CN112111604A - 一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂盒及方法。一种用于检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒N基因的引物组，包括：外引物F3‑N1，外引物B3‑N1，内引物FIP‑N1，内引物BIP‑N1，环引物LF‑N1，环引物LB‑N1。本发明用于检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒N基因的引物组可特异性扩增SARS‑CoV‑2新型冠状病毒N基因片段，最低均可检测到20个拷贝数，与常规PCR方法相比大大提高了检测灵敏度，从而判断检测样品中是否存在SARS‑CoV‑2新型冠状病毒。

Description

一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂 盒及方法
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，特别是涉及一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
2019冠状病毒病(COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒引起的，SARS-CoV-2病毒可通过飞沫、密切接触患者人或污染物迅速传播。
SARS-CoV-2属于有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度约为29 903核苷酸。SARS-CoV-2是现在已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。SARS-CoV-2与两种蝙蝠源冠状病毒株的相似性高于其他已知人类冠状病毒，在全基因组水平上有96％以上的相似性。新型冠状病毒的基因组包含5’非翻译区，复制酶复合体(orf1ab)基因，S基因，E基因，N基因，3’非翻译区，及数个非结构性开放阅读框架。此次COVID-19传染强，临床症状不典型，给临床诊断和疫情防控带来很大困难，快速又精确的诊断对COVID-19的防控至关重要。病原学是诊断新型冠状病毒感染的金标准，但由于其存在窗口期、灵敏度低、程序复杂等缺陷，难以在此次疫情中得到广泛应用，而病毒的核酸检测也是确诊SARS-CoV-2的金标准，其灵敏度更高，定量检测又可以动态检测病毒感染的程度从而观察疗效，因此核酸检测在此次SARS-CoV-2的诊断及疫情的防控中担任不可或缺的角色。
公开号为CN111187354A的发明公开了一种胶体金捕获法检测SARS-CoV-2抗体的检测试纸，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括nCOVAg01；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有鼠抗人IgM/IgG抗体，质控区负载有羊抗兔多抗；nCOVAg01包括所述的重组抗原。
公开号为CN111426844A的发明公开了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，结合垫上包被有SARS-CoV-2结构蛋白-标记物和羊抗兔IgG-标记物，硝酸纤维素膜上设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C。
上述两篇现有技术中均是用于检测人血清中是否含有抗SARS-CoV-2的抗体，而体内抗体水平可能是由于之前感染过SARS-CoV-2，所以，无法用于作为实时的诊断方式。
自SARS-CoV-2感染爆发以来，实时定量PCR(RT-PCR)检测在临床诊断和疑似病例调查中发挥了重要作用。但这种方法费时费力，需要专门的仪器，不能满足目前大量疑似患者、无症状患者和密切接触者检测的快速增长和需求。目前急需一种快速、简便、灵敏的测定方法。环介导等温扩增(LAMP)是一种快速、灵敏、有效的可视化核酸扩增方法。近年来，该方法被广泛应用于流感病毒、中东呼吸综合征-冠状病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、黄热病病毒等多种病原体的检测。该方法依赖于使用4到6个特异性引物在1小时内识别目标基因的6到8个序列的自循环链置换DNA合成。仅需恒温水浴即可完成扩增反应，不需要复杂昂贵的仪器。此外，通过结合探针杂交和侧流试纸条(LFD)进一步优化了LAMP产物的检测，提高了LAMP测定的灵敏度和特异性，并已在肺炎支原体，弓形虫，非洲锥虫，犬细小病毒等病原微生物的检测中得到验证。LAMP-LFD基于以下原理：生物素标记引物使扩增产物生物素化，同时异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针去与扩增产物杂交，因此该产物同时被生物素和FITC双重标记，最后被侧流试纸上的抗FITC抗体捕获。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂盒及方法。
一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组，包括：
外引物F3-N1：5’-TGGACCCCAAAATCAGCG-3’，
外引物B3-N1：5’-GCCTTGTCCTCGAGGGAAT-3’，
内引物FIP-N1：5’-CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTAAATGCACCCCGCATTACG-3’，
内引物BIP-N1：5’-CGCGATCAAAACAACGTCGGCCCTTGCCATGTTGAGTGAGA-3’，
环引物LF-N1：5’-TGCCAGTTGAATCTGAGGGT-3’，
环引物LB-N1：5’-ACTGCGTCTTGGTTCACC-3’。
本发明又提供了一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的试剂盒，包含所述引物组。
所述的试剂盒，还包括探针N1-Probe，探针N1-Probe：5’-FITC-CCCAAGGTTTACCCAATAATAC-3’。
本发明还提供了一种非医学诊断为目的的检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的方法，使用所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品中的RNA，
(2)配置环介导等温扩增反应体系，以步骤(1)提取的RNA作为模板，加入所述试剂盒中的引物组和探针N1-Probe，
(3)进行环介导等温扩增反应，并对结果进行检测，判断检测结果为阳性或阴性。
上述检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的方法中使用的待检测样品除了可以是人来源的样品用于检测人员是否感染病毒外，还可以是其他一些不涉及人体来源的样品，比如一些环境检测，货物检测(比如进出口冷冻食品)等，这些均不涉及医学诊断目的。
优选的，内引物FIP-N1的5’端标记有生物素，
步骤(2)将配置的环介导等温扩增反应体系放置在PCR管中，然后将装有环介导等温扩增反应体系的PCR管和装有核酸稀释缓冲液的PCR管，以及LFD检测试纸条分别装配到核酸扩增-LFD检测用的装置上，
所述核酸扩增-LFD检测用的装置包括相互盖合的反应盒与密封盖，所述反应盒具有用于放置LFD检测试纸条的放置槽，所述反应盒中还设有与放置槽一端连通的缓冲槽，装配时，LFD检测试纸条的检测起始端靠近缓冲槽一侧；所述密封盖覆盖所述放置槽和缓冲槽，并在对应缓冲槽的位置设有两个连接PCR管的接口，
在步骤(3)环介导等温扩增反应结束后，将所述装置翻转使装有环介导等温扩增反应体系的PCR管中的反应产物和装有核酸稀释缓冲液的PCR管中的核酸稀释缓冲液混合并流至LFD检测试纸条处进行检测，若LFD检测试纸条上呈现两条带，说明检测结果为阳性，若LFD检测试纸条上只有一条带，说明检测结果为阴性。
LFD试纸条由底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，其中结合垫上包被有金标记的亲和素SA，硝酸纤维素膜上设有包被鼠抗FITC单克隆抗体的检测线T和包被生物素的质控线C。
核酸扩增-LFD检测用的装置通过将LFD检测试纸条密封放置在装置内，使用时将核酸扩增的PCR管和装有稀释缓冲液的PCR管通过接口处连接密封，此时PCR管在下，所述装置处于倒扣状态，然后PCR管中进行核酸扩增反应，反应完成后，将装置翻转或轻甩后使反应产物和稀释缓冲液流入到装置的缓冲槽内混匀稀释，稀释后的核酸扩增产物可以沿LFD检测试纸条扩散，由LFD检测试纸条检测核酸扩增结果，整个过程均封闭进行，中间没有打开，能有效防止气溶胶等污染造成的假阳性。能快速、准确地检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因核酸，敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，操作简单，可视化读取结果，能较好地满足不同层次人员的需求，易于向基层推广。
优选的，反应盒的顶面可以设置一个用于放置密封盖的盖槽，所述密封盖卡入盖槽中，然后通过超声焊接密封。
为了使LFD检测试纸条倾斜放置，液体通过虹吸作用在LFD检测试纸条中扩散前进，所述放置槽中用于支撑所述LFD检测试纸条的支撑面为从远离缓冲槽一侧向缓冲槽一侧倾斜向下设置。所述支撑面的倾斜角度为1～5度。
所述支撑面可以是直接以放置槽的底面作为支撑面，也可以由设置在放置槽中的一些结构形成，优选的，所述支撑面由垂直装置轴向、间隔设置在放置槽中的若干支撑横板组成。其中，轴向是指装置的长度方向，即所述LFD检测试纸条的长度方向。
所述缓冲槽的深度较支撑面深，所述缓冲槽的宽度也较放置槽的宽度宽，缓冲槽与放置槽的连接处具有逐渐缩窄、变浅的试纸条虹吸流入口。使用时，缓冲槽较宽较深，一方面可以用于作为核酸扩增过程中PCR管内卸压的缓冲空间，另一方面在LFD检测试纸条检测时可以避免液体直接流向LFD检测试纸条，确保液体只能被LFD检测试纸条虹吸前进。
为了方便安装连接PCR管，所述接口处设有使用时供PCR管套接设置的连接孔柱，连接孔柱中间的连接孔通过接口处连通缓冲槽，这样可以直接将PCR管套接在连接孔柱上，使用方便的同时，也能够确保连接后的密封。为了更进一步确保PCR管套接在连接孔柱上后的密封性，所述连接孔柱的外周面磨砂处理，甚至，所述连接孔柱的外周面还可以设置一些沿连接孔柱周向设置的凸环。
所述密封盖的底面设有盖合时抵顶所述LFD检测试纸条的压条，所述压条包括间隔设置的多个。通过压条抵顶所述LFD检测试纸条，确保LFD检测试纸条位置固定。压条可以包括多条垂直装置轴向设置的横向压条和一条沿装置轴向设置的纵向压条，横向压条触及样品垫、金标垫、吸水滤纸部位以固定LFD检测试纸条，一条纵向压条可向下抵住样品垫的最前端加以固定，防止样品垫末端翘起。
所述反应盒在放置槽靠近所述缓冲槽的地方设有垂直装置轴向布置的卡槽，卡槽内设有用于防止核酸扩增反应过程中水蒸气通过的阻挡垫，所述阻挡垫为乳胶垫。乳胶垫放置后横跨所述LFD检测试纸条，且乳胶垫的下表面抵顶所述LFD检测试纸条。
所述密封盖具有透明的读取区，所述读取区至少覆盖LFD检测试纸条上检测线和质控线的位置。读取区的设置可以实现检测结果的可视化，也可以观察检测的过程，这样在不用打开密封盖的情况下就可以观察到检测结果。密封盖可以使用透明塑料制备，然后读取区可以通过减薄设计得到。当然，最优的方式是整个装置，包括反应盒与密封盖均使用透明的塑料制备，这样可以方便观察整个过程。
本发明用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组可特异性扩增SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因片段，最低均可检测到20个拷贝数，与常规PCR方法相比大大提高了检测灵敏度，从而判断检测样品中是否存在SARS-CoV-2新型冠状病毒。
附图说明
图1为本发明装置的结构示意图。
图2为本发明装置的剖视结构示意图。
图3为反应盒的立体结构示意图。
图4为反应盒的俯视结构示意图。
图5为密封盖的侧视结构示意图。
图6为密封盖的立体结构示意图。
图7为LFD检测试纸条的立体结构示意图。
图8为引物组N1和探针N1-Probe在SARS-CoV-2病毒N基因上的位置。
图9为N1引物组特异性检测结果图，其中，上方为N1引物组扩增曲线，最下方0刻度处的横线为SARS-CoV，MERS-CoV模板扩增的曲线。
图10为N1引物组灵敏度检测结果图，其中，从左往右依次为2×107～2×10copies模板扩增的曲线，最下方0刻度处为阴性对照。
图11为N1引物组及探针N1-Probe的LAMP-LFD特异性检测结果图，从左至右依次为SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒的假病毒基因组DNA为模板。
图12为N1引物组及探针N1-Probe的LAMP-LFD灵敏度检测结果图，从左至右依次为模板浓度2×107～2×10copie，最右侧为阴性对照。
具体实施方式
实施例1：核酸扩增-LFD检测用的装置
如图1～7所示，一种核酸扩增-LFD检测用的装置，包括相互盖合的反应盒1与密封盖2，反应盒1具有用于放置LFD检测试纸条3的放置槽11，反应盒1中还设有与放置槽11一端连通的缓冲槽12，装配时，LFD检测试纸条3的检测起始端靠近缓冲槽12一侧；密封盖2覆盖放置槽11和缓冲槽12，并在对应缓冲槽12的位置设有两个连接PCR管的接口21。反应盒1的顶面具有容纳所述密封盖2的盖槽16，密封盖2卡入盖槽16内，密封盖2与反应盒1之间可以直接通过一定的过盈配合卡住，或通过超声焊接密封，也可以通过其他比如涂胶、热熔密封等方式进行连接固定。
LFD检测试纸条3大致为长条的薄片状，LFD检测试纸条3的结构为现有技术，本申请不再赘述。为了使LFD检测试纸条3倾斜放置，液体通过虹吸作用在LFD检测试纸条3中扩散前进，放置槽11中用于支撑LFD检测试纸条3的支撑面为从远离缓冲槽12一侧向缓冲槽12一侧倾斜向下设置。支撑面的倾斜角度为1～5度。支撑面可以是直接以放置槽11的底面作为支撑面，也可以由设置在放置槽11中的一些结构形成，优选的，如图所示，支撑面11由垂直装置轴向、间隔设置在放置槽11中的若干支撑横板13组成。其中，轴向是指装置的长度方向，即LFD检测试纸条3的长度方向。
缓冲槽12的深度较支撑面深，缓冲槽12的宽度也较放置槽11的宽度宽，缓冲槽12与放置槽11的连接处具有逐渐缩窄、变浅的试纸条虹吸流入口14。使用时，缓冲槽较宽较深，一方面可以用于作为核酸扩增过程中PCR管内卸压的缓冲空间，另一方面在LFD检测试纸条3检测时可以避免液体直接流向LFD检测试纸条3，确保液体只能被LFD检测试纸条3虹吸前进。
为了方便安装连接PCR管，接口处21设有使用时供PCR管套接设置的连接孔柱22，连接孔柱22中间的连接孔通过接口21处连通缓冲槽12，这样可以直接将PCR管套接在连接孔柱22上，使用方便的同时，也能够确保连接后的密封。为了更进一步确保PCR管套接在连接孔柱22上后的密封性，连接孔柱22的外周面磨砂处理，甚至，连接孔柱22的外周面还可以设置一些沿连接孔柱22周向设置的凸环。
密封盖2的底面设有盖合时抵顶LFD检测试纸条3的压条23，压条23包括间隔设置的多个。通过压条23抵顶LFD检测试纸条3，确保LFD检测试纸条3位置固定。压条23可以包括多条垂直装置轴向设置的横向压条和一条沿装置轴向设置的纵向压条，横向压条触及样品垫、金标垫、吸水滤纸部位以固定LFD检测试纸条3，一条纵向压条可向下抵住样品垫的最前端加以固定，防止样品垫末端翘起。
反应盒1在放置槽11靠近缓冲槽12的地方设有垂直装置轴向布置的卡槽15，卡槽15内设有用于防止核酸扩增反应过程中水蒸气通过的阻挡垫4，阻挡垫4为乳胶垫。乳胶垫放置后横跨LFD检测试纸条3，且乳胶垫的下表面抵顶LFD检测试纸条3。
密封盖2具有透明的读取区24，读取区24至少覆盖LFD检测试纸条3上检测线和质控线的位置。读取区24的设置可以实现检测结果的可视化，也可以观察检测的过程，这样在不用打开密封盖2的情况下就可以观察到检测结果。密封盖2可以使用透明塑料制备，然后读取区可以通过减薄设计得到。当然，最优的方式是整个装置，包括反应盒1与密封盖2均使用透明的塑料制备，这样可以方便观察整个过程。
本实用新型核酸扩增-LFD检测用的装置通过将LFD检测试纸条3密封放置在装置内，使用时将核酸扩增的PCR管和装有稀释缓冲液的PCR管通过接口21处连接密封，此时PCR管在下，装置处于倒扣状态，然后PCR管中进行核酸扩增反应，反应完成后，将装置翻转后使反应产物和稀释缓冲液流入到装置的缓冲槽12内混匀稀释，稀释后的核酸扩增产物可以沿LFD检测试纸条3扩散，由LFD检测试纸条3检测核酸扩增结果，整个过程均封闭进行，中间没有打开，能有效防止气溶胶等污染造成的假阳性。若稀释后的核酸扩增产物不容易被LFD检测试纸条3虹吸，可以适当倾斜装置，以便产物能够充分被吸收检测。
实施例2：引物和探针的设计
根据日本荣研公司的在线LAMP引物设计网站：Primer Explorer http://primerexplorer.jp/e/在线设计了SARS-CoV-2病毒的N基因的LAMP引物组。具体步骤为，将SARS-CoV-2病毒的N基因核酸序列全长共1260bp导入网站，按照一般LAMP引物设计的原则设置引物长短、GC含量，ΔG大小、产物大小，最终生成6组符合设计需求的引物组，并在引物组的基础上设计探针，位于内引物BIP之间。对6组引物和探针分别进行验证，最终得到特异性最好，灵敏度最高的引物组N1探针N1-Probe。为了结合LFD试纸条对LAMP产物进行双夹心检测，我们在内引物N1-FIP的5’端添加了生物素(Biotin)标签，探针N1-Probe的5’端添加了FITC荧光素标签。
具体引物组N1和探针N1-Probe在SARS-CoV-2病毒N基因上的位置见图8所示。序列如下：
外引物F3-N1：5’-TGGACCCCAAAATCAGCG-3’，
外引物B3-N1：5’-GCCTTGTCCTCGAGGGAAT-3’，
内引物FIP-N1：5’-CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTAAATGCACCCCGCATTACG-3’，
内引物BIP-N1：5’-CGCGATCAAAACAACGTCGGCCCTTGCCATGTTGAGTGAGA-3’，
环引物LF-N1：5’-TGCCAGTTGAATCTGAGGGT-3’，
环引物LB-N1：5’-ACTGCGTCTTGGTTCACC-3’，
探针N1-Probe：5’-FITC-CCCAAGGTTTACCCAATAATAC-3’。
实施例3：引物组N1的RT-LAMP特异性检测
以SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒的假病毒基因组DNA为模板，将各模板加入反应管中，针对每种模板设置两管，并分别加入引物组N1：F3-N1，B3-N1，FIP-N1，BIP-N1，LF-N1，LB-N1，再分别加入8U Bst 2.0DNA聚合酶，20U逆转录酶，1.5mM dNTP，7.5mM MgSO4和ddH2O，此外还要加入1μl浓度为25μM的SYTO13荧光染料，在伯乐的荧光定量PCR仪上进行反应，具体的反应程序为：50℃，15min，65℃反应1h并收集荧光数据，95℃反应5min。
结果如图9所示，引物组N1能检测到SARS-CoV-2病毒的假病毒基因组DNA，不能检测出SARS-CoV，MERS-CoV病毒的假病毒基因组DNA，表明N1引物组均具有良好的特异性。
实施例4：引物组N1的RT-LAMP灵敏度检测
以SARS-CoV-2病毒的N基因DNA构建质粒为模板，分别按10倍梯度稀释为10～107copies/μl，将10～107copies/μl，共七个浓度梯度的模板分别加入各反应管中，并加入引物组N1：F3-N1，B3-N1，FIP-N1，BIP-N1，LF-N1，LB-N1，再分别加入2μl模板，8U Bst2.0DNA聚合酶，20U逆转录酶，1.5mM dNTP，7.5mM MgSO4和ddH2O，此外还要加入1μl浓度为25μM的SYTO13荧光染料，在伯乐的荧光定量PCR仪上进行反应，具体的反应程序为：50℃，15min，65℃反应1h并收集荧光数据，95℃反应5min。
结果如图10所示，引物组N1能检出20个拷贝的SARS-CoV-2病毒N基因。具有较高的灵敏度，优于常规PCR检测方法。
实施例5：引物组N1和探针N1-Probe的RT-LAMP-LFD特异性检测
以SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒的假病毒基因组DNA为模板，将各模板加入反应管中，并加入引物组N1：F3-N1，B3-N1，Biotin-FIP-N1，BIP-N1，LF-N1，LB-N1、N1-Probe，再分别加入8U Bst 2.0DNA聚合酶，20U逆转录酶，1.5mM dNTP，7.5mM MgSO4和ddH2O。将两管反应体系及另两管核酸稀释缓冲液(核酸稀释缓冲液：KH2PO4 2mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM、KCl 2.6mM。)与实施例1中核酸扩增-LFD检测用的装置连接，保证反应管口朝上。具体的扩增条件为：水浴50℃，15min，65℃，30min。扩增反应完成后，将反应装置翻转，反应管口朝下，扩增产物与核酸稀释缓冲液混合，并沿流至LFD检测试纸条上，观察反应结果。其中，LFD试纸条为现有常规结构，本发明未对LFD试纸条结构进行改进，LFD试纸条由底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，其中结合垫上包被有金标记的亲和素SA，硝酸纤维素膜上设有包被鼠抗FITC单克隆抗体的检测线T和包被生物素的质控线C。
检测结果如图11所示，引物组N1和和探针N1-Probe的RT-LAMP-LFD可以特异性的检测出SARS-CoV-2病毒的假病毒基因组DNA，而对SARS-CoV、MERS-CoV病毒的假病毒基因组DNA检测不出。显示出引物组N1和和探针N1-Probe的RT-LAMP-LFD方法对SARS-CoV-2病毒检测的特异性较好。
实施例6：引物组N1和探针N1-Probe的RT-LAMP-LFD灵敏度检测
以SARS-CoV-2病毒的N基因DNA构建质粒为模板，分别按10倍梯度稀释为10～107copies/μl，将10～107copies/μl，共七个浓度梯度的模板分别加入各反应管中，并加入引物组N1：F3-N1，B3-N1，FIP-N1，BIP-N1，LF-N1，LB-N1，和探针N1-Probe，再分别加入2μl模板，8U Bst 2.0DNA聚合酶，20U逆转录酶，1.5mM dNTP，7.5mM MgSO4和ddH2O。将每管反应体系及另一管核酸稀释缓冲液与实施例1中核酸扩增-LFD检测用的装置连接，保证反应管口朝上。具体的扩增条件为：水浴50℃，15min，65℃，30min。扩增反应完成后，将反应装置翻转，反应管口朝下，扩增产物与核酸稀释缓冲液混合，并沿流至LFD试纸条(LFD试纸条与实施例5中使用的相同)上，观察反应结果。
结果如图12所示，从左往右，引物组N1和探针N1-Probe的RT-LAMP-LFD可以对SARS-CoV-2病毒N基因模板浓度从2×107至2×10copies的七个浓度梯度的模板均可检测出，最后侧为阴性对照。最低检测限为20copies，即引物组N1和探针N1-Probe的RT-LAMP-LFD可以对SARS-CoV-2病毒N基因的检测灵敏度为20copies。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> 一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组、试剂盒及方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaccccaa aatcagcg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccttgtcct cgagggaat 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccactgcgtt ctccattctg gtaaatgcac cccgcattac g 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgatcaaa acaacgtcgg cccttgccat gttgagtgag a 41
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccagttga atctgagggt 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgcgtctt ggttcacc 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaaggttt acccaataat ac 22

Claims (10)

1.一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的引物组，包括：
外引物F3-N1：5’-TGGACCCCAAAATCAGCG-3’，
外引物B3-N1：5’-GCCTTGTCCTCGAGGGAAT-3’，
内引物FIP-N1：5’-CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTAAATGCACCCCGCATTACG-3’，
内引物BIP-N1：5’-CGCGATCAAAACAACGTCGGCCCTTGCCATGTTGAGTGAGA-3’，
环引物LF-N1：5’-TGCCAGTTGAATCTGAGGGT-3’，
环引物LB-N1：5’-ACTGCGTCTTGGTTCACC-3’。
2.一种用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括探针N1-Probe，探针N1-Probe：5’-FITC-CCCAAGGTTTACCCAATAATAC-3’。
4.一种非医学诊断为目的的检测SARS-CoV-2新型冠状病毒N基因的方法，其特征在于，使用如权利要求3所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品中的RNA，
(2)配置环介导等温扩增反应体系，以步骤(1)提取的RNA作为模板，加入所述试剂盒中的引物组和探针N1-Probe，
(3)进行环介导等温扩增反应，并对结果进行检测，判断检测结果为阳性或阴性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，内引物FIP-N1的5’端标记有生物素，
步骤(2)将配置的环介导等温扩增反应体系放置在PCR管中，然后将装有环介导等温扩增反应体系的PCR管和装有核酸稀释缓冲液的PCR管，以及LFD检测试纸条分别装配到核酸扩增-LFD检测用的装置上，
所述核酸扩增-LFD检测用的装置包括相互盖合的反应盒与密封盖，所述反应盒具有用于放置LFD检测试纸条的放置槽，所述反应盒中还设有与放置槽一端连通的缓冲槽，装配时，LFD检测试纸条的检测起始端靠近缓冲槽一侧；所述密封盖覆盖所述放置槽和缓冲槽，并在对应缓冲槽的位置设有两个连接PCR管的接口，
在步骤(3)环介导等温扩增反应结束后，将所述装置翻转使装有环介导等温扩增反应体系的PCR管中的反应产物和装有核酸稀释缓冲液的PCR管中的核酸稀释缓冲液混合并流至LFD检测试纸条处进行检测，若LFD检测试纸条上呈现两条带，说明检测结果为阳性，若LFD检测试纸条上只有一条带，说明检测结果为阴性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述放置槽中用于支撑所述LFD检测试纸条的支撑面为从远离缓冲槽一侧向缓冲槽一侧倾斜向下设置；
所述支撑面的倾斜角度为1～5度；
所述支撑面由垂直装置轴向、间隔设置在放置槽中的若干支撑横板组成；
所述缓冲槽的深度较支撑面深，所述缓冲槽的宽度也较放置槽的宽度宽，缓冲槽与放置槽的连接处具有逐渐缩窄、变浅的试纸条虹吸流入口。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述接口处设有使用时供PCR管套接设置的连接孔柱，所述连接孔柱的外周面磨砂处理。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述密封盖的底面设有盖合时抵顶所述LFD检测试纸条的压条，所述压条包括间隔设置的多个。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反应盒在放置槽靠近所述缓冲槽的地方设有垂直装置轴向布置的卡槽，卡槽内设有用于防止核酸扩增反应过程中水蒸气通过的阻挡垫，所述阻挡垫为乳胶垫。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述密封盖具有透明的读取区，所述读取区至少覆盖LFD检测试纸条上检测线和质控线的位置。
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