CN111549176B - 用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS‑CoV‑2的LAMP引物组及试剂盒。该引物组为用于检测SARS‑CoV‑2的LAMP引物组，灵敏度高，特异性好，对实验操作环境要求低，检测成本低廉，可应用于现场的快速检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。
现行主流的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)核酸检测方法为荧光定量PCR法，需要依赖于较为复杂的检测流程和相对复杂高价的仪器，同时对于检测环境的要求很高，目前需要在疾控中心等地集中检测，容易面临检测试剂有限、检测仪器和实验人员均超负荷运转等问题，无法广泛普及至广大基层医院、防控现场和家庭。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组。
所述引物组选自i)～vi)中的任一组或多组，每组均包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对：
i)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：7～10所示；
ii)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：11～14所示；
iii)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：15～18所示；
iv)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：19～22所示；
v)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：25～28所示；
vi)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：31～34所示。
本发明的目的之二在于提供一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的LAMP引物组。
本发明的目的之三在于提供一种如上所述的LAMP引物组、或如上所述的试剂盒在检测SARS-CoV-2中的非诊断用途。
本发明的有益效果：
1.选取新型冠状病毒的N基因或ORF1ab基因作为检测的目标基因，能够保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，对于新型冠状病毒疫情防控具有重要的意义。
2.采用LAMP技术预扩增，操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，灵敏度高，特异性好，仅能特异性扩增新型冠状病毒的基因组序列，且引物设计合理，避免了引物二聚体的形成，保证反应的顺利进行。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SARS-CoV-2的N基因第一区序列种内保守性比对结果；
图2为SARS-CoV-2的N基因第二区序列种内保守性比对结果；
图3 SARS-CoV-2的ORF1ab基因种内保守性比对结果；
图4为SARS-CoV-2的N基因第一区域与其它冠状病毒特异性比对结果；
图5为SARS-CoV-2的N基因第二区域与其它冠状病毒特异性比对结果；
图6为SARS-CoV-2的ORF1ab基因与其它冠状病毒特异性比对结果；
图7为N基因第一区域的引物筛选结果；
图8为N基因第二区域的引物筛选结果；
图9为ORF1ab基因的引物筛选结果；
图10为本发明实施例1中引物组1～6的LAMP扩增产物琼脂凝胶成像电泳图；
图11为本发明实施例3中CRISPR/Cas12a检测体系的有效性验证；
图12为本发明实施例4中CRISPR-侧向层析法检测结果的判读标准示意图；
图13为本发明实施例4中新型冠状病毒快速检测试剂(CRISPR-侧向层析法)有效性验证结果；
图14为本发明实施例5中N基因的CRISPR-荧光法灵敏度检测结果；
图15为本发明实施例5中ORF1ab基因的CRISPR-荧光法灵敏度检测结果；
图16为本发明实施例5中N基因的CRISPR-侧向层析法灵敏度检测结果；
图17为本发明实施例5中ORF1ab基因的CRISPR-侧向层析法灵敏度检测结果；
图18为本发明实施例6中CRISPR-侧向层析法特异性检测结果(N基因)；
图19为本发明实施例6中CRISPR-侧向层析法特异性检测结果(ORF1ab基因)。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
如本文所用，术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH 7～pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。
在一些实施方案中，引物包含不与目标核酸杂交的另外的序列。术语“引物”包括化学修饰的引物、荧光修饰的引物、功能引物(融合引物)、序列特异性引物、随机引物、具有特异性和随机序列的引物、及DNA和RNA引物。
如本文所用，术语“gRNA”是指向导RNA，其引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA。
如本文所用，术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型(type V-A)的酶。
如本文所用，术语“Cas12b”，“C2c1”可互换使用，是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-B型(type V-B)的酶。
如本文所用，术语“LAMP”是环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification)，是一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。
如本文所用，“靶序列”是靶标核酸中的碱基序列，并且可以指双链靶标的有义链和/或反义链，并且除非上下文另有规定，否则还涵盖与初始靶标核酸的以扩增的拷贝数再生的或复制的延伸产物或扩增产物相同的碱基序列。
本发明的第一方面在于提供一种用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组。
本发明的引物组由4类引物组成，即FIP，F3，BIP和B3。这些引物组对应于目标核酸序列的6个区域。具体地说，确定在目标碱基序列上从3'端到5端依次排列着F3c、F2c、Flc、B1、B2和B3区域。其后，产生与6个区域有关的4种引物，即FP、F3、BIP和B3。在这里，与F3c、F2c和Flc区互补的区域分别是B3、F2和F1。另外，与B1、B2和B3互补的区域分别是B1c、B2c和B3c。
FIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3端有与靶序列的F2c区互补的F2区并且在5端有与靶基因的F1c区相同的序列。如果需要，可在FP引物的Flc和F2之间的部分引入限制性酶切位点。
F3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因F3c区互补的F3区。
BIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3'端有与靶序列B2c区互补的B2区并且在5端有与靶基因Blc区相同的序列。如果需要，可在BIP引物的B1c和B2之间的部分引入限制性酶切位点。
B3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因B3c区互的B3区。
具体的，所述引物组选自i)～vi)中的任一组或多组，每组均包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对：
i)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：7～10所示；
ii)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：11～14所示；
iii)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：15～18所示；
iv)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：19～22所示；
v)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：25～28所示；
vi)F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：31～34所示。
使用本发明引物组时，可加入一或两类环状引物(LF引物或LB引物)以便加速核酸扩增反应。设计这样的环状引物以使其退火至F1和F2之间的区域或B1和B2之间的区域，然后加入到LAMP反应系统。这样，这些引物与在核酸扩增过程中未使用的环状部分结合，以致利用所有的环状部分作为起点促进核酸反应，从而加速核酸扩增反应。
在一些优选的实施方式中，其中第iv)组中还包含由至少一个来自SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中的序列表示的多核苷酸组成的引物，作为环引物。
在一些优选的实施方式中，其中第v)组中还包含由至少一个来自SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30中的序列表示的多核苷酸组成的引物，作为环引物。
在一些优选的实施方式中，其中第vi)组中还包含由至少一个来自SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中的序列表示的多核苷酸组成的引物，作为环引物。
根据本发明的第二方面，本发明还涉及一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的LAMP引物组。
在一些实施方式中，其还包括LAMP扩增试剂和/或CRISPR检测试剂。
在一些实施方式中，所述LAMP扩增试剂包含DNA聚合酶、dNTP、用于LAMP的反应缓冲液、样品预处理试剂、阳性对照和水中的至少一种。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
在一些实施方式中，所述样品预处理试剂中包含提取DNA所用的试剂，这样的试剂进一步优选为可用于酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法提取的试剂。
其中：
酚氯仿法通常是指通过酚氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。
NaOH法一般是强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放DNA，NaOH不破坏DNA一级结构。
树脂提取法常用Chelex100法，通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子，使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。
盐析法通常是将细胞破碎并离心后，用约6M的饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉淀，用TE溶解。
十六烷基三甲基溴化胺法通常是通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与DNA形成复合物，分离DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。
硅胶膜吸附法通常指通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA，并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。
FTA卡法通常指通过FTA卡裂解细胞释放DNA，从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。
硅珠法通常是指在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。
磁珠法通常是指在胍盐存在条件下，通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠，特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。
阳性对照通常以质粒的形式存在，其中含有所述LAMP引物组所扩增的靶核酸，特别优选的靶核酸为SEQ ID NO：1～3的至少一种所示。
在一些实施方式中，所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。
在一些实施方式中，所述扩增指示剂选自SYBR Green I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶(PI)、黄连素(berberine)、钙黄绿素(Calcein)和羟基萘酚蓝中的至少一种。
因为产物是双链DNA，也可以通过颜色变化直接观察，即在反应产物中加入SYBRGreen I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶等双链DNA荧光显色试剂或者黄连素，在荧光灯下观察颜色变化，如Sybr-Green、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、阳性为绿色荧光，阴性无绿色荧光。而PI阳性为红色荧光，阴性无红色荧光。黄连素在荧光下阳性为黄色荧光，而阴性无黄色荧光；
或者在反应体系中加入适当比例例如20mM～30mM钙黄绿素和0.3mM～0.7mMMnCl2，在反应过程中和反应后观察颜色或荧光变化，可见光下阴性为橙色，阳性为绿色，在荧光灯下阴性无绿色荧光，阳性为绿色荧光。钙黄绿素和MnCl2也可在反应结束后加入产物中观察颜色或荧光变化。
本发明所提供的试剂盒还包含CRISPR检测体系，进一步的，所述CRISPR检测体系包含gRNA、Cas12a核酸酶和/或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶、单链DNA探针和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种。
在一些实施方式中，所述gRNA包括a)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b)与靶核酸结合的特异性核酸片段。
利用CRISPR/Cas技术实现新型冠状病毒病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10-18mol/L)，实现靶标单分子检测；同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异。通过结合CRISPR/Cas检测技术与LAMP技术，可以实现新型冠状病毒的快速检测，有效解决了LAMP技术假阳性高的问题，同时由于CRISPR/Cas体系稳定性强，配合小型荧光仪或者胶体金侧向层析技术等显示手段，对实验操作环境要求低，检测成本低廉，可应用于现场的快速检测，具有广阔的应用前景。
在本发明中，所述特异性核酸片段可以包括SEQ ID NO：4～6中至少一种所示的核酸片段，或者与SEQ ID NO：4～6所示核酸片段实质上相同的核酸片段。
“实质上相同的核酸片段”是指在严格条件下能够与SEQ ID NO：4～6所对应的靶序列杂交的核酸片段。这样的核酸片段可以相较于SEQ ID NO：4～6替换、增加或减少1、2、3或更多个核酸碱基或碱基类似物【例如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、Q核苷等】，或者是部分碱基具有某些修饰(例如甲基化修饰，通常这种修饰对gRNA与靶核酸的杂交是无关紧要的)，长度优选控制在18bp～24bp的核酸片段。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于65℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。
通常一条Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段只与一条与靶核酸结合的特异性核酸片段连接。
在一些实施方式中，其还包含Cas12a核酸酶和/或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶、单链DNA探针和用于CRISPR检测体系的缓冲液中的至少一种。
本发明提供了基于Cas12a、Cas12b等酶在核酸检测中的应用。以下以Cas12a为例进行描述。Cas12a具有trans切割(反式切割)的活力，即一旦靶标DNA、crRNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时，会切割体系中其他的单链DNA(旁路单链DNA)。通过检测单链DNA是否被切割即可判断反应体系中是否含有靶核酸。根据这一原理设计了特异性核酸检测方法。
在一些实施方式中，所述的Cas12a核酸酶选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中的至少一种。
当所述Cas核酸酶为Cas12a核酸酶时，优选的所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：37所示。
在一些实施方式中，所述具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas核酸酶为Cas12b核酸酶。
在一些实施方式中，所述Cas12b核酸酶选自AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b和AcCas12b中的至少一种。
在一些实施方式中，所述单链DNA探针的5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。
在一些实施方式中，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种。
在一些实施方式中，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。
在一些实施方式中，所述单链DNA探针的两端分别标记有不同的标记物，分别为第一标记物和第二标记物；
在一些实施方式中，所述单链DNA探针上还标记有与所述标记物不同的信号物质，且所述信号物质上还标记有所述第二标记物的抗体，如此，当所述单链DNA探针被CRISPR检测体系切割时，所述信号物质与所述第二标记物位于同一核酸片段；
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含试剂条，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述检测区固定包被有针对所述第一标记物的第一抗标记物；
所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的抗体的二抗；
所述第一标记物与所述第一抗标记物能够形成标记物-抗标记物复合物，且所述第一抗标记物与所述第二标记物的抗体不同。
在一些实施方式中，所述标记物-抗标记物复合物中标记物/抗标记物的组合选自生物素或其衍生物/链霉亲和素，生物素或其衍生物/亲和素，生物素或其衍生物/中性抗生物素蛋白，半抗原/抗体，抗原/抗体，受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素和多核苷酸/互补的多核苷酸。
其中生物素的衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素或脱硫生物素中的任一种。
其中抗原和半抗原可以是多肽，也可以是蛋白或蛋白亚基，这样的蛋白或蛋白亚基本身也可以是抗体或抗体片段。
“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。
反应膜通常为微孔滤膜，例如NC膜。
本发明优选生物素/生物素集合的蛋白家族，以及地高辛/地高辛配基。
生物素结合的蛋白家族包括上述的链霉亲和素(streptavidin)、亲和素(avidin)和中性抗生物素蛋白(neutravidin)，每个蛋白都能够以高度的亲和力和特异性结合四个生物素分子。其中最常使用的是链霉亲和素，它未经糖基化且具有很低的非特异性结合水平。亲和素则是一种高度阳离子化的糖蛋白，等电点在10.5左右，它的正电荷残基和低聚糖成份能够介导非特异性结合，从而在某些应用中导致本底过高的问题。中性抗生物素蛋白经过去糖基化处理和降低等电势点，从而减少了其背景着色。
地高辛配基可以为抗体。
在一些实施方式中，信号物质指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。信号物质包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。信号物质可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。信号物质可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。信号物质可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)或者纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
在一些实施方式中，所述标记是荧光团。
在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。
在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。
在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。
在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazole orange,YO)系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。
在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
作为优选，信号物质为胶体金。
根据本发明的第三方面，本发明还涉及如上所述的LAMP引物组、或如上所述的试剂盒在检测SARS-CoV-2中的用途。
这样的用途可以是诊断或非诊断目的。
这样的用途可以用于诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
检测SARS-CoV-2所用的样本优选为受试者的上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本、抗凝血和血清标本等。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本(尤其是下呼吸道标本)和发病7天内急性期血清以及发病后第3～4周的恢复期血清。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。
实施例1新型冠状病毒核酸检测靶点扩增方法建立
在本发明中，我们通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)查找新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的全基因序列，使用Clone manager软件和BLAST进行同源性比对和序列分析，从中选择在本病毒的种内保守、种间变异的序列做为靶标区域。经过对多种冠状病毒的全基因组序列比对和同源性分析后，最终选择保守的N基因和ORF1ab基因作为靶标基因，这2个基因的三个靶标区域种内同源性和种间特异性比对结果见图1～图6。最终，以这两种靶标基因进行LAMP引物和gRNA设计。
基于CRISPR/Cas12a系统，在引物设计时，扩增片段应包含5’-TTTN-3’序列，且5’-TTTN-3’序列后需至少包含20bp碱基。本实施例采用LAMP扩增技术方案进行引物设计，分别在N基因设计了两个区域的引物组，N基因第一区域共6组引物，N基因第二区域共7组引物，ORF1ab基因共8组引物。将这所有21组引物进行恒温扩增和CRISPR/Cas12a系统检测，从而筛选出引物。筛选结果见图7～图10所示。N基因第一区域筛选出3组引物，第二区域筛选出2组引物，而ORF1ab基因筛选出1组引物。
本实施例经过序列比对和实验验证，最终筛选出的引物序列如下所示。实验中所用的靶标序列质粒和引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。
N基因第一区域引物序列(SEQ ID NO：1)：
引物组i)：
Cov-F3-N1:TAGTCGCAACAGTTCAAGAA(SEQ ID NO：7)
Cov-B3-N1:AGCAGATTTCTTAGTGACAG(SEQ ID NO：8)
Cov-FIP-N1:GCAAGAGCAGCATCACCGCCCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAA(SEQ ID NO：9)
Cov-BIP-N1:CAGCTTGAGAGCAAAATGTCGTTGTTGTTGGCCTTTAC(SEQ ID NO：10)
引物组ii)：
Cov-F3-N2:CAGAGGCGGCAGTCAAGCCTC(SEQ ID NO：11)
Cov-B3-N2:GTATGCTTTAGTGGCAGTAC(SEQ ID NO：12)
Cov-FIP-N2:CATTGCCAGCCATTCTAGCAGGTAGTCGCAACAGTTCAAGAA(SEQ ID NO：13)
Cov-BIP-N2:GTCTGGTAAAGGCCAACAACTCTTAGAAGCCTCAGCAGCAG(SEQ ID NO：14)
引物组iii)：
Cov-F3-N3:GGCTTCTACGCAGAAGGGA(SEQ ID NO：15)
Cov-B3-N3:GTGACAGTTTGGCCTTGTTG(SEQ ID NO：16)
Cov-FIP-N3:CCTACTGCTGCCTGGAGTTGAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATC(SEQ ID NO：17)
Cov-BIP-N3:GCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGTTGGCCTTTACCAGACA(SEQ ID NO：18)
N基因第二区域引物序列(SEQ ID NO：2)：
引物组iv)：
Cov-F3-N4：AGCATACAATGTAACACA(SEQ ID NO：19)
Cov-B3-N4：ATTTGGATCTTTGTCATCCAA(SEQ ID NO：20)
Cov-FIP-N4：TGCGGCCAATGTTTGTAATCAGAGGAAATTTTGGGGACCAG(SEQ ID NO：21)
Cov-BIP-N4：TGTCGCGCATTGGCATGGAAGCTTTGATGGCACCTGTGTAG(SEQ ID NO：22)
Cov-LF-N4：TTCCTTGTCTGATTAGTTC(SEQ ID NO：23)
Cov-LB-N4：CCTTCGGGAACGTGGTTG(SEQ ID NO：24)
引物组v)：
Cov-F3-N5：CAGAACAAACCCAAGGAAAT(SEQ ID NO：25)
Cov-B3-N5：TCTTTGTCATCCAATTTGATGG(SEQ ID NO：26)
Cov-FIP-N5：ATTGTGCAATTTGCGGCCAAGGGACCAGGAACTAATCAGA(SEQ ID NO：27)
Cov-BIP-N5：CGCTTCAGCGTTCTTCGGAAATGGAAGTCACACCTTCG(SEQ ID NO：28)
Cov-LF-N5：GCCAATGTTTGTAATCAGTTC(SEQ ID NO：29)
Cov-LB-N5：ACCTTCGGGAACGTGGTTGA(SEQ ID NO：30)
ORF1ab基因引物序列(SEQ ID NO：3)：
引物组vi)：
Cov-F3-O1：TACCCTCCAGATGAGGATGAAG(SEQ ID NO：31)
Cov-B3-O1：AATAGTCTGAACAACTGGTGT(SEQ ID NO：32)
Cov-FIP-O1：AGAGCAGCAGAAGTGGCACAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAG(SEQ ID NO：33)
Cov-BIP-O1：ACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAACTGATTGTCCTCACTGCC(SEQ ID NO：34)
Cov-LF-O1：CTCATATTGAGTTGATGGCTCA(SEQ ID NO：35)
Cov-LB-O1：AGTCAACAAACTGTTGGTCAAC(SEQ ID NO：36)
本实施例中分别使用含有N基因、ORF1ab基因靶序列的质粒进行LAMP扩增，60℃反应30分钟。在每组实验中以无靶核酸的样本为阴性对照(NC)，其它条件不变。
具体反应体系如下：
实验结果如图10所示：引物组1～6的阳性对照(PC)和阴性对照(NC)均能正常反应。由此可见，这6套新型冠状病毒的LAMP引物均能有效扩增。
实施例2新型冠状病毒CRISPR/Cas12a检测的gRNA设计及有效性验证
CRISPR/Cas12a系统在gRNA设计时，以20bp碱基为单位，在保守的N基因和ORF1ab基因序列中搜寻含有“TTTN”的序列并导出相关序列做为gRNA靶向序列的备选数据库。通过评估上述备选gRNA序列在不同病毒株间的特异性，备选gRNA序列的GC含量，碱基均一性，序列保守性等系列参数，最终筛选出最优的gRNA序列。可通过http://www.rgenome.net/cas-designer/在线软件辅助设计。
1、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达
采用源自Lachnospiraceae bacterium的Cas12a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas12a蛋白基因克隆入带6-His组氨酸标签的pET28a质粒，方便蛋白纯化表达。Cas12a蛋白重组表达载体转化，表达菌采用BL21 star(DE3)。
具体蛋白表达条件为：在培养菌液OD600＝0.6时加入0.5mM的IPTG培养4小时。收集菌体进行蛋白纯化。纯化条件为：将菌体重悬于裂解液(50mM Tris,pH8.0，300mM NaCl，5％甘油，20mM咪唑)，进行超声破碎(70％振幅，2s On/4s Off，3分钟，Sonics 750w超声仪)，离心分离上清液，以镍柱纯化，以含250mM咪唑的裂解液洗脱，浓缩洗脱组分，以Superdex200，Tricorn 10/300凝胶色谱柱进行纯化。SDS-PAGE检测以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas12a蛋白，放-80℃保存。
2、制备gRNA
基于实施例1设计的gRNA序列，设计含T7启动子的引物进行扩增双链DNA。参照T7RNA Polymerase(Thermo)试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再使用RNeasy mini kit(Qiagen)，获得纯化的gRNAs。
3、CRISPR/Cas12a检测体系的有效性验证
检测体系包括：取2ng靶标基因的质粒模板，45nM纯化的LbCas12a，20nM制备的gRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QC System,Thermo Scientific)，及检测缓冲液(20mM Tris,60mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.3)。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，37℃反应30min，取终末荧光值进行结果判读。
分析CRISPR/Cas12a反应荧光数据：为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光(无靶核苷酸或无gRNA的条件下)会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。取终末荧光值进行结果判读，在去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为SARS-CoV-2阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为SARS-CoV-2阴性。
检测结果如表1所示，结果表明：以所述6组LAMP引物的扩增产物为模板，所述Cas12a蛋白和所设计的对应gRNA为原料在CRISPR反应下，可识别靶标位点并切割荧光探针产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别病毒靶标序列，可用于新型冠状病毒的定性检测。
通过大量研究实验，最终筛选出针对两个靶标基因的三条gRNA，在CRISPR/Cas12a系统中对新型冠状病毒核酸的靶标具有良好的检测效果(表1)。gRNA序列如下所示：
N基因第一区域(SEQ ID NO：1)gRNA序列A：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO：37)-CUGCUGCUUGACAGAUUGAA(SEQ ID NO：4)
N基因第二区域(SEQ ID NO：2)gRNA序列B：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO：37)-CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQ ID NO：5)
ORF1ab基因(SEQ ID NO：3)gRNA序列C：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO：37)-CCUUGGUAAUCAUCUUCAGU(SEQ ID NO：6)
表1.新型冠状病毒的gRNA有效性验证剪切荧光值汇总
实施例3基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒(CRISPR-荧光法)快速检测技术
本实施例按照实施例2的方法，表达纯化Cas12a蛋白，制备靶标DNA和特异性gRNA，来验证新型冠状病毒快速检测试剂(CRISPR-荧光法)检测体系的有效性。
检测过程包括两个反应：
(1)第一个反应：恒温扩增：靶标DNA可经过重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)等方式进行扩增。本实施例中使用LAMP技术进行恒温扩增，按实施例1中的方法进行LAMP配制，使用的引物和gRNA为：本次实验使用的模板是新型冠状病毒毒株的核酸；
(2)第二个反应：CRISPR反应-荧光法：取2μl LAMP反应产物，45nM纯化的LbCas12a，20nM制备的gRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QC System,Thermo Scientific)，及检测缓冲液(20mM Tris,60mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.3)。反应体系置于37℃反应20min，取终末荧光值进行结果判读。
结果如图11所示，结果表明：以所述6组LAMP引物的扩增产物为模板，所述Cas12a蛋白和所设计的对应gRNA为原料在CRISPR反应下，可识别靶标位点并切割荧光探针产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别病毒靶标序列，可用于新型冠状病毒的定性检测。
实施例4基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒(CRISPR-侧向层析法)快速检测技术
CRISPR/Cas12a检测体系中Cas12a蛋白在切割靶标dsDNA的同时通过附属切割的活性对非特异单链DNA探针进行切割，运用这一特性，我们把CRISPR/Cas12a检测体系中的单链DNA探针进行特殊标记，然后通过与之配套的胶体金试纸条，在不同的划线区域固定不同的抗体进行信号捕获，从而实现通过胶体金侧向层析的方法对CRISPR/Cas12a检测体系进行结果判读。通过搭建胶体金试纸条技术平台，筛选相应的标记蛋白及工艺优化，完成新型冠状病毒CRISPR-侧向层析法检测体系的构建。
本实施例按照实施例2的方法，表达纯化Cas12a蛋白，制备靶标DNA和特异性gRNA，来验证新型冠状病毒快速检测试剂(CRISPR-侧向层析法)检测体系的有效性。
检测过程包括两个反应：
(1)第一个反应：恒温扩增：靶标DNA可经过重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、PCR扩增、NASBA等温扩增、环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)等方式进行扩增。本实施例中以LAMP技术来扩增，按实施例1中的方法LAMP进行靶标序列扩增，本次实验使用的模板是新型冠状病毒毒株的核酸；
(2)第二个反应：CRISPR反应-侧向层析法：取2μl LAMP反应产物，45nM纯化的LbCas12a，20nM制备的gRNA，100nM非特异单链DNA探针(探针5端标记生物素，3端标记地高辛)，及检测缓冲液(20mM Tris,60mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.3)。反应体系置于37℃反应30min，然后取出胶体金检测试剂条，将红色印记端朝下，插入上一步骤的CRISPR反应试剂管中，层析反应2分钟，然后根据试纸条的条带变化进行结果判读。
CRISPR-侧向层析法检测的结果判读标准如图12所示：
在本实施例中，单链DNA探针5'端标记地高辛，3'端标记生物素，且胶体金颗粒上标记有地高辛单抗。质控线C上固定包被抗地高辛抗体的二抗，检测线T上固定包被有链霉亲和素。
当反应体系中有靶序列时，单链DNA探针被切割完全，生物素被切割成游离状态，检测线T不会显色，此时质控线C显色而检测线T不显色，指示SARS-CoV-2为阳性；
当反应体系中没有靶序列时，单链DNA探针不被切割，此时质控线C和检测线T两条线均显色，指示SARS-CoV-2为阴性；
若质控线C不显色，则提示检测失败或试纸已失效，结果无效；
若质控线C显色而检测线T信号微弱，建议重复检测；延长CRISPR剪切时间至20分钟后观察结果，若质控线C显色，而检测线T信号依然微弱，则判定为SARS-CoV-2阴性；若质控线C显色，而检测线T信号无显色，则判定为SARS-CoV-2阳性。
本实施检测结果如图13所示，所述Cas12a蛋白和所设计的gRNA可识别靶标位点并切割体系中的胶体金探针，通过胶体金检测试纸条侧向层析，结果显示质控线C显色，而检测线T无色，判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测阳性。同时，6组引物的阴性对照NC质控线C和检测线T均显色。由此可见，设计的gRNA序列可特异性识别病毒靶标序列，可用于新型冠状病毒的定性检测。
实施例5基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒方法灵敏度测试
为了测试LAMP+Cas12a检测体系的灵敏度，我们采用了培养的新型冠状病毒毒株的核酸为模板，并计算稀释为5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL、5copies/μL和1copies/μL共5个梯度作为灵敏度检测的模板。
方法(1)：CRISPR-荧光法
具体操作如下：将实施例2中步骤2制备gRNA(SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6)，然后按实施例2中步骤3操作方法，以N基因(SEQ ID NO：2)和ORF1ab基因(SEQ ID NO：3)质粒浓度分别为5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL、5copies/μL、1copies/μL作为模板，进行LAMP反应。最后，按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，来分析LAMP+Cas12a检测体系的灵敏度。在实验中灭菌水做空白对照(B)，无靶核酸的样本为阴性对照(N)，其它条件不变。
结果分析时去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性；否则，为阴性。
结果如图14和图15所示，在5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL和5copies/μL质粒浓度中，N基因和ORF1ab基因的LAMP产物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)，在CRISPR/Cas12a检测体系(荧光法)中均有特异性荧光产生，结果为阳性；而1copies/μL、空白对照B和阴性对照N的LAMP产物，CRISPR/Cas12a检测体系检测结果均无荧光值产生，为阴性。
方法(2)：CRISPR-侧向层析法
具体操作如下：以N基因(SEQ ID NO：2)和ORF1ab基因(SEQ ID NO：3)质粒浓度分别为5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL、5copies/μL和1copies/μL作为模板，进行LAMP反应。然后，按照实施例3中的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，来分析LAMP+Cas12a检测体系(侧向层析法)的灵敏度。在实验中灭菌水做空白对照(B)，无靶核酸的样本为阴性对照(N)，其它条件不变。CRISPR-侧向层析法检测的结果判读标准按实施例3的判读标准进行判读。
结果如图16和图17所示，在5000copies/μL、500copies/μL、50copies/μL和5copies/μL质粒浓度中，N基因和ORF1ab基因的LAMP产物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)，通过CRISPR/Cas12a反应和胶体金检测试纸条侧向层析，结果显示均为质控线C显色，而检测线T无色，即判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测阳性；而1copies/μL质粒浓度、阴性对照N和空白对照B的质控线C和检测线T均显色，即判断为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测阴性。
综上，表明本发明建立的新型冠状病毒多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的灵敏度，灵敏度为5copies/μL。
实施例6基于CRISPR/Cas12a系统构建新型冠状病毒方法特异性验证
新型冠状病毒感染引起的临床症状，可与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等已知病毒感染引起的症状相似，需要鉴别诊断。为验证基于CRISPR/Cas12a系统的新型冠状病毒检测方法的特异性，本实施例按照实施例1的方法，分别选出甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)阳性的8种临床样本，并按照实施例2步骤3的方法制备靶标DNA。
设置2组组合实验，即组合1(N基因)和组合2(ORF1ab基因)。具体为：取以上8种呼吸道常见的感染病原，按照实施例1中设计的引物组4(N基因)和引物组6(ORF1ab基因)，分别对含有N基因、ORF1ab基因的质粒进行LAMP反应。然后，将LAMP产物分别与新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的gRNA，进行CRISPR/Cas12a反应(包括CRISPR-荧光法检测和CRISPR-侧向层析法检测)，来验证gRNA序列的特异性。在实验中，以灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，以新型冠状病毒阳性样本制备的LAMP产物作为阳性对照。其它条件不变。
CRISPR-荧光法检测的判读标准按实施例2所述的标准进行判读，CRISPR-侧向层析法检测的判读标准按实施例3所述的标准进行判读。
CRISPR-荧光法检测的特异性检测结果如表2所示：gRNA(SEQ ID NO：5)与其对应的SEQ ID NO：2反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果均无荧光值产生，为阴性。gRNA(SEQ ID NO：6)与其对应的SEQ ID NO：3反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果均无荧光值产生，为阴性。
表2.CRISPR-荧光法特异性检测结果
CRISPR-侧向层析法检测的特异性检测结果如图18和图19所示：gRNA(SEQ ID NO：5)与其对应的SEQ ID NO：2反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果检测线T均显色，为阴性(图18)。gRNA(SEQ ID NO：6)与其对应的SEQ ID NO：3反应为阳性，与其非对应的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)等8种临床样本反应，检测结果检测线T均显色，为阴性(图19)。
综上，上述结果表明该发明设计的新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的gRNA具有良好的特异性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州再生医学与健康广东省实验室;广州普世利华科技有限公司
<120> 用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
gagccttgaa tacaccaaaa gatcacattg gcacccgcaa tcctgctaac aatgctgcaa 60
tcgtgctaca acttcctcaa ggaacaacat tgccaaaagg cttctacgca gaagggagca 120
gaggcggcag tcaagcctct tctcgttcct catcacgtag tcgcaacagt tcaagaaatt 180
caactccagg cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat ggctggcaat ggcggtgatg 240
ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct tgagagcaaa atgtctggta 300
aaggccaaca acaacaaggc caaactgtca ctaagaaatc tgctgctgag gcttctaaga 360
agcctcggca aaaacgtact gccactaaag catacaatgt aacacaagct ttcggcagac 420
gtggtccaga acaaacccaa ggaaattttg gggaccagga ac 462
<210> 2
<211> 526
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
tgtcactaag aaatctgctg ctgaggcttc taagaagcct cggcaaaaac gtactgccac 60
taaagcatac aatgtaacac aagctttcgg cagacgtggt ccagaacaaa cccaaggaaa 120
ttttggggac caggaactaa tcagacaagg aactgattac aaacattggc cgcaaattgc 180
acaatttgcc cccagcgctt cagcgttctt cggaatgtcg cgcattggca tggaagtcac 240
accttcggga acgtggttga cctacacagg tgccatcaaa ttggatgaca aagatccaaa 300
tttcaaagat caagtcattt tgctgaataa gcatattgac gcatacaaaa cattcccacc 360
aacagagcct aaaaaggaca aaaagaagaa ggctgatgaa actcaagcct taccgcagag 420
acagaagaaa cagcaaactg tgactcttct tcctgctgca gatttggatg atttctccaa 480
acaattgcaa caatccatga gcagtgctga ctcaactcag gcctaa 526
<210> 3
<211> 480
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 60
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 120
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 180
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 240
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 300
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 360
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 420
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 480
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 4
cugcugcuug acagauugaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 5
cccccagcgc uucagcguuc 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> artificial sequence
<400> 6
ccuugguaau caucuucagu 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
tagtcgcaac agttcaagaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
agcagatttc ttagtgacag 20
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
gcaagagcag catcaccgcc ctcctgctag aatggctggc aa 42
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
cagcttgaga gcaaaatgtc gttgttgttg gcctttac 38
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
cagaggcggc agtcaagcct c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
gtatgcttta gtggcagtac 20
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 13
cattgccagc cattctagca ggtagtcgca acagttcaag aa 42
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 14
gtctggtaaa ggccaacaac tcttagaagc ctcagcagca g 41
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 15
ggcttctacg cagaaggga 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 16
gtgacagttt ggccttgttg 20
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 17
cctactgctg cctggagttg aagcctcttc tcgttcctca tc 42
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 18
gcggtgatgc tgctcttgct ttgttggcct ttaccagaca 40
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 19
agcatacaat gtaacaca 18
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 20
atttggatct ttgtcatcca a 21
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 21
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<212> RNA
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Claims (4)
1.用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包含LAMP扩增试剂和CRISPR检测试剂；
所述LAMP扩增试剂包含LAMP引物组，所述LAMP引物包含F3和B3组成的外引物对、FIP和BIP组成的内引物对和环引物，其中，F3、B3、FIP、BIP依次如SEQ ID NO：31~34所示，环引物如SEQ ID NO：35~36所示；
所述CRISPR检测试剂包含gRNA；所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，所述与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO：37所示，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述特异性核酸片段为SEQ ID NO：6所示的核酸片段；
所述CRISPR检测试剂还包含Cas12a核酸酶、非特异性单链DNA探针和用于CRISPR检测体系的缓冲液；
所述非特异性单链DNA探针的两端分别标记有不同的标记物，分别为第一标记物和第二标记物；其中，第一标记物为3'端标记生物素，第二标记物为5'端标记地高辛；
所述非特异性单链DNA探针上还标记有与所述标记物不同的信号物质，且所述信号物质上还标记有所述第二标记物的抗体，因此当所述非特异性单链DNA探针被CRISPR检测体系切割时，所述信号物质与所述第二标记物位于同一核酸片段；其中所述信号物质为胶体金；
所述试剂盒还包含试剂条，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
其中：
所述检测区固定包被有针对所述第一标记物的抗体，其中，第一标记物的抗体为链霉亲和素；
所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的抗体的二抗，其中，二抗为抗地高辛的二抗。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述Cas12a核酸酶选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述LAMP扩增试剂还包含扩增指示剂、DNA聚合酶、dNTP、用于LAMP的反应缓冲液、样品预处理试剂、阳性对照和水。
4.权利要求1~3任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的检测SARS-CoV-2中的用途。
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