CN103436637B - 用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法 - Google Patents
用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法，该方法主要是根据GenBank数据库中S基因的保守区序列，设计一对特异性引物，以10倍梯度稀释的阳性质粒为标准品，优化反应条件，通过qRT-PCR特异性扩增，建立检测感染Vero E6细胞、感染小鼠与临床患者汉滩病毒核酸的SYBR Green ⅠReal-time PCR方法，检测灵敏度达到101个拷贝数，并对其敏感性、重复性和特异性进行检验。与常规汉滩病毒检测与鉴定方法相比，该法具有检测标本种类丰富，使用范围大，对比性强，操作步骤少，方便快捷，灵敏度高，重复性高和特异性好，且具有良好的线性关系等优点。为肾综合征出血热的临床、实验室检测以及流行病学研究提供了有力的实验基础。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，涉及分子生物学、病毒学、免疫学及免疫应用等相关领域。本发明具体涉及一种用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法。检测与鉴定汉滩病毒核酸的样本包括感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者。它包括设计一对特异性扩增汉滩病毒的引物，通过制备标准品，研究和优化实验条件，对提取感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者血清的总RNA进行qRT-PCR特异性扩增检测。
背景技术
肾综合征出血热诊断与检测研究现状：
汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种分节段的负链RNA病毒, 基因组由大（L）、中（M）、小（S）三个基因片段组成，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、糖蛋白Gn和Gc和核衣壳蛋白。目前汉坦病毒属在世界范围内存在30个基因型，我国以汉滩（HTNV）和汉城（SEOV）型为主。汉坦病毒属病毒感染人主要可以引起肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS），在我国主要引起以发热、出血和急性肾功能损害为特征的肾综合征出血热。该病是我国最为常见的自然疫源性疾病之一，危害十分严重。此外，汉滩病毒还是一种可被侵略者和恐怖分子所利用的生物战剂，已被列入国际《禁止生物武器公约》议定书核查清单，因此具有极其重要的意义。目前对该病毒所致疾病仍无特效的治疗药物，因此及时发现和诊断汉滩病毒感染显得尤为重要。早期诊断是控制病情，提高治愈率，避免临床误诊贻误治疗时机的关键。
实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长，仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最终对初始模板进行定量。传统的PCR定量是一种终点法的检测，动态范围受限且检测重现性极差。实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测，具有灵敏度高，重复性好，动态范围宽，高通量等优点。实时荧光定量PCR技术主要分为荧光染料法和荧光探针法两种。
SYBR green I是一种能与dsDNA特异结合的染料，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green I荧光染料，可特异性地与dsDNA结合，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本，因此非常适合大规模样本的检测。
Taqman探针法是通过寡聚核苷酸探针与目的序列互补实现的。探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记荧光淬灭基团，当两个基团相互靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5′端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭基团发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。因为只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测，同时可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列，因此探针法具有特异性高，可多通道检测的特点，但价格昂贵，不适合做大规模样本的检测。
对于汉滩病毒感染，目前常用的诊断方法主要是传统的免疫学方法，包括病毒的分离鉴定、ELISA法检测血清中抗HTNV IgM、IgG抗体、间接免疫荧光法（IFA法）检测病毒抗原和抗体以及核酸分子杂交检测病毒基因组等。但经典的分离鉴定法费时，IFA法也不适用于快速的现场检测，检测HTNV抗体仅是一个侧面的间接指标，且均存在着特异性和敏感性不够高、不能准确定量等问题。实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR）以其特异性强、灵敏度高、检测速度快、能准确定量等优点，逐渐成为分子生物学和医学研究等领域的重要工具，在病原的定性定量检测、基因表达水平分析等方面得到了广泛应用。
发明内容
本发明的目的旨在建立一种能快速、准确、高效的用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法。该方法具有快速、灵敏、特异、准确定量和重复性好等优点，对检测微量、临床患者早期标本中汉滩病毒核酸的效果良好，可用于感染小鼠的实验室检测和患者早期标本的诊断检测，为肾综合征出血热提供一个快速诊断工具。
本发明目的是通过以下方式实现的：用于汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法，其特征是：根据汉滩病毒76-118株S基因保守区序列，设计一对汉滩病毒核酸的实时荧光定量PCR引物，扩增汉滩病毒核酸，准确定量样本中的病毒载量拷贝数。
所述的一对汉滩病毒核酸的实时荧光定量PCR引物序列如下：
No1：上游引物HTNV-F-13：GAG CCT GGA GAC CAT CTG
No2：下游引物HTNV-R-13：CGG GAC GAC AAA GGA TGT 。
所述的准确定量样本中的病毒载量拷贝数，即汉滩病毒定量检测标准品是：用含汉滩病毒标准株76-118 全长S基因片段的pMD18-T 载体，构建阳性标准品质粒；提取质粒紫外分光光度计测定浓度，根据公式：6.02 ×1023 拷贝数/摩尔(copies /moL）×浓度（g/μl）/平均分子量（MW g/moL）= copies/μl 计算其拷贝数。
所述的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法用于对感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者三种不同样本中的汉滩病毒核酸进行定量检测。
本发明与现有技术相比，有以下优点：
1、本发明通过实时收集反应体系中的荧光信号强度来检测 PCR 所扩增出的汉滩病毒核酸，可以定量分析样本中RNA的拷贝数，准确检测出样本中的基因数目，比传统血清学方法更精确，更灵敏。
2、 本发明中所确立的汉滩病毒核酸的SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法，可对感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者三种不同样本中的汉滩病毒核酸进行检测，使用范围大，对比性强。
3、 本发明中所确立的汉滩病毒核酸的SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法，选用专门针对微量RNA的提取试剂盒和逆转录酶，对于保存条件差，病毒RNA含量低的样本均有良好的检测效果，大幅提高阳性率，可用于临床、实验室检测以及流行病学研究。
4、本发明中的引物是根据汉坦病毒不同型别保守区的基因序列进行设计，检测特异性强，重复性好。
5、本发明从核酸角度对感染Vero E6细胞、感染实验小鼠和临床患者中的汉滩病毒进行检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要5~7小时，其中本发明中实时定量荧光PCR方法，操作更为简便快速，只需要1.5h的时间。并且，本发明对操作实验室环境要求不高，所用试剂比较常规，可实现样本的批量检测，进一步节省了时间和成本，因此本发明是一种快速、简单、经济的方法。
附图说明
图1. pMD18T-S PCR鉴定；
图2. HTNV 标准品的SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增曲线；其中：扩增曲线的拷贝数从左至右分别为106、105、104、103、102、101；纵坐标为荧光值;横坐标为循环数；
图3. HTNV 标准品的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线；纵坐标为阈值循环数；横坐标为拷贝数；
图4. HTNV 标准品的SYBR GreenⅠReal-time PCR熔解曲线；纵坐标为荧光值；横坐标为熔解温度；
图5. HTNV SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增产物的鉴定；
图6. HTNV感染4份Vero E6细胞样本HTNV的SYBR GreenⅠReal-time PCR特异性扩增曲线；纵坐标为荧光值;横坐标为循环数；
图7. HTNV感染实验小鼠1-9天HTNV的SYBR GreenⅠReal-time PCR特异性扩增曲线；纵坐标为荧光值;横坐标为循环数；
图8. 13例患者血清中HTNV的SYBR GreenⅠReal-time PCR特异性扩增曲线；纵坐标为荧光值;横坐标为循环数；
图9. HTNV SYBR GreenⅠReal-time PCR的特异性鉴定；纵坐标为荧光值;横坐标为循环数。
具体实施方式
1. 设计并合成一对汉滩病毒核酸的实时荧光定量PCR引物，由北京奥科鼎
盛生物科技有限公司（地址：北京市海淀区永丰产业基地丰贤中路7号B206邮编：10094）合成。
根据HTNV 76-118株（GenBank中登录号为M14626.1 ) 的S基因序列，利用Oligo6.0 软件及NCBI Blast分析设计了一对汉滩病毒核酸的实时荧光定量PCR引物(见表1)；分别命名为：上游引物HTNV-F-13；下游引物HTNV-R-13，扩增片段长度为144 bp。
表1. 汉滩病毒设计引物
通过上述引物扩增汉滩病毒核酸，准确定量样本中的病毒拷贝数。提取HTNV 76-118感染Vero E6细胞的总RNA，并反转录为cDNA。以上述cDNA为模板制备pMD18T-S阳性标准品。建立并优化荧光定量PCR反应条件，通过对76-118感染Vero E6细胞、感染实验小鼠血清和临床患者血清的cDNA进行SYBR GreenⅠReal-time PCR特异性扩增，得到阳性检测结果。同时还进行敏感性、重复性和特异性鉴定。
病毒RNA提取和cDNA的合成
2.1 Vero E6细胞按常规培养成单层后，接种HTNV 76-118，吸附2h后换成2%胎牛血清的维持液，CO2培养箱内37℃培养12d，参照TRIZOL试剂（Invitrogen公司）使用说明书提取细胞中的总RNA；HTNV 76-118接种1~2天的昆明鼠乳鼠鼠脑，从第1天接种病毒开始到第9天乳鼠发病死亡为止，均取血， QIAamp viral RNA mini kit（QIAGEN公司）提取总RNA；使用QIAamp viral RNA mini kit（QIAGEN公司）从临床患者血清中提取RNA。提取的总RNA 溶于60 μl DEPC处理的ddH2O。用微量分光光度计检测RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值OD260和OD280，通过计算OD260/OD280，确定RNA纯度，结果显示所有RNA标本1.9≤OD260/OD280≤2.1，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染；同时读取并记录各个RNA标本浓度。
反转录在20 μl体系中进行，首先取10 μl RNA，加入下游引物1 μl , dNTPs 2 μl，置65 ℃水浴5 min；取出后冰浴2 min，再依次加入5 ×First-Strand Buffer 4 μl，DTT 2 μl，37℃水浴2 min，加入M-MLV 1 μl，70 ℃水浴50 min，最后置70℃ 15 min终止反应，置-20 ℃备用。
阳性标准品的制备
以上述cDNA为模板，以S-F：5‘-ATGGCAACTATGGAGGAA-3’为上游引物，S-R：5‘-TTAGAGTTTCAAAGGCTCT-3’为下游引物进行PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的DNA片段，将目的片段与pMD18-T 载体16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，构建阳性标准品质粒。提取质粒紫外分光光度计测定浓度，根据公式：﹝6.02 ×1023 拷贝数/摩尔(copies /moL）×浓度（g/μl）/平均分子量（MW g/moL）= copies/μl﹞计算其拷贝数，置-20℃备用。结果显示用S-F和S-R经PCR扩增得到大小约1300 bp的目的片段，与预期大小一致。将此特异性片段与pMD18T连接，经PCR鉴定及测序证实HTNV-S质粒构建成功（图1），提取质粒DNA经紫外分光光度计测定结果：OD260/OD280=1.79，质粒浓度为243 ng/μl，根据公式换算成拷贝数为3.53×1010copies/μl，对该质粒进行10倍梯度稀释，选择3.53×106~3.53×101copies/μl。
荧光定量PCR方法的建立
4.1荧光定量PCR反应条件的建立：10倍梯度稀释质粒pMD18T-S标准品进行Real-time PCR扩增，反应体系为25 μl：SYBR Premix ExTaqTM（2 ×）12.5μl、HTNV-F ( 10 μmol/L ) 和HTNV-R ( 10 μmol/L ) 各0.5μl、模板2 μl、用ddH2O补足。反应条件：95℃预变性10 s；变性：95℃ 5 s ；退火/延伸：60 ℃ 20 s；每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，共40个循环。在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪（Mx 3000P）自动绘制线性标准曲线。反应结束后先加热至95℃，然后降至72℃，开始以0.2℃/s 递增加热至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。每次实验均设立1个空白对照即不加模板，当空白对照为阴性时，实验有效。CT值≤30为阳性，CT值＞30为阴性。结果显示将质粒标准品按最佳反应条件进行SYBR GreenⅠReal-time PCR反应，得到检测HTNV的扩增曲线（图2），以起始模板数的对数值为横坐标，以循环阈值（Ct）为纵坐标，可以得到一条严格的直线型标准曲线（图3），相关系数r=0.998，扩增效率E =0.99，斜率为-2.75。表明Ct和起始模板数之间存在着严格的线性关系，保证了准确度。熔解曲线分析表明（图4），扩增的目的片段只产生特异性单峰，没有引物二聚体和非特异性扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小约为144 bp（图5）。
汉滩病毒实时定量PCR检测方法的细胞水平研究：Vero E6细胞按常规培养成单层后，接种HTNV 76-118，吸附2h后换成2%胎牛血清的维持液，CO2培养箱内37℃培养12天，参照TRIZOL试剂（Invitrogen公司）使用说明书提取细胞中的总RNA,反转录为cDNA进行Real-time PCR检测。结果显示，如图6所示4个样本均有特异性扩增曲线，且Ct值相近，说明病毒增殖的量基本一致。根据标准曲线，可以推测出每份样本中的起始病毒拷贝数。
汉滩病毒实时定量PCR检测方法的实验小鼠研究：76-118株感染乳鼠鼠脑后，从第1天至第9天分别取小鼠血清提取总RNA，反转录为cDNA进行Real-time PCR检测。结果显示，如图7所示除第1天扩增曲线Ct值超过30可认为是阴性外,2~9天均有特异性扩增曲线，Ct值在20~30之间。说明病毒感染小鼠从第二天开始即有病毒增殖，且病毒量随时间逐渐增加，直到小鼠发病为止，病毒量达到稳定。
汉滩病毒实时定量PCR检测方法的临床应用 从第四军医大学第二附属医院传染科收集肾综合征出血热早期患者血清13份，提取病毒RNA进行Real-time PCR检测。结果显示，如图8所示健康人血清无扩增曲线，13份患者血清样品均为阳性，Ct值在20~30之间，与临床诊断结果一致，根据标准曲线，可以推测出每位病人血清中的病毒拷贝数。
荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性试验
5.1 敏感性试验: 将质粒标准品经10倍梯度稀释浓度从106 copies/μl 到101 copies/μl , 按上述体系进行Real-time PCR 反应, 确定检测的浓度最低限。经过检测，确定该方法检出的最低限为3.53×101 copies/μl。
特异性试验：对HTNV、SEOV分别取等量样品提取病毒RNA，然后用随机引物反转录，采用所建立的HTNV Real-time PCR方法进行检测。用该Real-time PCR方法检测我国的另一种流行株SEOV，检测结果为阴性（图9），表明引物特异性好。
重复性试验：为了评估Real-time PCR检测方法的组内和组间试验的重复性、稳定性，应用10倍梯度稀释的标准品进行Real-time PCR检测。依据检测结果计算Ct 平均值和变异系数（CV）通过CV 评价试验的稳定性。
批间重复性试验：取3个10倍梯度稀释的标准品，在同一反应条件下进行3次独立的Real-time PCR检测。
批内重复性试验：取3个10倍梯度稀释的标准品，并且每个梯度做3个重复，同时进行Real-time PCR检测。
结果显示用该法对3.53×103、3.53×104、3.53×105 copies/μl的标准品分别进行批内重复试验和批间重复试验，将实验结果进行统计分析，批内变异系数（CV）分别为0.42%、0.34%、0.20，批间变异系数（CV）分别为0.78%、1.09%、0.98%（表2），批内和批间变异系数均小于2%，表明该方法具有很好的稳定性。
序列表：
序列号No1：上游引物HTNV-F-13
GAG CCT GGA GAC CAT CTG
序列号No2： 下游引物HTNV-R-13
CGG GAC GAC AAA GGA TGT。
Claims (1)
1.用于非诊断目的汉滩病毒感染后快速检测与鉴定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法，其特征是：根据汉滩病毒76-118株S基因保守区序列，设计一对汉滩病毒核酸的实时荧光定量PCR引物，扩增汉滩病毒核酸，准确定量样本中的病毒载量拷贝数；所述的一对汉滩病毒核酸的实时荧光定量PCR引物序列如下：
序列号No1：上游引物HTNV-F-13：GAG CCT GGA GAC CAT CTG
序列号No2：下游引物HTNV-R-13：CGG GAC GAC AAA GGA TGT 。
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