长5～10nm的糖蛋白突起，这些突起被包埋在厚度约为5nm的双层脂质膜中。该科病毒的所有成员为三分基因组，单个病毒粒子包裹有大(L)、中(M)、小(S)3种负义或双义线形ssRNA，编码4种结构蛋白，包括两种外源糖蛋白(Gn Gc)、一种外壳蛋白(N)和一种超大的多聚酶(L)。每个基因组RNA片段的末端核苷酸碱基配对，形成非共价闭环RNA。布尼亚科病毒科包括布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)、汉坦病毒属(Hantavirus)、内罗华病毒属(Nairovirus)、白蛉热病毒属(Phlebovirus)和番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。尽管布尼亚科病毒5个成员属之间在结构上有很多相似的地方，但在它们之间仍存在很多差异：该科4个属主要感染脊椎动物和节肢动物，通常对脊椎动物寄主是溶细胞性的，而对无脊椎动物仅引起不显著的细胞病理变化；番茄斑萎病毒属是布尼亚科病毒中唯一能感染植物的一个属。流行病调查显示，汉坦病毒属病毒的主要宿主为啮齿类，经动物的分泌物和排泄物传播，而内罗华病毒属和白蛉热病毒属病毒的主要传播媒介为蜱。除血清学等常规检测方法之外，关于布尼亚病毒科白蛉病毒属和内罗病毒属检测方法研究几乎空白。这两种病毒属是主要以蜱虫为主要传播媒介的布尼亚病毒科病毒，与上述事件密切相关。

经全基因组测序，同源性分析后发现，该新型布尼亚病毒属于白蛉热病毒属。国内各新型布尼亚病毒株基因组序列的公布，也为新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR方法的建立提供了重要的支持。通过对已有的各株新型布尼亚病毒基因组序列进行比对，我们发现编码依赖RNA的RNA聚合酶的L片段核苷酸序列保守存在于各新型布尼亚病毒株中，相似度达95％以上，是新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测的良好靶点。通过选取新型布尼亚病毒L基因组序列中适合用于荧光定量RT-PCR检测的区域，设计引物、探针，建立新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测方法，将被广泛用于对各种样本中新型布尼亚病毒的快速鉴定，对完善新型布尼亚病毒的检测具有十分重大的意义。

实施例1：

1材料与方法

病毒株与临床标本：

新型布尼亚病毒毒株为浙江省疾病预防控制中心分离株，其DNA由序列表中的第4序列所示。临床样本来源于近期浙江省新型布尼亚病毒爆发疫情疑似患者的血清，样本采集后带冰运送到实验室。

1.2引物与探针

从美国的NCBI基因库上下载了全国各地的新型布尼亚病毒毒株基因组序列。对其进行了同源性比较，在所有新型布尼亚病毒基因组L基因区设计新型布尼亚病毒特异性引物与Taqman探针，序列如下(序列表中的第1至第3序列)：

上游引物：5’-AGGTTTGAGATATTCCCCAAGACA-3’

下游引物：5’-AATTTTTGTAGAAGCTTTTTGCTCC-3’

特异性探针：5’-FAM-CATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1-3’

本发明使用的引物和探针委托上海英骏生物科技有限公司合成。

1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取：

以浙江省疾病预防控制中心提供的新型布尼亚病毒毒株(确证患者标本分离的新型布尼亚病毒)为标准毒株，用非洲绿猴肾传代细胞(Vero)进行病毒滴度测定(10^5.3TCID₅₀/ml)后作为参考株。将其稀释至1000、100、10、1、0.1TCID₅₀/ml每个反应管。采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit试剂盒提取病毒RNA，按试剂盒说明书所述方法提取，得到病毒RNA为模板RNA备用。

1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

缓冲液选用上海超世生物科技有限公司的2×One Step RT-PCR ReactionBuffer，Code：Q40101，反应体系为25μl，其中2×One Step RT-PCR ReactionBuffer 7.5ul，Enzyme Mix 5ul，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl，模板RNA 2-3μl，RNase free dH₂O水补足25μl。反应条件为50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，60℃30s，在60℃进行单点荧光检测，共进行45个循环。

结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线(图1至图3中的阈值线Y)刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度分别为400nmol/体系、200nmol/体系。

1.5荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验

选择新型布尼亚病毒毒株和2010年浙江省新型布尼亚病毒感染疫情确诊患者的急性期血清为临床样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用新型布尼亚病毒荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；提取不同浓度新型布尼亚病毒的总RNA，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性，结果见图3[图中C表示采用本扩增体系对新型布尼亚病毒毒株核酸(阳性对照)的扩增结果]，结果表明，本发明所述的引物与探针能特异检测新型布尼亚病毒。

2结果

2.1荧光RT-PCR反应体系及条件

缓冲液选用上海超世生物科技有限公司的2×One Step RT-PCR ReactionBuffer，Code(货号)：Q40101，按说明书操作，反应体系为25μl，其中2×OneStep RT-PCR Reaction Buffer 7.5ul，用DNA聚合酶、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂来制它们的混合制剂Enzyme Mix 5ul(DNA聚合酶，逆转录酶、RNA酶抑制剂之比为1∶50∶5)，上游引物(10μmol/L)与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl，模板RNA 2-3μl，RNase free dH₂O水补足25μl。用Rotor-Gene6000荧光检测系统进行检测，反应参数为：反应条件为50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，60℃30s，在60℃进行单点荧光检测，共进行45个循环，可获得最低Ct值和最高荧光强度。

2.2特异性试验

本发明建立的荧光RT-PCR方法对新型布尼亚病毒具有较好的特异性，对近期流行的新型布尼亚病毒感染患者的急性期血清进行检测也显示阳性反应。而与其他能引起相似临床症状的病毒均无交叉反应(见图1)。

2.3敏感性试验

对新型布尼亚病毒毒株，采用Vero细胞进行病毒滴度测定，将其稀释至1000、100、10、1、0.1TCID₅₀/ml。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的ReansyMini Kit试剂盒；按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA。用荧光RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性达到0.1TCID₅₀/ml(见图2)。

2.4重复性试验

新型布尼亚病毒毒株按10倍梯度稀释成5个不同的浓度，反应体系如1.4中所述，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.05～0.25之间，具有较好的重复性(表1)。

表1荧光RT-PCR法检测肠道病毒的重复性试验

2.5临床样本的检测

从近期浙江省各地报告的新型布尼亚病毒感染疫情疑似患者的血清共10份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明新型布尼亚病毒荧光RT-PCR方法检测新型布尼亚病毒核酸，结果本发明方法检测出新型布尼亚病毒核酸8份，本发明荧光RT-PCR方法检测新型布尼亚病毒的阳性率高。本发明荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果，图3显示的是部分临床样本的检测图谱。

Claims

1.一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸以及包含DNA聚合酶、MMLV逆转录酶和RNA酶抑制剂的混合制剂；所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物-FP:5’-TGGCCCTGGCTCTATAAACAT-3’；

下游引物-RP:5’-AATGGCAGCCCAAATGAATC-3’；

荧光探针P:5’-FAM-TCCAATGAYGCCAAGAAGTGGAA-BHQ1-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分的含量为：

3.根据权利要求2所述的一种新型布尼亚病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR Reaction Buffer。