CN111500778A - 逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法。本发明将RT‑LAMP‑NBS用于2019‑nCoV的检测，针对2019‑nCoV的ORF1ab和N基因设计两套LAMP扩增引物，并于环引物的5'末端标记半抗原或生物素，实现ORF1ab和N两个靶基因的同时检测。本发明针对2019‑nCoV建立的检测体系具有特异性强、灵敏度高且操作简单快速的优势。

Description

逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠 状病毒的方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法。

背景技术

目前，2019-nCoV感染者没有特定治疗方法，早期诊断是阻止疫情播散的关键。因此，迫切需要研发特异性的检测方法，为早期2019冠状病毒病的诊断提供快速、可靠的检测方法。

分离培养是2019-nCoV实验室确诊的“金标准”，但该方法对实验室以及实验人员要求高，不易培养。2019冠状病毒病早期缺乏特异性临床表现，因此根据临床表现确诊十分困难。尽管基于基因组测序的诊断准确度高，但耗时长，设备要求高，不适于临床大样本筛查。目前，以PCR为基础的诊断技术(如RT-PCR 技术，rRT-PCR技术)是2019-nCoV检测的主流方法，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，熟练的操作人员，对于一些落后的实验室无法提供2019-nCoV 检测服务。此外，此类方法检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。上述缺点限制了这些技术的广泛运用，因此，迫切需要研发易于使用，简单快速的2019-nCoV检测技术。

恒温扩增技术相对PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的是环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)，LAMP针对靶序列的 8个特异部位设计4条核心引物和2条环引物，利用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶在恒定的温度条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增，具有特异性强，灵敏度高、操作简单等优势。目前，其它关于2019-nCoV的LAMP检测技术研究，只针对2019-nCoV的一个靶基因(ORF1ab)。当检测到与2019-nCoV 高度同源序列的样本时(比如蝙蝠严重急性呼吸综合征样冠状病毒，GenBankKY417152.1)易产生不可信的结果。LAMP扩增之后，传统的结果判定技术是 2SYBR Green荧光和琼脂糖凝胶电泳进行结果判读，这些方法只能检测LAMP 反应是否进行，不能识别针对某一靶序列的特异性扩增，导致LAMP技术只能检测单一目的序列，限制了LAMP技术的应用，且较繁琐，具有主观性。

为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。本发明将逆转录LAMP检测技术与纳米生物检测技术相结合(COVID-19RT-LAMP-NBS)用于2019-nCoV的检测，针对2019-nCoV的特异ORF1ab和N基因设计两套LAMP 扩增引物，实现ORF1ab和N两个靶基因的同时检测，旨在验证、评价 RT-LAMP-NBS技术及建立针对2019-nCoV的快速、敏感和特异的RT-LAMP-NBS检测体系。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供多逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种非诊断目的的逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检样本核酸，进行逆转录环介导等温扩增；逆转录环介导等温扩增的反应体系包括：

DNA聚合酶缓冲液，Bst链置换DNA聚合酶，AMV逆转录酶，dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3，环引物F1ab-LF*和F1ab-LB*，内引物F1ab-FIP和 F1ab-BIP，外引物np-F3和np-B3，环引物np-LF*和np-LB*，内引物np-FIP 和np-BIP；优选整个反应恒温在63℃40分钟。

F1ab-LF*的5'末端标记半抗原；F1ab-LB*的5'末端标记生物素；np-LF*的 5'末端标记半抗原；np-LB*的5'末端标记生物素；

(2)采用金纳米生物传感器对步骤(1)的扩增产物进行检测。

优选的，逆转录环介导等温扩增的反应体系包括：

12.5μL的2×DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst链置换DNA聚合酶，5U的 AMV逆转录酶，1.4mM的dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3各0.25μM，环引物F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB和F1ab-LB*各0.25μM，内引物F1ab-FIP 和F1ab-BIP各1.0μM，外引物np-F3和np-B3各0.15μM，环引物np-LF、 np-LF*、np-LB和np-LB*各0.15μM，内引物np-FIP和np-BIP各0.6μM，1～5μL模板，补加去离子水至25μL。其中，引物F1ab-F3、F1ab-B3、F1ab-FIP、F1ab-BIP、F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB、F1ab-LB*、np-F3、np-B3、np-FIP、np-BIP、np-LF、 np-LF*、np-LB、np-LB*的序列依序如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16所示。

优选的，F1ab-LF*的5'末端标记的半抗原为荧光素；np-LF*的5'末端标记的半抗原为地高辛。

优选的，所述金纳米生物传感器包括背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述纤维膜上依次设置检测线1、检测线2及质控线，在金标垫、检测线1、检测线2及质控线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体、绵羊抗地高辛配基抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

本发明提供了一组用于逆转录环介导等温扩增2019新型冠状病毒ORF1ab 和N基因的引物序列，所述序列包括：外引物F1ab-F3和F1ab-B3，环引物 F1ab-LF和F1ab-LB，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP，外引物np-F3和np-B3，环引物np-LF和np-LB，内引物np-FIP和np-BIP；

引物F1ab-F3、F1ab-B3、F1ab-FIP、F1ab-BIP、F1ab-LF、F1ab-LB、np-F3、 np-B3、np-FIP、np-BIP、np-LF、np-LB的序列依序如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15。

本发明还具体提供一种用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒至少包括：

逆转录环介导等温扩增反应试剂和金纳米生物传感器；

所述逆转录环介导等温扩增反应试剂包含：

DNA聚合酶缓冲液，Bst链置换DNA聚合酶，AMV逆转录酶，dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3，环引物F1ab-LF*和F1ab-LB*，内引物F1ab-FIP和 F1ab-BIP，外引物np-F3和np-B3，环引物np-LF*和np-LB*，内引物np-FIP 和np-BIP；F1ab-LF*的5'末端标记荧光素；np-LF*的5'末端标记地高辛；F1ab-LB* 的5'末端标记生物素；np-LB*的5'末端标记生物素；

所述金纳米生物传感器包括背板，样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述纤维膜上依次设置检测线1、检测线2及质控线，在金标垫、检测线1、检测线2及质控线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体、绵羊抗地高辛配基抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

优选的，该试剂盒还包含环引物F1ab-LF、F1ab-LB、np-LF和np-LB；引物 F1ab-F3、F1ab-B3、F1ab-FIP、F1ab-BIP、F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB、F1ab-LB*、 np-F3、np-B3、np-FIP、np-BIP、np-LF、np-LF*、np-LB、np-LB*的序列依序如 SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16所示。

优选的，本发明提供该试剂盒的逆转录环介导等温扩增反应试剂中，用于逆转录环介导等温扩增反应的用量为：

12.5μL的2×DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst链置换DNA聚合酶，5U的 AMV逆转录酶，1.4mM的dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3各0.25μM，环引物F1ab-LF,F1ab-LF*,F1ab-LB和F1ab-LB*各0.25μM，内引物F1ab-FIP和 F1ab-BIP各1.0μM，外引物np-F3和np-B3各0.15μM，环引物np-LF、np-LF*、 np-LB和np-LB*各0.15μM，内引物np-FIP和np-BIP各0.6μM，1～5μL模板，补加去离子水至25μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将RT-LAMP-NBS用于2019-nCoV的检测，针对2019-nCoV的 ORF1ab和N基因设计两套LAMP扩增引物，实现ORF1ab和N两个靶基因的同时检测。本发明针对2019-nCoV建立的检测体系具有特异性强、灵敏度高且操作简单快速的优势。

附图说明

图1.COVID-19RT-LAMP-NBS引物设计的位置和方向示意图；上排为 SARS-CoV-2基因结构(GenBank：MN908947，Wuhan-Hu-1)。所有基因的长度未按比例显示。下排为F1ab和np基因核苷酸序列和位置，用于设计COVID-19 RT-LAMP引物。显示部分F1ab(左)和N(右)的核苷酸序列，引物序列位置见下划线，向右和向左箭头分别为互补序列。F1ab(开放阅读框1a/b)、S(刺突糖蛋白)、E(包膜蛋白)、M(膜蛋白)、N(核蛋白)、辅助蛋白(3、6、 7a，7b和9b)。

图2.COVID-19RT-LAMP-NBS检测原理；A，准备扩增体系；B，RT-LAMP 扩增；C，COVID-19RT-LAMP产物。

图3.生物传检测器(NBS)用于COVID-19RT-LAMP产物检测原理；(A)，NBS设计的细节；(B)，NBS用于COVID-19RT-LAMP扩增产物检测原理； (C)，COVID-19RT-LAMP结果解释。I，F1ab和np检测阳性(TL1，TL2 和CL出现在检测区域)；II，np检测阳性(TL2和CL出现在检测区域)；III， F1ab检测阳性(TL1和CL出现在检测区域)；IV，F1ab和np检测阴性(仅 CL出现在检测区域)。

图4.COVID-19RT-LAMP-NBS引物验证及检测结果图；F1ab-(A，第一行，左)，np-(B，第一行，中间)和COVID-19(C，第一行，右)RT-LAMP管的颜色变化；NBS用于显示检测结果，F1ab-(A，底行，左)，np-(B，底行，中间)和COVID-19(C，下排，右)RT-LAMP扩增产物。管A1(NBS A1)， F1ab-RT-LAMP阳性对照(F1ab-质粒1.2×10²拷贝)；管A2(NBS A2)， F1ab-RT-LAMP阴性扩增(H1N1)；管A3(NBS A3)，F1ab-RT-LAMP阴性扩增(CVA16)；管A4(BS A4)，空白对照(DW)。管B1(NBS B1)，np-RT-LAMP 阳性对照(np-质粒1.2×10²拷贝)；管B2(NBS B2)，N-RT-LAMP阴性扩增 (H1N1)；B3管(NBSB3)，np-RT-LAMP阴性扩增(CVA16)；管B4(NBS B4)，空白对照(DW)。管C1(NBS C1)，COVID-19RT-LAMP阳性对照(F1ab 质粒和np-质粒各1.2×10²拷贝)；管C2(NBS C2)，COVID-19RT-LAMP阴性扩增(H1N1)；C3管(NBS C3)，COVID-19RT-LAMP阴性扩增(CVA16)；管C4(NBS C4)，空白对照(DW)。H1N1，H1N1流感病毒；CVA16，柯萨奇病毒A16；DW，蒸馏水。

图5.RT-LAMP-NBS最佳反应温度测试结果图；A，通过实时测量浊度 (LA320c)检测F1ab基因扩增的F1ab-RT-LAMP反应。阈值为0.1，浊度>0.1 可认为检测阳性的。在不同温度下产生了八个动力学图(1-8)(60-67℃，间隔 1℃)，模板为1.2×10³拷贝(F1ab-质粒)，在61℃至64℃显示更快的扩增。B，模板为1.2×10³拷贝(N-质粒)，在62℃到65℃显示更快的扩增。

图6.COVID-19RT-LAMP-NBS检测2019-nCoV的灵敏度结果图；A，NBS 用于结果报告；B，实时浊度仪用于结果报告；C，VDR应用于结果报告。NBS (A)/曲线(B)/管(C)1-8代表每个反应的不同质粒浓度(F1ab质粒和np质粒)，分别为1.2×10⁴，1.2×10³，1.2×10²，1.2×10¹，1.2×10⁰，1.2×10^-1，1.2×10^-2拷贝，空白对照(DW)。质粒浓度为1.2×10⁴至1.2×10¹拷贝时，出现阳性反应。

图7.COVID-19RT-LAMP-NBS技术的最佳反应时间测试结果图；测试了四个反应时间(A，10分钟；B，20分钟；C，30分钟；D，40分钟)，并在63℃下比较。COVID-19RT-LAMP反应使用LoD水平模板(F1ab-质粒和N-质粒各 1.2×10¹拷贝)，当RT-LAMP恒温扩增30分钟(生物传感器3)时，可检测出。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1.本发明中所涉及的试剂

背板，样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。抗荧光素抗体 (anti-FITC)，绵羊抗地高辛配基抗体(Anti-Dig)，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-DNPs)，生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)，脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒和特异性核酸扩增指示剂购于北京海泰正元生物科技有限公司。临床样本病毒RNA的提取使用广州中山达安公司的RNA提取试剂盒(Nucleic Acid Isolation or Purification Reagent；DA0590)。其他细菌的基因组DNA的提取使用 Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden, Germany)。AMV逆转录酶(AMV Reverse Transcriptase,B500999)购于上海生工生物公司，其余试剂均为市售分型纯产品。本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。

2.本发明涉及的质粒构建及菌株信息

针对2019-nCoV的ORF1ab和N基因序列构建F1ab-质粒和np-质粒作为标准模板，并连续稀释为1.2×10⁴、1.2×10³、1.2×10²、1.2×10¹、1.2×10⁰、1.2×10^-1、 1.2×10^-2拷贝，分装-20℃保存备用。运用连续稀释好的F1ab-质粒和np-质粒模板用于RT-LAMP-NBS扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的细菌病毒病原体为模板评价COVID-19RT-LAMP-NBS技术的特异性。菌株信息见表 1。

表1.用于本研究病原体信息表

注：U，未鉴定菌株；P，阳性；N，阴性。

实施例1.引物设计

ORF1ab和N基因存在于2019-nCoV中，其保守性和特异性良好，可以将 2019-nCoV与其他密切相近的病原体区分开。本发明针对2019-nCoV的ORF1ab 和N特异基因设计两套LAMP扩增引物，旨在验证COVID-19RT-LAMP-NBS 技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。利用引物设计软件Primer Explorer V5(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0 设计LAMP引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的LAMP扩增引物。为了使得扩增产物可应用于NBS检测，本发明还在引物中进行了半抗原标记和生物素标记。引物设计的位置和方向见图1，序列及修饰见表2。

表2.引物序列及修饰信息

F1ab，开放阅读框1a/b，N，核蛋白基因；F1ab-LF*，5'末端荧光素(FITC)标记，F1ab-LB*， 5'末端生物素标记；np-LF*，5'末端地高辛配基(Dig)标记，np-LB*，5'末端生物素标记。

实施例2.RT-LAMP扩增

提取待检样本核酸，采用以下反应体系进行RT-LAMP扩增。

常规RT-LAMP(F1ab-和np-RT-LAMP)反应体系：12.5μL的2×DNA 聚合酶缓冲液，8U的Bst链置换DNA聚合酶，5U的AMV逆转录酶，1.4 mM的dNTP，外引物F3和B3各0.4μM，环引物LF、LF*、LB和LB*各0.4μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，模板(1μL的质粒)，补加去离子水至25μL。整个反应恒温在63℃40分钟。

COVID-19-RT-LAMP反应体系：12.5μL的2×DNA聚合酶缓冲液，8U 的Bst链置换DNA聚合酶，5U的AMV逆转录酶，1.4mM的dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3各0.25μM，环引物F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB 和F1ab-LB*各0.25μM，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP各1.0μM，外引物np-F3和np-B3各0.15μM，环引物np-LF、np-LF*、np-LB和np-LB*各 0.15μM，内引物np-FIP和np-BIP各0.6μM，模板(1μL的质粒或5μL的样本核酸)，补加去离子水至25μL。整个反应恒温在63℃40分钟。

实施例3.RT-LAMP-NBS检测

COVID-19RT-LAMP-NBS检测原理：

COVID-19RT-LAMP-NBS检测原理中，如图2所示，将荧光素(FITC)用于F1ab引物组，地高辛配基(Dig)用于np引物组。因此，在引物F1ab-LF*和 F1ab-LB*5'末端用荧光素(FITC)和生物素标记，在引物np-LF*和np-LB*5'末端用地高辛配基(Dig)和生物素标记(图2中A)。通过AMV逆转录酶作用，将2019-nCoV的RNA模板逆转录转化为cDNA模板，用于后续LAMP扩增(图 2中B)。63℃下恒温扩增40分钟后，F1ab-LAMP扩增产物可同时标记荧光素(FITC)和生物素，np-LAMP扩增产物可同时标记地高辛配基(Dig)和生物素 (图2中C)。

生物传检测器(NBS)的设计：

生物检测器(NBS)的设计中，一共包含五个部分，背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫。首先将样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-DNPs(129nm,金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-FITC(抗荧光素抗体)，Anti-Dig(绵羊抗地高辛配基抗体)及B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫，检测线1(TestLine1，TL1)，检测线2(Test Line2， TL2)及质控线(Control Line，CL)，待干燥后备用。

NBS的检测原理：将COVID-19RT-LAMP产物直接滴加到NBS的样品垫区，然后将120uL的检测缓冲液加到样品垫区域，LAMP扩增产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当LAMP产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-DNPs(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线1区域。双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-DNPs(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即地高辛标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线2区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-DNPs (金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对LAMP产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-DNPs(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与CL(质控线) 区域的B-BSA(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，进行直接显色反应，判断NBS 的功能是否正常。

NBS结果的判读(图3中C)：仅仅CL区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物(图3中C，IV)；CL及检测线区域1出现红色条带，表示针对ORF1ab靶标的检测为阳性结果(图3中C，III)；CL及检测线区域2出现红色条带，表示针对N靶标的检测为阳性结果(图3中C，II)；CL及检测线区域1，2同时出现红色条带，表示针对ORF1ab和N靶标的检测为阳性结果(图3中C，I)；当NBS不出现红线条带时，表示NBS失效；仅当测试线出现红色条带时，CL无红色条带,代表结果不可行，需要重新检测。

实施例4.验证RT-LAMP-NBS引物的可行性

RT-LAMP扩增之后，采用两种检测方法用于RT-LAMP扩增判别，首先，是特异性核酸扩增指示剂(Visual detection reagent,购于北京海泰正元科技有限公司)，用于核酸扩增分析。扩增反应后，阳性反应管呈绿色，阴性反应管从绿色变为无色。其次，更为直接简单的方法为通过NBS对产物进行检测。

可视颜色变化法：特异性核酸扩增指示剂在各种扩增体系中呈现绿色，随着扩增反应进行，温度升高，特异性核酸扩增指示剂降解为A基团和B基团，则扩增体系呈无色；当扩增体系中存在双链核酸时，A基团能够和双链核酸结合，呈绿色。因此，可以通过反应管颜色变化判读结果。阳性反应管保持绿色不变，阴性反应从绿色变为无色，见图4第一行。A1表示阳性扩增(反应管中加入 1.2×10²拷贝F1ab-质粒模板，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的甲型H1N1流感病毒模板，作用阴性对照)，A3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的柯萨奇病毒A16模板，作用阴性对照)，A4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照应)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对ORF1ab基因设计的检测RT-LAMP引物可用。

B1表示阳性扩增(反应管中加入1.2×10²拷贝np-质粒模板，作为阳性对照)， B2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的甲型H1N1流感病毒模板，作用阴性对照)，B3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的柯萨奇病毒A16模板，作用阴性对照)，B4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照应)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对N基因设计的检测 2019-nCoV的RT-LAMP引物可用。

C1表示阳性扩增(反应管中加入F1ab-质粒和np-质粒模板各1.2×10²拷贝，作为阳性对照)，C2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的甲型H1N1流感病毒模板，作用阴性对照)，C3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的柯萨奇病毒A16模板，作用阴性对照)，C4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10 pg的模板，作为空白对照应)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对ORF1ab 和N基因设计的检测2019-nCoV的RT-LAMP引物可用。

NBS检测：见图4第二行。A1由于针对2019-nCoV的ORF1ab基因检测的 RT-LAMP引物标记的半抗原为FITC(荧光素)，因此，当TL1和CL出现红色条带时表示针对ORF1ab基因设计的检测2019-nCoV阳性。B1由于针对2019-nCoV 的N基因检测的RT-LAMP引物标记的半抗原为Dig(地高辛)，因此，当TL2和 CL出现红色条带时表示针对N基因设计的检测2019-nCoV阳性。因此，C1当 TL1、TL2和CL出现红色条带时表示针对ORF1ab和N基因设计的检测 2019-nCoV阳性。通过NBS检测法判读RT-LAMP扩增结果，阳性反应出现了预期的结果(出现TL1、TL2和CL)，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的NBS，COVID-19RT-LAMP-NBS技术及COVID-19 RT-LAMP-NBS引物可行，能够用于目的靶序列的检测(C1)。

实施例5测定RT-LAMP-NBS技术的最佳反应温度

在标准反应体系条件下，加入针对F1ab-质粒模板及所设计的对应的 RT-LAMP引物，其模板浓度为1.2×10³拷贝。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图5 中A。61-64℃(图5中A，2-5)被推荐作为针对ORF1ab基因的RT-LAMP引物的最佳反应温度。

在标准反应体系条件下，加入针对np-质粒模板及所设计的对应的RT-LAMP 引物，其模板浓度为1.2×10³拷贝。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图5中B。 62-65℃(图5中B，3-6)被推荐作为针对N基因的RT-LAMP引物的最佳反应温度。

本发明中的后续验证选择63℃作为恒温条件进行RT-LAMP扩增。图5表示针对ORF1ab和N基因序列设计的检测2019-nCoV的RT-LAMP引物温度动态曲线图。

实施例6.COVID-19RT-LAMP-NBS检测2019-nCoV的灵敏度

运用连续稀释好的F1ab-质粒和np-质粒模板进行标准的COVID-19 RT-LAMP扩增反应后，运用NBS检测显示：COVID-19RT-LAMP-NBS的检测范围为1.2×10¹～1.2×10⁴拷贝，NBS在TL1、TL2和CL区域出现红色线(图6 中A，1-4)。当反应体系中基因组模板量降低至1.2×10¹拷贝以下时，NBS仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图6中A，5-7)。图6中A代表运用 NBS可视化读取COVID-19RT-LAMP扩增结果；1到7表示F1ab-质粒和np-质粒模板量为1.2×10⁴、1.2×10³、1.2×10²、1.2×10¹、1.2×10⁰、1.2×10^-1、1.2×10^-2拷贝，8表示空白对照(1微升双蒸水)。

为了进一步验证COVID-19RT-LAMP检测2019-nCoV的敏感性，另外2种检测方法用于COVID-19RT-LAMP扩增结果判别，进一步确认COVID-19 RT-LAMP的检测灵敏度。首先，实时浊度仪用于分析COVID-19RT-LAMP扩增 (图6中B)。运用连续稀释好的F1ab-质粒和np-质粒模板进行标准的COVID-19 RT-LAMP扩增反应后，运用实时浊度仪进行结果判定，检测显示：COVID-19 RT-LAMP的检测范围为1.2×10¹～1.2×10⁴拷贝，阳性扩增浊度曲线被观察到(图 6中1-4)。当反应体系中基因组模板量降低至1.2×10¹拷贝以下时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(5-7)。图6中B代表运用实时浊度仪可视化读取COVID-19RT-LAMP扩增结果，1到7表示F1ab-质粒和np-质粒模板量为 1.2×10⁴、1.2×10³、1.2×10²、1.2×10¹、1.2×10⁰、1.2×10^-1、1.2×10^-2拷贝，8表示空白对照(1微升双蒸水)。

其次，在反应混合物中预先加入特异性核酸扩增指示剂，阳性反应管保持绿色不变，阴性反应从绿色变为无色。检测显示：COVID-19RT-LAMP的检测范围为1.2×10¹～1.2×10⁴拷贝，阳性扩增管变为绿色(图6中C，1-4)。当反应体系中基因组模板量降低至1.2×10¹拷贝以下时，反应管从绿色变为无色，表示阴性结果(5-7)。图6中C代表运用特异性核酸扩增指示剂可视法读取COVID-19 RT-LAMP扩增结果，1到7表示F1ab-质粒和np-质粒模板量为1.2×10⁴、1.2×10³、 1.2×10²、1.2×10¹、1.2×10⁰、1.2×10^-1、1.2×10^-2拷贝，8表示空白对照(1微升双蒸水)。

实施例7.测定COVID-19RT-LAMP-NBS技术的最佳扩增时间

在标准应体系条件下，加入F1ab-质粒和np-质粒模板(1.2×10¹拷贝)及针对ORF1ab和N基因所设计的对应的COVID-19RT-LAMP引物。反应在恒温条件下进行(63℃)，恒温时间分别10分钟、20分钟、30分钟和40分钟。运用 NBS检测显示：COVID-19RT-LAMP技术在检测2019-nCoV的ORF1ab和N基因时，最佳反应时间为30分钟(图7)。当COVID-19RT-LAMP体系在扩增步骤恒温30分钟时，检测线水平的模板能够被检出(图7中3)。但考虑到实际样本情况，建议检测时间延至40分钟。

实施例8.测定COVID-19RT-LAMP-NBS技术的特异性

以常见的细菌病毒病原体核酸(甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、合胞病毒、EV71肠道病毒、CAV16柯萨奇病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、脑膜炎奈瑟菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、热带假丝酵母、隐球菌、粪肠球菌、尿肠球菌、产肠毒素大肠杆菌、沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、单增李斯特菌、猪链球菌、肺炎链球菌、副溶血性弧菌和白色念珠菌) 为模板评价COVID-19RT-LAMP-NBS技术的特异性。(菌株信息详见表1)。COVID-19RT-LAMP-NBS技术能准确的鉴别2019-nCoV，说明COVID-19 RT-LAMP-NBS方法的特异性良好，见表1。结果表明，COVID-19RT-LAMP-NBS 能够正确的检测靶序列。

实施例9.COVID-19RT-LAMP-NBS技术临床应用

129个临床咽拭子样本中，经rRT-PCR检测33例为2019-nCoV核酸检测阳性，结合流行病史，临床表现和实验室检查确诊为COVID-19，96例2019-nCoV 核酸检测阴性，结合流行病史，临床表现和实验室检查排除2019-nCoV感染。上述样本经COVID-19RT-LAMP-NBS检测的敏感性为100％(33/33)，COVID-19 RT-LAMP-NBS检测的特异性为100％(96/96)。这些初步结果显示，COVID-19 RT-LAMP-BS技术对2019-nCoV感染的诊断具有高敏感性和特异性。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 三亚市人民医院

<120> 逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggattttgtg acttaaaagg taag 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacttacac cgcaaacc 18

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggtacagac tgtgttttta agtgttgtac aaatacctac aacttgtg 48

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctgcggtat gtggaaaggt tataaacgat tgtgcatcag c 41

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacccacag ggtcattag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacccacag ggtcattag 19

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaacccatgc ttcagtc 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaacccatgc ttcagtc 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctacctagga actgggcc 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agaagaggct tgactgcc 18

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtgtattca aggctccctc acctatggtg ctaacaaaga c 41

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aatcctgcta acaatgctgc aatcctgctc ccttctgcgt ag 42

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttgcaaccc atatgatgc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttgcaaccc atatgatgc 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttcctcaag gaacaacat 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttcctcaag gaacaacat 19

Claims (10)

1.一种非诊断目的的逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检样本核酸，进行逆转录环介导等温扩增；逆转录环介导等温扩增的反应体系包括：

DNA聚合酶缓冲液，Bst链置换DNA聚合酶，AMV逆转录酶，dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3，环引物F1ab-LF*和F1ab-LB*，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP，外引物np-F3和np-B3，环引物np-LF*和np-LB*，内引物np-FIP和np-BIP；

F1ab-LF*的5'末端标记半抗原；F1ab-LB*的5'末端标记生物素；np-LF*的5'末端标记半抗原；np-LB*的5'末端标记生物素；

(2)采用金纳米生物传感器对步骤(1)的扩增产物进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，逆转录环介导等温扩增的反应程序：整个反应恒温在63℃反应40分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，逆转录环介导等温扩增的反应体系包括：

12.5μL的2×DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst链置换DNA聚合酶，5U的AMV逆转录酶，1.4mM的dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3各0.25μM，环引物F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB和F1ab-LB*各0.25μM，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP各1.0μM，外引物np-F3和np-B3各0.15μM，环引物np-LF、np-LF*、np-LB和np-LB*各0.15μM，内引物np-FIP和np-BIP各0.6μM，1～5μL模板，补加去离子水至25μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，引物F1ab-F3、F1ab-B3、F1ab-FIP、F1ab-BIP、F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB、F1ab-LB*、np-F3、np-B3、np-FIP、np-BIP、np-LF、np-LF*、np-LB、np-LB*的序列依序如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，F1ab-LF*的5'末端标记的半抗原为荧光素；np-LF*的5'末端标记的半抗原为地高辛。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述纤维膜上依次设置检测线1、检测线2及质控线，在金标垫、检测线1、检测线2及质控线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体、绵羊抗地高辛配基抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

7.一组用于逆转录环介导等温扩增2019新型冠状病毒ORF1ab和N基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：外引物F1ab-F3和F1ab-B3，环引物F1ab-LF和F1ab-LB，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP，外引物np-F3和np-B3，环引物np-LF和np-LB，内引物np-FIP和np-BIP；

引物F1ab-F3、F1ab-B3、F1ab-FIP、F1ab-BIP、F1ab-LF、F1ab-LB、np-F3、np-B3、np-FIP、np-BIP、np-LF、np-LB的序列依序如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15。

8.一种用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括：

逆转录环介导等温扩增反应试剂和金纳米生物传感器；

所述逆转录环介导等温扩增反应试剂包含：

DNA聚合酶缓冲液，Bst链置换DNA聚合酶，AMV逆转录酶，dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3，环引物F1ab-LF*和F1ab-LB*，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP，外引物np-F3和np-B3，环引物np-LF*和np-LB*，内引物np-FIP和np-BIP；F1ab-LF*的5'末端标记荧光素；np-LF*的5'末端标记地高辛；F1ab-LB*的5'末端标记生物素；np-LB*的5'末端标记生物素；

所述金纳米生物传感器包括背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫，在所述纤维膜上依次设置检测线1、检测线2及质控线，在金标垫、检测线1、检测线2及质控线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体、绵羊抗地高辛配基抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

9.根据权利要求8所述的用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，还包含环引物F1ab-LF、F1ab-LB、np-LF和np-LB；引物F1ab-F3、F1ab-B3、F1ab-FIP、F1ab-BIP、F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB、F1ab-LB*、np-F3、np-B3、np-FIP、np-BIP、np-LF、np-LF*、np-LB、np-LB*的序列依序如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16所示。

10.根据权利要求9所述的用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述逆转录环介导等温扩增反应试剂中，用于逆转录环介导等温扩增反应的用量为：

12.5μL的2×DNA聚合酶缓冲液，8U的Bst链置换DNA聚合酶，5U的AMV逆转录酶，1.4mM的dNTP，外引物F1ab-F3和F1ab-B3各0.25μM，环引物F1ab-LF、F1ab-LF*、F1ab-LB和F1ab-LB*各0.25μM，内引物F1ab-FIP和F1ab-BIP各1.0μM，外引物np-F3和np-B3各0.15μM，环引物np-LF、np-LF*、np-LB和np-LB*各0.15μM，内引物np-FIP和np-BIP各0.6μM，1～5μL模板，补加去离子水至25μL。

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