CN102912035B

CN102912035B - 一种通用型检测汉坦病毒实时荧光rt-pcr的非诊断性方法

Info

Publication number: CN102912035B
Application number: CN201210265437.9A
Authority: CN
Inventors: 杨鹏飞; 胡孔新; 燕清丽; 姚李四; 张丽萍
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: CN102912035A

Abstract

本发明公开了一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法，该检测方法包括选择汉坦病毒L基因全长序列，进行同源性比对，在其保守区设计引物；根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并检测探针的特异性；对待检测物进行实时定量分析，利用特异性荧光探针，实行完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会、减少了实验步骤、实验时间和对试剂的消耗。目前尚无汉坦病毒的通用性检测方法，基本上都是以每一种汉坦基因型别为基础单一的扩增对应的型别。本发明实现了利用一对引物及一条探针检测不同基因型别的汉坦病毒，实时PCR具有非常高的灵敏度和特异度，对汉坦病毒基因检测灵敏、准确。在实际中，尤其是疫情爆发时有高的应用价值。

Description

一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法

技术领域

本发明提供一种利用荧光定量RT-PCR检测汉坦病毒的非诊断性方法。

背景技术

汉坦病毒属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的汉坦病毒属(Hantavirus)，为分节段的单股负链RNA病毒，其基因组由大(L)、中(M)和小(S)3个基因片段组成，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn、Gc以及核蛋白。汉坦病毒的基因型别较多，截止目前已发现40多种。汉坦病毒引起人类肾综合征出血热和人类肺综合征出血热。

随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。传染病在国际间的广泛传播与流行，已成为各国政府密切关注的政治问题。《国际卫生条例》、《中华人民共和国卫生检疫法》都对传染病风险预警与快速决策做出了相应的规定。我国尤其是在边境口岸应对一些未知病原的袭击或传入，基本不具备发现和控制的能力。这种缺陷突出表现在缺乏先进的分型技术、分子溯源技术及快速检出技术，难于在短时间内建立正确的应对措施。这种状况下，在我国国境口岸病原体宿主之间的交流机会加速了汉坦病毒基因组的微进化，一旦这种进化朝着有利的方向发展，很可能使缺乏普遍相应免疫力的人群感染并迅速传播，从而引起汉坦病毒的广泛流行。鉴于汉坦病毒流行态势的复杂性、汉坦病毒的基因多态性、病毒寄生宿主的多样性，使得建立一种通用检测鉴别技术成为必要。

目前，针对外来疫病的实验室快速检测技术主要采用的是免疫学检测及核酸检测技术，尤其是以PCR技术为代表的核酸检测技术，能够非常灵敏的检测到各种疫病病原体。近年来，随着实时荧光PCR技术的广范应用，使得病原体的检测得到飞速的发展。目前，尚无汉坦病毒的通用性检测方法，基本上都是以每一种汉坦基因型别为基础单一的扩增对应的型别。本发明拟采用实时荧光PCR技术，利用一对引物及一条探针检测不同基因型别的汉坦病毒，使之成为应对国内汉坦病毒型别或外来汉坦病毒型别传入我国的有力武器，保障人民群众的生命安全和国家的卫生安全。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高的检测汉坦病毒的荧光定量PCR非诊断性方法。

为实现上述目的，本发明一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法，该非诊断性方法包括:

(1)选择汉坦病毒L基因全长序列，进行同源性比对，在其保守区设计引物；

(2)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并检测探针的特异性；

(3)对待检测物进行实时定量分析；

其中，针对汉坦病毒L基因全长序列设计引物和探针为：

进一步，所述引物和探针参数信息为：

。

进一步，所述探针HV Universal Probe L的5’端所标记荧光基团为FAM或CY3，探针3’端连接的淬灭基团为BHQ1或TAMARA。

进一步，所述非诊断性方法包括步骤：

1)提取待检测样本的RNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μL PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中;

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

扩增条件：

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应可使用的仪器为ABI实时PCR系统：7000、7300、7500或7900；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪MX4000、MX3000或MX3005。

本发明的有益效果在于：汉坦病毒实时PCR检测方法利用特异性荧光探针，实行完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会、减少了实验步骤、实验时间和对试剂的消耗，不同于常规PCR，无需电泳鉴定。目前尚无汉坦病毒的通用性检测方法，基本上都是以每一种汉坦基因型别为基础单一的扩增对应的型别。本发明实现了利用一对引物及一条探针检测不同基因型别的汉坦病毒，实时PCR具有非常高的灵敏度和特异度，对汉坦病毒基因非常灵敏、准确。在实际中，尤其是疫情爆发时有很高的应用价值。

附图说明

图1为型别一的汉坦病毒L基因全长的同源性区域示意图；

图2为型别二的汉坦病毒L基因全长的同源性区域示意图；

图3为型别三的汉坦病毒L基因全长的同源性区域示意图；

图4为汉坦病毒通用型实时荧光PCR灵敏度检测图；

图5为汉坦病毒通用型实时荧光PCR的标准曲线图；

图6为汉坦病毒通用型实时荧光PCR对汉坦病毒阴性的鼠进行非特异性测试图；

注：图4以汉滩型汉坦病毒为例；

图5以普马拉型汉坦病毒为例；其中，X轴表示相应的校正后报告荧光强度的对数，Y轴循环次数；

图6中鼠种包括黑线姬鼠、大林姬鼠、褐家鼠、棕背鼠平。

具体实施方式

在本发明上述方法中，适用于海关等需要检验检疫的地方，可用于检验粉末病毒、食品、物品等，所筛选的汉坦病毒可以是NCBI公布的所有汉坦病毒L基因全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。比对结果见图1、图2、图3。图中为L基因序列高保守区。

在本发明引物和探针设计中，首先在比对的序列保守区设计上下游引物，根据引物设计原理，在保守区之间设计上游和下游引物，其中在上游引物的第20位存在简并性，下游引物的第12、15及21位存在简并性，设计位于扩增区域内的特异的探针，其中在探针的第16位、第19及25位分别存在简并性。引物和探针在合成时探针5′端连接FAM荧光基团和3′端连接BHQ1非荧光基团。引物的特异性增强。引物和探针的序列为表1所示：

表2为利用Beacon Designer 7.5软件分析设计的引物和探针的参数。

本发明检测汉坦病毒方法包括以下步骤：

(1)核酸提取

病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906病毒RNA提取试剂盒。

(2)RT-PCR扩增

选用的扩增试剂盒为ABI公司AgPath-ID^TM One-step RT-PCR Kit。

反应体系组分及其体积见表3。

表3 反应体系

扩增条件：采用以下扩增条件。

例如

本发明所述的方法中，探针与荧光基团相连，所述荧光基团为FAM-BHQ，其它荧光基团也同样适用，比如，CY3-TAMARA、BHQ等。

所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

实施例1：引物灵敏度检测

选择几种代表性的汉坦病毒型别如汉滩型(HTNV)、汉城型(SEOV)、普马拉型(PUUV)、多布拉伐-贝尔格莱德型(DOBV)及辛诺柏型(SNV)的L全长基因中高保守区片段做为标准品，将其浓度从10^-3依次稀释到10^-10；

1)阴性对照：汉坦病毒阴性的鼠RNA；

2)NTC:无核酸酶水

3)反应体系按照表3进行配制。

4)PCR反应体系为：

检测结果以汉滩型(HTNV)汉坦病毒为例说明，如图4所示。

图4中1～8曲线分别为标准品用无核酸酶水浓度稀释度为10^-3～10^-8扩增的曲线。小结，从图中可以得出引物和探针检测阳性标准品的最低检出限为10^-8。

表4 引物灵敏度检测结果

表4中的数据示的数据为阳性标准品不同稀释度的CT值。其中CT值结果为“-”表示该引物对此浓度的样本无扩增反应。NTC为阴性对照。

实施例2：通用型汉坦病毒实时荧光PCR标准曲线的制作

1)选择普马拉型汉坦病毒做为标准品，将其浓度从依次稀释到10^-10，选择10^-3～10^-10作为模板；

2)阴性对照：汉坦病毒阴性鼠肺RNA；

3)PCR反应体系为

；

结果如图5所示，汉坦病毒通用型实时荧光PCR的标准曲线为：y=37.860-3.220x，R²=0.996。

实施例3:非特异性检测

1)选择多布拉伐-贝尔格莱德型汉坦病毒做为阳性对照；

2)阴性对照：无核酸酶水；

3)模板：选择汉坦病毒阴性的鼠进行非特异性测试，其中鼠种包括黑线姬鼠、大林姬鼠、褐家鼠、棕背鼠平等。

4)配制反应体系，同上。

结果如图6，所建立的汉坦病毒通用型实时荧光PCR方法对于汉坦病毒的宿主RNA没有特异性的扩增。

实施例4：引物检测未知样本

1)对采集的试验用小鼠鼠肺样本进行检测，考察引物探针的特异性问题。

2)对采集2009年-2011年304份鼠肺样本进行检测，考察方法的可靠性，同时选择普通的RT-PCR做对照。

3)阴性对照：汉坦病毒阴性鼠肺RNA；

4)配制反应体系，同上。

表6 未知样品检测结果

结果分析：

利用实验小鼠鼠肺100份，进行RNA提取，后者作为模板，加入到本发明中进行实时荧光RT-PCR反应，分两次进行，每次实验均设有阳性对照及阴性对照，结果显示100份实验小鼠鼠肺均没有扩增曲线，均无Ct值。对采集2009年-2011年304份鼠肺样本进行检测检测结果见表6。由表6可以看出利用本方法从鼠肺中检测出汉坦病毒20份，经测序鉴定均为汉坦病毒，而普通的RT-PCR对汉坦病毒的检测率比较低，容易造成汉坦病毒监测中的漏检情况。

上述病原菌RNA是从试剂盒中提取的，本发明公开的检测方法并非以人体和动物为对象，只是为了检测是否具有病原菌，如检测粉末、食品、海关进出口物品等，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。

除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法

<130> 发明

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> HV Universal Forward L

<400> 1

CTCTATCAGACTTACCAGGWTTAGG 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> HV Universal Reverse L

<400> 2

AGGTCCAGAGCYTTRACACAY 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Chikungunya virus primer PROBE

<400> 3

TGACGATTTAGCAGCYGCHCAAAGH 25

Claims

1.一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法，该非诊断性方法包括：

(3)对待检测物进行实时定量分析；

其中，针对汉坦病毒L基因全长序列设计引物和探针为：

2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述汉坦病毒L基因探针的5’端所标记荧光基团为FAM或CY3，探针3’端连接的淬灭基团为BHQ1或TAMARA。

3.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR的反应体系组分及其体积如下：

扩增条件：