CN115807125A - 一种用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，具体公开了一种用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒。所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其包含特异性探针A以及引物1和引物2；所述的特异性探针A的序列为：5’‑CCACAGAAGCAGCATTCCAAGC‑3’；所述的引物1的序列为：5’‑CCCAATCTCAATGTCCTTAC‑3’；所述的引物2的序列为：5’‑CTGTGAGTAACTTGGCATAC‑3’；所述的特异性探针A的5’端连接有荧光发生基团，3’端连接有荧光淬灭基团。采用本发明所述的试剂盒用于检测流行性出血热特异性高，确保了检测的准确度，避免了假阳性以及假阴性的发生；此外，还具有灵敏度高以及检出限低的优点，对低感染时的样本具有较高的检测率。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测流行性出血热的荧光
检测试剂盒。
背景技术
目前对流行性出血热的临床诊断方法主要有常规检查、超声检查、分离鉴定以及血清学检测等。临床主要根据患者的症状、体征及血、尿常规来进行诊断，但此类检测方法针对的是已发病或症状典型的患者，但对病毒处于潜伏期的患者，诊断就比较困难，常因误诊耽误最佳治疗时期，导致病情严重甚至死亡，因此早期诊断尤为重要。同时，现阶段检测手段比较多的是血清学检测，但此检测需要特殊设备，并对操作技能有一定的要求，一次检测周期从采样到孵育、洗板、显
色需要较长的时间，时间成本较高。
实时荧光PCR在病毒性传染病早期诊断中应用广泛，可以实现病毒在潜伏期的诊断；但目前采用实时荧光PCR检测流行性出血热的过程中存在特异性不强，准确度不高以及灵敏度低等一系列问题。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种用于检
测流行性出血热的荧光检测试剂盒。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，包含特异
性探针A以及引物1和引物2；
所述的特异性探针A的序列为：5’-CCACAGAAGCAGCATTCCAAGC-3’（SEQ ID NO：1）；
所述的引物1的序列为：5’-CCCAATCTCAATGTCCTTAC-3’（SEQ ID NO：2）；
所述的引物2的序列为：5’-CTGTGAGTAACTTGGCATAC-3’（SEQ ID NO：3）；
所述的特异性探针A的5’端连接有荧光发生基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
发明人通过设计上述全新的特异性探针A，可以成功的实现对检测流行性出血热的检测。
优选地，所述的荧光发生基团为Texas Red。
优选地，所述的荧光淬灭基团为BHQ2。
优选地，所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，还包含特异性探针B以及引物3和引物4；
所述的特异性探针B的序列为：5’-TCTTATCCTGTTGAGCATCCTGTGT-3’（SEQ ID NO：4）；
所述的引物3的序列为：5’-GGTTGTCCTAATTGTCTTG-3’（SEQ ID NO：5）；
所述的引物4的序列为：5’-ACTCGATACATGCTATGAA-3’（SEQ ID NO：6）；
所述的特异性探针B的5’端连接有荧光发生基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
发明人在研究中进一步发现，在试剂盒中进一步加入特异性探针B，同时以特异性探针A和特异性探针B进行检测，可以进一步大幅提高检测的特异性，确保检测的准确度，避免了假阳性的发生。
此外，本发明同时以特异性探针A和特异性探针B进行检测，还具有灵敏度高以及检出限低的优点，对低感染时可疑样本具有较高的检测率。
优选地，所述的荧光发生基团为Alexa Flour 680。
优选地，所述的荧光淬灭基团为BHQ3。
优选地，所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，还包含缓冲液以及水。
优选地，所述的缓冲液为QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液；所述的水为ddH2O。
优选地，所述的荧光检测试剂盒中包含0.6~1.2μL特异性探针A、0.7~1.2μL引物1、0.7~1.2μL引物2、0.6~1.2μL特异性探针B、0.7~1.2μL引物3、0.7~1.2μL引物4、8~12μL缓冲液以及17~22μL水。
最优选地的，所述的荧光检测试剂盒中包含0.64μL特异性探针A、0.72μL引物1、0.72μL引物2、0.64μL特异性探针B、0.72μL引物3、0.72μL引物4、10μL缓冲液以及20.84μL水。
优选地，所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒中，特异性探针A、引物1、引物2、特异性探针B、引物3以及引物4的浓度为10~30μM。
最优选地，特异性探针A、引物1、引物2、特异性探针B、引物3以及引物4的浓度为25μM。
有益效果：本发明提供了一种全新组成的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒；所述的试剂盒中通过采用全新的特异性探针A，可以检测出流行性出血热病毒的相关核酸片段，因此，采用该试剂盒对病毒处于潜伏期的患者即可实现诊断。尤其是，本发明试剂盒中进一步加入特异性探针B，同时以特异性探针A和特异性探针B进行检测，可以进一步大幅提高检测的特异性，确保检测的准确度，避免了假阳性的发生。此外，本发明同时以特异性探针A和特异性探针B进行检测，还具有灵敏度高以及检出限低的优点，对低感染时的样本具有较高的检测率。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1 用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒
所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒包含如下组分：
0.64μL特异性探针A（5’端连接有荧光发生基团Texas Red，3’端连接有荧光淬灭基团BHQ2）；
0.72μL引物1；
0.72μL引物2；
0.64μL特异性探针B（5’端连接有荧光发生基团Alexa Flour 680，3’端连接有荧光淬灭基团BHQ3）；
0.72μL引物3；
0.72μL引物4；
10μL缓冲液（QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液）；
20.84μL水ddH2O；
其中，特异性探针A、引物1、引物2、特异性探针B、引物3以及引物4的浓度为25μM。
实施例2流行性出血热的PCR检测方法
采集来自国内不同地区的30份流行性出血热患者的血清临床样本，以及30份正常人的血清临床样本，采用本发明所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒进行PCR检测。
（1）分别将30份流行性出血热患者的血清临床样本以及30份正常人的血清临床样本，采用RNA抽提试剂盒进行RNA提取，将待检测临床病毒样本进行RT-PCR反应，将提取的DNA进行纯化，得待测样本；
（2）将待测样本稀释成按照拷贝数梯度稀释为：105、104、103、102copies/μL；
（3）分别取2.5μL各浓度的待测样本加入到实施例1所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒中，形成PCR反应液；
（4）将反应液充分混匀，将样品加入数字PCR的反应板中，过程中应避免有气泡产生，加样后，贴上封膜，将数字PCR板按标识放入数字PCR仪中；反应程序：95℃ 2min；95℃30s；58℃ 1min；40个cycles；
（5）采用数字PCR仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数，按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数。
结果显示，30份流行性出血热患者的血清临床样本均显示出阳性信号，其中阳性信号中最低可检测限为100copies/μL；30份正常人的血清临床样本无荧光信号，检测拷贝数为0。
由此可见，本发明试剂盒中同时以特异性探针A和特异性探针B对流行性出血热进行检测，具有十分高的检测的特异性，确保检测的准确度，避免了假阳性以及假阴性的发生；本发明试剂盒中同时以特异性探针A和特异性探针B对流行性出血热进行检测，还具有灵敏度高以及检出限低的优点，可以实现对低感染时的样本的检出。
Claims (10)
1.一种用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，包含特异
性探针A以及引物1和引物2；
所述的特异性探针A的序列为：5’-CCACAGAAGCAGCATTCCAAGC-3’；
所述的引物1的序列为：5’-CCCAATCTCAATGTCCTTAC-3’；
所述的引物2的序列为：5’-CTGTGAGTAACTTGGCATAC-3’；
所述的特异性探针A的5’端连接有荧光发生基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光发生基团为Texas Red。
3.根据权利要求1所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光淬灭基团为BHQ2。
4.根据权利要求1所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，还包含特异性探针B以及引物3和引物4；
所述的特异性探针B的序列为：5’-TCTTATCCTGTTGAGCATCCTGTGT-3’；
所述的引物3的序列为：5’-GGTTGTCCTAATTGTCTTG-3’；
所述的引物4的序列为：5’-ACTCGATACATGCTATGAA-3’；
所述的特异性探针B的5’端连接有荧光发生基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光发生基团为Alexa Flour 680。
6.根据权利要求4所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光淬灭基团为BHQ3。
7.根据权利要求1或4所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，还包含缓冲液以及水。
8.根据权利要求7所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液；所述的水为ddH2O。
9.根据权利要求7所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光检测试剂盒中包含0.6~1.2μL特异性探针A、0.7~1.2μL引物1、0.7~1.2μL引物2、0.6~1.2μL特异性探针B、0.7~1.2μL引物3、0.7~1.2μL引物4、8~12μL缓冲液以及17~22μL水；
最优选地的，所述的荧光检测试剂盒中包含0.64μL特异性探针A、0.72μL引物1、0.72μL引物2、0.64μL特异性探针B、0.72μL引物3、0.72μL引物4、10μL缓冲液以及20.84μL水。
10.根据权利要求9所述的用于检测流行性出血热的荧光检测试剂盒，其特征在于，
特异性探针A、引物1、引物2、特异性探针B、引物3以及引物4的浓度为10~30μM；
最优选地，特异性探针A、引物1、引物2、特异性探针B、引物3以及引物4的浓度为25μM。
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