JP5811086B2

JP5811086B2 - クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法

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Publication number: JP5811086B2
Application number: JP2012506971A
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Inventors: 友一石川; 裕巳公文
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Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2015-11-11
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Description

本発明は、核酸の増幅およびその検出系を利用した、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）を検出及び／又は同定する方法に関するものである。

今日、性風俗の多様化や若者を中心とする日本人の性行動様式の変化にともない性感染症としてのクラミジア感染症の増加は著しい。

クラミジア（Chlamydia）は、真核細胞の偏性細胞内寄生細菌である。クラミジアは宿主細胞で生育増殖し、細胞の細胞質に封入体（inclusion）を形成し、宿主の臨床的症状の原因となる。例えば、性器クラミジア感染症の原因菌はクラミジア・トラコマティスであり、主に男性では尿道炎、女性では子宮頚管炎を発症する。

クラミジアの検出法としては、直接蛍光抗体染色（ＤＦＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）および酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等の、抗原を検出する方法が開発されている。また、標識物質で標識した、クラミジア・トラコマティスのリボソームRNAに相補的な１本鎖DNAを用いたプローブハイブリダイゼーションにより、クラミジア・トラコマティスを検出する方法（Gen-Probe Pace 2 Chlamydia test、非特許文献１）も開発されている。

さらに、核酸増幅技術を利用した、より高感度な検出方法も開発されている。

例えば、ドメイカら（非特許文献２）、ボーウェンズら（非特許文献３）および米国特許第5,232,829号明細書（特許文献１）は、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、PCR）と、それに続いて微量滴定プレートハイブリダイゼーションを行い、クラミジア・トラコマティスを検出する方法を報告している。

また、リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction、ＬＣＲ）と、それに続いて微粒子サンドイッチ免疫検定検出を行って、クラミジア・トラコマティスを検出する方法も報告されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。

更に、クラミジア・トラコマティスは、この菌に特異的な内在性プラスミドを複数コピー持つことが知られている（非特許文献７）。そして、この内在性プラスミドの特定の配列を標的とし、その一部配列を遺伝子増幅法により増幅し、増幅産物を検出することによりクラミジア・トラコマティスを検出する方法が、開発されている（特許文献２、特許文献３）。

ところで、クラミジア・トラコマティスには、免疫学的に決定された１８種類の血清型が存在することが知られている。そして、近年、上記したような従来のクラミジア・トラコマティスの検出法ではクラミジア・トラコマティスを検出できなかった事例が報告されている（非特許文献８）。すなわち、従来のクラミジア・トラコマティスの検出法では偽陰性の判定が生じる場合があることが判明し、問題になっている。

米国特許第５２３２８２９号明細書特許第２７１９２２５号公報特許第３１２７１３５号公報

Warren R., et al.,Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31, 1663-1666. Domeika M. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32, 2350-2352 Bauwens J. E. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31, 3013-3106 Chernesky Max A. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32, 2682-2685 Lee H. H. et al., Lancet, 1995, 345, 213-216 Bassiri M. et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33, 898-900 C. Hatt et al., Nucleic Acids Research, 1988, 16(9), p.4053-4067 Emerging Infectious Diseases Vol. 14, No. 9, September 2008

本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、偽陰性の判定が生じることのない、感度および特異性に優れかつ迅速なクラミジア・トラコマティスの検出方法およびそれに使用するプライマー及びプローブを提供することを課題とする。

本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。
（１）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー。
（３）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
（４）配列番号１０で表されるクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子中の、配列番号１で表される塩基配列を持つ塩基番号４１３３〜塩基番号４２７７の領域若しくは配列番号２で表される塩基配列を持つ塩基番号３２〜塩基番号１７６の領域、又はこれらの領域内の更に特定の領域を標的とし、試料中にこれらの領域の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドが存在するか否かを確認するために、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、当該反応の結果生じるものを検出することを特徴とする、クラミジア・トラコマティスの検出方法。
（５）配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして含んでなる、クラミジア・トラコマティス検出用試薬キット。

本発明者等は、現在までに決定されたクラミジア・トラコマティスとその他の生物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた。その結果、クラミジア・トラコマティスの検出に最適な核酸配列を得、そして更にこれらの配列をもとにクラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブを開発し、これらを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法を確立し、本発明を完成させるに至った。

本発明により、感度および特異性に優れかつ迅速なクラミジア・トラコマティスの検出方法が提供される。また、本発明が提供する検出用プライマーを用いた検出方法により、従来法では発生する虞のあった偽陰性を回避して、クラミジア・トラコマティスの検出を精度良く行うことが出来る。

実施例２で得られた、プライマーTcTI_Fw01及びプライマーTcTI_Rv01を用い、クラミジア・トラコマティス由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いたリアルタイムPCRで得られた増幅曲線である。実施例２で行ったリアルタイムPCRで得られた増幅曲線をもとに作成した、ゲノムのコピー数（ｘ軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。実施例３で得られた、プライマーTcTI_Fw02m及びプライマーTcTI_Rv02を用い、クラミジア・トラコマティス由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いたリアルタイムPCRで得られた増幅曲線である。実施例３で行ったリアルタイムPCRで得られた増幅曲線をもとに作成した、ゲノムのコピー数（ｘ軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。

本発明者等は、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）の内在性プラスミドとして、pLGV440と呼ばれるプラスミドに着目した。

クラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド（cryptic plasmid）pLGV440遺伝子の全塩基配列は、非特許文献７のFigure 2に記載されており、7498塩基の大きさで、本明細書では配列番号１０で表される塩基配列である。

本発明において、「クラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子」と記載した場合、上記したクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド（pLGV440）遺伝子の全塩基配列を指す場合と、該全塩基配列のうちの任意の塩基配列単位（領域）を指す場合がある。尚、「クラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド」を、以下単に「内在性プラスミド」という場合がある。

本発明者等は、内在性プラスミド（pLGV440）遺伝子から、特に２箇所の領域に注目した。すなわち、配列番号１０で表されるクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド（pLGV440）遺伝子の、塩基番号４１３３〜塩基番号４２７７の領域（配列番号１で表される塩基配列からなる）と、塩基番号３２〜塩基番号１７６の領域（配列番号２で表される塩基配列からなる）である。本発明者等は、配列番号１で表される塩基配列を「TcTI_Fw01Rv01」と命名し、配列番号２で表される塩基配列を「TcTI_Fw02Rv02」と命名した。

そして、この２箇所の領域の塩基配列を元に、クラミジア・トラコマティスの検出に利用できる本発明のオリゴヌクレオチドを設計した。

すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。」（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」と略記する場合がある。）である。

本発明に係る「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド」の具体例としては、配列表の、「配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド」が挙げられる。

本発明に係る「配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列」としては、例えば本発明の配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件又はハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。

ここでいう、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜70℃の温度の条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で洗浄する。」という条件である。

また、ここでいう「ハイストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「50%ホルムアミド中で42〜70℃で、好ましくは60〜70℃でハイブリダイゼーションを行い、その後0.2〜2×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中、25〜70℃で洗浄する。」という条件である。

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction, PCR）等の核酸増幅反応を用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法では、クラミジア・トラコマティスの遺伝子の特定領域の塩基配列を標的として設定し、その塩基配列を増幅するようなプライマーセットを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてPCRを行う。そして目的のプライマー伸長産物が得られた場合、試料中には標的の塩基配列を持つ核酸が存在する、すなわち、クラミジア・トラコマティスが、又はその遺伝子が存在すると判定できる。

本発明に係る配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列は、上記したクラミジア・トラコマティスの検出の際の標的と成りうるものである。

具体的に説明すると、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列を標的にしてＰＣＲを行う。そして、プライマー伸長産物が得られれば、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列を持つ核酸が試料中に存在する、すなわち試料中にはクラミジア・トラコマティス又はその遺伝子が存在すると判定できる。

尚、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列中の、更に特定の領域の配列を標的として設定してもよい。すなわち、例えば配列番号１で表される塩基配列中の、更に特定の領域の配列を標的として設定し、この配列を増幅させるプライマーセットを設計する。そして該プライマーセットを用いたＰＣＲでプライマー伸長産物が得られた場合、試料中には標的の塩基配列を持つ核酸が存在する、すなわち、クラミジア・トラコマティスが、又はその遺伝子が存在すると判定できるのである。

また、本発明のオリゴヌクレオチドは、クラミジア・トラコマティス検出用プライマー又はプローブ設計のために使用することも出来る。すなわち、本発明の配列番号１若しくは配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号１で表される塩基配列に対する相補配列、又は配列番号２若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列に基づいて、後述する常法に従ってプライマー又はプローブを設計すればよい。

本発明に係るクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとは、クラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。そのハイストリンジェントな条件及びストリンジェントな条件は、上記したとおりである。

尚、配列番号３、配列番号４及び配列番号８で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計されたものである。

配列番号５〜配列番号７、及び配列番号９で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計されたものである。

本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行なって得られた、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、一つ若しくは複数のヌクレオチドが欠失、挿入又は置換されたオリゴヌクレオチドであってもよい。一つ若しくは複数のヌクレオチドがイノシン（I）のような修飾ヌクレオチドであってもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドを得る方法としては、特に限定されないが、例えば自体公知の化学合成法により調製する方法、ベクター等を用いる遺伝子操作法によりオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを得る方法（クローン化法）等が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドのうち、15〜30塩基程度のオリゴヌクレオチドを得る場合には、容易・大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能なことから、化学合成法が、通常利用される。

例えば、ＤＮＡの合成に通常行われている、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製すれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。

また、オリゴヌクレオチドの合成を行う委託業者から購入してもよい。

本発明のプライマーは、クラミジア・トラコマティス検出用として用いられるもので、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー。」（以下、「本発明のプライマー」と記載する場合がある。）である。

すなわち、本発明のプライマーは、配列番号１０で表されるクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド（pLGV440）遺伝子の、塩基番号４１３３〜塩基番号４２７７の領域（配列番号１で表される塩基配列から成る）又は塩基番号３２〜塩基番号１７６（配列番号２で表される塩基配列から成る）の領域の塩基配列に基づいて設計されるものである。そして、これらのプライマーを用いた核酸増幅反応で、上記領域、又はこれらの領域内のさらに特定の領域を増幅させることができる。

更に本発明のプライマーは、上記した領域の塩基配列の相補配列を増幅させるのに用いることができる。

配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいてプライマーを設計する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、当該プライマーを使用する反応の種類［（ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーションなど］や反応条件［例えば解離温度（Ｔｍ値）など］を考慮して、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列の中から、適当な領域の適当な長さを選択することにより、プライマーを設計すればよい。

また、プライマー設計のために一般に用いられているソフトや、例えばプライマーデザイン用のWebツールPrimer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research.)等を用いてプライマーを設計してもよい。

また、本発明のプライマーは、好ましくはプライマー配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、更に好ましくは１８〜２５塩基の長さを有しているオリゴヌクレオチドである。

本発明のプライマーに用いられる、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド」（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドに関する記載で説明した通りである。また、本発明のプライマーに使用するオリゴヌクレオチドは、使用する条件、目的などに応じて、オリゴヌクレオチド中に一つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換が存在していてもよい。

本発明のプライマーの具体例としては、「配列番号３〜配列番号７のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号３〜配列番号７のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー」が挙げられる。

また、本発明のプライマーには、「配列番号３〜配列番号７のいずれかで表される塩基配列又は配列番号３〜配列番号７のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチドから選択されるフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せ」も含まれる。

尚、本発明の好ましいプライマーと、本発明で命名したその名称を、下記表１に示す。

本発明のプライマーを得る方法は、上記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。

また、本発明のプライマーは、標識物質で標識されていてもよい。

本発明のプライマーを標識する方法としては、この分野で通常行われているオリゴヌクレオチドの標識方法が挙げられ、標識物質毎に適宜方法を選択すればよい。

本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であればいずれも用いることができる。

例えば、放射性同位体としては³²P，³³P，³⁵S等が、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等が、蛍光物質としてはAlexa555，Alexa647（インビトロジェン社）、Cyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等が、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。

本発明のプライマーを放射性同位体で標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる5'−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた3'−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。

本発明のプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野に於ける常法である直接標識法が挙げられる。

本発明のプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野に於ける常法の標識手法によりプライマーに取り込ませる方法が挙げられる。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチド中に置換する方法（例えば、Nucleic Acids Res.,1986年, 第14巻, p.6115参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。例えば、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、そのデオキシウリジンを含有するオリゴヌクレオチドを合成し、次いでそのオリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法がある（特開昭60-50717号公報）。

本発明のプライマーを発光物質で標識する方法及びビオチンで標識する方法としては、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法が挙げられる。

本発明のプローブは、クラミジア・トラコマティス検出用として用いられるもので、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。」（以下、「本発明のプローブ」と記載する場合がある。）である。

また、本発明のプローブは、配列番号１０で表されるクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子の、本願の配列番号１に相当する塩基番号４１３３〜塩基番号４２７７の領域若しくは本願の配列番号２に相当する塩基番号３２〜塩基番号１７６の領域の塩基配列、又はこれらの領域内のさらに特定の領域の塩基配列とハイブリダイズすることができるものを含む。

更に本発明のプローブは、上記した領域の塩基配列の相補配列とハイブリダイズすることができるものを含む。

本発明のプローブは、ＰＣＲ(リアルタイムＰＣＲを含む)等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列に対する相補配列から、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して設計すればよい。但し、プローブに十分な特異性を持たせたいのならば、プローブ配列としての特異性を維持するために必要な塩基数を考慮して設計することが望ましい。

例えば、核酸増幅法（例えばTaqMan^TM法、Molecular Beacon法等）等に用いるプローブとしては、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基、更に好ましくは２０〜３０塩基の長さを有しているものが好ましい。

また、例えば核酸ハイブリダイゼーション法（例えばサザン・ハイブリダイゼーション等）等に用いるプローブとしては、１０〜７００塩基、好ましくは１００〜６００塩基、更に好ましくは１００〜５００塩基の長さを有しているものが好ましい。

本発明のプローブに用いられる、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド」（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載した通りである。

本発明のプローブの具体例としては、例えば上記した方法で配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計された、配列番号１〜配列番号９のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号１〜配列番号９のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。

好ましいプローブとしては、配列番号８若しくは配列番号９のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号８若しくは配列番号９のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。

本発明のプローブを得る方法は、上記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。

さらに、本発明のプローブは、標識物質で標識されていてもよい。

本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であればいずれも用いることができる。

本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる、標識物質の具体例及び標識方法としては、本発明のプライマーの標識方法の説明に記載した方法と同じ方法が挙げられる。

また、後述するリアルタイム検出法（例えばTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法等のリアルタイムＰＣＲ）による検出法に於いて用いられる標識プローブとしては、例えばリアルタイムＰＣＲ法において通常用いられている5'末端がレポーター蛍光物質で標識され、3'末端がクエンチャー色素で標識された本発明のプローブが挙げられる。
本発明に係るプローブの5'末端を標識するレポーター蛍光物質としては、カルボキシフルオレセイン（FAM^TM、Applera Corporation商品名）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)、Texas Red^TM（Molecular Probes社商品名）、Cy5、VIC等が挙げられる。

本発明に係るプローブの3'末端を標識するクエンチャー色素としては、例えばカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA^TM、Applera Corporation商品名）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（BHQ^TM、Biosearch Technologies Inc. Novato CA商品名），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質が挙げられる。

具体的な標識プローブとしては、例えば、配列番号８若しくは配列番号９のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号８若しくは配列番号９のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチドをレポーター蛍光物質とクエンチャー色素で標識した標識プローブが挙げられる。

後述するTaqMan^TMリアルタイム検出法による検出法においても、上記した標識プローブを用いることができる。

本発明のクラミジア・トラコマティスの検出方法における「検出」とは、クラミジア・トラコマティスの持つ内在性プラスミドの塩基配列中の一部を増幅・検出することにより、患者検体などの各種臨床材料中のクラミジア・トラコマティスを検出する場合や、単離、培養された菌体の菌種を判定する場合なども含まれる。また、本発明の検出法の用途としては、臨床分野における検出に限られず、研究室等における基礎実験での検出も含まれる。

本発明に係るクラミジア・トラコマティスの検出に用いられる検体（specimen）としては、例えば尿，尿道スワブ懸濁液、頚管スワブ懸濁液、口腔スワブ懸濁液等の各種臨床検体が挙げられる。これら検体は、検出の前に予め検体中に存在する菌の濃縮、分離や、菌体からの核酸の分離、濃縮などの操作を前処理として行ってもよい。その方法としては、酵素、界面活性剤、アルカリ、熱による処理などがある。

また、本発明における試料としては、上記の各種臨床材料の他、培養菌体や、これらより単離、精製された核酸なども含まれる。また、増幅された核酸でもよい。

上記試料からＤＮＡを抽出・精製するには、検体からのクラミジアＤＮＡ抽出に用いられる常法に従って行えばよい。

例えば、下記の方法で行えばよい。

まず、試料中のクラミジアの細胞壁を破壊する必要がある。その方法としては、例えば菌体を試料とする場合には、例えばSDS等の界面活性剤や、グアニジンチオシアネート（GTC）等の蛋白変性剤で菌体を処理してクラミジアの膜構造を破壊する方法、又は菌体をガラスビーズ等によって物理的に破砕する方法等が挙げられる。

クラミジアの細胞壁を破壊した後、この分野で一般的なＤＮＡの調製法［フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿法、Rapid and simple method for purification of nucleic acids、J. Clin. Microbiol., 1990, Mar;28（3）, 495-503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa Jに記載された方法、イソプロパノールを用いて沈殿する方法等］によりＤＮＡの抽出及び精製を行えばよい。

ＤＮＡの抽出及び精製には、そのための様々なキットが市販されているので、それを用いてもよい。例えば（株）キアゲン製イオン交換樹脂タイプＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tip等を用いてＤＮＡの抽出、精製を行えばよい。

本発明のクラミジア・トラコマティスの検出方法は、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプライマー（本発明のプライマー）として用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、当該反応の結果生じるものを検出することを特徴とする、クラミジア・トラコマティスの検出方法。」である。

上記方法はすなわち、配列番号１０で表されるクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子の、塩基番号４１３３〜塩基番号４２７７の領域（配列番号１）若しくは塩基番号３２〜塩基番号１７６（配列番号２）の領域、又はこれらの領域内の更に特定の領域を標的とし、試料中にこれらの領域の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドが存在するか否かを確認することにより、クラミジア・トラコマティスを検出する方法である。

ＰＣＲ等の核酸増幅反応において用いられる本発明のプライマーの具体例としては、例えば配列番号３〜配列番号７のいずれかで表される塩基配列、又は配列番号３〜配列番号７のいずれかで表される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。

また、核酸増幅反応に用いられる、好ましいプライマーの組合せ（プライマー対）としては、下記のものが挙げられる。
（１）配列番号３で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、
（２）配列番号５で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、
（３）配列番号７で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー。

上記プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ等の核酸増幅反応に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常この分野で用いられているものを用いればよく、その条件、手法等は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、ＰＣＲ法の一般的なプロトコルに従って行えばよい。
以下に、本発明のクラミジア・トラコマティスの検出方法の具体例について説明する。

（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、当該反応の結果生じるものを検出することを特徴とする、クラミジア・トラコマティスの検出方法

（Ａ）の方法において、本発明のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う方法としては、例えば、本発明のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅反応[例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（Tsugunori Notomi et al., Nucleic Acid Res., 28, e63, 2000）、ICANTM（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（臨床病理, 51(11), 1061-1067, 2003, Nov）、LCR(ligase chain reaction)法（特開平4-211399号）、SDA(strand displacement amplification）法（特開平8-19394号）]を行う方法が挙げられる。これによりクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長産物を検出・測定することにより、クラミジア・トラコマティスを検出することができる。

上記の核酸増幅反応を行う方法の中でも、ＰＣＲ法が最も一般的な方法として挙げられる。

また、核酸増幅反応を行う方法として、例えばリアルタイム増幅検出法（例えば米国特許第5210015号、米国特許第5538848号の記載参照）を用いることができる。また、リアルタイム増幅検出法による検出法の例として、例えばリアルタイムＰＣＲ検出法が挙げられる。

リアルタイムＰＣＲ検出法の例としては、TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）等が挙げられる。

「核酸増幅反応の結果生じるものを検出する方法」は、通常この分野で行われている常法が挙げられ、特に限定されない。

例えば、上記したリアルタイムPCR検出法の例に挙げた方法、インターカレーター法の他、核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法等、様々な検出法が挙げられる。

これらのうち、一般によく用いられる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。

（Ａ−１）TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法（TaqMan^TMプローブ法）
（Ａ−２）インターカレーター法、
（Ａ−３）核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、
（Ａ−４）標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法。

以下に、夫々の方法について説明する。
（Ａ−１）TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法（TaqMan^TMプローブ法）
TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法は、5'末端を例えばFAM等の蛍光色素（レポーター）で、3'末端を例えばTAMRA等のクエンチャー色素で標識したプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行い、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングする方法であり、目的の微量なＤＮＡを高感度且つ定量的に検出する方法である。

この方法では、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。

また、TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法は、非特異的な増幅反応によるノイズの発生が非常に少ない。そのため、より特異的なターゲットの増幅・検出が可能となる点で、特に優れた方法である。

TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法を利用した本発明に係る検出法に用いられるプライマーとしては、本発明のプライマーが用いられる。好ましい本発明のプライマーとしては、上記したＰＣＲ法等の核酸増幅反応において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましいプライマーの組合せも上記したとおりである。

本発明に係るTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法に用いられる5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識したプローブに用いられるプローブとしては、上記した本発明のプローブであればよい。実際には、選択したプライマーの組合せでリアルタイムＰＣＲを行った場合に得られると予測されるプライマー伸長産物の塩基配列を含有するプローブ、又は更にその配列から設計される塩基配列を含有するプローブが用いられる。

例えば、クラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子の、塩基番号４１３３〜塩基番号４２７７の領域を標的として本発明の検出法を実施する場合、例えば当該領域の塩基配列（配列番号１で表される）を元に設計されたプライマーTcTI_Fw01（配列番号３）とプライマーTcTI_Rv01（配列番号４）を用いてTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲを行う。この場合は、当該領域のうちの全領域が増幅される。そこで、プライマーTcTI_Fw01（配列番号３）とプライマーTcTI_Rv01（配列番号４）を用いた検出の場合は、この領域の塩基配列（配列番号１）を元に設計されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる。例えば、配列番号８で表される配列からなるオリゴヌクレオチド（「TcTI_FwRv1」と呼ぶ。）が挙げられる。

また、内在性プラスミド遺伝子の、塩基番号３２〜塩基番号１７６の領域を標的として本発明の検出法を実施する場合、例えば当該領域の塩基配列（配列番号２で表される）を元に設計されたプライマーTcTI_Fw02m（配列番号５）とプライマーTcTI_Rv02（配列番号６）を用いてTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲを行う。この場合は、当該領域のうち、塩基番号６３〜塩基番号１７６の領域が増幅される。そこで、プライマーTcTI_Fw02m（配列番号５）とプライマーTcTI_Rv02（配列番号６）を用いた検出の場合は、塩基番号６３〜塩基番号１７６の領域を元に設計されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる。例えば、配列番号９で表される配列からなるオリゴヌクレオチド（「TcTI_FwRv2」と呼ぶ。）が挙げられる。

また、内在性プラスミド遺伝子の、塩基番号３２〜塩基番号１７６の領域の塩基配列を元に設計された別のプライマーTcTI_Fw02（配列番号７）とプライマーTcTI_Rv02（配列番号６）を用いてTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲを行う。この場合は、当該領域のうちの全領域（塩基番号３２〜塩基番号１７６）が増幅される。そこで、プライマーTcTI_Fw02（配列番号７）とプライマーTcTI_Rv02（配列番号６）を用いた検出の場合は、塩基番号３２〜塩基番号１７６の領域を元に設計されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる。この場合も、例えば配列番号９で表される配列からなるオリゴヌクレオチド（「TcTI_FwRv2」と呼ぶ。）を用いることができる。

TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムＰＣＲで用いられているものを用いればよく、TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲの手法は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。

TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法を利用した、「核酸増幅反応の結果生じるものを検出する方法」の例を説明すると、以下の通りである。

本発明のプライマーと、本発明のプローブの5'末端がレポーター蛍光色素で標識され、3'末端がクエンチャー色素で標識された標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、該標識プローブから遊離されたレポーター蛍光色素由来の蛍光を検出する。その結果、レポーター蛍光色素由来の蛍光が測定された場合に、被検試料はクラミジア・トラコマティス陽性（すなわち、被検試料中にクラミジア・トラコマティス、またはその遺伝子若しくは遺伝子断片が存在する。以下同じ）と判定される。

また、TaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法では、検量線を作成することができるので、試料中のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることがでる。また、その数はクラミジア・トラコマティスの数に比例するので、試料（被検試料）中のクラミジア・トラコマティスの数も知ることができる。

検量線の作成方法は、リアルタイムＰＣＲ法において通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知（希釈系列）のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡ試料を用いて、上記方法に従いTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲを行い、レポーター色素の蛍光強度を測定する。得られた蛍光強度を元に常法で増幅曲線を作成する。得られた増幅曲線から常法によりThreshold cycle（Ct）値を得、リアルタイムＰＣＲに用いたＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。

試料中のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を定量するには、上記した如き常法により得られた検量線を用いればよい。

すなわち、コピー数既知のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡ試料を用い、上記方法に従い上記方法に従いTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThreshold line (Th)と得られた増幅曲線が交差したCt値（threshold cycle value）を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。

本発明のクラミジア・トラコマティスの検出方法における、TaqMan^TMリアルタイムPCR法の具体例としては、例えば下記の方法が挙げられる。
（１）配列番号３で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号８で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをレポーター色素とクエンチャー色素で標識した標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、該標識プローブから遊離した標識物質を検出する、

（２）配列番号５で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号９で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをレポーター色素とクエンチャー色素で標識した標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、該標識プローブから遊離した標識物質を検出する、

（３）配列番号７で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号９で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをレポーター色素とクエンチャー色素で標識した標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、該標識プローブから遊離した標識物質を検出する。

本発明に係るTaqMan^TMリアルタイムＰＣＲ法によるクラミジア・トラコマティスの検出方法の一例として、上記した本発明の「プライマーTcTI_Fw01」と「プライマーTcTI_Rv01」を用いて、クラミジア・トラコマティスを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。

まず、公知の方法により、クラミジア・トラコマティスを検出すべき試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。

別に、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(TcTI_Fw01)、及び配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(TcTI_Rv01)を合成する。

また、TcTI_Fw01とTcTI_Rv01のプライマー対を用いたＰＣＲで増幅されると予想される塩基配列から、プローブとして利用するための配列として、配列番号８で表される塩基配列(TcTI_FwRv1)を設計し、この塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素のFAMを、３'末端にレポーター消光体のTAMRAを常法により結合し、蛍光標識プローブを得る。

上記で合成したTcTI_Fw01およびTcTI_Rv01を増幅用プライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。

すなわち、各 0.1〜2μM、好ましくは各１μMのプライマーTcTI_Fw01及びプライマーTcTI_Rv01、100〜1000nMの蛍光標識プローブ、1.0〜4.0mM MgCl₂、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。このＰＣＲ用反応液20μｌに精製ＤＮＡ試料1ngを加え、ＰＣＲ用試料を得る。

このＰＣＲ用試料を用い、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素由来の蛍光強度量を測定する。

この場合、レポーター色素由来の蛍光が測定された場合に、クラミジア・トラコマティス陽性と判定される。

更に、上記した方法で検量線を作成することによって、試料（被検試料）中のクラミジア・トラコマティスの数も知ることができる。

（Ａ−２）インターカレーター法
公知のインターカレーターを利用してリアルタイムＰＣＲ等のリアルタイム核酸増幅反応を行う、通常のインターカレーター法によって、「核酸増幅反応の結果生じるものを検出」することができる。

インターカレーター法は、核酸増幅反応の後に電気泳動を行う必要がないので、臨床検査の分野等において、迅速に検出を行う必要がある場合には、有効な方法である。

インターカレーター法を利用した本発明に係る検出法に用いられるプライマーとしては、本発明のプライマーが用いられる。好ましい本発明のプライマーとしては、上記したＰＣＲ法等の核酸増幅反応において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましいプライマーの組合せも上記したとおりである。

本発明に係るインターカレーター法に用いられるインターカレーターとしては、通常この分野で用いられているインターカレーターであれば、何でも用いることができるが、例えばSYBR^TM Green I (Molecular Probe社商品名)、エチジウムブロマイド、フルオレン等がある。

インターカレーター法を利用した、「核酸増幅反応の結果生じるものを検出する方法」の例を説明すると、以下の通りである。

本発明のプライマーと、インターカレーター（例えばSYBR^TM Green I）を用い、クラミジア・トラコマティスを検出すべき試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を鋳型として用いて、Taq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲを行う。そしてプライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするインターカレーター由来の蛍光強度を測定する。

次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。これを用いて、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、ピークの検出を行う。一方、クラミジア・トラコマティスのtype strain（基準株）を用いて同様の測定を行い、ピークの検出を行う。被検試料を用いて得られた結果、単一のピークが得られ、かつそのピークのTm値（Tmピーク値）がクラミジア・トラコマティスの基準株を用いて得られたTmピーク値と同じ場合に、被検試料はクラミジア・トラコマティス陽性と判定される。

但し、同じ機器を用いて被検試料中のクラミジア・トラコマティスの検出を行う場合、一度基準株のTmピーク値を確認しておけば、以後の被検試料の検査は、このTmピーク値を用いれば良く、検査毎に改めて基準株のTmピーク値の確認を行う必要はない。

また、インターカレーター法を利用した方法で得られた測定値をもとに、リアルタイムＰＣＲで行われる常法に従って、検量線を作成することもできるので、その検量線を用いて試料中にあるクラミジアラ・トラコマティスのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。

検量線の作成方法は、リアルタイムＰＣＲ法に於いて通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知（希釈系列）のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡ試料を用い、上記方法に従いリアルタイムＰＣＲを行い、インターカレーター由来の蛍光強度を測定し、同様に増幅曲線を作成する。得られた増幅曲線から常法によりCt値を得る。そして、リアルタイムＰＣＲに用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。

すなわち、クラミジア・トラコマティスを検出する試料中からＤＮＡを分離精製した後、得られたＤＮＡ試料について、同様にインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成し、検量線を作成したときのThreshold line (Th)と得られた増幅曲線が交差したCt値（threshold cycle value）を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のクラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。

本発明に係る、インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ法によるクラミジア・トラコマティスの検出方法の一例として、上記した本発明の「プライマーTcTI_Fw01」と「プライマーTcTI_Rv01」を用いて、クラミジア・トラコマティスを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。

まず、クラミジア・トラコマティスを検出すべき試料（被検試料）中から、公知の方法により精製ＤＮＡ試料を得る。

別に、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（TcTI_Fw01）、及び配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（TcTI_Rv01）を合成する。

合成したTcTI_Fw01およびTcTI_Rv01を増幅用プライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。

すなわち、プライマーTcTI_Fw01と、プライマーTcTI_Rv01を各50〜2000nM、インターカレーター［例えばSYBR^TM Green I (Molecular Probe社商品名)］を原液の約５〜100000倍希釈、1.0〜4.0mM MgCl₂、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのポリメラーゼ（例えばTaq DNA ポリメラーゼ）を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。該ＰＣＲ用反応液に、クラミジア・トラコマティスを検出すべき試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を加え、ＰＣＲ用試料とする。このＰＣＲ用試料を用い、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にプライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBR^TM Green Iの蛍光強度を測定する。

次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。これを用いて、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行って、ピークの検出を行う。得られたピークが単一のピークであって、且つクラミジア・トラコマティスのtype strainを用いて同様に測定を行って得られたピークの解離温度と同じ位置に出現したことが確認された場合に、被検試料はクラミジア・トラコマティス陽性と判定される。

（Ａ−３）核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法
該方法における核酸増幅反応の具体例は、上記したとおりである。例えば、通常のＰＣＲ法等の核酸増幅法や、リアルタイムＰＣＲ法等のリアルタイム核酸増幅法等が挙げられる。

核酸増幅反応で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて、クラミジア・トラコマティスを検出する方法としては、例えば
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより行う方法、
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法、
（Ａ−３−３）電気泳動画分のインターカレーター由来の蛍光を検出する方法、
等が挙げられる。

電気泳動法の条件、操作方法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。

以下に、各方法について説明する。

（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより行う方法
例えば、核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物について、電気泳動を行う。

別に、核酸増幅反応に用いたプライマーの組合せから、増幅されるであろうプライマー伸長産物の大きさ（塩基対数）を予測しておく。

そして、得られた電気泳動画分が予測された大きさのプライマー伸長産物に該当するか否かを、常法により確認すればよい。例えば、得られた電気泳動画分をエチジウムブロマイド等で染色して核酸種を視覚化するといった方法で、該画分を染色し、そのプライマー伸長産物の大きさを確認する等の方法が挙げられる。そして、使用したそのプライマーの組合せで増幅されると予想された塩基配列のオリゴヌクレオチド、又はその塩基対数の大きさの画分が確認された場合に、「その被検試料はクラミジア・トラコマティス陽性である」と判定する。

（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法
例えば核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物について、電気泳動を行う。

別に、核酸増幅反応に用いたプライマーの組合せから、増幅されると予測されるプライマー伸長産物の塩基配列を元に、プローブを設計し、それを標識物質で標識した標識プローブを得る。

得られた電気泳動画分について、標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行う。そして、該標識プローブの標識を検出し、その結果、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、「その被検試料は、クラミジア・トラコマティス陽性である」と判定する。

該方法で用いられるプローブ及びプローブを標識する標識物質の具体例、並びにプローブの標識方法は、上記したとおりである。

（Ａ−３−３）電気泳動画分のインターカレーター由来の蛍光を検出する方法、
例えば、下記の方法が挙げられる。
（i）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型としてインターカレーター法による核酸増幅反応を行う、
（ii）(i)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。
（iii）電気泳動画分について通常の蛍光検出を行う。

すなわち、核酸増幅反応によってプライマー伸長産物が得られれば、該プライマー伸長産物が取り込んだインターカレーター由来の蛍光が検出されるはずである。そこで、インターカレーター由来の蛍光を発する電気泳動画分が検出された場合に、「その被検試料はクラミジア・トラコマティス陽性である」と判定する。

また本発明は、核酸増幅工程において、ＲＮＡ転写産物を利用した検出法を適用する事ができる。例えば、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許第2650159号）、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法（特公平7-114718号）、ＴＡＳ（transcription based amplification system）法（特表平2-500565号：国際公開WO88/10315号）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）法（特開平11-46778号）などが挙げられる。中でも逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用（逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させる。）を利用する一定温度核酸増幅法は、測定系を自動化する場合には適した方法である。

(Ａ−４)標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法、
（Ａ−４）の方法としては、本発明のプライマーを上記した方法で標識した標識プライマーを用い、被検試料中の核酸を鋳型として用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を検出・測定し、標識を検出できた場合には、その被検試料はクラミジア・トラコマティス陽性であると判定する方法が挙げられる。

上記方法の場合、核酸増幅反応を行ったのち、プライマー伸長産物の標識を測定する前に、公知の方法で遊離の標識プライマーを除く操作を行ってもよい。遊離の標識プライマーを除く方法としては、例えば核酸増幅反応反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長産物を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法等が挙げられる。

また、核酸増幅反応を行って得られた反応物を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長産物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。

尚、以上の方法の他に、（Ｂ）本発明のプローブのみを用い、クラミジア・トラコマティスを検出する方法もある。この方法では、いわゆる核酸増幅反応は行わない。

具体的には、例えば下記のような方法が挙げられる。

（Ｂ−１）標識物質で標識された固相担体に本発明のプローブを結合させたもの、又は固相担体に標識物質で標識された本発明のプローブ（標識プローブ）を結合させたものを捕捉プローブとして用いる方法である。この補足プローブを、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のクラミジア・トラコマティス由来の核酸を固相上に固定化させた後、標識プローブの標識、又は標識担体の標識を常法により検出する（例えば、特開昭62-265999号の記載参照）。

標識が検出された場合に、「その被検試料は、クラミジア・トラコマティス陽性である」と判定する。

（Ｂ−２）標識されていない(B-1)の捕捉プローブと、本発明のプローブを標識した標識プローブを用いる方法である。この二つのプローブを被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとクラミジア・トラコマティス由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ（例えば、特開昭58-40099号の記載参照）を行うことにより、クラミドフィラ・トラコマティスを検出する。

（Ｂ−３）ビオチンで標識した本発明のプローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のクラミジア・トラコマティス由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉し、クラミジア・トラコマティス由来核酸とアビジン結合担体との複合体を常法により検出する方法。

複合体が検出された場合に、「その被検試料は、クラミジア・トラコマティス陽性である」と判定する。

尚、本発明のクラミジア・トラコマティスの検出方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。

緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。

また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBR^TM Greenなど）やFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。

本発明のクラミジア・トラコマティス検出用試薬キットとしては、「配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計され、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして含んでなる、クラミジア・トラコマティス検出用試薬キット。」が挙げられる。

上記キットを構成する本発明のプライマー及び本発明のプローブの具体例は、上記した「本発明のプライマー」、「本発明のプローブ」についての説明に記載したとおりである。

本発明のプライマー及び／又はプローブは標識物質で標識されたものであってもよい。その標識物質の具体例は上記したとおりである。

本発明のプライマーを含んでなるキットには、プライマー対を含む組成も含まれる。プライマー対の好ましい組合せは、下記の通りである。
（１）配列番号３で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号４で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、
（２）配列番号５で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、
（３）配列番号７で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー。

また、上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを含有していてもよい。

例えば、下記の構成のものが挙げられる。
（１'）配列番号３で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号４で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブ、
（２'）配列番号５で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号６で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、及び配列番号９で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブ、
（３'）配列番号７で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、及び配列番号９で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブ。

これらのキットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は上記したとおりである。

尚、本発明のクラミジア・トラコマティス検出用試薬キットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。

緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。

また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（SYBR^TM Green、エチジウムブロマイドなど）やFAMやTAMRA等の標識検出物質などを含んでいてもよい。

以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。

実施例で用いられる細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。

実施例１．クラミジア・トラコマティス（C. trachomatis）の内在性プラスミド（pLGV440）上の塩基配列をターゲットにしたDNA増幅反応を行ない、本発明のプライマーの特異性評価を行った。

（１）ターゲット配列の決定本発明では、クラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド（pLGV440）の遺伝子配列（配列番号１０）から、クラミジア・トラコマティスの検出のためのターゲット配列として、配列番号１０の中から4133〜4277番目の145bpの塩基配列、そして32〜176番目の145bpの塩基配列を選択した。それぞれの配列をTcTI_Fw01Rv01、TcTI_Fw02Rv02と命名した。TcTI_Fw01Rv01の塩基配列を配列表の配列番号１に、TcTI_Fw02Rv02の塩基配列を配列表の配列番号２に、夫々示す。

（２）プライマーの設計と合成上記(１)で特定したターゲット配列TcTI_Fw01Rv01の配列から、ＰＣＲ増幅検出のためのプライマー、すなわち「5'-cgctcaaggaccagcaaata-3'」（以下、「TcTI_Fw01」と呼ぶ。配列番号３）及び「5'-gctttttccgcatccaaac-3'」（以下、「TcTI_Rv01」と呼ぶ。配列番号４）を設計した。

オリゴヌクレオチドの合成をシグマジェノシス社に委託し、設計した塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを得た。これをプライマーとして用いた。

（３）標識プローブの設計と合成
上記(２)で設計されたTcTI_Fw01とTcTI_Rv01のプライマーの組合せを用いたＰＣＲで増幅されると予測される核酸配列から、プローブとして利用するための配列を設計した。設計したオリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号８で表されるものであり、「TcTI_FwRv1」と命名した。

更に、「TcTI_FwRv1」の5'末端にレポーター色素Texas Red^TMを、3'末端にレポーター消光体のBHQ2^TM を化学結合させた標識オリゴヌクレオチドプローブを設計した。

オリゴヌクレオチドの合成及び標識をシグマジェノシス社に委託し、設計した標識プローブを得た。

（４）ＤＮＡ試料の調製
下記表２に示す各クラミジア（クラミジア属：Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pecorum、クラミドフィラ属：Chlamydophila caviae）を常法に従って培養した後、公知の核酸精製手法を用いて精製ゲノムＤＮＡを取得した。得られたそれぞれの精製ＤＮＡを、最終１ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＤＮＡ試料とした。

尚、用いた細菌株は、すべて岡山大学医学部公文裕巳教授の研究室から供与された。

（５）リアルタイムＰＣＲ
１）ＰＣＲ用反応液の調製
上記（２）で得られたプライマーTcTI_Fw01及びプライマーTcTI_Rv01各１μM、上記(３)で得られた標識プローブ 195nM、1.5mM MgCl₂ 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。

２）リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲ用反応液20μlに上記（４）で調製したＤＮＡ試料１μL を加えたものをＰＣＲ用試料とし、これを定量PCR反応用ガラスキャピラリーチューブ（ロシュ社製）に入れ、定量ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（LightCycler2.0、ロシュ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の由来の蛍光量を測定した。尚、蛍光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供したガラスキャピラリーチューブ毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。

（６）結果
得られたリアルタイムＰＣＲの結果を下記表３にまとめた。表３において判定がpositiveとは、蛍光シグナルが検出されたことを示す。一方、判定がnegativeとは、蛍光シグナルが検出されなかったことを示す。

表３の結果から明らかなとおり、本発明のプライマーTcTI_Fw01及びプライマーTcTI_Rv01の組合せと本発明の標識プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、増幅された核酸の検出を行った結果、クラミジア・トラコマティスの各々の株に由来するゲノムＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認できた。すなわち、これらの試料は、クラミジア・トラコマティス陽性と判定できた。これに対し、クラミジア・トラコマティス以外の菌体由来ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合には、該当する蛍光シグナルが確認できなかった。すなわち、これらの試料はすべてクラミジア・トラコマティス陰性と判定できた。

以上のことから、本発明のプライマー及びプローブを用いて核酸増幅反応を行うことにより、クラミジア・トラコマティスを特異的に検出することが出来ることが判る。また、本発明のプライマー及びプローブはクラミジア・トラコマティスに対する特異性が高い。そのため、クラミジアを単離することなく臨床材料から得られた核酸をそのまま、本発明のプライマー及びプローブを用いたＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いた検出法に使用できる可能性が期待できる。

実施例２．
リアルタイム検出系を利用し、本発明で特定したプライマー配列を用いた遺伝子増幅系での検出感度の検定を行った。
（１）プライマー
実施例１(２)で得られたTcTI_Fw01及びTcTI_Rv01を用いた。

（２）標識プローブの作製
実施例１(３)で作製した、オリゴヌクレオチド「TcTI_FwRv1」の5'末端にレポーター色素Texas Red^TMを、3'末端にレポーター消光体のBHQ2^TMを化学結合させた標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた。

（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
表２のC. trachomatis（D (Serovar)株）を常法に従って培養した後、実施例１(４)と同様の方法で、公知の核酸精製手法を用いて精製ゲノムＤＮＡを取得した。これを10mM Tris-HCl緩衝液に溶解し、吸光度を測定した。得られた吸光度測定値より、モル数を算出することで、ＤＮＡ試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。

次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を10⁶,10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10, 5コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。

（４）リアルタイムＰＣＲ
１）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(１)で得られたプライマーTcTI_Fw01及びプライマーTcTI_Rv01各１μM、上記(２)で得られた標識プローブ 195nM、1.5mM MgCl₂ 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、夫々0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。

２）リアルタイムＰＣＲ
配列TcTI_Fw01Rv01をＰＣＲにおける増幅ターゲットとし、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして、上記(３)で調製したC.trachomatis（D (Serovar)株）由来のＰＣＲ用ＤＮＡ試料（希釈系列）を用いた。

まず、ＰＣＲ用反応液20μlに、上記(３)で調製したＰＣＲ用ＤＮＡ試料各々１μL を加えたものをＰＣＲ用試料とし、これを定量PCR反応用ガラスキャピラリーチューブ（ロシュ社製）に入れ、定量ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（LightCycler2.0、ロシュ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃で１分間の反応を50サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素由来の蛍光量を測定した。尚、蛍光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供したガラスキャピラリーチューブ毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。

（５）結果
得られた測定結果から、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従って、検量線を作成した。

すなわち、各濃度のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素由来の蛍光量(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。得られた増幅曲線を図１に示す。

図１において、図中のａ〜ｈは、夫々10⁶,10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10, 5コピー/μLのＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いた場合の増幅曲線を夫々示す。

次いで、蛍光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の蛍光量が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ct値に対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図２に示す。

図２の結果から、検出感度として5 copy/reactionまでの増幅検出が可能であることがわかる。また、ＰＣＲ効率（PCR Efficiency） =１.９７９（９５．３％）であった。

以上の結果、本発明に係るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、リアルタイムＰＣＲを行えば、クラミジア・トラコマティスが高感度で検出できることが判る。

また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行えば、クラミジア・トラコマティスの定量が可能であることが判った。更に、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法では、クラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡが初期量として５コピー存在する条件でもクラミジア・トラコマティスの検出が可能になり、高い検出感度でクラミジア・トラコマティスの検出が行える事がわかる。

更に、リアルタイムＰＣＲ法を利用した場合には、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができ、クラミジア・トラコマティスの検出に有効である。

実施例３
リアルタイム検出系を利用し、本発明で特定したプライマー配列を用いた遺伝子増幅系での検出感度の検定を行った。

（１）プライマーの設計と合成
実施例１（１）で特定したターゲット配列TcTI_Fw02Rv02の配列（配列番号２）から、PCR増幅検出のためのプライマー、すなわち「5'-cagatttcctttcgcattaaaaa-3'」（以下、「TcTI_Fw02m」と呼ぶ。配列番号５）、及び「5'-tctcccatttctcccacaag-3'」（以下、「TcTI_Rv02」と呼ぶ。配列番号６）を設計した。
オリゴヌクレオチドの合成をシグマジェノシス社に委託し、設計した塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを得た。これをプライマーとして用いた。

（２）標識プローブの設計と合成
上記(１)で設計されたTcTI_Fw02mとTcTI_Rv02のプライマーの組合せを用いたＰＣＲで増幅されると予測される核酸配列から、プローブとして利用するための配列を設計した。設計したオリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号９で表されるものであり、「TcTI_FwRv2」と命名した。

更に、「TcTI_FwRv2」の5'末端にレポーター色素HEX^TMを、3'末端にレポーター消光体のBHQ^TMを化学結合させた標識オリゴヌクレオチドプローブを設計した。

（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
表２のC.trachomatis（D (Serovar)株）を常法に従って培養した後、実施例１(４)と同様の方法で、公知の核酸精製手法を用いて精製ゲノムＤＮＡを取得した。これを10mM Tris-HCl緩衝液に溶解し、吸光度を測定した。得られた吸光度測定値より、モル数を算出することで、ＤＮＡ試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。

（４）リアルタイムＰＣＲ
１）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマーTcTI_Fw02m及びプライマーTcTI_Rv02各１μM、上記（３）で得られた蛍光標識プローブ 195nM、1.5mM MgCl₂ 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、夫々0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、PCR用反応液とした。

２）リアルタイムＰＣＲ
配列TcTI_Fw02Rv02をＰＣＲにおける増幅ターゲットとし、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして、上記(３)で調製したC.trachomatis（D (Serovar)株）由来のＰＣＲ用ＤＮＡ試料（希釈系列）を用いた。

まず、ＰＣＲ用反応液20μlに、上記(３)で調製したＰＣＲ用ＤＮＡ試料各々１μL を加えたものをＰＣＲ用試料とし、９６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、リアルタイムＰＣＲ検出装置（ABI 7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてＰＣＲを行った。反応は、９５℃ で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃ で１分間の反応を５０サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素由来の蛍光量を測定した。尚、蛍光量は、測定に用いたサーマルサイクラーの、測定に供したサンプル・ウェル毎に相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。

すなわち、各濃度のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の蛍光量(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。得られた増幅曲線を図３に示す。

図３において、図中のａ〜ｈは、夫々10⁶,10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10, 5コピー/μLのＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いた場合の増幅曲線を夫々示す。

次いで、蛍光量が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の蛍光量が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図４に示す。

得られた検量線の、回帰分析を行って求めた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。
ｙ＝−３．４２１３５８ｘ＋４０．９７１９２４
Ｒ^２＝０．９９２４０１

図４から明らかな通り、良好な（直線性の良い）検量線が得られた。よって、本発明のプライマー及びプローブを用いた核酸増幅反応を行えば、クラミジア・トラコマティスの定量が可能であることが分かる。

また、図４の結果から、検出感度として５copy/reactionまでの増幅検出が可能であることが分かる。すなわち、本発明のプライマー及びプローブを用いた検出法を行えば、クラミジア・トラコマティスのゲノムＤＮＡが初期量として５コピーが存在する条件でも、クラミジア・トラコマティスの検出が可能である。

また、行ったＰＣＲの増幅効率(PCR Efficiency)は96.1%で、ほぼ100%に近かった。

以上のことから、本発明のプライマーTcTI_Fw02mとプライマーTcTI_Rv02の組合せと本発明の標識プローブとを用い、TcTI_Fw02Rv02をＰＣＲにおける増幅ターゲットとしてリアルタイムPCRを行えば、本発明のプライマーTcTI_Fw01とプライマーTcTI_Rv01の組合せと本発明の標識プローブとを用い、TcTI_Fw01Rv01をＰＣＲにおける増幅ターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合と同様、クラミジア・トラコマティスが高感度且つ特異的に検出できることが分かる。

更に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができ、この点でもクラミジア・トラコマティスの検出に有効である。

本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、クラミジア・トラコマティスの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でクラミジア・トラコマティスの検出を行うことにより、診断上の偽陰性が排除可能となり、より高精度にクラミジア・トラコマティスの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、クラミジア・トラコマティス自体の定量も行うこともできるという効果を奏する。

図１において、各記号は、それぞれ以下の場合の結果を示す。
a：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10⁶コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｂ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10⁵コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｃ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10⁴コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｄ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10³コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
e：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10²コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｆ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｇ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が5コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｈ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が0コピーで、TcTI_Fw01Rv01をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
図３において、各記号は、それぞれ以下の場合の結果を示す。
a：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10⁶コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｂ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10⁵コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｃ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10⁴コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｄ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10³コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
e：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10²コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｆ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｇ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が5コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
ｈ：ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が0コピーで、TcTI_Fw02Rv02をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。

Claims

配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーの組合せからなる、クラミジア・トラコマティス検出用プライマー対。
フォワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも一方が標識物質で標識された、請求項１に記載のプライマー対。
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項２に記載のプライマー対。
請求項１に記載のプライマー対を用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、当該反応の結果生じるものを検出することによる、クラミジア・トラコマティスの検出方法。
核酸増幅反応がリアルタイムPCRである、請求項４に記載の検出方法
更に、配列番号１で表される塩基配列の連続した２０〜５０塩基の塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをレポーター色素及びクエンチャー蛍光色素で標識した標識プローブを用いる、請求項４又は５に記載の検出方法
請求項１に記載のプライマー対と、配列番号８で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドをレポーター色素とクエンチャー蛍光色素で標識した標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、該標識プローブから遊離した標識物質を検出する、請求項４〜６のいずれかに記載の検出方法。
当該反応の結果生じるものがプライマー伸長産物であり、これをインターカレーターを用いて検出する、請求項４又は５に記載の検出方法。
核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいてクラミジア・トラコマティスの有無を判定する、請求項４に記載の検出方法。
請求項１〜３のいずれかに記載のプライマー対を含んでなる、クラミジア・トラコマティス検出用試薬キット。
更に下記から選択されるオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる、請求項１０に記載のキット：
（１）配列番号１で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド、
（２）配列番号１で表される塩基配列の連続した１００〜１４５塩基の塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
（３）配列番号１で表される塩基配列の連続した２０〜５０塩基の塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドプローブが標識物質で標識化されたものである、請求項１１に記載のキット。
配列番号１で表される塩基配列の連続した２０〜５０塩基の塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つクラミジア・トラコマティスの内在性プラスミド遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、レポーター色素及びクエンチャー蛍光色素で標識化されたものである、請求項１１に記載のキット。
請求項１に記載のプライマー対、及び配列番号８で表される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブの組合せを含んでなる、請求項１０〜１３のいずれかに記載のキット。