CN105018605A - 一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物免疫行业技术领域，具体涉及一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法。包括以下几个步骤：实时荧光定量PCR引物的合成；病毒RNA的提取；病毒RNA纯度的确定；病毒RNA反转录成cDNA；阳性标准品的制备；荧光定量PCR反应条件的建立。本发明能够定量分析样本中RNA的拷贝数，准确检测出样本中的基因数目，可对感染Vero？E6细胞和感染实验小鼠两种不同样本中的汉城病毒核酸进行检测，使用范围大，对比性强，操作简便快速，且本发明对操作实验室环境要求不高，可实现样本的批量检测，节省了大量的时间和成本，检测特异性强，重复性好，结果真实可靠。
Description
技术领域
本发明涉及微生物免疫行业技术领域，具体涉及一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法。
背景技术
汉城病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，可引起肾综合征出血热，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒,基因组由大(L)、中(M)、小(S)三个基因片段组成，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、糖蛋白和核衣壳蛋白。目前汉坦病毒属在世界范围内存在30个基因型，我国以汉滩(HTNV)和汉城(SEOV)型为主。
汉坦病毒属病毒感染人主要可以引起肾综合征出血热(Hemorrhagicfever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus pulmonarysyndrome，HPS)，在我国主要引起以发热、出血和急性肾功能损害为特征的肾综合征出血热。该病是我国最为常见的自然疫源性疾病之一，危害十分严重。目前对该病毒所致疾病仍无特效的治疗药物，因此及时发现和诊断汉城病毒感染显得尤为重要，初期诊断是控制病情，提高治愈率，避免临床误诊贻误治疗时机的关键，另外通过流行病学观察和统计，建立监测体系并采取相应预防措施，可对汉城病毒发病高峰期的提前预防提供有力支撑。
对于汉城病毒感染，目前常用的诊断方法主要是传统的免疫学方法，包括病毒的分离鉴定、ELISA法检测血清中抗SEOV IgM、IgG抗体、间接免疫荧光法(IFA法)检测病毒抗原和抗体以及核酸分子杂交检测病毒基因组等。但经典的分离鉴定法费时，IFA法也不适用于快速的现场检测，检测SEOV抗体仅是一个侧面的间接指标，且均存在着特异性和敏感性不够高、不能准确定量等问题。实时荧光定量PCR(Real-time fluorescentquantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)以其特异性强、灵敏度高、检测速度快、能准确定量等优点，逐渐成为分子生物学和医学研究等领域的重要工具，在病原的定性定量检测、基因表达水平分析等方面得到了广泛应用。
SYBR green I是一种能与dsDNA特异结合的染料，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green I荧光染料，可特异性地与dsDNA结合，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本，因此非常适合大规模样本的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法，包括以下几个步骤：
1)实时荧光定量PCR引物的合成：由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，根据SEOV SR-11株的S基因序列，利用Oligo6.0软件及NCBI Blast分析设计了一对汉城病毒核酸的实时荧光定量PCR引物(见表1)；分别命名为：上游引物SEOV-S-F-14；下游引物SEOV-S-R-14，扩增片段长度为153bp。
表1
2)病毒RNA的提取及其纯度的确定
Vero E6细胞按常规培养成单层后，接种SEOV SR-11，吸附2h后换成2％胎牛血清的维持液，CO2培养箱内37℃培养12d，参照TRIZOL试剂(Invitrogen公司)使用说明书提取细胞中的总RNA；SEOV SR-11接种1～2天的昆明鼠乳鼠鼠脑，第1天接种病毒后到第25天，每3天取血一次，QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN公司)提取病毒RNA，提取的病毒RNA溶于60μl经DEPC技术处理的ddH2O，用微量分光光度计检测RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值OD260和OD280，通过计算OD260/OD280，确定RNA纯度，本发明中实验的结果显示所有RNA标本1.9≤OD260/OD280≤2.1，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染，同时读取并记录RNA标本浓度(见图1)。
3)病毒RNA反转录成cDNA
反转录在20μl体系中进行，首先取10μl RNA，加入下游引物1μl,dNTPs2μl，置65℃水浴5min，取出后冰浴2min，再依次加入5×First-StrandBuffer 4μl，DTT 2μl，37℃水浴2min，加入M-MLV 1μl，70℃水浴50min，最后置70℃15min终止反应，置-20℃备用。
4)阳性标准品的制备
以上述cDNA为模板，以S-F：5‘-ATGGCAACTATGGAGGAA-3’为上游引物，S-R：5‘-TTAGAGTTTCAAAGGCTCT-3’为下游引物进行PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的DNA片段，将目的片段与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，构建阳性标准品质粒，提取质粒紫外分光光度计测定浓度，根据公式：﹝6.02×1023拷贝数/摩尔(copies/moL)×浓度(g/μl)/平均分子量(MW g/moL)＝copies/μl﹞计算其拷贝数，置-20℃备用，本发明中的实验结果显示用S-F和S-R经PCR扩增得到大小约1300bp的目的片段，与预期大小一致，将此特异性片段与pMD18T连接，经PCR鉴定及测序证实SEOV-S质粒构建成功(见图2)，提取质粒DNA经紫外分光光度计测定结果：OD260/OD280＝1.9，质粒浓度为185ng/μl，根据公式换算成拷贝数为1.3×1011copies/μl，对该质粒进行10倍梯度稀释，选择1.3×105～1.3×100copies/μl。
5)荧光定量PCR方法的建立
10倍梯度稀释质粒pMD18T-S标准品进行Real-time PCR扩增，反应体系为25μl，其中SYBRPremix ExTaqTM(2×)12.5μl、SEOV-S-F(10μmol/L)和SEOV-S-R(10μmol/L)各0.5μl、模板2μl、用ddH2O补足，反应条件为：95℃预变性10s；变性：95℃5s；退火/延伸：60℃20s；每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，共40个循环，在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪(Mx 3000P)自动绘制线性标准曲线，反应结束后先加热至95℃，然后降至72℃，开始以0.2℃/s递增加热至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线，每次实验均设立1个空白对照即不加模板，当空白对照为阴性时，实验有效，其中CT值≤30为阳性，CT值＞30为阴性，本发明中的实验结果显示将质粒标准品按最佳反应条件进行SYBR GreenⅠReal-timePCR反应，得到检测SEOV的扩增曲线(见图3)，以起始模板数的对数值为横坐标，以循环阈值(Ct)为纵坐标，可以得到一条严格的直线型标准曲线(见图4)，相关系数r＝0.993，扩增效率E＝104.8％，斜率为-3.212，表明Ct和起始模板数之间存在着严格的线性关系，保证了准确度，对熔解曲线(图5所示)分析表明，扩增的目的片段只产生特异性单峰，没有引物二聚体和非特异性扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小约为153bp(图6所示)。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：其中，本发明通过实时收集反应体系中的荧光信号强度来检测PCR所扩增出的汉城病毒核酸，可以定量分析样本中RNA的拷贝数，准确检测出样本中的基因数目，比传统血清学方法更精确，更灵敏本；
其中，发明中所确立的汉城病毒核酸的SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法，可对感染Vero E6细胞和感染实验小鼠两种不同样本中的汉城病毒核酸进行检测，使用范围大，对比性强；
其中，本发明中所确立的汉城病毒核酸的SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法，选用专门针对微量RNA的提取试剂盒和逆转录酶，对于保存条件差，病毒RNA含量低的样本均有良好的检测效果，大幅提高阳性率，可用于临床、实验室检测以及流行病学研究；
其中，本发明中的引物是根据汉坦病毒不同型别保守区的基因序列进行设计，检测特异性强，重复性好，结果真实可靠；
其中，本发明从核酸角度对感染Vero E6细胞和感染实验小鼠中的汉城病毒进行检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要5～7小时，本发明中实时定量荧光PCR方法，操作更为简便快速，只需要1.5h的时间，并且，本发明对操作实验室环境要求不高，所用试剂比较常规，可实现样本的批量检测，进一步节省了时间和成本，因此本发明是一种快速、简单、经济的方法。
附图说明
图1为本发明中SEOV感染E6细胞提取RNA标本的结构图；
图2为本发明中Pmd18T-S PCR的鉴定图；
图3为本发明中SEOV标准品的SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增曲线图(其中：扩增曲线的拷贝数从左至右分别为105、104、103、102、101、100，纵坐标为荧光值，横坐标为循环数)；
图4为本发明中SEOV标准品的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线图(纵坐标为阈值循环数；横坐标为拷贝数)；
图5为本发明中SEOV标准品的SYBR GreenⅠReal-time PCR熔解曲线图(纵坐标为荧光值，横坐标为熔解温度)；
图6为本发明中SEOV SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增产物的鉴定图；
图7为本发明中SEOV感染12份Vero E6细胞样本SEOV的SYBR GreenⅠReal-time PCR特异性扩增曲线和阴性对照图(纵坐标为荧光值，横坐标为循环数)；
图8为本发明中SEOV感染实验小鼠每3天的SYBR GreenⅠReal-timePCR特异性扩增曲线图(纵坐标为荧光值；横坐标为循环数)；
图9为本发明中SEOV SYBR GreenⅠReal-time PCR的特异性鉴定图(纵坐标为荧光值，横坐标为循环数)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1汉城病毒实时定量PCR检测方法的细胞水平研究
Vero E6细胞按常规培养成单层后，接种SEOV SR-11，吸附2h后换成2％胎牛血清的维持液，CO2培养箱内37℃培养25天，参照TRIZOL试剂(Invitrogen公司)使用说明书提取细胞中的病毒RNA，反转录为cDNA进行Real-time PCR检测，结果如图7显示，与阴性对照相比，12个样本都有特异性扩增曲线，均可检测到SEOV的病毒载量，根据标准曲线，可以推测出每份样本中的起始病毒拷贝数。
实施例2汉城病毒实时定量PCR检测方法的实验小鼠研究
SR-11株感染乳鼠鼠脑，从第1天至第25天每3天取小鼠血清提取病毒RNA，反转录为cDNA进行Real-time PCR检测，结果显示，如图8所示除第1天无扩增曲线，可认为是阴性外，其他样本特异性扩增曲线Ct值在15～36之间，均可检测到SEOV病毒载量，同时可看出病毒感染小鼠从第4天开始即有病毒增殖，且病毒量随时间逐渐增加，第16天到达峰值后，病毒量开始下降，到第25天病毒量达到最小值。
实施例3荧光定量PCR方法的敏感性试验
将质粒标准品经10倍梯度稀释浓度从105copies/μl到100copies/μl,按上述体系进行Real-time PCR反应,确定检测的浓度最低限，经过检测，确定该方法检出的最低限为1.3×100copies/μl。
实施例4荧光定量PCR方法的特异性试验
对汉城病毒(SEOV)、汉滩病毒(HTNV)取等量样品提取病毒RNA，然后用随机引物反转录，采用所建立的SEOV Real-time PCR方法进行检测，用该Real-time PCR方法检测我国的另一种流行株HTNV，检测结果为阴性，如图9所示，表明引物特异性好。
实施例5荧光定量PCR方法的重复性试验
为了评估Real-time PCR检测方法的组内和组间试验的重复性、稳定性，应用10倍梯度稀释的标准品进行Real-time PCR检测，依据检测结果计算Ct平均值和变异系数(CV)通过CV评价试验的稳定性。
实施例6批间重复性试验和批内重复性试验
批间重复性试验：取3个10倍梯度稀释的标准品，在同一反应条件下进行3次独立的Real-time PCR检测。
批内重复性试验：取3个10倍梯度稀释的标准品，并且每个梯度做3个重复，同时进行Real-time PCR检测。
结果显示用该法对1.3×101、1.3×102、1.3×103copies/μl的标准品分别进行批内重复试验和批间重复试验，将实验结果进行统计分析，批内变异系数(CV)分别为0.43％、0.36％、0.22，批间变异系数(CV)分别为0.66％、0.59％、0.48％(见表2)，批内和批间变异系数均小于2％，表明该方法具有很好的稳定性。
表2.批内和批间重复性试验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法，其特征在于包括以下几个步骤：
1)实时荧光定量PCR引物的合成：根据SEOV SR-11株的S基因序列，利用Olig06.0软件及NCBI Blast方法分析设计出上下游引物，分别命名为上游引物SEOV-S-F-14和下游引物SEOV-S-R-14，扩增片段长度为153bp；
2)病毒RNA的提取：按常规方法培养Vero E6细胞成单层后，接种SEOVSR-11，吸附2h后换成2％胎牛血清的维持液，并在CO2培养箱内37℃条件下培养12d，提取细胞中的总RNA备用；接种SEOV SR-11的昆明鼠乳鼠鼠脑，在接种病毒后的第1天至25天内，每3天取血清一次，并提取血清中的病毒RNA备用；
3)病毒RNA纯度的确定：提取的病毒RNA溶于60μl经DEPC技术处理的ddH2O，用微量分光光度计检测RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值OD260和OD280,通过计算OD260/OD280的比值，确定病毒RNA的纯度；
4)病毒RNA反转录成cDNA：取10μl提取好的RNA，加入下游引物1μl，dNTPs 2μl，置65℃水浴5min，取出后冰裕2min，再依次加入5×First-StrandBuffer 4μl，DTT 2μl，37℃水浴2min，加入M-MLV 1μl，70℃水浴50min，最后置70℃条件下15min终止反应，存贮在-20℃条件下备用；
5)阳性标准品的制备：以上述步骤4)中的cDNA为模板，以S-F：5‘-ATGGCAACTATGGAGGAA-3’为上游引物，S-R：5‘-TTAGAGTTTCAAAGGCTCT-3’为下游引物进行PCR反应，回收目的DNA片段，将目的片段与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，构建阳性标准品质粒，提取质粒并用紫外分光光度计测定浓度，并计算其拷贝数，贮存在-20℃条件下备用；
6)荧光定量PCR反应条件的建立：10倍梯度稀释质粒pMD18T-S标准品进行Real-time PCR扩增，反应条件为：95℃预变性10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸20s，每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，共40个循环，在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线，反应结束后先加热至95℃，然后降至72℃，开始以0.2℃/s递增加热至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线，每次实验均设立1个空白对照，当空白对照为阴性时，实验有效，其中CT值＞30为阴性，CT值不超过30为阳性。
2.根据权利要求1所述的一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法，其特征在于：所述步骤2)中Vero E6细胞内总RNA提取方法依据TRIZOL试剂使用说明书中所提供的方法，所述小鼠血清中的病毒RNA由QIAamp viralRNA mini kit公司提取。
3.根据权利要求1所述的一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法，其特征在于：所述步骤5)中质粒拷贝数的计算公式为：6.02×1023拷贝数/摩尔(copies/moL)×浓度/平均分子量＝copies/μl，其中浓度的单位为：g/μl，平均分子量的单位为：MW g/moL。
4.根据权利要求1所述的一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法，其特征在于：所述步骤6)中的质控标准为：阴性对照，CT值＞30，且无扩增曲线，表明没有感染汉城病毒；阳性对照，CT值小于等于30，且出现扩增曲线，表明已感染汉城病毒。
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