CN102918155A - 沙眼衣原体检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸，沙眼衣原体检测用寡核苷酸引物和探针，使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法，以及该寡核苷酸在沙眼衣原体检测用引物或探针设计中的用途。

Description

沙眼衣原体检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法
技术领域
本发明涉及利用了核酸的扩增及其检测系统的、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的检测和/或鉴定方法。
背景技术
目前，伴随性风俗的多样化、以年轻人为中心的日本人的性行为样式的变化，作为性感染症的衣原体感染症的增加显著。
衣原体(Chlamydia)是真核细胞的专性细胞内寄生细菌。衣原体在宿主细胞内生长繁殖，在细胞的细胞质中形成包涵体(inclusion)，成为宿主的临床症状的原因。例如，性器官衣原体感染症的病原菌是沙眼衣原体，主要在男性中引发尿道炎，在女性中引发宫颈炎。
作为衣原体的检测法，开发了直接荧光抗体染色(DFA)、酶免疫测定法(EIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等检测抗原的方法。另外，还开发了通过使用经标记物质标记的、与沙眼衣原体的核糖体RNA互补的单链DNA的探针杂交来检测沙眼衣原体的方法(Gen-Probe Pace 2 Chlamydia  test、非专利文献1)。
另外，还开发了利用核酸扩增技术的、更高灵敏度的检测方法。
例如，Domeika等(非专利文献2)、Bauwens等(非专利文献3)和美国专利第5,232,829号说明书(专利文献1)报告了进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction、PCR)和接下来的微量滴定板杂交来检测沙眼衣原体的方法。
另外，还报告了进行连接酶链反应(Ligase Chain Reaction、LCR)和接下来的微粒夹心免疫测定检测来检测沙眼衣原体的方法(非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)。
另外，已知沙眼衣原体在其菌内具有多拷贝的特异的内源性质粒(非专利文献7)。而且，还开发了以该内源性质粒的特定序列为靶，通过基因扩增法扩增其一部分序列，检测扩增产物，从而检测沙眼衣原体的方法(专利文献2、专利文献3)。
但是，已知沙眼衣原体中存在免疫学上确定的18种血清型。而且，近年来报告了通过如上所述现有的沙眼衣原体的检测法不能检测沙眼衣原体的事例(非专利文献8)。即，判明了在现有的沙眼衣原体的检测法中有时会产生伪阴性的判定，成为问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第5232829号说明书
专利文献2:日本特许第2719225号公报
专利文献3:日本特许第3127135号公报
非专利文献
非专利文献1:Warren R.,et al.,Journal of Clinical Microbiology,1993,31,1663-1666.
非专利文献2:Domeika M.et al.,Journal of Clinical Microbiology,1994,32,2350-2352
非专利文献3:Bauwens J.E.et al.,Journal of Clinical Microbiology,1993,31,3013-3106
非专利文献4:Chernesky Max A.et al.,Journal of ClinicalMicrobiology,1994,32,2682-2685
非专利文献5:Lee H.H.et al.,Lancet,1995,345,213-216
非专利文献6:Bassiri M.et al.,J.Clin.Microbiol.,1995,33,898-900
非专利文献7:C.Hatt et al.,Nucleic Acids Research,1988,16(9),p.4053-4067
非专利文献8:Emerging Infectious Diseases Vol.14,No.9,September2008
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于如上所述的状况而做出的，课题是提供不产生伪阴性的判定、灵敏度和特异性优异且迅速的沙眼衣原体的检测方法和在该方法中使用的引物和探针。
用于解决课题的方法
本发明是为了解决上述课题而做出的，包括以下的构成。
(1)寡核苷酸，其基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。
(2)寡核苷酸引物，其基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。
(3)寡核苷酸探针，其基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。
(4)沙眼衣原体的检测方法，其特征在于，为了以序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒基因中的、具有序列号1所示的碱基序列的碱基号4133～碱基号4277的区或具有序列号2所示的碱基序列的碱基号32～碱基号176的区、或这些区内进一步特定的区作为靶，确认试样中是否存在具有这些区的碱基序列的寡核苷酸，而使用基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测该反应的结果所生成的产物。
(5)沙眼衣原体检测用试剂盒，其中，包含基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物或/和探针。
本发明者们对于到目前为止确定的沙眼衣原体和其他生物的各种基因反复进行了各种间的各基因序列的同源性的理论验证和实验验证。其结果是，得到了最适合沙眼衣原体的检测的核酸序列，并且进一步以这些序列为基础开发了沙眼衣原体检测用引物和探针，确立了使用这些引物和探针的沙眼衣原体的检测方法，从而完成了本发明。
发明的效果
根据本发明，可提供灵敏度和特异性优异且迅速的沙眼衣原体的检测方法。另外，通过使用本发明所提供的检测用引物的检测方法，可以避免现有方法中可能发生的伪阴性，精度良好地进行沙眼衣原体的检测。
附图说明
图1是实施例2所得的、使用引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01、使用来源于沙眼衣原体的DNA试样作为模板的实时PCR所得的扩增曲线。
图2是以实施例2中进行的实时PCR所得的扩增曲线为基础制成的、将Ct值(y轴)相对于基因组的拷贝数(x轴、对数值)作图而得的标准曲线。
图3是实施例3所得的、使用引物TcTI_Fw02m和引物TcTI_Rv02、使用来源于沙眼衣原体的DNA试样作为模板的实时PCR所得的扩增曲线。
图4是以在实施例3中进行的实时PCR所得的扩增曲线为基础制成的、将Ct值(y轴)相对于基因组的拷贝数(x轴、对数值)作图而得的标准曲线。
具体实施方式
本发明者们着眼于作为沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的内源性质粒的、被称为pLGV440的质粒。
沙眼衣原体的内源性质粒(隐蔽性质粒，cryptic plasmid)pLGV440基因的全碱基序列记载于非专利文献7的图2，大小为7498碱基，在本说明书中为序列号10所示的碱基序列。
在本发明中，记载为“沙眼衣原体的内源性质粒基因”的情况，有指上述的沙眼衣原体的内源性质粒(pLGV440)基因的全碱基序列的情况、和指该全碱基序列中的任意碱基序列单元(区)的情况。此外，以下有将“沙眼衣原体的内源性质粒”仅称为“内源性质粒”这样的情况。
本发明者们注意到来自内源性质粒(pLGV440)基因的特别的2个区。即，序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒(pLGV440)基因的、碱基号4133～碱基号4277的区(包含序列号1所示的碱基序列)、和碱基号32～碱基号176的区(包含序列号2所示的碱基序列)。本发明者们将序列号1所示的碱基序列命名为“TcTI_Fw01Rv01”，将序列号2所示的碱基序列命名为“TcTI_Fw02Rv02”。
然后，以这2个区的碱基序列为基础，设计能在沙眼衣原体的检测中利用的本发明的寡核苷酸。
即，本发明的寡核苷酸是“基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸。”(以下，有时简称为“本发明的寡核苷酸”)。
作为本发明所涉及的“基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸”的具体例，可列举序列表的“包含序列号1～9的任一项所示的碱基序列、或序列号1～9的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸”。
作为本发明所涉及的“序列号1～9的任一项所示的碱基序列的互补序列”，可列举例如含有与包含本发明的序列号1～9的任一项所示的碱基序列的寡核苷酸在严格条件或高严格条件下杂交的碱基序列的寡核苷酸。
这里所说的“严格条件”，具体是例如“在6×SSC或与这同等的盐浓度的杂交溶液中、在50～70℃的温度条件下进行16小时杂交，用6×SSC或与这同等的盐浓度的溶液等根据需要进行预洗涤，然后用1×SSC或与这同等的盐浓度的溶液等洗涤”这样的条件。
另外，这里所说的“高严格条件”，具体是例如“在50%甲酰胺中、在42～70℃、优选为60～70℃进行杂交，然后在0.2～2×SSC、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)中、在25～70℃洗涤”这样的条件。
例如，在使用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)等核酸扩增反应的沙眼衣原体的检测方法中，设定沙眼衣原体的基因的特定区的碱基序列作为靶，使用扩增该碱基序列的引物组，使用试样中的核酸作为模板进行PCR。然后在得到了目标引物延伸产物的情况下，可以判定试样中存在具有靶碱基序列的核酸，即，存在沙眼衣原体或其基因。
本发明所涉及的序列号1或序列号2所示的碱基序列、或序列号1或序列号2所示的碱基序列的互补序列可以成为上述的沙眼衣原体的检测时的靶。
如果具体地说明，则以序列号1或序列号2所示的碱基序列、或序列号1或序列号2所示的碱基序列的互补序列作为靶进行PCR。并且，如果得到了引物延伸产物，则可以判定试样中存在具有序列号1或序列号2所示的碱基序列、或序列号1或序列号2所示的碱基序列的互补序列的核酸，即试样中存在沙眼衣原体或其基因。
此外，还可以设定序列号1或序列号2所示的碱基序列、或序列号1或序列号2所示的碱基序列的互补序列中的、进一步特定的区的序列作为靶。即，例如设定序列号1所示的碱基序列中的、进一步特定的区的序列作为靶，设计扩增该序列的引物组。并且在使用该引物组的PCR中获得了的引物延伸产物的情况下，可以判定试样中存在具有靶碱基序列的核酸，即，存在沙眼衣原体或其基因。
另外，本发明的寡核苷酸还可以用于沙眼衣原体检测用引物或探针设计。即，基于本发明的序列号1或序列号1所示的碱基序列、或序列号2或序列号2所示的碱基序列的互补序列，按照后述的常规方法设计引物或探针即可。
作为本发明所涉及的与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸，可列举包含与沙眼衣原体的内源性质粒基因在高严格条件或严格条件下杂交的碱基序列的寡核苷酸等。该高严格条件和严格条件如上所述。
此外，序列号3、序列号4和序列号8所示的碱基序列是基于序列号1所示的碱基序列而设计的。
序列号5～序列号7、和序列号9所示的碱基序列是基于序列号2所示的碱基序列而设计的。
本发明的寡核苷酸既可以是脱氧核糖核酸(DNA)也可以是核糖核酸(RNA)。在核糖核酸的情况下，将胸苷残基(T)替换成尿苷残基(U)是不必说的。另外也可以是在合成时将任意位置的T变为U而进行合成而得的、包含尿苷残基的DNA。同样地也可以是将任意位置的U变为T的包含胸苷残基的RNA。另外，也可以是一个或多个核苷酸被缺失、插入或替换的寡核苷酸。一个或多个核苷酸也可以是胸苷(I)那样的修饰核苷酸。
作为得到本发明的寡核苷酸的方法，不特别限定，可列举例如：通过本身公知的化学合成法来调制的方法、通过使用载体等的基因操作法来获得寡核苷酸或多核苷酸的方法(克隆化法)等。由于在获得本发明的寡核苷酸中、15～30碱基左右的寡核苷酸的情况下，化学合成法由于可以容易、大量且廉价地获得一定品质的寡核苷酸，因而通常被利用。
例如，如果通过DNA的合成中通常进行的使用DNA合成仪，用通常的亚磷酰胺法合成寡核苷酸，使用阴离子交换柱色谱的常规方法来纯化，则可以得到作为目标的本发明的寡核苷酸。
另外，也可以从进行寡核苷酸的合成的委托商家购入。
本发明的引物是作为沙眼衣原体检测用而使用的引物，是“基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸引物”(以下，有时记载为“本发明的引物”)。
即，本发明的引物是基于序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒(pLGV440)基因的、碱基号4133～碱基号4277的区(包含序列号1所示的碱基序列)或碱基号32～碱基号176(包含序列号2所示的碱基序列)的区的碱基序列而设计的。而且，通过使用这些引物的核酸扩增反应，可以扩增上述区、或这些区内的进一步特定的区。
进而本发明的引物可以在上述区的碱基序列的互补序列的扩增中使用。
作为基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计引物的方法，可列举例如以下方法。即，考虑使用该引物的反应的种类[(PCR(包含实时PCR)等核酸扩增反应、核酸杂交等]和/或反应条件[例如解链温度(Tm值)等]，从序列号1或序列号2所示的碱基序列、或序列号1或序列号2所示的碱基序列的互补序列中选择出适当的区的适当的长度，从而设计引物即可。
另外，还可以使用一般用于引物设计的软件，例如引物设计用的Web工具Primer3(怀特黑德生物医学研究所，Whitehead Institute forBiomedical Research.)等设计引物。
另外，本发明的引物优选为被认为是具有维持作为引物序列的特异性所需的碱基数的10～50碱基、更优选为10～35碱基、进一步优选为18～25碱基的长度的寡核苷酸。
本发明的引物所使用的“基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸”(本发明的寡核苷酸)的具体例，如上述关于本发明的寡核苷酸的记载中所说明的那样。另外，本发明的引物中使用的寡核苷酸根据使用的条件、目的等可以在寡核苷酸中存在一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换。
作为本发明的引物的具体例，可列举“包含序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列、或序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸引物”。
另外，本发明的引物还包含“选自包含序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列或序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸的正向引物与反向引物的组合”。
此外，本发明的优选的引物、和在本发明中命名的该引物的名称示于下述表1。
表1
  序列号   引物的名称
  序列号3   TcTI_Fw01
  序列号4   TcTI_Rv01
  序列号5   TcTI_Fw02m
  序列号6   TcTI_Rv02
  序列号7   TcTI_Fw02
获得本发明的引物的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所记载。
另外，本发明的引物可以被标记物质标记。
作为标记本发明的引物的方法，可列举本领域中通常进行的寡核苷酸的标记方法，根据每种标记物质选择适宜的方法即可。
作为用于将本发明的引物用标记物质标记的标记物质，只要是放射性同位素和/或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，任一种均可使用。
例如，作为放射性同位素可列举32P、33P、35S等，作为酶可列举碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等，作为荧光物质可列举Alexa555、Alexa647(ィンビトロジエン社)、花青染料(Cyanine Dye)系的Cy3，Cy5(アマシヤムバィオサィエンス株式会社)、荧光素等，作为发光物质可列举包含吖啶酯的化学发光试剂等。
作为将本发明的引物用放射性同位素标记的方法，可列举：通过在合成引物时引入被放射性同位素标记的核苷酸来标记引物的方法，和/或合成引物之后用放射性同位素标记的方法等。具体可列举一般常用的随机引物法、缺口平移法、利用T4多核苷酸激酶的5’-末端标记法、使用末端脱氧核苷酸转移酶的3’-末端标记法、RNA标记法等。
作为将本发明的引物用酶标记的方法，可列举使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与要标记的引物直接共价结合等、作为本领域的常规方法的直接标记法。
作为将本发明的引物用荧光物质标记的方法，可列举例如将荧光素标记的核苷酸通过本领域中的常规方法的标记方法引入引物中的方法。另外，通过将具有连接臂的核苷酸替换到序列的寡核苷酸中的方法(例如，参照Nucleic Acids Res.,1986年,第14卷,p.6115)，也可以将核苷酸用荧光物质标记。例如有，通过日本特开昭60-500717号公报所公开的合成法，从脱氧尿苷化学合成5位具有连接臂的尿苷，合成含有该脱氧尿苷的寡核苷酸，接着在该寡核苷酸链中导入荧光物质的方法(日本特开昭60-50717号公报)。
作为将本发明的引物用发光物质标记的方法和用生物素标记的方法，可列举通常本领域中进行的将核苷酸进行发光标记或生物素标记的常规方法。
本发明的探针是作为沙眼衣原体检测用而使用的探针，“基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸探针”(以下，有时记载为“本发明的探针”)。
另外，本发明的探针包含能够与序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒基因的、相当于碱基序列1的碱基号4133～碱基号4277的区或相当于碱基序列2的碱基号32～碱基号176的区的碱基序列、或这些区内的进一步特定的区的碱基序列杂交的探针。
进而本发明的探针包含可以与上述的区的碱基序列的互补序列杂交的探针。
本发明的探针根据PCR(包含实时PCR)等核酸扩增反应、核酸杂交等的条件，从序列号1或序列号2所示的碱基序列、或序列号1或序列号2所示的碱基序列的互补序列中，考虑解链温度(Tm值)等选择适当的区的适当的长度来设计即可。但是，如果希望对探针具有充分的特异性，则优选考虑维持作为探针序列的特异性所需的碱基数来设计。
例如，作为在核酸扩增法(例如TaqManTM法、Molecular Beacon(分子信标)法等)等中使用的探针，优选具有10～50个碱基、优选为15～40个碱基、进一步优选为20～30个碱基的长度的探针。
另外，作为在例如核酸杂交法(例如DNA杂交(Southern hybridization)等)等中使用探针，优选具有10～700个碱基、优选为100～600个碱基、进一步优选为100～500个碱基的长度的探针。
本发明的探针中使用的、“基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸”(本发明的寡核苷酸)的具体例，如上述的本发明的寡核苷酸的说明中所记载。
作为本发明的探针的具体例，可列举例如，用上述的方法基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的、包含序列号1～序列号9的任一项所示的碱基序列、或序列号1～序列号9的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸探针。
作为优选的探针，可列举包含序列号8和序列号9的任一项所示的碱基序列、或序列号8和序列号9的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸探针。
获得本发明的探针的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所记载。
进而，本发明的探针可以被标记物质标记。
作为用于将本发明的探针用标记物质标记的标记物质，只要是放射性同位素和/或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，则任一种均可使用。
作为用于将本发明的探针用标记物质标记的、标记物质的具体例和标记方法，可列举与本发明的引物的标记方法的说明中所记载的方法相同的方法。
另外，作为在后述的利用实时检测法(例如TaqManTM实时PCR法等实时PCR)的检测法中使用的标记探针，可列举例如，在实时PCR法中通常使用的5’末端被报告荧光物质标记、3’末端被猝灭色素标记的本发明的探针。
作为标记本发明所涉及的探针的5’末端的报告荧光物质，可列举羧基荧光素(FAMTM、Applera Corporation商品名)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、Texas RedTM(Molecular Probes社商品名)、Cy5、VIC等。
作为标记本发明所涉及的探针的3’末端的猝灭色素，可列举例如，羧基四甲基罗丹明(TAMRATM、Applera Corporation商品名)等荧光物质、Black Hole Quencher色素(BHQTM、Biosearch Technologies Inc.NovatoCA商品名)，4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质。
作为具体的标记探针，可列举例如，将包含序列号8和序列号9的任一项所示的碱基序列、或序列号8和序列号9的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸用报告荧光物质和猝灭色素标记而得的标记探针。
在后述的利用TaqManTM实时检测法的检测法中也可以使用上述的标记探针。
本发明的沙眼衣原体的检测方法中的“检测”，还包含通过扩增和/或检测沙眼衣原体所具有的内源性质粒的碱基序列中的一部分，从而检测患者样本等各种临床材料中的沙眼衣原体的情况，和/或判定分离、培养的菌体的菌种的情况等。另外，作为本发明的检测法的用途，不限于临床领域中的检测，还包含研究室等的基础实验中的检测。
作为本发明所涉及的沙眼衣原体的检测中使用的样本(specimen)，可列举例如，尿、尿道拭子悬浮液、颈管拭子悬浮液、口腔拭子悬浮液等各种临床样本。这些样本在检测之前，也可以作为前处理预先进行样本中存在的菌的浓缩、分离、和/或从菌体的核酸的分离、浓缩等操作。作为其方法，有利用酶、表面活性剂、碱、热的处理等。
另外，作为本发明中的试样，除了上述各种临床材料之外，还包含培养菌体、和/或由这些菌体分离、纯化的核酸等。另外，也可以是扩增的核酸。
为了从上述试样提取和/或纯化DNA，按照来自样本的衣原体DNA提取中使用的常规方法进行即可。
例如，通过下述的方法进行即可。
首先，需要破坏试样中的衣原体的细胞壁。作为其方法，例如在以菌体为试样的情况下，可列举例如，用SDS等表面活性剂、和/或硫氰酸胍(GTC)等蛋白变性剂处理菌体而破坏衣原体的膜结构的方法，或用玻璃珠等物理地破碎菌体的方法等。
破坏衣原体的细胞壁之后，通过本领域一般的DNA的调制法[酚-氯仿提取、乙醇沉淀法、Rapid and simple method for purification of nucleicacids、J.Clin.Microbiol.,1990,Mar;28(3),495-503,Boom R,Sol CJ,Salimans MM,Jansen CL,Wertheim-van Dillen PM,van der Noordaa J中记载的方法、使用异丙醇进行沉淀的方法等]来进行DNA的提取和纯化即可。
对于DNA的提取和纯化，由于市售有用于DNA的提取和纯化的各种试剂盒，因而可以使用这些试剂盒。例如使用(株)キアゲン制离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip等进行DNA的提取、纯化即可。
本发明的沙眼衣原体的检测方法是“沙眼衣原体的检测方法，其特征在于，使用基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)作为引物(本发明的引物)，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测该反应的结果生成的产物。”
上述方法即，以序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒基因的、碱基号4133～碱基号4277的区(序列号1)或碱基号32～碱基号176(序列号2)的区、或这些区内进一步特定的区作为靶，通过确认试样中是否存在具有这些区的碱基序列的寡核苷酸，来检测沙眼衣原体的方法。
作为在PCR等核酸扩增反应中使用的本发明的引物的具体例，可列举例如，包含序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列、或序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸引物。
另外，作为在核酸扩增反应中使用的优选的引物的组合(引物对)，可列举下述引物对。
(1)包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、
(2)包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、
(3)包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物。
在使用上述引物的实时PCR等核酸扩增反应中使用的其他脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂使用通常本领域使用的试剂即可，除了使用本发明的引物和探针以外，其条件、方法等按照PCR法的一般方案进行即可。
以下，对于本发明的沙眼衣原体的检测方法的具体例进行说明。
(A)沙眼衣原体的检测方法，其特征在于，使用本发明的寡核苷酸作为引物，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测该反应的结果生成的产物。
在(A)的方法中，作为使用本发明的引物进行核酸扩增反应的方法，可列举例如，使用本发明的引物，使用试样中的核酸作为模板通过DNA聚合酶等进行核酸扩增反应[例如聚合酶链反应(PCR)法、LAMP(环介导等温扩增，Loop-mediated Isothermal Amplification)法(Tsugunori Notomi et al.,Nucleic Acid Res.,28,e63,2000)、ICANTM(等温和嵌合引物起始的核酸扩增，Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleicacids)法(临床病理,51(11),1061-1067,2003,Nov)、LCR(连接酶链反应，ligase chain reaction)法(日本特开平4-211399号)、SDA(链置换扩增，stranddisplacement amplification)法(日本特开平8-19394号)]的方法。因为由此能够扩增沙眼衣原体的内源性质粒基因的特定的区的序列，所以通过检测-测定所得的引物延伸产物，可以检测沙眼衣原体。
在进行上述核酸扩增反应的方法中，可列举PCR法作为最一般的方法。
另外，作为进行核酸扩增反应的方法，可以使用例如实时扩增检测法(例如参照美国专利第5210015号、美国专利第5538848号的记载)。另外，作为利用实时扩增检测法的检测法的例子，可列举例如实时PCR检测法。
作为实时PCR检测法的例子，可列举TaqManTM实时PCR法(例如参照美国专利第5538848号的记载)、MGB Eclipse Probe System(MGBEclipse探针系统)法(例如参照美国专利第5,801,155号的记载)、MolecularBeacons Probe Technology(分子信标探针技术)法(例如参照美国专利第5925517号的记载)、LUX Fluorogenic Primer(LUX荧光引物)法(Invitrogen Corporation)、Quenching probe-PCR(猝灭探针PCR，QP)法(例如参照美国专利第6,492,121号的记载)等。
“检测核酸扩增反应的结果生成的产物方法”可列举通常本领域进行的常规方法，不特别限定。
可列举例如，上述的实时PCR检测法的例子中所列举的方法；嵌入剂法；以及进行核酸扩增反应之后，对于所得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果而进行的方法；进行使用标记引物的核酸扩增反应，测定所得的引物延伸产物的标记的方法等各种检测法。
其中，作为一般常用的方法，可列举例如以下方法。
(A-1)TaqManTM实时PCR法(TaqManTM探针法)；
(A-2)嵌入剂法；
(A-3)进行核酸扩增反应之后，对于所得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果进行的方法；
(A-4)进行使用标记引物的核酸扩增反应，测定所得的引物延伸产物的标记的方法。
以下对于各个方法进行说明。
(A-1)TaqManTM实时PCR法(TaqManTM探针法)
TaqManTM实时PCR法，是使用将5’末端用例如FAM等荧光色素(报告色素)标记、将3’末端用例如TAMRA等猝灭色素标记而得的探针进行实时PCR，实时地监控该荧光强度的方法，是高灵敏度且定量地检测目标的微量DNA的方法。
在该方法中，可以正确地定量模板DNA的初始量。
另外，TaqManTM实时PCR法由于非特异性的扩增反应而造成的噪声的发生非常少。因此，从能更特异性地进行靶的扩增-检测的方面考虑，是特别优异的方法。
作为在利用TaqManTM实时PCR法的本发明所涉及的检测法中使用的引物，可使用本发明的引物。作为优选的本发明的引物，可列举在上述的PCR法等核酸扩增反应中使用的引物，其优选的具体例和优选的引物的组合也如上所述。
作为在本发明所涉及的TaqManTM实时PCR法中使用的、将5’末端用荧光色素(报告色素)标记、将3’末端用猝灭色素标记而得的探针中所用的探针，只要是上述的本发明的探针即可。实际上，可使用含有预测在用选择的引物的组合进行实时PCR时得到的引物延伸产物的碱基序列的探针、或含有进一步由该序列设计的碱基序列的探针。
例如，在以沙眼衣原体的内源性质粒基因的、碱基号4133～碱基号4277的区作为靶实施本发明的检测法时，例如使用以该区的碱基序列(用序列号1表示)为基础设计的引物TcTI_Fw01(序列号3)和引物TcTI_Rv01(序列号4)进行TaqManTM实时PCR。这种情况下，可扩增该区中的全区。因此，在使用引物TcTI_Fw01(序列号3)和引物TcTI_Rv01(序列号4)进行检测的情况下，使用以该区的碱基序列(序列号1)为基础设计的寡核苷酸作为探针。可列举例如，包含序列号8所示的序列的寡核苷酸(称为“TcTI_FwRv1”)。
另外，以内源性质粒基因的、碱基号32～碱基号176的区作为靶实施本发明的检测法时，例如使用以该区的碱基序列(用序列号2表示)为基础设计的引物TcTI_Fw02m(序列号5)和引物TcTI_Rv02(序列号6)进行TaqManTM实时PCR。这种情况下，该区中的碱基号63～碱基号176的区被扩增。因此，在使用引物TcTI_Fw02m(序列号5)和引物TcTI_Rv02(序列号6)进行检测的情况下，使用以碱基号63～碱基号176的区为基础设计的寡核苷酸作为探针。可列举例如，包含序列号9所示的序列的寡核苷酸(称为“TcTI_FwRv2”)。
另外，使用以内源性质粒基因的、碱基号32～碱基号176的区的碱基序列为基础设计的其他引物TcTI_Fw02(序列号7)和引物TcTI_Rv02(序列号6)进行TaqManTM实时PCR。这种情况下，该区中的全区(碱基号32～碱基号176)被扩增。因此，在使用引物TcTI_Fw02(序列号7)和引物TcTI_Rv02(序列号6)进行检测的情况下，使用以碱基号32～碱基号176的区为基础设计的寡核苷酸作为探针。这种情况下，也可以使用例如包含序列号9所示的序列的寡核苷酸(称为“TcTI_FwRv2”)。
在TaqManTM实时PCR法中使用的其他脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂使用通常在实时PCR中使用的试剂即可，TaqManTM实时PCR的方法除了使用本发明的引物和探针以外，按照TaqManTM实时PCR的一般方案进行即可。
说明利用了TaqManTM实时PCR法的“检测核酸扩增反应的结果生成的产物的方法”的例子，则如下。
使用本发明的引物、和本发明的探针的5’末端被报告荧光色素标记、3’末端被猝灭色素标记的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行PCR，检测来源于由该标记探针游离的报告荧光色素的荧光。其结果在测定到来源于报告荧光色素的荧光的情况下，判定被检试样为沙眼衣原体阳性(即，被检试样中存在沙眼衣原体、或其基因或基因片段。以下相同)。
另外，因为在TaqManTM实时PCR法中可以制成标准曲线，所以可以获得试样中的沙眼衣原体的基因组DNA的数(拷贝数)。另外，因为该数与沙眼衣原体的数成比例，所以也可以知道试样(被检试样)中的沙眼衣原体的数。
标准曲线的制成方法按照实时PCR法中通常进行的常规方法即可。例如，作为标准使用拷贝数已知(稀释系列)的沙眼衣原体的基因组DNA试样，按照上述方法进行TaqManTM实时PCR，测定报告色素的荧光强度。以所得的荧光强度为基础通过常规方法制成扩增曲线。由所得的扩增曲线通过常规方法获得循环阈(Threshold cycle，Ct)值，将Ct值(y轴)相对于实时PCR中使用的DNA试样的拷贝数的对数值(x轴)作图，以对各Ct所得的近似曲线作为标准曲线即可。
为了定量试样中的沙眼衣原体的基因组DNA的数(拷贝数)，使用通过如上所述的常规方法获得的标准曲线即可。
即，使用拷贝数已知的沙眼衣原体的基因组DNA试样，按照上述方法进行TaqManTM实时PCR，同样地制成扩增曲线。获得制成标准曲线时的阈值线(Threshold line，Th)与所得的扩增曲线交差的Ct值(循环阈值，threshold cycle value)。通过将该Ct值代入标准曲线，可以获得试样中的沙眼衣原体的基因组DNA量(拷贝数)。
作为本发明的沙眼衣原体的检测方法中的TaqManTM实时PCR法的具体例，可列举例如下述的方法。
(1)使用包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号8所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用报告色素和猝灭色素进行标记而得的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测从该标记探针游离出的标记物质，
(2)使用包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用报告色素和猝灭色素进行标记而得的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测从该标记探针游离出的标记物质，
(3)使用包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用报告色素和猝灭色素进行标记而得的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测从该标记探针游离出的标记物质。
作为利用本发明所涉及的TaqManTM实时PCR法的沙眼衣原体的检测方法的一例，使用上述的本发明的“引物TcTI_Fw01”和“引物TcTI_Rv01”，以检测沙眼衣原体的情况为例说明，则如下。
首先，通过公知的方法从应检测沙眼衣原体的试样(被检试样)中获得纯化DNA试样。
另外，例如使用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法合成包含序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸(TcTI_Fw01)、和包含序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸(TcTI_Rv01)。
另外，从预想通过使用TcTI_Fw01和TcTI_Rv01的引物对的PCR而被扩增的碱基序列中，作为用作探针的序列，设计序列号8所示的碱基序列(TcTI_FwRv1)，合成具有该碱基序列的寡核苷酸。通过常规方法在该寡核苷酸的5’末端结合报告色素FAM、在3’末端结合报告消光体TAMRA，获得荧光标记探针。
使用上述合成的TcTI_Fw01和TcTI_Rv01作为扩增用引物，例如下述那样进行实时PCR。
即，调制含有各0.1～2μM、优选为各1μM的引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01、100～1000nM的荧光标记探针、1.0～4.0mM MgCl2、KCl、BSA、胆酸钠、0.005～0.2%TritonX-100、各0.2mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10～80单元/ml的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.9)，作为PCR用反应液。在该PCR用反应液20μl中加入纯化DNA试样1ng，得到PCR用试样。
使用该PCR用试样，使用实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应重复30～50次循环，每1次循环测定来源于报告色素的荧光强度量。
此时，在测定到来源于报告色素的荧光的情况下，判定为沙眼衣原体阳性。
进而，通过用上述方法制成标准曲线，从而可以知晓试样(被检试样)中的沙眼衣原体的数。
(A-2)嵌入剂法
通过利用公知的嵌入剂进行实时PCR等的实时核酸扩增反应的通常的嵌入剂法，可以“检测核酸扩增反应的结果生成的产物”。
嵌入剂法因为在核酸扩增反应之后不需要进行电泳，所以在临床检查领域等需要迅速地进行检测的情况下，是有效的方法。
作为在利用了嵌入剂法的本发明所涉及的检测法中使用的引物，可使用本发明的引物。作为优选的本发明的引物，可列举在上述的PCR法等核酸扩增反应中使用的引物，其优选的具体例和优选的引物的组合也如上所述。
作为在本发明所涉及的嵌入剂法中使用的嵌入剂，只要是通常在本领域中使用的嵌入剂，则任一种均可使用，例如有SYBRTM Green I(Molecular Probe社商品名)、溴化乙锭、芴等。
说明利用嵌入剂法的“检测核酸扩增反应的结果生成的产物的方法”的例子，则如下。
使用本发明的引物和嵌入剂(例如SYBRTM Green I)，使用从应检测沙眼衣原体的试样(被检试样)中纯化的纯化DNA试样作为模板，使用TaqDNA聚合酶等聚合酶进行实时PCR。然后测定来源于与引物延伸产物的扩增量相关地嵌入的嵌入剂的荧光强度。
接着，以横轴为引物延伸产物(双链DNA)的解链温度、纵轴取荧光强度的1次微分(变化量)制成熔解曲线。使用该曲线进行引物延伸产物的熔解曲线分析，进行峰的检测。另一方面，使用沙眼衣原体的type strain(模式株)进行同样的测定，进行峰的检测。使用被检试样所得的结果是，得到了单一的峰，并且在该峰的Tm值(Tm峰值)与使用沙眼衣原体的模式株得到的Tm峰值相同的情况下，判定被检试样为沙眼衣原体阳性。
但是，在使用相同的仪器进行被检试样中的沙眼衣原体的检测的情况下，只要一次确认了模式株的Tm峰值，则以后的被检试样的检查就使用该Tm峰值即可，无需每次检查都重新进行模式株的Tm峰值的确认。
另外，因为可以以利用嵌入剂法的方法得到的测定值为基础，按照实时PCR中进行的常规方法制成标准曲线，所示可以使用该标准曲线获得试样中的沙眼衣原体的基因组DNA量(拷贝数)。
标准曲线的制成方法按照实时PCR法中通常进行常规方法即可。例如，作为标准使用拷贝数已知(稀释系列)的沙眼衣原体的基因组DNA试样，按照上述方法进行实时PCR，测定来源于嵌入剂的荧光强度，同样地制成扩增曲线。由所得的扩增曲线通过常规方法得到Ct值。然后，将Ct值(y轴)相对于实时PCR中使用的各PCR用DNA试样的拷贝数的对数值(x轴)作图，将对各Ct得到的近似曲线作为标准曲线即可。
为了定量试样中的沙眼衣原体的基因组DNA的数(拷贝数)，使用通过如上所述的常规方法得到的标准曲线即可。
即，从检测沙眼衣原体的试样中分离纯化DNA之后，对于所得的DNA试样同样地进行利用嵌入剂法的实时PCR，同样地制成扩增曲线，得到制成标准曲线时的阈值线(threshold line，Th)与所得的扩增曲线交差的Ct值(循环阈值，threshold cycle value)。通过将该Ct值代入标准曲线，从而可以得到试样中的沙眼衣原体的基因组DNA量(拷贝数)。
作为本发明所涉及的、利用使用嵌入剂的实时PCR法的沙眼衣原体的检测方法的一例，如果以使用上述的本发明的“引物TcTI_Fw01”和“引物TcTI_Rv01”检测沙眼衣原体的情况为例进行说明，则如下。
首先，从应检测沙眼衣原体的试样(被检试样)中通过公知的方法获得纯化DNA试样。
另外，例如使用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法合成包含序列号1所示的碱基序列寡核苷酸(TcTI_Fw01)、和包含序列号2所示的碱基序列寡核苷酸(TcTI_Rv01)。
使用合成的TcTI_Fw01和TcTI_Rv01作为扩增用引物，例如如下地进行实时PCR。
即，调制含有引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01各50～2000nM、稀释至原液的约5～100000倍的嵌入剂[例如SYBRTM Green I(MolecularProbe社商品名)]、1.0～4.0mM MgCl2、KCl、BSA、胆酸钠、0.005～0.2%TritonX-100、各0.2mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10～80单元/ml的聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.9)，作为PCR用反应液。该PCR用反应液中加入从应检测沙眼衣原体的试样(被检试样)中纯化的纯化DNA试样，作为PCR用试样。使用该PCR用试样，使用实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应重复30～50次循环，每1次循环测定与引物延伸产物的扩增量相关地嵌入的SYBRTM GreenI的荧光强度。
接着，以横轴为引物延伸产物(双链DNA)的解链温度、纵轴取荧光强度的1次微分(变化量)制成熔解曲线。使用该曲线进行引物延伸产物的熔解曲线分析，并进行峰的检测。在确认了所得的峰为单一的峰，且与使用沙眼衣原体的模式株同样地进行测定而得的峰的解链温度出现在相同位置的情况下，判定被检试样为沙眼衣原体阳性。
进而可以通过上述的方法制成标准曲线，从而得知试样(被检试样)中的沙眼衣原体的数。
(A-3)进行核酸扩增反应之后，对于所得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果进行的方法
该方法中的核酸扩增反应的具体例如上所述。可列举例如，通常的PCR法等核酸扩增法、和/或实时PCR法等实时核酸扩增法等。
作为对于核酸扩增反应所得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果检测沙眼衣原体的方法，可列举例如以下(A-3-1)～(A-3-3)等。
(A-3-1)通过确认目的大小(碱基对数)的引物延伸产物级分来进行的方法；
(A-3-2)通过使用标记探针的杂交来检测的方法、
(A-3-3)检测来源于电泳级分的嵌入剂的荧光的方法等。
电泳法的条件、操作方法等按照本领域通常进行的常规方法即可。
以下对于各方法进行说明。
(A-3-1)通过确认目的大小(碱基对数)的引物延伸产物级分来进行的方法
例如，对于进行核酸扩增反应所得的引物延伸产物进行电泳。
另外，预先由核酸扩增反应中使用的引物的组合，预测要扩增的引物延伸产物的大小(碱基对数)。
然后，通过常规方法确认所得的电泳级分是否对应于预测的大小的引物延伸产物即可。可列举例如，通过将所得的电泳级分用溴化乙锭等染色而将核酸种可视化这样的方法，将该级分染色，确认其引物延伸产物的大小等的方法。然后，在确认了预想被使用的该引物的组合扩增的碱基序列的寡核苷酸、或其碱基对数的大小的级分的情况下，判定“该被检试样为沙眼衣原体阳性”。
(A-3-2)通过使用标记探针的杂交来检测的方法
例如对于进行核酸扩增反应所得的引物延伸产物进行电泳。
另外，由在核酸扩增反应中使用的引物的组合，以预测被扩增的引物延伸产物的碱基序列为基础设计探针，得到将其用标记物质标记而得的标记探针。
对于所得的电泳级分进行针对标记探针的杂交。然后，检测该标记探针的标记，在其结果确认了与该标记探针杂交的级分存在的情况下，判定“该被检试样为沙眼衣原体阳性”。
该方法中使用的探针和用于标记探针的标记物质的具体例、以及探针的标记方法如上所述。
(A-3-3)检测来源于电泳级分的嵌入剂的荧光的方法
例如可列举下述方法。
(i)使用本发明的寡核苷酸作为引物，以试样中的核酸作为模板进行利用嵌入剂法的核酸扩增反应。
(ii)对于(i)所得的引物延伸产物进行电泳。
(iii)对于电泳级分进行通常的荧光检测。
即，如果通过核酸扩增反应获得了引物延伸产物，则应该检测到来源于插入了该引物延伸产物的嵌入剂的荧光。因此，在检测到发出来源于嵌入剂的荧光的电泳级分的情况下，判定“该被检试样为沙眼衣原体阳性”。
另外本发明在核酸扩增工序中可以应用利用了RNA转录产物的检测法。可列举例如，NASBA(核酸序列依赖性扩增，nucleic acid sequence basedamplification)法(日本特许第2650159号)、3SR(自主序列复制，self-sustained sequence replication)法(日本特公平7-114718号)、TAS(转录依赖扩增系统，transcription based amplification system)法(日本特表平2-500565号：国际公开WO88/10315号)、TMA(转录介导扩增，transcriptionmediated amplification)法(日本特开平11-46778号)等。其中，利用逆转录酶和RNA聚合酶的协同作用(在逆转录酶和RNA聚合酶协同作用的条件下进行反应)的恒温核酸扩增法是适合将测定系统自动化的情况的方法。
(A-4)进行使用标记引物的核酸扩增反应，测定所得的引物延伸产物的标记的方法
作为(A-4)的方法，可列举：使用将本发明的引物用上述的方法标记而得的标记引物，使用被检试样中的核酸作为模板进行PCR等核酸扩增反应，对所得的引物延伸产物的标记进行检测和/或测定，在能检测到标记的情况下，判定该被检试样为沙眼衣原体阳性的方法。
在上述方法的情况下，在进行核酸扩增反应之后、测定引物延伸产物的标记之前，可以进行用公知的方法除去游离的标记引物的操作。作为除去游离的标记引物的方法，可列举例如：通过沉淀核酸的常规方法(乙醇沉淀法、使用异丙醇的沉淀法等)使进行核酸扩增反应反应而得的反应产物中的引物延伸产物沉淀，然后除去含有未沉淀的游离的标记引物的上清的方法等。
另外，还可列举：将进行核酸扩增反应所得的反应产物在适当的条件下用凝胶色谱法处理，从而分离引物延伸产物与游离的标记引物的方法；通过电泳法进行分离的方法等。
此外，除了以上的方法以外，还有(B)仅使用本发明的探针来检测沙眼衣原体的方法。在该方法中不进行所谓核酸扩增反应。
具体可列举例如如下所述的方法。
(B-1)使用使被标记物质标记的固相载体与本发明的探针结合而得的产物、或使固相载体与被标记物质标记的本发明的探针(标记探针)结合而得的产物作为捕捉探针的方法。使该捕捉探针与被检试样中的核酸杂交，使试样中的来源于沙眼衣原体的核酸固定化于固相上，然后通过常规方法检测标记探针的标记、或标记载体的标记(例如，参照日本特开昭62-265999号的记载)。
在检测到标记的情况下，判定“该被检试样为沙眼衣原体阳性”。
(B-2)使用未被标记的(B-1)的捕捉探针、和将本发明的探针进行标记而得的标记探针的方法。通过进行使这两种探针与被检试样中的核酸杂交，在固相载体上形成捕捉探针、来源于沙眼衣原体的核酸和标记探针的复合体，测定标记探针的标记的夹心分析(例如，参照日本特开昭58-40099号的记载)，来检测沙眼嗜衣原体。
在检测到标记的情况下，判定“该被检试样为沙眼衣原体阳性”。
(B-3)使用以生物素标记了的本发明的探针，与试样中的核酸杂交后，用亲和素结合载体捕捉试样中的来源于沙眼衣原体的核酸，通过常规方法检测来源于沙眼衣原体的核酸与亲和素结合载体的复合体。
在检测到复合体的情况下，判定“该被检试样为沙眼衣原体阳性”。
此外，在本发明的沙眼衣原体的检测方法中使用试剂中可以使用通常本领域中使用的试剂类，例如缓冲剂、稳定化剂、防腐剂等不抑制共存的试剂等的稳定性且不抑制PCR等核酸扩增反应和/或杂交反应的试剂。另外，其浓度也从通常本领域中通常使用的浓度范围中适宜选择即可。
如果列举缓冲液的具体例，则可列举例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、good’s缓冲液等实施通常的PCR等核酸扩增反应和/或杂交反应时使用的所有缓冲液，对其pH值也不特别限定，通常优选为5～9的范围。
另外，根据需要可使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、适应酶的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(溴化乙锭、SYBRTM Green等)、FAM、TAMRA等标记检测物质等。
作为本发明的沙眼衣原体检测用试剂盒，可列举“包含基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物或/和探针的沙眼衣原体检测用试剂盒。”
构成上述试剂盒的本发明的引物和本发明的探针的具体例，如上述的关于“本发明的引物”、“本发明的探针”的说明中所记载。
本发明的引物和/或探针可以是被标记物质标记的引物和/或探针。该标记物质的具体例子如上所述。
包含本发明的引物的试剂盒还包含含有引物对的组成。引物对的优选的组合如下所述。
(1)包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、
(2)包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、
(3)包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物。
另外，上述试剂盒可以进一步含有将本发明的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针。
例如，可列举下述的构成。
(1’)包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号8所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针、
(2’)包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针、
(3’)包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针。
构成这些试剂盒的构成试剂的优选方式和具体例如上所述。
此外，本发明的沙眼衣原体检测用试剂盒中还可以包含例如缓冲剂、稳定化剂、防腐剂等不抑制共存的试剂等的稳定性且不抑制PCR和/或杂交反应的试剂。另外，其浓度也从通常本领域中通常使用的浓度范围中适宜选择即可。
如果列举缓冲液的具体例，可列举例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、good’s缓冲液等实施通常的PCR和/或杂交反应时使用的所有缓冲液，对其pH值也不特别限定，通常优选为5～9的范围。
另外，根据需要还可以包含核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、适应酶的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(SYBRTMGreen、溴化乙锭等)、FAM、TAMRA等标记检测物质等。
以下列举实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限定。
实施例
实施例中使用的细菌均为临床分离株，是培养后已经通过菌落的形状和/或现有的各种生物化学试验等鉴别了菌种的菌株。
实施例1.进行以沙眼衣原体(C.trachomatis)的内源性质粒(pLGV440)上的碱基序列为靶的DNA扩增反应，进行本发明的引物的特异性评价。
(1)靶序列的确定 在本发明中，从沙眼衣原体的内源性质粒(pLGV440)的基因序列(序列号10)中，作为用于沙眼衣原体的检测的靶序列，从序列号10中选择出第4133～4277位的145bp的碱基序列、以及第32～176位的145bp的碱基序列。将各个序列命名为TcTI_Fw01Rv01、TcTI_Fw02Rv02。TcTI_Fw01Rv01的碱基序列示于序列表的序列号1，TcTI_Fw02Rv02的碱基序列示于序列表的序列号2。
(2)引物的设计和合成从上述(1)所特定的靶序列TcTI_Fw01Rv01的序列中，设计出用于PCR扩增检测的引物、即“5’-cgctcaaggaccagcaaata-3’”(以下称为“TcTI_Fw01”，序列号3)和“5’-gctttttccgcatccaaac-3’”(以下称为“TcTI_Rv01”，序列号4)。
寡核苷酸的合成委托シグマジエノシス社，获得具有设计的碱基序列的合成寡核苷酸。使用该合成寡核苷酸作为引物。
(3)标记探针的设计和合成
由预测在使用上述(2)所设计的TcTI_Fw01和TcTI_Rv01的引物的组合的PCR中被扩增的核酸序列，设计用作探针的序列。设计的寡核苷酸的碱基序列用序列号8表示，命名为“TcTI_FwRv1”。
进而，设计在“TcTI_FwRv1”的5’末端化学结合了报告色素TexasRedTM、在3’末端化学结合了报告消光体BHQ2TM的标记寡核苷酸探针。
寡核苷酸的合成和标记委托シグマジエノシス社，得到设计的标记探针。
(4)DNA试样的调制
按照常规方法培养下述表2所示的各衣原体(衣原体(Chlamydia)属：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis),肺炎衣原体(Chlamydia  pneumoniae),鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci),家畜衣原体(Chlamydia  pecorum)；嗜衣原体属(Chlamydophila)：豚鼠嗜衣原体(Chlamydophila  caviae))，然后使用公知的核酸纯化方法获得纯化基因组DNA。将所得的各个纯化DNA调制成最终1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH值8.9)，作为DNA试样。
此外，使用的细菌株全部由冈山大学医学部公文裕巳教授的研究室提供。
表2
Figure BDA00002173652500291
(5)实时PCR
1)PCR用反应液的调制
调制含有上述(2)所得的引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01各1μM、上述(3)所得的标记探针195nM、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Taq DNA聚合酶((株)ニッポン-ジ一ン制)40单元/ml的10mMTris-HCl缓冲液(pH值8.9)，作为PCR用反应液。
2)实时PCR
在PCR用反应液20μl中加入上述(4)所调制的DNA试样1μL作为PCR用试样，将该PCR用试样加入定量PCR反应用玻璃毛细管(ロシュ社制)中，使用定量PCR专用热循环检测器(LightCycler2.0、ロシュ社制)进行实时PCR。反应在95℃保温10分钟，然后将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复50个循环，每1个循环测定来源于报告色素的荧光量。此外，荧光量使用测定中使用的热循环仪的、将与供测定的每个玻璃毛细管对应的荧光强度比数值化的功能来求得。
(6)结果
将所得的实时PCR的结果归纳于下述表3。在表3中，判定为阳性表示检测到了荧光信号。另一方面，判定为阴性显示未检测到荧光信号。
表3
Figure BDA00002173652500301
如由表3的结果可明确的那样，使用本发明的引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01的组合以及本发明的标记探针进行实时PCR，进行扩增的核酸的检测，结果是，仅在使用来源于沙眼衣原体的各株的基因组DNA试样为模板的情况下，可以确认核酸扩增的结果所生成的荧光信号。即，可以判定这些试样为沙眼衣原体阳性。与此相对，在使用来源于除沙眼衣原体以外的菌体的基因组DNA作为模板，使用相同的引物的组合同样地进行实时PCR的情况下，不能确认该荧光信号。即，可以判定这些试样全部为沙眼衣原体阴性。
由以上判断，通过使用本发明的引物和探针进行核酸扩增反应，可以特异性地检测沙眼衣原体。另外，本发明的引物和探针对沙眼衣原体的特异性高。因此，可以期待以下可能性：可以不分离衣原体而将由临床材料获得的核酸直接在使用本发明的引物和探针的使用PCR等的核酸扩增反应的检测法中使用。
实施例2.
利用实时检测系统，进行使用了本发明所特定的引物序列的基因扩增系统中的检测灵敏度的测定。
(1)引物
使用实施例1(2)所得的TcTI_Fw01和TcTI_Rv01。
(2)标记探针的制作
使用实施例1(3)中制作的、在寡核苷酸“TcTI_FwRv1”的5’末端化学结合了报告色素Texas RedTM、在3’末端化学结合了报告消光体的BHQ2TM的标记寡核苷酸探针。
(3)PCR用DNA试样的调制
按照常规方法培养表2的沙眼衣原体(D(血清变型)株)，然后用与实施例1(4)同样的方法使用公知的核酸纯化方法获得纯化基因组DNA。将该纯化基因组DNA溶解于10mM Tris-HCl缓冲液中，测定吸光度。由所得的吸光度测定值计算出摩尔数，从而确定DNA试样中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。
接着使用pH值8.9的10mM Tris-HCl缓冲液调制将DNA试样稀释为106、105、104、103、102、10、5拷贝/μL的稀释系列的试样，作为PCR用DNA试样。
(4)实时PCR
1)PCR用反应液的调制
调制含有上述(1)所得的引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01各1μM、上述(2)所得的标记探针195nM、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mlBSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Taq DNA聚合酶((株)ニッポン-ジ一ン制)40单元/ml的10mMTris-HCl缓冲液(pH值8.9)，作为PCR用反应液。
2)实时PCR
以序列TcTI_Fw01Rv01为PCR中的扩增靶，作为PCR的模板DNA，使用来源于上述(3)中调制的沙眼衣原体(D(血清变型)株)的PCR用DNA试样(稀释系列)。
首先，在PCR用反应液20μl中加入上述(3)中调制的PCR用DNA试样各1μL，作为PCR用试样，将该PCR用试样加入到定量PCR反应用玻璃毛细管(ロシュ社制)中，使用定量PCR专用热循环检测器(LightCycler2.0、ロシュ社制)进行实时PCR。反应在95℃保温10分钟之后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复50个循环，每1个循环测定来源于报告色素的荧光量。此外，荧光量使用测定中使用的热循环仪的、将与供测定的每个玻璃毛细管对应的荧光强度比数值化的功能来求得。
(5)结果
由所得的测定结果，按照实时PCR法中进行的常规方法制成标准曲线。
即，对各浓度的PCR用DNA试样，制成将来源于报告色素的荧光量(Rn、y轴)相对于PCR的循环数(x轴)作图而得的扩增曲线。所得的扩增曲线示于图1。
在图1中，图中的a～h分别显示使用106、105、104、103、102、10、5拷贝/μL的PCR用DNA试样时的扩增曲线。
接着，选择荧光量以指数函数扩增的Rn部，划出阈值线(Th)。将Th与各PCR用DNA试样的荧光量交差的点作为循环阈(Threshold cycle，Ct)值。接着将Ct值(y轴)相对于使用的各PCR用DNA试样的基因组的拷贝数(x轴、对数值)作图，将对各Ct值获得的近似曲线作为标准曲线。所得的标准曲线示于图2。
由图2的结果可以进行检测灵敏度达到5拷贝/反应的扩增检测。另外，PCR效率(PCR Efficiency)=1.979(95.3％)。
由以上的结果判断，如果使用本发明所涉及的寡核苷酸作为引物进行实时PCR，则可以以高灵敏度检测沙眼衣原体。
另外，通过能够制成标准曲线，判定如果进行使用本发明的引物和探针的实时PCR法，则可以实现沙眼衣原体的定量。进而可知，在使用本发明的引物和探针的实时PCR法中，即使在沙眼衣原体的基因组DNA作为初始量以5拷贝存在的条件下也可以进行沙眼衣原体的检测，可以以高检测灵敏度进行沙眼衣原体的检测。
进而，在利用实时PCR法的情况下，因为实时地监测该荧光强度，所以可以正确地定量模板DNA的初始量，对沙眼衣原体的检测是有效的。
实施例3
利用实时检测系统，进行使用本发明所特定的引物序列的基因扩增系中的检测灵敏度的测定。
(1)引物的设计和合成
由实施例1(1)所特定的靶序列TcTI_Fw02Rv02的序列(序列号2)，设计用于PCR扩增检测的引物，即“5’-cagatttcctttcgcattaaaaa-3’”(以下称为“TcTI_Fw02m”，序列号5)、和“5’-tctcccatttctcccacaag-3’”(以下称为“TcTI_Rv02”，序列号6)。
将寡核苷酸的合成委托シグマジエノシス社，获得具有设计的碱基序列的合成寡核苷酸。使用该合成寡核苷酸作为引物。
(2)标记探针的设计和合成
由预测在使用上述(1)设计的TcTI_Fw02m和TcTI_Rv02的引物的组合的PCR中被扩增的核酸序列，设计用作探针的序列。设计的寡核苷酸的碱基序列用序列号9表示，命名为“TcTI_FwRv2”。
进而，设计在“TcTI_FwRv2”的5’末端化学结合了报告色素HEXTM、在3’末端化学结合了报告消光体的BHQTM的标记寡核苷酸探针。
将寡核苷酸的合成和标记委托シグマジエノシス社，得到设计的标记探针。
(3)PCR用DNA试样的调制
按照常规方法培养表2的沙眼衣原体(D(血清变型)株)，然后通过与实施例1(4)同样的方法，使用公知的核酸纯化方法获得纯化基因组DNA。将该纯化基因组DNA溶解于10mM Tris-HCl缓冲液中，测定吸光度。由所得的吸光度测定值计算出摩尔数，从而确定DNA试样中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。
接着使用pH值8.9的10mM Tris-HCl缓冲液调制将DNA试样稀释至106、105、104、103、102、10、5拷贝/μL的稀释系列而得的试样，作为PCR用DNA试样。
(4)实时PCR
1)PCR用反应液的调制
调制含有上述(1)所得的引物TcTI_Fw02m和引物TcTI_Rv02各1μM、上述(3)所得的荧光标记探针195nM、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mlBSA、0.1%胆酸钠、0.1%TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Taq DNA聚合酶((株)ニッポン-ジ一ン制)40单元/ml的10mMTris-HCl缓冲液(pH值8.9)，作为PCR用反应液。
2)实时PCR
以序列TcTI_Fw02Rv02为PCR中的扩增靶，作为PCR的模板DNA，使用上述(3)中调制的来源于沙眼衣原体(D(血清变型)株)的PCR用DNA试样(稀释系列)。
首先，在PCR用反应液20μl中加入上述(3)所调制的PCR用DNA试样各1μL，作为PCR用试样，加入96孔反应板(マィクロアンプ·オプチカル·96ウエル·リアクション·プレ一ト、アプラィドバィオシステムズジヤパン社制)的孔中，使用实时PCR检测装置(ABI 7500、アプラィドバィオシステムズジヤパン社制)进行PCR。反应在95℃保温10分钟之后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复50个循环，每1个循环测定来源于报告色素的荧光量。此外，荧光量使用测定所用的热循环的、将供测定的每个样品孔所对应的荧光强度比数值化的功能来求得。
(5)结果
由所得的测定结果，按照在实时PCR法中进行的常规方法制成标准曲线。
即，对各浓度的PCR用DNA试样，制成将报告色素的荧光量(Rn、y轴)相对于PCR的循环数(x轴)作图而得的扩增曲线。所得的扩增曲线示于图3。
在图3中，图中的a～h分别显示分别使用106、105、104、103、102、10、5拷贝/μL的PCR用DNA试样时的扩增曲线。
接着，选择荧光量以指数函数扩增的Rn部，划出阈值线(Th)。将Th与各PCR用DNA试样的荧光量交差的点作为循环阈(Threshold cycle，Ct)值。接着将Ct值(y轴)相对于使用的各PCR用DNA试样的基因组的拷贝数(x轴、对数值)作图，将对各Ct得到的近似曲线作为标准曲线。所得的标准曲线示于图4。
所得的标准曲线的、进行回归分析求得的回归直线式和相关系数如下所述。
y＝-3.421358x＋40.971924
R2＝0.992401
如由图4可明确的那样，获得了良好的(直线性良好)标准曲线。因此可知，如果进行使用本发明的引物和探针的核酸扩增反应，则可以实现沙眼衣原体的定量。
另外，由图4的结果可知，可以进行检测灵敏度达到5拷贝/反应的扩增检测。即，如果进行使用本发明的引物和探针的检测法，则即使在沙眼衣原体的基因组DNA作为初始量存在5拷贝的条件下，也可以进行沙眼衣原体的检测。
另外，进行的PCR的扩增效率(PCR Efficiency)为96.1%，几乎接近100%。
由以上结果可知，如果使用本发明的引物TcTI_Fw02m与引物TcTI_Rv02的组合以及本发明的标记探针，以TcTI_Fw02Rv02为PCR中的扩增靶进行实时PCR，则与使用本发明的引物TcTI_Fw01与引物TcTI_Rv01的组合以及本发明的标记探针以TcTI_Fw01Rv01为PCR中的扩增靶进行实时PCR的情况同样地，可以高灵敏度且特异性地检测沙眼衣原体。
进而，在利用实时PCR的情况下，因为实时地监测该荧光强度，所以可以正确地定量模板DNA的初始量，这一点对沙眼衣原体的检测也是有效的。
产业可利用性
根据使用本发明的引物或/和探针的沙眼衣原体的检测方法，可以远比现有的通过菌的培养检查等来鉴定菌种的方法迅速且高精度地进行沙眼衣原体的检测。另外，通过利用本发明的检测方法进行沙眼衣原体的检测，可以排除诊断上的伪阴性，从而更高精度地进行沙眼衣原体的检测和诊断。进而，通过使用本发明的检测方法，实现了还可以进行沙眼衣原体自身的定量这样的效果。
符号说明
在图1中各标号分别显示以下情况的结果。
a：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为106拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
b：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为105拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
c：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为104拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
d：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为103拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
e：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为102拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
f：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为10拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
g：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为5拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
h：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为0拷贝、以TcTI_Fw01Rv01为靶进行实时PCR的情况。
在图3中，各标号分别显示以下情况的结果。
a：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为106拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
b：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为105拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
c：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为104拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
d：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为103拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
e：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为102拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
f：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为10拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
g：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为5拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
h：PCR用DNA试样中的初始DNA的浓度为0拷贝、以TcTI_Fw02Rv02为靶进行实时PCR的情况。
Figure IDA00002173653200011
Figure IDA00002173653200021
Figure IDA00002173653200031
Figure IDA00002173653200041
Figure IDA00002173653200051
Figure IDA00002173653200061
Figure IDA00002173653200071
Figure IDA00002173653200081

Claims (25)

1.寡核苷酸，其基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的内源性质粒基因杂交。
2.基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸在沙眼衣原体检测用引物或探针设计中的用途。
3.寡核苷酸引物，其基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸引物，其中，基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸引物，是包含序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列、或序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸引物。
5.根据权利要求3所述的寡核苷酸引物，其中，基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸引物包含选自下述寡核苷酸的正向引物和反向引物的组合，所述寡核苷酸包含序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列或序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列的互补序列。
6.寡核苷酸探针，其基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸探针，基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸探针，是包含序列号1～序列号9的任一项所示的碱基序列、或序列号1～序列号9的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸探针。
8.根据权利要求6所述的寡核苷酸探针，基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸探针，是包含序列号8和序列号9的任一项所示的碱基序列、或序列号8和序列号9的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸探针。
9.根据权利要求6所述的探针，其被标记物质标记。
10.根据权利要求9所述的探针，其中，标记物质是选自放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质和生物素的标记物质。
11.根据权利要求9所述的探针，其被报告荧光色素和猝灭色素标记。
12.沙眼衣原体的检测方法，其特征在于，使用基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测该反应的结果所生成的产物。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其中，基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸引物，是包含序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列、或序列号3～序列号7的任一项所示的碱基序列的互补序列的寡核苷酸引物。
14.根据权利要求12所述的检测方法，其中，使用下述任一引物对进行核酸扩增反应：
(1)包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物，
(2)包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物，
(3)包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物。
15.根据权利要求12所述的检测方法，其中，核酸扩增反应是实时PCR。
16.根据权利要求12所述的检测方法，其中，该反应的结果所生成的产物是引物延伸产物，使用嵌入剂来检测该产物。
17.根据权利要求12所述的检测方法，其中，进一步使用将基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸用报告色素和猝灭荧光色素进行标记而得的标记探针。
18.根据权利要求12所述的检测方法，其通过下述任一工序来进行：
(1)使用包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号8所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用报告色素和猝灭色素进行标记而得的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测从该标记探针游离出的标记物质，
(2)使用包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用报告色素和猝灭色素进行标记而得的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测从该标记探针游离出的标记物质，
(3)使用包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用报告色素和猝灭色素进行标记而得的标记探针，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测从该标记探针游离出的标记物质。
19.根据权利要求12所述的检测方法，其中，在进行核酸扩增反应之后，对于所得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果来判定豚鼠嗜衣原体的有无。
20.沙眼衣原体检测用试剂盒，其中，包含基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物或/和探针。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计的寡核苷酸引物或/和探针，是包含序列号1～序列号9的任一项所示的碱基序列、或序列号1～序列号9的任一项所示的碱基序列的互补序列的引物或/和探针。
22.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，探针是被标记物质标记化的探针。
23.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，探针是被报告色素和猝灭荧光色素标记化的探针。
24.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，作为引物，含有选自下述(1)～(3)的引物对：
(1)包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物，
(2)包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物，
(3)包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物。
25.根据权利要求20所述的试剂盒，其中，含有选自下述(1)～(3)的引物对和探针的组合，
(1)包含序列号3所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号4所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号8所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针，
(2)包含序列号5所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针，
(3)包含序列号7所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸引物、包含序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸引物、和将包含序列号9所示的碱基序列或其互补序列的寡核苷酸用标记物质标记而得的标记探针。
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