CN104152581A - 汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法 - Google Patents

汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，上游引物序列为：5’-CAGCAGAAATCCCTCTTGTCC-3’；下游引物序列为：5’-TGGGTTTGTGAGATGCCTTTTA-3’；探针序列为：5′-fam+ACAGATAATGCTCATGGCGTTGGGA+tamara-3′；取200ul离心管，利用移液器依次加入PremixExTapTM(2×)10.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，荧光探针溶液0.8μl，模板DNA2.0μl，灭菌蒸馏水6.4μl，总体积共计20.0μl，放入离心机瞬时离心，将离心管放入荧光定量PCR仪进行检测。本发明方法检测精度高，所需时间短。

Description

汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，涉及汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法。
背景技术
汉坦病毒(hantavirus，HV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是肾综合征出血(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantaviruspulmonarysyndrome，HPS)的病原体。此病的传染源是带病毒的宿主动物，主要为啮齿类动物，每种基因型的HV有其主要的宿主动物，其中黑线姬鼠和褐家鼠分别携带汉坦型HV和汉城型HV，是主要宿主和传染源。汉坦病毒是肾综合征出血和汉坦病毒肺综合征的病原体。随着分子生物学技术发展，对HV本质和特征研究证实HV至少包括6个血清型：汉坦病毒、汉城病毒、普马拉病毒、希望山病毒、泰国病毒和索托帕拉亚病毒等。全世界每年汉坦病毒病的发病人数为6万～10万，中国是受HV危害较为严重的国家。汉坦病毒肺综合征主要引起急性发热，进行性呼吸衰竭，病死率高达40％-60％。HV流行广泛，危害严重，已成为一个全球性的公共问题。因此，建立一种快速、特异、灵敏、定量检测汉坦病毒的方法很有必要，对汉坦病毒感染的预防控制有着非常重要的意义。
HFRS的实验室诊断一直是比较活跃的研究领域，人们一直希望从组织和标本中直接检测出病原体.用动物和细胞培养分离病毒是最为可靠的，但由于HV的分离培养对标本要求高，分离周期长(每传一代标本需观察20d～30d)，在胞内增殖不出现典型的细胞病变，需要用免疫荧光试验检测病毒的毒力和要求较高的生物安全防护等，而常常不适于大规模的流行病学调查。特别是有些试验感染HV病毒的动物，其免疫荧光的结果往往是阴性的，而将此试验动物的内脏组织制备成悬液，却可使其它的健康动物遭受感染。
目前血清学检测方法仍然是汉坦病毒的主要检测手段，用IIF检测IgM和IgG最常用。但是以往的血清学诊断方法，如间接免疫荧光试验、斑点免疫结合试验、带状免疫斑点试验等敏感性和特异性不够高，给临床诊断带来一定限制，常造成漏诊和误诊，使患者得不到及时有效的治疗。因此有必要建立一种高灵敏的、高特异的检测技术。
荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR，FQPCR)技术是近几年发展起来的新技术，既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其避免了传统PCR方法以终产物检测定量产生的偏差，提高了实验的可复性。因此实验应用TaqMan探针建立了汉城型汉坦病毒的荧光定量PCR检测方法。
现有技术一：血清学诊断是汉坦病毒感染的主要诊断方法，用IIF检测IgM和IgG最常用，酶免疫测定(ElA)检测IgM，利用核蛋白进行的IgG检测，适用于疾病的早期诊断和大量血清流行病学调查；免疫印迹敏感而特异，是一种快速的抗体检测方法，可用于区分不同汉坦病毒引起的感染。检测技术存在的问题：1，检测方法复杂，步骤繁琐，2，检测结果可能产生假阳性和难以进行定量检测。3，检测过程时间长，反应速度慢。
现有技术二：应用RT-PCR方法检测病毒，PCR法其灵敏性高，特异性好以及快速简便的优点被广泛采用。RT-PCR技术存在的问题是：1基因的高效扩增，可能产生假阳性结果和难以进行定量检测。2电泳过程中的染色剂EB(溴化乙锭)为强烈致癌物质，若操作不当，会严重危害操作者的身体健康。3定量方法都是针对PCR终产物来进行的，而PCR的平台效应在一定程度上干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。
发明内容
本发明的目的在于提供汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，解决了现有的汉坦病毒感染检测方法复杂，反应速度慢，检测精度低的问题。
本发明建立一种汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，以鼠肺组织中克隆的汉城型汉坦病毒M基因片段为基础，设计特异的荧光定量PCR引物和探针，以pGM-T重组的M基因为标准品，按10倍从107-101稀释，制作汉城型汉坦病毒的荧光定量标准曲线，建立汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量方法，该方法能够对组织样本中的汉城型汉坦病毒进行定性和定量分析，该方法检测精度高(能达到10个拷贝)，所需时间短(1.5小时内完成)。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：荧光定量PCR引物和探针设计；
根据已克隆和测序的汉城型汉坦病毒M基因序列设计荧光定量PCR引物和探针，序列如下：
上游引物序列为：
5’-CAGCAGAAATCCCTCTTGTCC-3’；
下游引物序列为：
5’-TGGGTTTGTGAGATGCCTTTTA-3’；
探针序列为：
5′-fam+ACAGATAATGCTCATGGCGTTGGGA+tamara-3′；
步骤2：取200ul离心管，利用移液器依次加入PremixExTapTM(2×)10.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，荧光探针溶液0.8μl，模板DNA2.0μl，灭菌蒸馏水6.4μl，总体积共计20.0μl，放入离心机瞬时离心，将离心管放入荧光定量PCR仪进行检测。
进一步，上游引物、下游引物、荧光探针溶液使用浓度均为10μM。
进一步，荧光定量PCR仪为lightcycle480II。
进一步，荧光定量PCR仪检测条件为：荧光定量PCR仪进行循环参数设置为：预变性95℃30秒，1个循环，95℃5秒，60℃20秒，50个循环，在60℃检测荧光阈值。
附图说明
图1是荧光信号生成标准曲线；
图2是扩增曲线；
图3是检测样本的扩增曲线；
图4是检测样本和阳性对照扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，包括以下步骤：
荧光定量PCR引物和探针设计；
根据已克隆和测序的汉城型汉坦病毒M基因序列设计荧光定量PCR引物和探针，序列如下：
上游引物序列为：
5’-CAGCAGAAATCCCTCTTGTCC-3’；
下游引物序列为：
5’-TGGGTTTGTGAGATGCCTTTTA-3’；
探针序列为：
5′-fam+ACAGATAATGCTCATGGCGTTGGGA+tamara-3′；
使用浓度均为10μM。
荧光定量标准曲线的建立；
以克隆的汉城型汉坦病毒M基因重组质粒pGM-T-M为模板DNA，从107-101进行10倍稀释，在荧光定量PCR仪(lightcycle480II)上进行荧光定量检测，最优反应条件如下：
1、取200ul离心管，利用移液器依次加入PremixExTapTM(2×)10.0μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10μM)0.4μl，荧光探针溶液(10μM)0.8μl，模板DNA2.0μl，灭菌蒸馏水6.4μl，总体积共计20.0μl，放入离心机瞬时离心，将离心管放入lightcycle480II荧光定量PCR仪进行检测。
2、本实验采用两步法PCR，在荧光定量PCR仪进行循环参数设定，参数如下：预变性95℃、30秒，1个循环，95℃、5秒，60℃、20秒，50个循环，在60℃检测荧光阈值。整个检测过程在1.5小时内完成。
本发明的优点，能够对组织样本中的汉城型汉坦病毒进行定性和定量分析，该方法检测精度高，能达到10个拷贝，所需时间短，在1.5小时内完成。
根据反应后检测的荧光信号生成标准曲线(见图1)，扩增曲线(见图2)。根据拷贝数取对数建立标准曲线方程为：Y＝-0.281X+12.14，直线斜率0.281，扩增效率为91％。
对建立方法进行样品检测实验：
1.采集鼠肺脏进行总RNA提取：参照Invitrogen公司TRIzol说明书，对所有样本提取总RNA，提取的总RNA经ND-1000全分光光度计检测，A260/280介于1.7-2.0之间。
2.逆转录反应：采用SuperScripTMII或AMV逆转录酶对样品总RNA进行逆转录，反应体系和条件如下：5×primerscriptbuffer2.0μL；PrimerscriptRTenzymemix0.5μL；逆转录引物(10uM)0.5μL；提取总RNA(500ng/μL)1.0μL；无RNA酶去离子水6.0，总体积10μL，反应条件为42℃水浴1h，85℃灭活逆转录酶。
3.样品检测：以反转录产物为模板，取2μL进行荧光定量检测，反应条件同标准曲线制作，取200ul离心管，利用移液器依次加入PremixExTapTM(2×)10.0μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10μM)0.4μl，荧光探针溶液(10μM)0.8μl，模板DNA为反转录产物，2.0μl，灭菌蒸馏水6.4μl，总体积共计20.0μl，放入离心机瞬时离心，将离心管放入lightcycle480II荧光定量PCR仪进行检测。采用两步法PCR，在荧光定量PCR仪进行循环参数设定，参数如下：预变性95℃30秒，1个循环，95℃5秒，60℃20秒，50个循环，在60℃检测荧光阈值。对巢式RT-PCR检测阳性样本A1-A7，A8为质粒阳性对照，利用荧光定量PCR进一步验证，不同鼠肺脏检测样品结果如下：
实例1：根据标准曲线方程将CP检测值换算为实际样品拷贝数，按照Y＝-0.281X+12.14计算拷贝数对数值，然后换算为拷贝数，检测样本的扩增曲线如图3所示，结果见表1。
计算实例：A1∶Y＝-0.281×18.32+12.14＝6.99换算为拷贝数＝106.99＝9.8×106。
表1.检测样本CP值
实例2：对未知样品A1-A5，A6，A7为阳性对照，应用建立的荧光定量PCR方法进行检测，在5个检测样本中检出一个阳性样本。根据建立的标准曲线进行计算，检测样本和阳性对照扩增曲线如图4所示，结果见表2。
表2.未知样品的随机检测结果
由以上实验结果可以看出，本发明方法能够对组织样本中的汉城型汉坦病毒进行定性和定量分析，特异性强，检测精度高，能达到10个拷贝；所需时间短，在1.5小时内完成；重复性好，证明实验结果稳定可靠，适合于实际应用。
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：荧光定量PCR引物和探针设计；
根据已克隆和测序的汉城型汉坦病毒M基因序列设计荧光定量PCR引物和探针，序列如下：
上游引物序列为：
5’-CAGCAGAAATCCCTCTTGTCC-3’；
下游引物序列为：
5’-TGGGTTTGTGAGATGCCTTTTA-3’；
探针序列为：
5′-fam+ACAGATAATGCTCATGGCGTTGGGA+tamara-3′；
步骤2：取200ul离心管，利用移液器依次加入PremixExTapTM(2×)10.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，荧光探针溶液0.8μl，模板DNA2.0μl，灭菌蒸馏水6.4μl，总体积共计20.0μl，放入离心机瞬时离心，将离心管放入荧光定量PCR仪进行检测。
2.按照权利要求1所述汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，其特征在于：所述步骤2中上游引物、下游引物、荧光探针溶液使用浓度均为10μM。
3.按照权利要求1所述汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，其特征在于：所述步骤2中荧光定量PCR仪为lightcycle480II。
4.按照权利要求1所述汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，其特征在于：所述步骤2中荧光定量PCR仪检测条件为：荧光定量PCR仪进行循环参数设置为：预变性95℃30秒，1个循环，95℃5秒，60℃20秒，50个循环，在60℃检测荧光阈值。
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