CN111647690B - 用于检测covid-19病毒的rt-raa引物对和诊断试剂盒 - Google Patents

用于检测covid-19病毒的rt-raa引物对和诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于检测COVID‑19病毒的RT‑RAA引物对，其上游引物包括SEQ No 1所示的核酸序列，下游引物包括SEQ No 2所示的核酸序列。采用本发明提供的引物对建立的检测方法，操作简单且不易交叉感染，反应快速，结果准确可靠，适用于COVID‑19的快速检测，可用于疫情早诊断、早隔离、降低感染率以及控制疫情蔓延。

Description

用于检测COVID-19病毒的RT-RAA引物对和诊断试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种RAA引物对，用于检测COVID-19病毒，及其诊断试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2是一种大型阳性单链核糖核酸(RNA)病毒，由其引起的肺部疾病于2020年2月11日被世界卫生组织(WHO)命名为COVID-19。SARS-CoV-2最主要的传播途径有接触传播和飞沫传播。截止2020年6月1日，全球已确诊的COVID-19病例超过605万例，而全球死亡人数超过37万人。对于此次传播性强、传染速度快、致死率高的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的肺炎，针对性的疫苗与药物尚在研发中，早发现、早隔离是目前控制传染源，阻断传播途径的最有效措施。因此，尽快建立高效灵敏、快速简易的临床诊断体系，是当前疫情防治工作的重中之重。
目前国内外已建立的COVID-19检测可分为两大类。第一类包括检测个体由于暴露于病毒而产生的抗体或检测被感染个体中的抗原蛋白的血清学检测。第二类包括使用基于聚合酶链反应(PCR)的技术或与核酸杂交相关的策略检测SARS-CoV-2病毒RNA的分子诊断。然而血清学检测需要患者体内的特异性抗体含量达到一定程度，且缺乏专门的商业试剂，故在疾病早期较难发挥作用。基于实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的COVID-19分子诊断已在全球范围内被广泛使用。然而，目前其诊断分析并十分不可靠，因为它们仍然会遗漏某些感染病例。此外，它们只能在装备精良的中央实验室由高技能的分析人员进行分析操作。
综上所述，迫切需要发展一种适用于医疗点或需求点以及在低资源环境下的高准确度的、专一的、用户友好的、快速的、便携的即时检测设备，用于COVID-19的现场检测。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于RAA检测COVID-19病毒的引物对，提高检测COVID-19病毒核酸的灵敏度。
本发明的另一个目的在于提供一种基于RAA检测COVID-19病毒的引物对，提高检测COVID-19病毒核酸的特异性。
本发明的再一个目的在于提供一种诊断试剂，改善COVID-19病毒核酸检测界面的用户友好性，使检测结果可视化，易于识别。
本发明所称的RAA即重组酶介导等温扩增技术。
一种基于RAA检测COVID-19病毒的引物对，其上游引物包括SEQ No 1所示的核酸序列，下游引物包括SEQ No 2所示的核酸序列。
在上游引物的5’端结合荧光标记，如：但不限于Hex、VIC、Cy5或FAM等。
在下游引物的5’端结合耦合标记，如：生物素，其与亲和素耦合。
本发明提供的基于RAA检测COVID-19病毒的引物对，还需要与其它试剂相组合，形成试剂盒，应用于COVID-19病毒的核酸检测。比如：分子拥挤试剂(如：但不限于20wt％分子量为35，000聚乙二醇(PEG))，核酸扩增启动剂(如：但不限于280nM醋酸镁)和反应干粉酶试剂等。
实施核酸检测的扩增反应条件为37℃～42℃，时间为10分钟～25分钟。
一种扩增方法，以本发明的引物对样本实施核酸扩增，其包括以下步骤：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入37～42℃恒温箱，扩增10～30分钟后，结束反应。
对本发明的引物对用于核酸扩增反应进行研究发现，扩增反应的温度和时间直接影响检测的结果，有利于呈现清晰的检测条带，即T线。
另一种扩增方法，以本发明的引物对样本实施核酸扩增，其包括以下步骤：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入37～42℃恒温箱，扩增3～7分钟后取出，充分混匀，掌式低速离心10秒，再置入37～42℃恒温箱继续扩增。10分钟～20分钟后，结束反应。
另一种扩增方法，以本发明的引物对样本实施核酸扩增，其包括以下步骤：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入42℃恒温箱，扩增6分钟后取出，充分混匀，掌式低速离心10秒，再置入42℃恒温箱继续扩增。16分钟后，结束反应。
将本发明的引物扩增方法应用于COVID-19病毒核酸检测试剂盒，便于对检测结果的识别(如：直接肉眼观察)，以利于更直观呈现检测结果。
一种试剂盒，用于检测COVID-19病毒，包括：
上游引物：其包括SEQ No 1所示的核酸序列；
下游引物：其包括SEQ No 2所示的核酸序列；
分子拥挤试剂；
核酸扩增启动剂；和
反应干粉酶试剂。
本发明的试剂盒，还包括说明书，其上记载了引物扩增方法。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.针对COVID-19病毒的N基因设计特异性RAA引物，建立了COVID-19病毒RAA检测方法，可对单拷贝每微升N基因进行定性检测。
2.采用本发明的引物对，无需使用探针即可检测COVID-19病毒：针对COVID-19病毒的N基因设计一对标记荧光的引物即可完成扩增，省去了复杂的引物探针设计过程。引物扩增只需要42℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；25分钟以内即可完成扩增反应。
3.与常规RAA侧流试纸条层析实验(需要nfo核酸内切酶对探针酶切)相比，本发明提供的技术方案，由于无需探针，所需的酶种类少。
4.本发明提供的RAA扩增引物特异性好、灵敏度高。COVID-19病毒样本检测证明，检测特异性为100％，检测灵敏度为98％。
5.建立的COVID-19病毒RAA检测方法扩增反应全程在PCR管中进行，扩增后在密闭装置中进行横向流动试纸检测，可有效防止交叉污染。
6.本发明建立的RAA方法操作简单、高效快速、灵敏度高、结果准确可靠，全程在密闭装置中进行，可防止交叉污染，结果显示不需要外加仪器，可直接读取，在COVID-19的POCT(及时检测)方面有望得到较好的应用。
附图说明
图1为优化针对COVID-19病毒N基因的最佳引物对的结果图，其中加“框”处表明本发明的引物对系最佳的引物组合；
图2为采用本发明引物对对COVID-19病毒N基因扩增孵育时间优化的结果示意图，其中加“框”处表明最佳扩增时间；
图3为采用本发明引物对对COVID-19病毒N基因进行可行性验证的结果示意图，其中加“框”处表明核酸的最低检测限为2aM；
图4为采用本发明引物对对COVID-19病毒N基因进行特异性检测的结果示意图，其中加“框”处表明病毒N基因检测结果呈阳性；
图5为采用本发明引物对对COVID-19病毒N基因进行灵敏度验证的结果示意图，其中加“框”处表明核酸的最低检测限为2aM。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
RAA引物的筛选方法为：针对COVID-19病毒的N基因的保守序列，设计引物并组成引物对，再进行筛选优化，综合其灵敏度及与核酸检测试装置的适配性，最终筛选出灵敏度最高的一对RAA引物。
此引物对(F3R2)的具体序列如下：
上游引物FAM-GCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGC；
下游引物Biotin-TAGTGACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCT。
实施例2
本实施例提供了一种基于RAA的检测试剂盒，包括：反应干粉酶试剂(购自众测生物科技有限公司，基础型，主要包含单链结合蛋白、重组酶和DNA聚合酶，不含核酸内切酶，已分装，每次使用一管)，2mL分子拥挤试剂，200μL核酸扩增启动剂，200μL核酸扩增引物对，100μL阳性质控品，30个卡槽密闭装置和若干PCR管。
实施例3
将实施例1的RAA引物作为核酸扩增引物引用于实施例2的试剂盒中，并对样本实施核酸检测，具体步骤如下：
1.提取核酸：
利用常规商品化试剂盒提取核酸；在本实施例中，具体采用优思达生物科技有限公司的注射器法RNA核酸提取试剂盒。
2.RAA扩增：
向PCR管中依次加入13.5μL分子拥挤试剂(PEG35000，浓度20％)、30μL由步骤1得到的样本RNA以及4μLRAA引物对，混匀后将液体转移至装有反应干粉酶制剂的检测管，盖上管盖，并上下颠倒7-8次充分混匀，掌式低速离心10s；
将以上混匀的液体重新转移至PCR管，在管盖中加入2.5μL核酸扩增启动剂(280nM醋酸镁)，上下混匀颠倒7-8次充分混匀，掌式低速离心10s，计时开始。放入42℃恒温设备，扩增6分钟后拿出，上下颠倒7-8次充分混匀，掌式低速离心10s，重新放入恒温箱继续扩增。10分钟反应结束；
3.RAA扩增产物的检测
利用一次性核酸试纸条检测装置进行检测，试纸条上其结合垫上固定胶体金结合抗FAM抗体，T线处固定标记有链霉亲和素的抗体，在C线处固定荧光素抗抗体。经5-15分钟观察结果，若同时呈现T线和C线，则表明样本为阳性，含有目标核酸。
实施例4
本实施例对实施例3建立的检测COVID-19的方法进行反应条件优化。
分别对引物对、扩增孵育时间进行优化。配制50μL RAA反应体系在如下范围内进行优化：向PCR管中依次加入13.5μL分子拥挤试剂、30μL样本RNA以及4μL引物对(F1R1/F1R2/F1R3/F2R1/F2R2/F2R3/F3R1/F3R2/F3R3，F为上游引物，R为下游引物，1，2，3为不同的引物设计)，混匀后将液体转移至装有反应干粉酶制剂的检测管，盖上管盖，并上下颠倒7-8次充分混匀，掌式低速离心10s。
将以上混匀的液体重新转移至PCR管，在管盖中加入2.5μL核酸扩增启动剂，上下混匀颠倒7-8次充分混匀，掌式低速离心10秒，计时开始。放入42℃恒温设备，扩增6分钟后拿出，上下颠倒7-8次充分混匀，掌式低速离心10秒，重新放入恒温箱继续扩增。反应总时间设置为10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟和20分钟。
反应结束后，利用一次性核酸试纸条检测装置进行检测，5-15分钟观察结果，若同时呈现T线和C线，则表明样本为阳性，含有目标核酸。检测结果如图1图2所示：使用最佳引物组合F3R2引物对的扩增产物的检测结果阴性对照只有一个条带，阳性有两条清晰条带，故F3R2为最佳引物对；扩增孵育时间为16分钟时，阴性对照只有一个条带，阳性样品的检测试纸条上有两条清晰条带，故扩增孵育最佳时间为16分钟。
实施例5
本实施例对实施例3建立的检测COVID-19的方法进行可行性验证。包括如下步骤：
用热裂解法提取核酸，得到每微升0、100、101、102、103、104、105拷贝数的样本RNA。RPA扩增和RPA扩增产物的检测的方法同实施例3的步骤2和步骤3。结果如图3所示，含有N基因的样品，检测试纸条上均出现两条清晰条带，说明本发明实施例1提供的引物对COVID-19病毒核酸检测具有可行性。
实施例6
本实施例对实施例3建立的检测COVID-19的方法进行特异性验证。包括如下步骤：
将COVID-19病毒的N、ORFlab、E、S基因按照实施例3的步骤2和步骤3进行扩增和检测，同时设置空白对照组。结果如图4所示，只有N基因扩增出目的条带，其余基因同空白对照一样均为出现特异性扩增，表明该方法具有较强的特异性。
实施例7
本实施例对实施例3建立的检测COVID-19的方法进行灵敏度验证。包括如下步骤：
按实施例3的步骤1的方法提取核酸，得到每微升0、100、101、102、103、104、105拷贝数的样本RNA。RPA扩增和RPA扩增产物的检测的方法同实施例3的步骤2和步骤3。结果如图5所示，本发明实施例1中的引物对灵敏度高，低至每微升1个RNA拷贝。
实施例8
本实施例对实施例3建立的检测COVID-19的方法进行临床样品验证。包括如下步骤：
按实施例3的步骤1的方法提取COVID-19患者的核酸，得到实际样本RNA。RPA扩增和RPA扩增产物的检测的方法同实施例3的步骤2和步骤3。同临床qPCR结果进行对比，结果如表1所示，本方法临床检测的灵敏度为98％，特异性为100％。
表1
Figure BDA0002551458240000081
序列表
<110> 华侨大学
厦门大学
<120> 用于检测COVID-19病毒的RT-RAA引物对和诊断试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaacagttc aagaaattca actccaggca gc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtgacagt ttggccttgt tgttgttggc ct 32

Claims (10)

1.一种基于RAA检测COVID-19病毒的引物对，其特征在于，上游引物包括SEQ No 1所示的核酸序列，下游引物包括SEQ No 2所示的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于在所述的上游引物的5’端结合荧光标记，所述的下游引物的5’端结合耦合标记。
3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于在上游引物的5’端结合荧光标记，所述的下游引物的5’端结合生物素。
4.根据权利要求1～3之一所述的引物对在制备检测COVID-19病毒的诊断试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1～3之一所述的引物对，其特征在于按如下方法对样本实施核酸扩增：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入37～42℃恒温箱，扩增3～7分钟后取出，充分混匀，掌式低速离心10秒，再置入37～42℃恒温箱继续扩增， 10分钟～20分钟后，结束反应。
6.根据权利要求1～3之一所述的引物对，其特征在于按如下方法对样本实施核酸扩增：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入42℃恒温箱，扩增6分钟后取出，充分混匀，掌式低速离心10秒，再置入37～42℃恒温箱继续扩增，16分钟后，结束反应。
7.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1～3之一所述的引物对。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包括分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂和反应干粉酶试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包括说明书，其上记载如下扩增步骤：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入37～42℃恒温箱，扩增10～30分钟后，结束反应。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包括说明书，其上记载如下扩增步骤：
将分子拥挤试剂、核酸扩增启动剂、反应干粉酶制剂和扩增引物对共混后，置入37～42℃恒温箱，扩增3～7分钟后取出，充分混匀，掌式低速离心10秒，再置入37～42℃恒温箱继续扩增， 10分钟～20分钟后，结束反应。
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