CN110982944A

CN110982944A - 新型冠状病毒可视化恒温快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN110982944A
Application number: CN202010138116.7A
Authority: CN
Inventors: 崔尚金; 梁琳; 贾亚雄; 梁瑞英
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明提供新型冠状病毒可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒。本发明以新型冠状病毒（2019‑nCoV）的特异性核酸序列为靶基因，设计LAMP扩增引物，基于环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便的优势，建立了一套新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术检测方法，基于该检测方法构建了可视化恒温新型冠状病毒快速检测试剂盒。本发明试剂盒可将浓度为5拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为30min。本发明试剂盒可实现快速、准确检测新型冠状病毒的目的，具有良好的应用前景。

Description

新型冠状病毒可视化恒温快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及新型冠状病毒可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒是2019年12月以来新发现的一种病毒，可导致人类病毒性肺炎/肺部感染，2020年1月12日被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”。目前新型冠状病毒的的检测方法为核酸检测方法，常用普通PCR及荧光定量PCR。应用这些检测方法新型冠状病毒进行检测，不仅对仪器及实验室环境要求较高，并且操作过程复杂，对操作人员技术要求严格，检测时间较长。尤其受限于基层检测设备及人员的限制，严重影响了该病毒的检测效率。

因此，迫切需要建立一种设备简单并且操作便捷的快速、高效、特异性高的检测新型冠状病毒的技术，以满足基层检测及快速筛查的需求。

环介导恒温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年由日本学者Notomi开发的一门新兴的基因扩增技术，具有特异性强、灵敏性高、等温高效、操作简便、成本低廉等优点。但由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链RNA的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，因此特别注意严谨操作，来防范非特异性扩增与污染。

发明内容

本发明的目的是提供新型冠状病毒可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法。

本发明构思如下：根据NCBI公布的武汉新型冠状病毒基因组序列（GenBank No.:NC_045512.2），将新型冠状病毒2019-nCoV的保守靶基因ORF1ab（序列见SEQ ID NO:7）与SARS、MERS等病毒进行序列同源性比对分析，2019-nCoV目标基因序列与SARS同源性为73%，与MERS同源性210.1%。在相对区分度较高区段，利用LAMP Desiner2.0软件进行引物设计。利用恒温快速核酸扩增技术，在恒温条件下，呈指数级别放大核酸分子特性，其在30分钟内将病毒核酸分子放大10⁹~10¹⁰倍。扩增完成后，放大的核酸分子与OG（Orange-Green）染料结合，由橙色变为鲜艳的绿色，通过肉眼观察即可判定样本中是否含有目标病毒分子，阳性样本为鲜艳的绿色，阴性样本为橙黄色，从而建立一套可视化恒温新型冠状病毒快速检测方法，

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物，所述LAMP引物包括如SEQ ID NO:1-2所示的外侧正向引物F3和外侧反向引物B3，以及如SEQ ID NO:3-4所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。

第二方面，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物组，包括SEQID NO:1-4所示的LAMP引物以及如SEQ ID NO:5-6所示的环引物LoopF和LoopB。

第三方面，本发明提供含有如SEQ ID NO:1-4所示LAMP引物或如SEQ ID NO:1-6所示引物组的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供一种新型冠状病毒2019-nCoV可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO:1-6所示引物组，还包含dNTPs、Bst DNA聚合酶（优选Bst 4.0 DNA聚合酶）、海藻糖、OG染料、Tris HCl，TrionX-100，含Mg²⁺的反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。该试剂盒可用于感染新型冠状病毒肺炎的早期诊断。

第五方面，本发明提供如SEQ ID NO:1-4所示LAMP引物或如SEQ ID NO:1-6所示引物组在制备用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂或试剂盒中的应用。

所述试剂或试剂盒为用于LAMP法的试剂或试剂盒。

第六方面，本发明提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法（含非诊断目的），包括以下步骤：

1）用650μl反应缓冲液溶解50mg OG冻干反应试剂，得到OG反应试剂；然后在反应管底部加入20 µl ddH₂O，加入20μl OG反应试剂，再加入20μl待测样品，混匀后加入10μl OG染料，进行LAMP扩增反应及显色反应；

2）扩增结果判定（荧光染色法）：若反应体系由橙色变为绿色，表明待测样品中含有新型冠状病毒2019-nCoV。

步骤1）中所述反应缓冲液的组成如下：

Tris-HCl 20mM，pH8.8

MgSO₄ 6mM

Trion X-100 0.1%

所述OG冻干反应试剂的组成如下：

Bst 4.0 DNA聚合酶 0.4U/μl

dNTPs 0.2μM

海藻糖 10%

引物F3 4μM

引物B3 4μM

引物FIP 32μM

引物BIP 32μM

环引物LoopF 16μM

环引物LoopB 16μM

进行LAMP扩增反应采用的最佳反应条件为：60℃ 30分钟。

应理解的是，步骤2）也可以采用如下①或②的方法替代荧光染色法，进行扩增结果判定：

①琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有新型冠状病毒2019-nCoV；

②焦磷酸镁浊度检测法：通过肉眼观察反应后的浑浊情况来判断是否发生了LAMP扩增反应，或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，实现实时定量检测。

本发明中，所述待测样品可以是获自疑似患有新型冠状病毒2019-nCoV的人或其它动物的样品，如痰液、支气管肺泡灌洗液、鼻溢、鼻吸出物、鼻洗剂、鼻海绵、咽拭子、唾液、血液、血清、血浆、脊髓液、尿液、粪便及组织。此外，包括例如用于感染实验等的细胞及其培养液，或从获自生物的样品或培养细胞分离的病毒的样品也可作为样品。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明以新型冠状病毒（2019-nCoV）的特异性核酸序列为靶基因，设计LAMP扩增引物，基于环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便的优势，建立了一套新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术检测方法，基于该检测方法构建了可视化恒温新型冠状病毒快速检测试剂盒。本发明试剂盒可将浓度为5拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为30min。本发明试剂盒可直接利用简易设备（水浴锅或金属浴）对待测样品（如咽拭子浸泡液样品）进行免核酸提取的新型冠状病毒的直接检测、肉眼可视化检测。可用于快速诊前分离，适合于户外操作。本发明试剂盒可实现快速、准确检测新型冠状病毒的目的，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果。其中，M为DNAMarker，1和2为PCR扩增产物，大小为381bp。

图2为本发明实施例3中LAMP检测的灵敏度实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1 新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术引物的获得

本实施例针对新型冠状病毒（2019-nCoV）的高度保守片段（SEQ ID NO:7），依据LAMP引物设计原则，使用LAMP Desiner2.0软件进行6引物组合的设计，通过RNAMAN对引物进行分析，挑选出3个候选引物组合（表1）。

由于组II、组III引物组合均存在非特异性扩增情况，因此本发明最终确定检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒中的6条特异性引物为以下组合（SEQ ID NO:1-6）：

外侧正向引物Co5-153-F3：AACATGGAGGAGGTGTTG

外侧反向引物Co5-153-B3：CAAGTAGAACTTCGTGCTG

内侧正向引物Co5-153-FIP：AAACACAACTACCACCCACTTTTGCCATGCAAGTTGAATC

内侧反向引物Co5-153-BIP：AAGCGGACACAATCTTGCTAATAAGAAGTTGAATGTCTTCACC

环引物Co5-153-LoopF：AGTGGTCCATTAGTAGCTATGT

环引物Co5-153-LoopB：ACACTGTCTTCATGTTGTCG

实施例2 新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术方法的建立

采用实施例1确定的引物组合，对新型冠状病毒阳性质粒进行恒温快速核酸扩增技术。

在反应管底部加入20 µL ddH₂O，加入20 µL OG反应试剂，用枪头轻轻吹打一次，混合均匀。再向反应管中加入20μL的样品浸泡液（咽拭子浸泡液样品），混匀，最后加入10µLOG染料（购自哈尔滨新海基因检测有限公司）。

所述OG反应试剂的配制方法如下：用650μl反应缓冲液溶解50mg OG冻干反应试剂，得到OG反应试剂。

其中，反应缓冲液的组成如下：

Tris-HCl 20mM，pH8.8

MgSO₄ 6mM

Trion X-100 0.1%

OG冻干反应试剂的组成如下：

Bst 4.0 DNA聚合酶 0.4U/μl

dNTPs 0.2μM

海藻糖 10%

引物F3 4μM

引物B3 4μM

引物FIP 32μM

引物BIP 32μM

环引物LoopF 16μM

环引物LoopB 16μM

实施例3 灵敏度实验

将新型冠状病毒阳性质粒进行10倍比稀释，稀释度为10^-1到10^-7七个稀释度，按照实施例2所建立的方法进行恒温快速核酸扩增技术，以确定本发明所建立的恒温快速核酸扩增检测技术的灵敏度。

灵敏度分析结果表明，以GenBank公布的新型冠状病毒（2019-nCoV）（GenBank No:NC 045512.2）序列为模板，采用T7P引物（5’- AAGCTTCTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’）和pJET-R引物（5’- AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG -3’）扩增含有病毒核酸序列的质粒，将扩增产物（图1）插入pJET质粒的多克隆位点上，构建得到2019 nCoV-pJET标准质粒为检测模板。

PCR扩增体系：5×G5 PCR Mix 10 μl，10μM T7P 1 μl，10μM pJET-R 1 μl，含有病毒核酸序列的质粒10 ng，ddH₂O补齐至50 μl。

PCR扩增条件：95℃ 1min；95℃ 10s，58℃ 10s，72℃ 10s，30个循环；72℃ 2min。

利用新型冠状病毒恒温快速核酸扩增检测技术可将浓度为5拷贝/μl的标准质粒有效检出（图2），反应时间仅为30 min。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 新型冠状病毒可视化恒温快速检测试剂盒

<130> KHP201110471.7YS

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacatggagg aggtgttg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagtagaac ttcgtgctg 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacacaact accacccact tttgccatgc aagttgaatc 40

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcggacac aatcttgcta ataagaagtt gaatgtcttc acc 43

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtggtccat tagtagctat gt 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acactgtctt catgttgtcg 20

<210> 7

<211> 240

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(Coronavirus)

<400> 7

aacatggagg aggtgttgca ggagccttaa ataaggctac taacaatgcc atgcaagttg 60

aatctgatga ttacatagct actaatggac cacttaaagt gggtggtagt tgtgttttaa 120

gcggacacaa tcttgctaaa cactgtcttc atgttgtcgg cccaaatgtt aacaaaggtg 180

aagacattca acttcttaag agtgcttatg aaaattttaa tcagcacgaa gttctacttg 240

Claims

1.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括如SEQ ID NO:1-2所示的外侧正向引物F3和外侧反向引物B3，以及如SEQ ID NO:3-4所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。

2.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物组，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物以及如SEQ ID NO:5-6所示的环引物LoopF和LoopB。

3.含有权利要求1所述LAMP引物或权利要求2所述引物组的检测试剂或试剂盒。

4.新型冠状病毒2019-nCoV可视化恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述引物组，还包含Bst DNA聚合酶、dNTPs、海藻糖、OG染料、Tris HCl，TrionX-100，含Mg²⁺的反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

5.权利要求1所述LAMP引物或权利要求2所述引物组在制备用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂或试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒为用于LAMP法的试剂或试剂盒。

7.非诊断目的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2）扩增结果判定：若反应体系由橙色变为绿色，表明待测样品中含有新型冠状病毒2019-nCoV；

步骤1）中所述反应缓冲液的组成如下：

Tris-HCl 20mM，pH8.8

MgSO₄ 6mM

Trion X-100 0.1%

所述OG冻干反应试剂的组成如下：

Bst 4.0 DNA聚合酶 0.4U/μl

dNTPs 0.2μM

海藻糖 10%

引物F3 4μM

引物B3 4μM

引物FIP 32μM

引物BIP 32μM

环引物LoopF 16μM

环引物LoopB 16μM

其中，引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、环引物LoopF和环引物LoopB的序列分别如SEQ ID NO:1-6所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1）进行LAMP扩增反应采用的最佳反应条件为：60℃ 30分钟。