ES2197412T3 - Ensayo de la chlamydia trachomatis mediante amplificacion y deteccion del plasmido criptico de chlamydia trachomatis. - Google Patents
Ensayo de la chlamydia trachomatis mediante amplificacion y deteccion del plasmido criptico de chlamydia trachomatis.Info
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Abstract
SE HA IDENTIFICADO UNA REGION DEL PLASMIDIO CRIPTICO DE LA CHLAMYDIA TRACHOMATIS QUE ES UTIL PARA REALIZAR ENSAYOS DE AMPLIFICACION A FIN DE DETERMINAR ESPECIFICAMENTE SI SE ENCUENTRA PRESENTE LA C. TRACHOMATIS EN LA MUESTRA QUE SE ESTA ENSAYANDO. SE EXPONEN LOS OLIGONUCLEOTIDOS UTILES PARA EFECTUAR REACCIONES DE ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE HEBRAS (EDH) TERMICO EN ESTE GEN. LOS OLIGONUCLEOTIDOS EXPUESTOS PUEDEN UTILIZARSE EN UN ENSAYO QUE SEA ESPECIFICO PARA TODAS LAS CEPAS DE C. TRACHOMATIS, Y QUE NO MUESTREN REACTIVIDAD CRUZADA CON LOS GENOMAS DE OTROS MICROORGANISMOS, NI CON EL ADN HUMANO.
Description
Ensayo para Chlamydia trachomatis mediante
amplificación y detección del plásmido críptico de Chlamydia
trachomatis.
La presente invención se refiere a métodos para
determinar la presencia o ausencia de Chlamydia trachomatis
en pacientes. El método implica utilizar cebadores de ácidos
nucleicos para amplificar específicamente el plásmido críptico de
Chlamydia trachomatis, preferiblemente utilizando una de las
técnicas de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA),
amplificación por desplazamiento de hebra termofílica (tSDA) o tSDA
fluorescente en tiempo real.
Chlamydia trachomatis es el agente
causante de tracoma (que es la primera causa individual de ceguera),
conjuntivitis de inclusión, neumonitis del lactante, uretritis y
linfogranuloma venéreo. El diagnóstico y la detección de este
organismo se realizan a menudo sobre la base de las observaciones
patológicas o clínicas, pudiendo confirmarse mediante técnicas de
aislamiento y tinción.
C. trachomatis incluye un plásmido
críptico que tiene un tamaño de aproximadamente 7,5 kb y está
presente en múltiples copias en el organismo. La presencia de
múltiples copias hace de este plásmido un buen blanco con
propósitos de diagnóstico en ensayos que utilizan técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos.
Los términos siguientes se definen aquí como
sigue:
Un cebador de amplificación es un cebador para la
amplificación de una secuencia blanco mediante extensión del cebador
tras hibridación con la secuencia blanco. Los cebadores de
amplificación tienen típicamente una longitud de aproximadamente
10-75 nucleótidos, preferiblemente una longitud de
aproximadamente 15-50 nucleótidos. La longitud total
de un cebador de amplificación para SDA es típicamente de
aproximadamente 25-50 nucleótidos. El extremo 3' de
un cebador de amplificación SDA (la secuencia de unión con el
blanco) hibrida con el extremo 5' de la secuencia blanco. La
secuencia de unión con el blanco tiene una longitud de
aproximadamente 10-25 nucleótidos y confiere
especificidad de hibridación al cebador de amplificación. El cebador
de amplificación SDA comprende adicionalmente un sitio de
reconocimiento para una endonucleasa de restricción 5' de la
secuencia de unión con el blanco. El sitio de reconocimiento es
para una endonucleasa de restricción que mellará una hebra de un
dúplex de ADN cuando se hemimodifique el sitio de reconocimiento,
como describen G. Walker y otros (PNAS
89:392-396, 1992 y Nucl. Acids Res. 20:
1691-1696, 1992). Los nucleótidos 5' del sitio de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción (la ``cola'')
funcionan como sitio de represión de la polimerasa cuando se mella
y desplaza el restante del cebador de amplificación durante la SDA.
La función represora de los nucleótidos de cola sustenta la
reacción SDA y permite la síntesis de múltiples amplicones a partir
de una única molécula blanco. La cola tiene típicamente una longitud
de aproximadamente 10-25 nucleótidos. Su longitud y
secuencia no son generalmente cruciales y pueden seleccionarse y
modificarse de forma rutinaria. Como la secuencia de unión con el
blanco es la porción de un cebador que determina su especificidad
de blanco, para métodos de amplificación que no requieren
secuencias especializadas en los extremos del blanco, el cebador de
amplificación consiste por lo general esencialmente en únicamente la
secuencia de unión con el blanco. Para métodos de amplificación que
requieren secuencias especializadas anexionadas al blanco distintas
del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción
mellable y la cola de SDA (por ejemplo, un promotor de ARN
polimerasa para 3SR, NASBA o amplificación basada en transcripción),
la secuencia especializada requerida puede enlazarse a la secuencia
de unión con el blanco utilizando métodos rutinarios para la
preparación de oligonucleótidos sin alterar la especificidad de
hibridación del cebador.
Un cebador deflector o cebador externo es un
cebador utilizado para desplazar productos de extensión del cebador
en reacciones de amplificación isotérmicas. El cebador deflector se
pega a una secuencia blanco aguas arriba del cebador de
amplificación tal que la extensión del cebador deflector desplaza el
cebador de amplificación y su producto de extensión aguas abajo.
Los términos blanco o secuencia blanco se
refieren a secuencias de ácidos nucleicos a amplificar. Éstas
incluyen la secuencia de ácido nucleico original a amplificar, la
segunda hebra complementaria de la secuencia de ácido nucleico
original a amplificar y cualquiera de las dos hebras de una copia de
la secuencia original producida mediante la reacción de
amplificación. Estas copias sirven de blancos amplificables en
virtud del hecho de que contienen copias de la secuencia con que se
hibridan los cebadores de amplificación.
Las copias de la secuencia blanco que se generan
durante la reacción de amplificación se denominan productos de
amplificación, amplímeros o amplicones.
El término producto de extensión se refiere a la
copia de una secuencia blanco producida mediante hibridación de un
cebador y extensión del cebador por una polimerasa utilizando la
secuencia blanco como molde.
El término especificidad de especie se refiere a
la detección, amplificación o hibridación de oligonucleótidos de una
especie de un organismo o un grupo de especies relacionadas sin
sustancial detección, amplificación o hibridación de
oligonucleótidos de otras especies del mismo género o especies de un
género diferente.
El término sonda de ensayo se refiere a cualquier
oligonucleótido utilizado para facilitar la detección o
identificación de un ácido nucleico. Por ejemplo, en la presente
invención, se utilizan sondas de ensayo para la detección o
identificación de ácidos nucleicos del plásmido críptico de C.
trachomatis. Las sondas de detección, los cebadores de
detección, las sondas de captura y los cebadores de señal que se
describen a continuación son ejemplos de sondas de ensayo.
La presente invención proporciona
oligonucleótidos útiles como cebadores de amplificación y sondas de
ensayo para la detección e identificación específica de
Chlamydia trachomatis. Las sondas específicas amplifican el
plásmido críptico de C. trachomatis con escasa o nula
amplificación detectable de ya sea ADN humano o ADN de otros
microorganismos. Se seleccionaron dos regiones del plásmido
críptico de C. trachomatis para desarrollar cebadores de
ácidos nucleicos que amplificarán específicamente ese plásmido sin
mostrar reactividad cruzada con ADN humano o ADN de otros
microorganismos.
Los oligonucleótidos de la invención pueden
utilizarse tras un cultivo como medio para confirmar la identidad
del organismo cultivado. Alternativamente, pueden utilizarse
previamente al cultivo o en lugar del cultivo para la detección e
identificación de ácidos nucleicos del plásmido críptico de C.
trachomatis utilizando métodos de amplificación conocidos. En
cualquiera de los casos, los oligonucleótidos y métodos de ensayo
de la invención proporcionan un medio para discriminar rápidamente
entre C. trachomatis y otros microorganismos, permitiendo al
practicante identificar rápidamente ese microorganismo sin recurrir
a los procedimientos más tradicionales de los que se suele
depender. Tal identificación rápida del agente etiológico
específico implicado en una infección proporciona información que
puede ser utilizada para determinar terapias apropiadas en un corto
período de tiempo.
Los distintos objetos, ventajas y características
novedosas de la presente invención se entenderán fácilmente a partir
de la descripción detallada siguiente cuando se lea en conjunción
con los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 indica los deflectores, cebadores y
detectores utilizados para el Sistema B.
Las Figuras 2 A-D muestran las
imágenes de fósforo resultantes del uso de una matriz de condiciones
de prueba utilizando distintas combinaciones de cebadores,
condiciones de tampón y temperaturas para efectuar tSDA con una
porción del plásmido críptico de C. trachomatis (en el
plásmido pCT16) como blanco.
Las Figuras 3A y 3B muestran las imágenes de
fósforo de reacciones tSDA efectuadas usando pCT16 como blanco pero
usando dos detectores diferentes aunque complementarios. Las
reacciones se efectuaron usando 3% de DMSO, 7% de glicerol, magnesio
6 mM y fosfato potásico 35 mM y se amplificaron a 52ºC. Se
utilizaron las cuatro combinaciones de cebadores (1, 2, 3 y 4). Las
cuatro muestras de la Figura 3A se detectaron con un cebador de
extensión que hibridó con la hebra antisentido del producto
amplificado de la Figura 3B. Las mismas cuatro muestras se
detectaron con el complemento del detector utilizado en la Figura
3A. El detector utilizado para los experimentos mostrados en la
Figura 3B hibrida con la hebra homosentido del producto
amplificado.
La Figura 4 muestra en imágenes de fósforo los
resultados de efectuar tSDA usando pCT16 como blanco y usando
distintas combinaciones de cebadores y condiciones de tampón para
probar la sensibilidad. El blanco estaba presente en entre 10^{2}
y 10^{6} copias. Cada una de las combinaciones de cebadores 1, 2,
3 y 4 se probó en cada rango de número de copias de blanco. Los
experimentos se efectuaron en dos conjuntos de condiciones de
tamponado como se explica en el Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo
para comprobar la especificidad y la reactividad cruzada de la
combinación de cebadores 2. El ácido nucleico blanco consistió en
catorce serovares de C. trachomatis (A, B, Ba, C, D, E, F,
G, H, I, J, K, L2 y L3) para probar la especificidad así como C.
pneumoniae, C. psittaci y N. gonorrhoeae para probar la
reactividad cruzada. Cada serovar se probó tanto a 10^{4} como a
10^{3} copias genómicas, mientras que las pruebas de reactividad
cruzada utilizaron 10^{7} copias genómicas de los organismos
probados. Se incluyeron también líneas con control (pCT16) y sin
blanco.
La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo
para probar la sensibilidad de la combinación de cebadores 2 para
el plásmido críptico de C. trachomatis en presencia de
distintas cantidades de ADN humano en el rango de 300 a 3000 ng.
La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo
de reactividad cruzada usando la combinación de cebadores 2. Se
probaron nueve mezclas consistentes en un total de 35 organismos
diferentes que representaban 30 especies diferentes para determinar
si había alguna reactividad cruzada. Cada especie se probó en
10^{7} copias genómicas. Para cada mezcla, la línea izquierda
indica la amplificación de la mezcla sola, mientras que la línea
derecha indica la amplificación de la mezcla más 200 copias de
pCT16.
La presente invención se refiere a
oligonucleótidos, cebadores de amplificación y sondas de ensayo que
exhiben especificidad para Chlamydia trachomatis en
reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. También se
proporcionan métodos para la detección e identificación de los
ácidos nucleicos del plásmido críptico de C. trachomatis
utilizando los oligonucleótidos de la invención. Los métodos
preferidos son la utilización de SDA, tSDA o tSDA fluorescente en
tiempo real homogénea. Estos métodos son conocidos para los
expertos en la técnica a partir de referencias tales como la
patente de EE.UU. Nº 5,547,861 y la patente de EE.UU. Nº 5,648,211,
la solicitud de patente europea Nº 98109682.9 presentada el 28 de
mayo de 1998 y la solicitud de patente europea Nº 98108491.6
presentada el 11 de mayo de 1998.
Los cebadores de la presente invención se
diseñaron en base a la secuencia del plásmido críptico de C.
trachomatis que está disponible a través de GenBank. Las
secuencias de plásmido se alinearon y seccionaron en regiones
manejables (300-500 pb). Se seleccionaron dos
regiones (B y F) para estudio adicional. Se secuenciaron las
regiones B y F para varios serovares de C. trachomatis y se
diseñaron sistemas tSDA en esas zonas. Los cebadores utilizados para
amplificar y secuenciar las regiones B y F, respectivamente,
son:
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
CTpB1P \+
5' - GAAGATCGAGTAGACGTAATAT - 3' \+ (ID
SEC Nº: 1)\cr CTpB2P \+
5' - ATAGCAGATATATCTAGAACCTT - 3'\+ (ID
SEC Nº: 2)\cr CTpB3N \+
5' - TTGGATCGAAATGTAATACCGA - 3' \+ (ID
SEC Nº: 3)\cr CTpB4N \+
5' - ACTTCTGATTTTCAAGGTGGAT - 3' \+ (ID
SEC Nº:
4)\cr}
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
CTpFPL \+
5' - CAAAACTGCGTCTTTGCTGATA - 3' \+ (ID
SEC Nº: 5)\cr CTpFPR \+
5' - GGGTGTGACTGTGAATTTTCC - 3' \+ (ID
SEC Nº: 6)\cr CTpFSL \+
5' - AGTTGGGCAAATGACAGAGC - 3' \+ (ID
SEC Nº: 7)\cr CTpFSR \+
5' - TGAATAACCCGTTGCATTGA - 3' \+ (ID
SEC Nº:
8)\cr}
Los sistemas de detección relativos a análisis de
las regiones B y F se describen a continuación. Se probaron
distintas combinaciones de cebadores en función de su especificidad
y sensibilidad en reacciones de tSDA y en reacciones de tSDA
fluorescente en tiempo real.
Como los ácidos nucleicos no requieren
complementaridad completa a fin de hibridarse, hay que entender que
las secuencias de sondas y cebadores aquí descritas pueden
modificarse hasta cierto punto sin pérdida de utilidad como sondas
y cebadores específicos de C. trachomatis. Como es conocido
en la técnica, la hibridación de secuencias de ácido nucleico
complementarias y parcialmente complementarias puede obtenerse
mediante ajuste de las condiciones de hibridación para aumentar o
disminuir la estringencia (es decir, ajuste de la temperatura de
hibridación o el contenido salino del tampón). Tales modificaciones
menores de las secuencias divulgadas y cualquier ajuste necesario de
las condiciones de hibridación para mantener la especificidad de
C. trachomatis requieren únicamente experimentación de
rutina y están dentro de las aptitudes ordinarias de la técnica.
Los productos de amplificación generados
utilizando los cebadores de la invención pueden detectarse por un
tamaño característico, por ejemplo sobre geles de poliacrilamida o
agarosa teñidos con bromuro de etidio. Alternativamente, las
secuencias blanco del plásmido críptico de C. trachomatis
amplificadas pueden detectarse por medio de una sonda de ensayo,
que es un oligonucleótido marcado con una etiqueta detectable. En
una realización, puede utilizarse al menos una sonda de ensayo
marcada para la detección de secuencias blanco amplificadas mediante
hibridación (una sonda de detección), mediante hibridación y
extensión como se describe en Walker y otros, Nucl. Acids. Res.,
supra (un cebador de detección) o mediante hibridación,
extensión y conversión a una forma de doble hebra como se describe
en el documento EP 0 678 582 (un cebador de señal).
Preferiblemente, la sonda de ensayo se selecciona para hibridar con
una secuencia del blanco que está entre los cebadores de
amplificación, es decir, debería ser una sonda de ensayo interna.
Alternativamente, puede utilizarse como sonda de ensayo un cebador
de amplificación o la secuencia de unión con el blanco de éste.
La etiqueta detectable de la sonda de ensayo es
una fracción que puede detectarse bien directamente o indirectamente
como indicación de la presencia del ácido nucleico blanco. Para la
detección directa de la etiqueta, las sondas de ensayo pueden
marcarse con un radioisótopo y detectarse mediante autoradiografía o
marcarse con una fracción fluorescente y detectarse mediante
fluorescencia como es conocido en la técnica. Alternativamente, las
sondas de ensayo pueden detectarse indirectamente mediante marcado
con una etiqueta que requiere reactivos adicionales que la hagan
detectable. Entre las etiquetas detectables indirectamente se
incluyen, por ejemplo, agentes quimioluminiscentes, enzimas que
producen productos de reacción visibles y ligandos (por ejemplo
haptenos, anticuerpos o antígenos) que pueden detectarse mediante
unión con parejas de unión específicas etiquetadas (por ejemplo
anticuerpos o antígenos/haptenos). Los ligandos son también útiles
inmovilizando el oligonucleótido etiquetado con ligando (la sonda
de captura) sobre una fase sólida para facilitar su detección.
Entre las etiquetas particularmente útiles se incluyen biotina
(detectable mediante unión con avidina o estreptavidina
etiquetadas) y enzimas tales como peroxidasa de rábano o fosfatasa
alcalina (detectables mediante adición de sustratos enzimáticos
para producir productos de reacción coloreados). Los métodos para
añadir tales etiquetas a, o incluir tales etiquetas en,
oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y cualquiera de
esos métodos es adecuado para uso en la presente invención.
Entre los ejemplos de métodos de detección
específicos que se pueden emplear se incluye un método
quimioluminiscente en el que los productos amplificados se detectan
utilizando una sonda de captura biotinilada y una sonda de detección
conjugado enzimático como se describe en la patente de EE.UU. Nº
5,470,723. Tras la hibridación de estas dos sondas de ensayo en
diferentes sitios de la región de ensayo de la secuencia blanco
(entre los sitios de unión de los dos cebadores de amplificación),
el complejo se captura sobre una placa de microtitulación
recubierta con estreptavidina por medio de la sonda de captura, y la
señal quimioluminiscente se revela y se lee en un luminómetro.
Como otra alternativa para la detección de productos de
amplificación, puede incluirse en la reacción SDA un cebador de
señal como se describe en el documento EP 0 678 582. En esta
realización, durante la SDA se generan productos de amplificación
secundarios etiquetados de una manera que depende de la
amplificación del blanco, que pueden detectarse como indicación de
la amplificación del blanco por medio de la etiqueta asociada.
Por conveniencia comercial, los cebadores de
amplificación para la detección e identificación específica de
ácidos nucleicos del plásmido críptico de C. trachomatis
pueden empaquetarse en forma de estuche. Típicamente, tal estuche
contiene al menos un par de cebadores de amplificación según la
presente invención. Pueden incluirse también con los cebadores de
amplificación específicos del plásmido críptico de C.
trachomatis reactivos para efectuar una reacción de
amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, tampones, cebadores
adicionales, trifosfatos de nucleótidos, enzimas, etc. Los
componentes del estuche se empaquetan juntos en un contenedor común,
opcionalmente incluyendo instrucciones para efectuar una realización
específica de los métodos de la invención. También pueden incluirse
en el estuche otros componentes opcionales, por ejemplo un
oligonucleótido marcado con una etiqueta adecuada para uso como
sonda de ensayo, y/o reactivos o medios para detectar la
etiqueta.
Las secuencias de unión con el blanco de los
cebadores de amplificación confieren especificidad de hibridación de
especie a los oligonucleótidos y por tanto proporcionan
especificidad de especie a la reacción de amplificación. A las
secuencias de unión con el blanco aquí divulgadas pueden añadirse
opcionalmente otras secuencias, como se requiera para efectuar una
reacción de amplificación seleccionada, sin alterar la
especificidad de especie del oligonucleótido. A modo de ejemplo,
los cebadores de amplificación específicos del plásmido críptico de
C. trachomatis de la invención pueden contener un sitio de
reconocimiento para la endonucleasa de restricción BsoBI que
se mella durante la reacción SDA. Resultará evidente para alguien
experto en la técnica que pueden utilizarse otros sitios de
reconocimiento de endonucleasas de restricción mellables en
sustitución del sitio de reconocimiento de BsoBI, incluyendo
pero sin limitación aquellos sitios de reconocimiento divulgados en
el documento EP 0 684 315. Preferiblemente, el sitio de
reconocimiento es para una endonucleasa de restricción termofílica
de modo que la reacción de amplificación pueda efectuarse en
condiciones de SDA termofílica (tSDA). Similarmente, la secuencia
de cola del cebador de amplificación (5' del sitio de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción) no es en general
crítica, aunque deben evitarse el sitio de restricción utilizado
para SDA y secuencias que hibriden bien con su propia secuencia de
unión con el blanco o con los otros cebadores. Algunos cebadores de
amplificación para SDA según la invención consisten por tanto en
las secuencias de unión con el blanco 3', un sitio de
reconocimiento para una endonucleasa de restricción mellable 5' de
la secuencia de unión con el blanco y una secuencia de cola con una
longitud de aproximadamente 10-25 nucleótidos 5'
del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. El
sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción mellable
y la secuencia de cola son secuencias requeridas para la reacción
SDA. Para otras reacciones de amplificación, los cebadores de
amplificación según la invención pueden consistir en las secuencias
de unión con el blanco divulgadas únicamente (por ejemplo, para PCR)
o en la secuencia de unión con el blanco y secuencias adicionales
requeridas para la reacción de amplificación seleccionada (por
ejemplo, secuencias requeridas para SDA como se describió
anteriormente o un promotor reconocido por ARN polimerasa para
3SR).
En SDA, los cebadores deflectores no son
esenciales para la especificidad de especie, ya que su función es
desplazar los cebadores de amplificación con especificidad de
especie en aguas abajo. Sólo se requiere que los cebadores
deflectores hibriden con el blanco aguas arriba de los cebadores de
amplificación de modo que cuando se extiendan desplacen el cebador
de amplificación y su producto de extensión. La secuencia
particular del cebador deflector no es por tanto, en general,
crítica, y puede derivarse de cualquier secuencia blanco aguas
arriba que esté lo suficientemente cercana al sitio de unión del
cebador de amplificación para permitir el desplazamiento del
producto de extensión del cebador de amplificación tras la extensión
del cebador deflector. Faltas de coincidencia con el blanco
ocasionales en la secuencia del cebador deflector o alguna
hibridación cruzada con secuencias no blanco no afectan por lo
general de forma negativa a la eficiencia de amplificación en tanto
que el cebador deflector permanezca capaz de hibridar con la
secuencia blanco específica. Sin embargo, los cebadores deflectores
aquí descritos presentan especificidad de especie para C.
trachomatis y pueden por tanto utilizarse también como
secuencias de unión con el blanco en cebadores de amplificación, si
así se desea.
Las reacciones de amplificación que emplean los
cebadores de la invención pueden incorporar timina como se revela en
Walker y otros, supra, o pueden sustituir en todo o en parte
por 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato
el TTP de la reacción para reducir la contaminación cruzada de las
reacciones de amplificación subsiguientes, por ejemplo como se
revela en el documento EP 0 624 643. En los productos de
amplificación se incorpora dU (uridina) que puede ser escindida
mediante tratamiento con uracil ADN glicosilasa (UDG). Estos sitios
abásicos hacen el producto de amplificación inamplificable en
reacciones de amplificación subsiguientes. La UDG puede inactivarse
mediante inhibidor de uracil ADN glicosilasa (Ugi) previamente a
efectuarse la amplificación subsiguiente para impedir la escisión
de la dU en los productos de amplificación recién formados.
Se desarrollaron otros sistemas para efectuar
tSDA utilizando diferentes combinaciones de cebadores, deflectores y
detectores. Sin embargo, esos otros sistemas no se prefirieron por
varias razones tales como falta de especificidad adecuada, estrecho
rango de condiciones óptimas y falta de robustez.
La Figura 1 indica los cebadores, deflectores y
detectores para el sistema B. Este sistema se discute en los
Ejemplos. El sistema B está situado en el extremo 5' de la región B.
En los experimentos iniciales, se diseñaron dos cebadores aguas
arriba y dos cebadores aguas abajo junto con un deflector aguas
arriba y un deflector aguas abajo. Éstos se usaron en distintas
combinaciones junto con detectores. Los cebadores, deflectores y
detectores utilizados en el sistema B se muestran a continuación. La
región de hibridación de los cebadores aparece subrayada y el sitio
de restricción de BsoBI en cursiva.
CTpB4.S1
5'-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGG CGATTACTTGCAGTTG-3'
(ID SEC Nº: 9)
CTpB4.S1.1
5'-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGG GATTACTTGCAGTTG-3'
(ID SEC Nº: 10)
CTpB4.B1
5'-GAGTAGACGTAATATT-3' (ID SEC Nº:
11)
CTpB4.S2
5'-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG ATATCTGCTATTTCATT-3'
(ID SEC Nº: 12)
CTpB4.S2.1
5'-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG ATATCTGCTATTTCAT-3'
(SEQ IS NO: 13)
CTpB4.B2
5'-CTCTTAAGGTTCTAG-3' (ID SEC Nº:
14)
CTpB4.D1
5'-CTCATCGGTTGGAGA-3' (ID SEC Nº:
15)
CTpB4.D2
5'-TCTCCAACCGATGAG-3' (ID SEC Nº:
16)
CtpB4.FD1 5'-
[FAM]TAGCACCCGAGTGCT[ROX]TTGACGATTTTCTCCAACCGATGAGTTGAT-3'
(ID SEC Nº: 17)
En experimentos de cribado iniciales, se
prepararon mezclas de cebadores que contuvieran un cebador aguas
arriba y un cebador aguas abajo. Las cuatro mezclas de cebadores
posibles son:
Combinación 1
CTpB4.S1 (ID SEC Nº: 9)
CTpB4.S2 (ID SEC Nº: 12)
Combinación 2
CTpB4.S1.1 (ID SEC Nº: 10)
CTpB4.S2 (ID SEC Nº: 12)
Combinación 3
CTpB4.S1 (ID SEC Nº: 9)
CTpB4.S2.1 (ID SEC Nº: 13)
Combinación 4
CTpB4.S1.1 (ID SEC Nº: 10)
CTpB4.S2.1 (ID SEC Nº: 13)
Todas las mezclas de cebadores contenían también
los deflectores aguas arriba y aguas abajo. Los cebadores y
deflectores se utilizan en una concentración final de 0,5 y 0,05
\muM respectivamente.
Las mezclas de cebadores anteriores se utilizan
en el estudio de la región B del plásmido críptico y se discuten
adicionalmente en los Ejemplos. Otros cebadores que hibridan con la
región F del plásmido críptico y que son también útiles para el
ensayo de C. trachomatis se discuten también en los Ejemplos.
Los ejemplos posteriores divulgan también métodos de uso de
cebadores de la región F para uso en tSDA fluorescente en tiempo
real homogénea.
Los cebadores y las sondas del Sistema B se
utilizan preferiblemente en un método de transferencia de energía
fluorescente en tiempo real tSDA. La amplificación por
desplazamiento de hebra (SDA) es un método isotérmico de
amplificación de ácidos nucleicos en el que la extensión de los
cebadores, la mella de un sitio de reconocimiento para endonucleasa
de restricción/escisión hemimodificado, el desplazamiento de
productos de extensión de hebra única, el pegado de cebadores a los
productos de extensión (o la secuencia blanco original) y la
subsiguiente extensión de los cebadores ocurren de forma concurrente
en la mezcla de reacción. Eso está en contraste con la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), en la que los pasos de la reacción
ocurren en fases discretas o ciclos como resultado de las
características de ciclación de la temperatura de la reacción. La
SDA se basa en 1) la habilidad de una endonucleasa de restricción
para mellar la hebra no modificada de una forma hemifosforotioato de
su sitio de reconocimiento/escisión de doble hebra y 2) la habilidad
de ciertas polimerasas para iniciar la replicación en la mella y
desplazar la hebra no molde aguas abajo. Tras una incubación inicial
a temperatura aumentada (aproximadamente 95ºC) para desnaturalizar
secuencias blanco de doble hebra para el pegado de los cebadores, la
subsiguiente polimerización y desplazamiento de hebras recién
sintetizadas tiene lugar a temperatura constante. La producción de
cada nueva copia de la secuencia blanco consiste en cinco pasos: 1)
unión de cebadores de amplificación a una secuencia blanco original
o a un producto de extensión de hebra única desplazado previamente
polimerizado, 2) extensión de los cebadores mediante una polimerasa
deficiente en exonucleasa 5'-3' que incorpora un
\alpha-tio desoxinucleósido trifosfato
(\alpha-tio dNTP), 3) mella de un sitio de
restricción de doble hebra hemimodificado, 4) disociación de la
enzima de restricción del sitio de mella, y 5) extensión desde el
extremo 3' de la mella mediante la polimerasa deficiente en
exonucleasa 5'-3' con desplazamiento de la hebra
recién sintetizada aguas abajo. Mella, polimerización y
desplazamiento ocurren de forma concurrente y continua a una
temperatura constante porque la extensión desde la mella regenera
otro sitio de restricción mellable. Cuando se utiliza un par de
cebadores de amplificación, cada uno de ellos hibrida con una de las
dos hebras de una secuencia blanco de doble hebra, la amplificación
es exponencial. Eso es porque las hebras homosentido y antisentido
sirven como moldes para el cebador opuesto en subsiguientes rondas
de amplificación. Cuando se utiliza un único cebador de
amplificación, la amplificación es lineal porque sólo una hebra
sirve como molde para la extensión del cebador. Son ejemplos de
endonucleasas de restricción que mellan sus sitios de
reconocimiento/escisión de doble hebra cuando se incorpora un
\alpha-tio dNTP HincII, HindII, AvaI, NciI y
Fnu4HI. Todas estas endonucleasas de restricción y otras que
presentan la requerida actividad de mella son adecuadas para uso en
SDA convencional. Sin embargo, son relativamente termolábiles y
pierden actividad por encima de aproximadamente 40ºC.
Pueden prepararse blancos para amplificación
mediante SDA fragmentando ácidos nucleicos de mayor tamaño mediante
restricción con una endonucleasa que no corta la secuencia blanco.
Sin embargo, se prefiere generalmente que los ácidos nucleicos
blanco con los sitios de reconocimiento/escisión para endonucleasa
de restricción seleccionados para mella en la reacción SDA se
generen como se describe en Walker y otros (Nuc. Acids Res.,
supra, 1992) y en la patente de EE.UU. Nº 5,270,184.
Brevemente, si la secuencia blanco es de doble hebra, se hibridan
con ella cuatro cebadores. Dos de los cebadores (S_{1} y S_{2})
son cebadores de amplificación SDA y dos (B_{1} y B_{2}) son
cebadores externos o deflectores. S_{1} y S_{2} se unen a
hebras opuestas de ácidos nucleicos de doble hebra flanqueando la
secuencia blanco. B_{1} y B_{2} se unen a la secuencia blanco 5'
(es decir, aguas arriba) de S_{1} y S_{2} respectivamente. Se
utiliza entonces la polimerasa deficiente en exonucleasa para
extender simultáneamente todos los cuatro cebadores en presencia de
tres desoxinucleósido trifosfatos y al menos un desoxinucleósido
trifosfato modificado (por ejemplo,
2'-desoxiadenosin
5'-O-(1-tiotrifosfato),
``dATP\alphaS''). Los productos de extensión de S_{1} y S_{2}
se desplazan de ese modo desde la secuencia blanco molde original
mediante extensión de B_{1} y B_{2}. Los productos de extensión
de los cebadores de amplificación desplazados, de hebra única,
sirven como blancos para la unión de los cebadores deflector y de
amplificación opuestos (por ejemplo, el producto de extensión de
S_{1} se une a S_{2} y B_{2}). El siguiente ciclo de extensión
y desplazamiento resulta en dos fragmentos de ácidos nucleicos de
doble hebra con sitios de reconocimiento/escisión para endonucleasa
de restricción hemimodificados en cada extremo. Esos son sustratos
adecuados para la amplificación mediante SDA. Como en SDA, los pasos
individuales de la reacción de generación del blanco ocurren de
forma concurrente y continua, generando secuencias blanco con las
secuencias de reconocimiento/escisión requeridas para mella por la
enzima de restricción en SDA en los extremos. Como todos los
componentes de la reacción SDA están ya presentes en la reacción de
generación del blanco, las secuencias blanco generadas entran de
forma automática y continua al ciclo SDA y se amplifican.
Para impedir la contaminación cruzada de una
reacción SDA con los productos de amplificación de otra, puede
incorporarse dUTP al ADN amplificado mediante SDA en lugar de dTTP
sin inhibición de la reacción de amplificación. Los ácidos nucleicos
modificados con uracilo pueden reconocerse entonces e inactivarse
específicamente mediante tratamiento con uracil ADN glicosilasa
(UDG). Por tanto, si se incorpora dUTP al ADN amplificado mediante
SDA en una reacción previa, cualquier reacción SDA subsiguiente
puede tratarse con UDG previamente a la amplificación de blancos de
doble hebra, y cualquier ADN que contenga dU de las reacciones
previamente amplificadas se hará inamplificable. El ADN blanco a
amplificar en la reacción subsiguiente no contiene dU y no se verá
afectado por el tratamiento con UDG. La UDG puede inhibirse entonces
mediante tratamiento con Ugi previamente a la amplificación del
blanco. Alternativamente, la UDG puede inactivarse mediante calor.
En SDA termofílica, la mayor temperatura de la reacción en sí
(\geq 50ºC) puede utilizarse para inactivar la UDG y amplificar el
blanco de forma concurrente.
La SDA requiere una polimerasa que carezca de
actividad exonucleasa 5'-3', inicie la
polimerización en una mella de hebra única de los ácidos nucleicos
de doble hebra, y desplace la hebra aguas abajo de la mella al
tiempo que se genera una nueva hebra complementaria utilizando la
hebra sin mellar como molde. La polimerasa debe extenderse añadiendo
nucleótidos a un -OH 3' libre. Para optimizar la reacción SDA, es
también deseable que la polimerasa sea altamente procesiva para
maximizar la longitud de la secuencia blanco que puede amplificarse.
Las polimerasas altamente procesivas son capaces de polimerizar
nuevas hebras de longitud significativa antes de disociarse y
terminar la síntesis del producto de extensión. La actividad de
desplazamiento es esencial para la reacción de amplificación, ya que
hace el blanco disponible para la síntesis de copias adicionales y
genera el producto de extensión de hebra única con el que se puede
hibridar un segundo cebador de amplificación en reacciones de
amplificación exponencial. La actividad de mella es también de gran
importancia, ya que es la mella la que perpetúa la reacción y
permite la iniciación de subsiguientes rondas de amplificación del
blanco.
La SDA termofílica se efectúa esencialmente como
la SDA convencional descrita por Walker y otros (PNAS y Nuc.
Acids Res., 1992, supra), con sustitución por la
polimerasa termoestable y endonucleasa de restricción termoestable
deseadas. Por supuesto, la temperatura de la reacción se ajustará a
la temperatura más alta adecuada para las enzimas sustitutas y el
sitio de reconocimiento/escisión para la endonucleasa de restricción
HincII se reemplazará por el sitio de reconocimiento/escisión para
endonucleasa de restricción apropiado para la endonucleasa
termoestable seleccionada. También en contraste con Walker y otros,
el practicante puede incluir las enzimas en la mezcla de reacción
previamente al paso de desnaturalización inicial si son
suficientemente estables a la temperatura de desnaturalización. Son
endonucleasas de restricción preferidas para uso en SDA termofílica
BsrI, BstNI, BsmAI, BsII y BsoBI (New England Biolabs), y BstOI
(Promega). Las polimerasas termofílicas preferidas son Bca (Panvera)
y Bst (New England Biolabs).
La tSDA fluorescente en tiempo real homogénea es
una modificación de la tSDA. Emplea oligonucleótidos de detección
para producir una extinción de la fluorescencia reducida de manera
dependiente del blanco. Los oligonucleótidos de detección contienen
un par enlazado de colorantes donor/aceptor de modo que en ausencia
del blanco ocurra la extinción de la fluorescencia. El
desdoblamiento o la linealización de una estructura secundaria de
pareado de bases intramolecular del oligonucleótido de detección en
presencia del blanco aumenta la distancia entre los colorantes y
reduce la extinción de la fluorescencia. El desdoblamiento de la
estructura secundaria de pareado de bases implica típicamente un
pareado de bases intermolecular entre la secuencia de la estructura
secundaria y una hebra complementaria tal que la estructura
secundaria se desbarata al menos parcialmente. Ésta puede
linealizarse completamente en presencia de una hebra complementaria
de longitud suficiente. En una realización preferida, hay un sitio
de reconocimiento para endonucleasa de restricción (RERS) presente
entre los dos colorantes tal que el pareado de bases intermolecular
entre la estructura secundaria y una hebra complementaria hace
también al RERS de doble hebra y escindible o mellable por una
endonucleasa de restricción. La escisión o mella por parte de la
endonucleasa de restricción separa los colorantes donor y aceptor en
fragmentos de ácidos nucleicos separados, contribuyendo
adicionalmente a la disminución de la extinción. En cualquiera de
las dos realizaciones, se monitoriza un cambio asociado en un
parámetro fluorescente (por ejemplo, un aumento de la intensidad de
fluorescencia del donor, una disminución de la intensidad de
fluorescencia del aceptor o una relación de la fluorescencia antes y
después del desdoblamiento) como indicación de la presencia de la
secuencia blanco. Se prefiere la monitorización de un cambio en la
intensidad de fluorescencia del donor, ya que este cambio es
típicamente mayor que el cambio en la intensidad de fluorescencia
del aceptor. También pueden monitorizarse otros parámetros de
fluorescencia tales como un cambio en la vida media de
fluorescencia.
Un oligonucleótido de detección para tSDA
fluorescente en tiempo real homogénea es un oligonucleótido que
comprende una sección 5' o 3' de hebra única que hibrida con la
secuencia blanco (la secuencia de unión con el blanco) y una
estructura secundaria de pareado de bases intramolecular adyacente a
la secuencia de unión con el blanco. Los oligonucleótidos de
detección de la invención comprenden adicionalmente un par enlazado
de colorantes donor/aceptor al oligonucleótido de detección de modo
que la fluorescencia del donor se extingue cuando la estructura
secundaria es un pareado de bases intramolecular y el desdoblamiento
o la linealización de la estructura secundaria resulta en una
disminución de la extinción de la fluorescencia. La escisión de un
oligonucleótido se refiere a la rotura de los enlaces fosfodiéster
de ambas hebras de un dúplex de ADN o la rotura del enlace
fosfodiéster de un ADN de hebra única. Esto es en contraste con la
mella, que se refiere a la rotura del enlace fosfodiéster de sólo
una de las dos hebras de un dúplex de ADN.
Los oligonucleótidos de detección de la invención
para tSDA fluorescente en tiempo real homogénea comprenden una
secuencia que forma una estructura secundaria de pareado de bases
intramolecular en las condiciones de reacción seleccionadas para la
hibridación o extensión del cebador. La estructura secundaria se
encuentra posicionada adyacente a la secuencia de unión con el
blanco del oligonucleótido de detección de modo que al menos una
porción de la secuencia de unión con el blanco forma una cola 3' o
5' de hebra única. Como se utiliza aquí, el término ``adyacente a la
secuencia de unión con el blanco'' quiere decir que toda o parte de
la secuencia de unión con el blanco queda como hebra única en una
cola 5' o 3' que está disponible para la hibridación con el blanco.
Eso es, la estructura secundaria no comprende la secuencia de unión
con el blanco entera. Una porción de la secuencia de unión con el
blanco puede estar implicada en el pareado de bases intramolecular
de la estructura secundaria, puede incluir todo o parte de una
primera secuencia implicada en el pareado de bases intramolecular de
la estructura secundaria, puede incluir todo o parte de una primera
secuencia implicada en el pareado de bases intramolecular de la
estructura secundaria pero preferiblemente no se extiende a su
secuencia complementaria. Por ejemplo, si la estructura secundaria
es una estructura tallo-bucle (por ejemplo, una
``horquilla'') y la secuencia de unión con el blanco del
oligonucleótido de detección está presente como cola 3' de hebra
única, la secuencia de unión con el blanco puede extenderse también
a través de todo o parte del primer brazo del tallo y,
opcionalmente, a través de todo o parte del bucle. Sin embargo, la
secuencia de unión con el blanco no se extiende preferiblemente al
segundo brazo de la secuencia implicada en el pareado de bases
intramolecular del tallo. Es decir, es deseable evitar tener ambas
secuencias implicadas en el pareado de bases intramolecular en una
estructura secundaria capaz de hibridar con el blanco. Las faltas de
coincidencia en la porción pareado de bases intramolecular de la
estructura secundaria del oligonucleótido de detección pueden
reducir la magnitud del cambio en la fluorescencia en presencia del
blanco, pero son aceptables si la sensibilidad del ensayo no es de
importancia. Las faltas de coincidencia en la secuencia de unión con
el blanco de la cola de hebra única son también aceptables pero
pueden reducir similarmente la sensibilidad y/o la especificidad del
ensayo. Sin embargo, es una característica de la presente invención
que el perfecto pareado de bases tanto en la estructura secundaria
como en la secuencia de unión con el blanco no compromete la
reacción. Las coincidencias perfectas de las secuencias implicadas
en la hibridación mejoran la especificidad del ensayo sin efectos
negativos sobre la cinética de reacción.
Cuando se añaden a la reacción de amplificación,
los cebadores de señal oligonucleótida de detección de la invención
se convierten a la forma de doble hebra mediante hibridación y
extensión de un cebador de amplificación como se describió
anteriormente. El desplazamiento de hebra por parte de la polimerasa
también desdobla o linealiza la estructura secundaria y la convierte
a su forma de doble hebra mediante síntesis de una hebra
complementaria. El RERS, si está presente, también se vuelve de
doble hebra y escisindible o mellable por la endonucleasa de
restricción. A medida que la estructura secundaria se desdobla o
linealiza por la actividad de desplazamiento de hebra de la
polimerasa, la distancia entre los colorantes donor y aceptor
aumenta, reduciéndose de ese modo la extinción de la fluorescencia
del donor. El cambio asociado en la fluorescencia de bien el
colorante donor o el aceptor puede monitorizarse o detectarse como
indicación de la amplificación de la secuencia blanco. La escisión o
mella del RERS aumenta por lo general adicionalmente la magnitud del
cambio de fluorescencia al producir dos fragmentos separados del
producto de amplificación secundario de doble hebra, teniendo cada
uno enlazado uno de los dos colorantes. Estos fragmentos se pueden
difundir libremente en la disolución de reacción, aumentando
adicionalmente la distancia entre el par donor/aceptor de
colorantes. Puede detectarse y/o monitorizarse un aumento de la
intensidad de fluorescencia del donor o una disminución de la
intensidad de fluorescencia del detector como indicación de que está
ocurriendo o ha ocurrido la amplificación del blanco, pero también
pueden monitorizarse otros parámetros de fluorescencia que se ven
afectados por la proximidad del par de colorantes donor/aceptor. Un
cambio en la intensidad de fluorescencia del donor o el aceptor
puede detectarse también como cambio en una relación de intensidades
de fluorescencia del donor y/o el aceptor. Por ejemplo, un cambio en
la intensidad de fluorescencia puede detectarse como a) un aumento
de la relación de la fluorescencia del fluoróforo donor tras la
linealización o el desdoblamiento de la estructura secundaria y la
fluorescencia del fluoróforo donor del oligonucleótido de detección
previamente a la linealización o el desdoblamiento, o b) como una
disminución de la relación de la fluorescencia del colorante aceptor
tras la linealización o el desdoblamiento y la fluorescencia del
colorante aceptor del oligonucleótido de detección previamente a la
linealización o el desdoblamiento.
Resultará patente que, además de en SDA, los
oligonucleótidos de detección de la invención pueden adaptarse para
uso como cebadores de señal en otros métodos de amplificación con
extensión del cebador (por ejemplo PCR, 3SR, TMA o NASBA). Por
ejemplo, los métodos pueden adaptarse para uso en PCR utilizando
cebadores de amplificación PCR y una ADN polimerasa de
desplazamiento de hebra que carezca de actividad exonucleasa
5'\rightarrow3' (por ejemplo, Sequencing Grade Taq de Promega o
exo^{-} Vent o exo^{-} Deep Vent de New England Biolabs) en la
PCR. Los cebadores de señal oligonucleótida de detección hibridan
con el blanco aguas abajo de los cebadores de amplificación PCR, se
desplazan y se hacen de doble hebra esencialmente como se describió
para SDA. En PCR, puede opcionalmente seleccionarse para uso en el
oligonucleótido de detección cualquier RERS, ya que típicamente no
hay desoxinucleósido trifosfatos modificados presentes que puedan
inducir la mella en lugar de la escisión del RERS. Como los ciclos
térmicos son una característica de la amplificación mediante PCR, la
endonucleasa de restricción se añade preferiblemente a baja
temperatura tras el ciclo final de pegado y extensión del cebador
para la detección de punto final de la amplificación. Sin embargo,
una endonucleasa de restricción termofílica que permanezca activa a
través de las fases de alta temperatura de la reacción PCR podría
estar presente durante la amplificación para proporcionar un ensayo
en tiempo real. Como en los sistemas SDA, la linealización de la
estructura secundaria y la separación del par de colorantes reduce
la extinción de la fluorescencia, sirviendo un cambio en un
parámetro de fluorescencia tal como una intensidad como indicación
de la amplificación del blanco.
El cambio de fluorescencia resultante del
desdoblamiento o la linealización de los oligonucleótidos de
detección puede detectarse en un punto final seleccionado de la
reacción. Sin embargo, puesto que las estructuras secundarias
linealizadas se producen de forma concurrente con la hibridación o
la extensión del cebador, el cambio de fluorescencia puede
monitorizarse también a medida que ocurre la reacción, es decir en
``tiempo real''. Este formato de ensayo homogéneo en tiempo real
puede utilizarse para proporcionar información semicuantitativa o
cuantitativa acerca de la cantidad inicial de blanco presente. Por
ejemplo, la velocidad con la que cambia la intensidad de
fluorescencia durante la reacción de desdoblamiento o linealización
(bien como parte de la amplificación del blanco o en métodos de
detección sin amplificación) es una indicación de los niveles
iniciales de blanco. Como resultado, cuando hay presentes más copias
iniciales de la secuencia blanco, la fluorescencia del donor alcanza
más rápidamente un valor umbral seleccionado (es decir, tiempo más
corto para el positivo). La disminución de la fluorescencia del
aceptor exhibe similarmente un tiempo más corto para el positivo,
detectado como el tiempo requerido para alcanzar un valor mínimo
seleccionado. Además, la velocidad de cambio de los parámetros de
fluorescencia durante el curso de la reacción es más rápida en
muestras que contienen cantidades iniciales de blanco más altas que
en muestras que contienen cantidades iniciales de blanco más bajas
(es decir, mayor pendiente de la curva de fluorescencia). Pueden
efectuarse éstas u otras medidas como se conoce en la técnica como
indicación de la presencia de blanco o como indicación de la
amplificación del blanco. La cantidad inicial de blanco se determina
típicamente mediante comparación de los resultados experimentales
con resultados para cantidades conocidas de blanco.
Los ensayos de presencia de una secuencia blanco
seleccionada según los métodos de la invención pueden efectuarse en
disolución o en fase sólida. Los ensayos en tiempo real o de punto
final homogéneos en los que el oligonucleótido de detección funciona
como cebador se efectúan típicamente en disolución. Los ensayos de
hibridación que utilizan los oligonucleótidos de detección de la
invención pueden efectuarse también en disolución (por ejemplo, como
ensayos en tiempo real homogéneos) pero son también particularmente
adecuados para ensayos en fase sólida para la detección en tiempo
real o de punto final de un blanco. En un ensayo en fase sólida, los
oligonucleótidos de detección pueden inmovilizarse sobre la fase
sólida (por ejemplo, perlas, membranas o el recipiente de reacción)
vía etiquetas internas o terminales utilizando métodos conocidos en
la técnica. Por ejemplo, un oligonucleótido de detección con
etiqueta de biotina puede inmovilizarse sobre una fase sólida
modificada con avidina donde producirá un cambio de fluorescencia
cuando se exponga al blanco en condiciones de hibridación
apropiadas. La captura del blanco de esta manera facilita la
separación del blanco de la muestra y permite la eliminación de
sustancias de la muestra que puedan interferir con la detección de
la señal u otros aspectos del ensayo.
Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones
específicas de la invención aquí descrita. Como resultará evidente
para los expertos, son posibles varios cambios y modificaciones, que
se contemplan dentro del alcance de la invención descrita.
Todas las cuatro combinaciones de cebadores se
probaron según una matriz de condiciones para determinar cuál de las
combinaciones funcionaba mejor en el mayor número de condiciones.
Las condiciones de reacción que se hicieron variar fueron las
siguientes:
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Temperatura de amplificación \+ 52º y 54ºC\cr Fosfato potásico, pH
7,6 \+ 35 y 45 mM\cr Acetato magnésico \+ 5 y 6 mM\cr Sulfóxido de
dimetilo \+ 3 y 7% (vol/vol)\cr Glicerol \+ 3 y 7%
(vol/vol)\cr}
Las reacciones (50 \mul) contenían también 9
unidades de polimerasa Bst, 165 unidades de endonucleasa de
restricción BsoBI, 1200 ng de ADN placental humano, dATP y
dGTP 0,2 mM, dCTP 1,4 mM, dUTP 0,5 mM, 0,1 mg/ml de albúmina sérica
bovina acetilada, 1,8% de trehalosa, ditiotreitol (DTT) 0,36 mM y 1
x 10^{6} copias de ADN del plásmido blanco. El plásmido blanco era
el plásmido pCT16 que contiene las regiones B y F del plásmido
críptico (del serovar J) insertadas en pUC18.
Se prepararon muestras que contuvieran fosfato,
DMSO, glicerol, ADN humano y ADN blanco en un volumen de 30 \mul.
Las muestras se desnaturalizaron térmicamente durante 2 minutos en
un baño de agua hirviendo, se centrifugaron brevemente, y se
colocaron en un baño seco Thermal-Lok (USA
Scientific, Florida) a 45ºC. Tras entre 2 y 5 minutos de
equilibrado, se añadieron los siguientes componentes en un volumen
de 10 \mul: fosfato potásico, cebadores, deflectores, dGTP, dATP,
dC_{s}TP, BSA, DTT, trehalosa, magnesio y 1 unidad de
uracil-N-ADN glicosilasa (UDG). Las muestras se incubaron
durante 30 minutos. Se transfirieron entonces las muestras a un baño
seco Thermal-Lok fijado a la temperatura de
amplificación deseada. Se añadieron los reactivos siguientes en un
volumen de 10 \mul: fosfato potásico, dUTP, BSA, DTT, trehalosa,
magnesio, Bst, BsoBI e inhibidor de uracil-N
ADN glicosilasa (UDI). La SDA térmica ocurrió durante los treinta
minutos siguientes. Las reacciones se detuvieron llevando las
muestras a ebullición durante 5 minutos. Los productos amplificados
se detectaron mediante la extensión de la sonda etiquetada con
^{32}P CTpB4.D1 (ID SEC Nº: 15) hibridada específicamente con la
región central del amplicón. Las muestras detectadas se analizaron
en un gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron mediante
imágenes de fósforo o mediante exposición durante la noche en
película autoradiográfica.
Las figuras 2A-D muestran las
imágenes de fósforo de la matriz de condiciones de prueba. La
combinación de cebadores se indica en la base de cada línea. En
ciertas condiciones, solo funcionarán algunas de las combinaciones
de cebadores, mientras que otras condiciones son favorables para
cualquiera de las cuatro combinaciones. Aunque las combinaciones 1 y
2 parecen funcionar mejor en una serie de condiciones, no es
claramente evidente que una combinación sea superior a todas las
demás.
En el mismo experimento, se detectaron cuatro de
las muestras (52ºC, KPO_{4} 35 mM, MgOAC 5 mM, 3% DMSO, 7%
glicerol) con un detector complementario, CTpB4.D2 (ID SEC Nº: 16).
Los resultados se muestran en la Figura 3. El detector que hibridó
con la hebra homosentido dio un aumento de 50 veces en la intensidad
de la imagen de fósforo, lo que indica que se alcanza una mejor
sensibilidad con ese detector en comparación con su complementario.
Así pues, todos los ejemplos subsiguientes con Sistema B utilizaron
el detector CTpB4.D2 (ID SEC Nº: 16).
A fin de seleccionar la combinación de cebadores
y condiciones de tamponado con la mayor sensibilidad, se probaron
cada una de las 4 combinaciones de cebadores anteriores en las dos
mejores condiciones vistas en el Ejemplo 1. Esos dos conjuntos de
condiciones son como sigue:
Fosfato potásico (pH 7,6) 35 mM
Acetato magnésico 6 mM
3% de sulfóxido de dimetilo
3% de glicerol
Amplificación a 54ºC
Fosfato potásico (pH 7,6) 35 mM
Acetato magnésico 6 mM
3% de sulfóxido de dimetilo
7% de glicerol
Amplificación a 54ºC
Todas las demás condiciones de reacción fueron
como se describió en el Ejemplo 1. La imagen de fósforo del gel se
muestra en la Figura 4. Estos resultados indican que todas las
combinaciones de cebadores funcionaron mejor en la condición 2, y
que la mejor sensibilidad (10^{2}) se vio con las combinaciones de
cebadores 1 y 2 en ambas condiciones. Se seleccionó la combinación
de cebadores 2 para estudio adicional. Así pues, todos los ejemplos
subsiguientes para el Sistema B utilizaron la combinación de
cebadores 2 (CTpB4.S1.1 (ID SEC Nº: 10) y CTpB4.S2 (ID SEC Nº:
12)).
Se efectuó un ensayo para probar la habilidad del
sistema de cebadores B para amplificar los múltiples serovares de
C. trachomatis. Se probaron catorce serovares usando la
condición 2 descrita en el Ejemplo 2. Cada serovar se probó a
10^{4} y 10^{3} copias genómicas (el número real de copias del
plásmido críptico presentes en la muestra es desconocido). Trece de
los catorce serovares amplificaron al nivel 10^{4} y siete de los
catorce amplificaron al nivel 10^{3} (véase Figura 5). El serovar
B no amplificó. El serovar B es idéntico al 100% a los cebadores y
deflectores, y se cree que la ausencia de amplificación se debió a
una muestra impura o un bajo número de copias del plásmido. Otras
dos especies de Chlamydia y una cepa de Neisseria gonorrhoeae se
probaron a un nivel de entrada de 10^{7} copias genómicas. Ninguna
de éstas produjo un producto amplificado específico.
Se efectuó un ensayo para probar la sensibilidad
del sistema en presencia de ADN humano, usando la Condición 2
descrita en el Ejemplo 2 anterior. El plásmido blanco se tituló a
tan sólo 10 copias en presencia de ADN humano en un rango de 300 a
3000 ng. Los resultados se muestran en la Figura 6. Las reacciones
contenían 10^{3}, 10^{2} (duplicados) y 10 (duplicados) copias
de ADN de plásmido blanco para cada nivel de ADNh. Se analizó
también un control negativo (sin plásmido blanco) al nivel de 1200
ng de ADNh. El sistema mostró una sensibilidad de 10 copias entre
600 y 2500 ng de ADN humano y una sensibilidad de 10^{2} a 300 y
3000 ng de ADN humano.
Se efectuó un ensayo para probar si habría
reactividad cruzada con potenciales contaminantes genitourinarios.
Se utilizó la Condición 2 esbozada en el Ejemplo 2. Se probaron un
total de treinta y cinco organismos que muestrean treinta especies.
Esos organismos se listan en la Tabla 1. Se prepararon nueve mezclas
que contuvieran cada una tres o cuatro especies de ADN a 10^{7}
copias genómicas por especie. Cada mezcla se amplificó en ausencia
del plásmido blanco o en presencia de 200 copias del plásmido pCT16.
Las mezclas con blanco añadido servían como controles de la
amplificación. Ninguna de las mezclas sin blanco añadido mostró
amplificación, mientras que todas las mezclas con blanco plásmido
añadido amplificaron el producto específico. Estos resultados se
muestran en la Figura 7.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline
Mezcla \+ Organismo \+ Cepa \\\hline 1 \+ Neisseria
gonorrhoeae \+ ATCC 19424 \\\hline \+ Neisseria
gonorrhoeae \+ ATCC 35541 \\\hline \+ Neisseria
gonorrhoeae \+ BDMS 2900 \\\hline \+ Neisseria
gonorrhoeae \+ BDMS 1632 \\\hline 2 \+ Neisseria
lactamica \+ ATCC 23970 \\\hline \+ Neisseria
lactamica \+ ATCC 23972 \\\hline \+ Neisseria
meningitidis \+ ATCC 13090 \\\hline \+ Neisseria
meningitidis \+ ATCC 13077 \\\hline 3 \+ Staphylococcus
aureus \+ ATCC 12598 \\\hline \+ Streptococcus
faecalis \+ ATCC 29212 \\\hline \+ Strep. grupo A \+ ATCC
16915 \\\hline \+ Strep. grupo B \+ ATCC 12386 \\\hline 4 \+
Salmonella typhimurium \+ ATCC 13311 \\\hline \+
Salmonella minnesota \+ ATCC 9700 \\\hline \+
Escherichia coli \+ ATCC 11775 \\\hline \+ Klebsiella
pneumoniae \+ ATCC 13883 \\\hline 5 \+ Proteus
mirabilis \+ ATCC 29906 \\\hline \+ Moraxella lacunata
\+ ATCC 17967 \\\hline \+ Haemophilus influenzae \+ ATCC
33533 \\\hline \+ Acinetobacter lwoffii \+ ATCC 19001
\\\hline 6 \+ Gardenerella vaginalis \+ ATCC 14018
\\\hline \+ Mycoplasma orale \+ ATCC 73714 \\\hline \+
Trichomonas vaginalis \+ ATCC 30001 \\\hline \+ Candida
albicans \+ ATCC 44808 \\\hline 7 \+ Virus herpes simplex 1
\+ McIntyre \\ \+ VHS - 1 \+ \\\hline \+ Virus
herpes simplex 2 \+ G \\ \+ VHS - 2 \+ \\\hline
\+ Peptostreptococcus \+ ATCC 27340 \\ \+ productus
\+ \\\hline 8 \+ Neisseria flavescens \+ ATCC 13120
\\\hline \+ Neisseria sicca \+ ATCC 29193 \\\hline \+
Neisseria cinerae \+ ATCC 14685 \\\hline \+ Neisseria
elongata \+ ATCC 25295 \\\hline 9 \+ Neisseria mucosa
\+ ATCC 19696 \\\hline \+ Neisseria subflava \+ ATCC
14799 \\\hline \+ Branhamella catarrhalis \+ ATCC 25240
\\\hline \+ Kingella kingae \+ ATCC 23330
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
En la base de datos Genbank había disponibles
datos de secuencias de la región F del plásmido críptico procedente
de cuatro serovares humanos de C. trachomatis. Otros cuatro
serovares se secuenciaron en esa región. Se utilizó una alineación
compuesta para diseñar conjuntos de cebadores tSDA que superaran las
variaciones en secuencia. Los cebadores, deflectores y detectores
elegidos para uso con la región F se exponen a continuación. Los
sitios para BsoBI dentro de los cebadores tSDA están en
cursiva y la región de hibridación está subrayada. Las sondas de
detección D1L y D2L se utilizaron en ensayos de extensión con
radioetiquetas, D3L y D4L se utilizaron en ensayos de
captura/detección, y FD1 se utilizó como detector con etiqueta
fluorescente.
CtpF8.BL
5'-CAGCAAATAATCCTTGG-3' (ID SEC Nº:
18)
CtpF8.BR
5'-CATTGGTTGATGAATTATT-3' (ID SEC
Nº: 19)
CtpF8.AL1
5'-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGG ACAAAATCAACACCTG-3'
(ID SEC Nº: 20)
CtpF8.AL2
5'-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGG ACAAAATCAACACCTGT-3'
(ID SEC Nº: 21)
CtpF8.AR1
5'-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG GAGACTGTTAAAGATA-3'
(ID SEC Nº: 22)
CtpF8.AR2
5'-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG GAGACTGTTAAAGATAT-3'
(ID SEC Nº: 23)
CtpF8.AR3
5'-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGG GAGACTGTTAAAGATATT-3'
(ID SEC Nº: 24)
CtpF8.D1L
5'-GTCGCAGCCAAAATG-3' (ID SEC Nº:
25)
CtpF8.D2L
5'-ACAGCTTCTGATGGAA-3' (ID SEC Nº:
26)
CtpF8.D3L
5'-GTCGCAGCCAAAAT-(fosfatasa alcalina
x3)-3' (ID SEC Nº: 27)
CtpF8.D4L 5'-(biotina
x3)-GACAGCTTCTGATGGAA-3' (ID SEC Nº:
28)
CtpF8.FD1 5'-
[FAM]TAGCACCCGAGTGCT[ROX]CGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA-3'
(ID SEC Nº: 29)
Se cribaron cebadores de diferentes longitudes (y
consecuentemente diferentes Tf) en un experimento en que se varió la
temperatura (50ºC o 52ºC), el fosfato potásico (25 mM o 35 mM), el
glicerol (3,5% o 7%), el DMSO (3% o 8%) y el ADN placental humano
(300 ng o 1200 ng). Otros componentes para las reacciones tSDA eran:
acetato magnésico 6 mM, 160 unidades de BsoBI, 9 unidades de
polimerasa Bst, dATP 0,2 mM, d_{s}CTP 1,4 mM, dGTP 0,2 mM,
dUTP 0,5 mM, cada cebador 0,5 \muM, cada deflector 0,05 \muM, 1
unidad de UDG, 5 unidades de UDI, 100 \mug/ml de BSA, DTT 0,36 mM
y 1,86% de trehalosa. El blanco eran 10^{6} genomas de C.
trachomatis LGVII. La descontaminación fue a 45ºC durante 30
minutos y la amplificación fue a bien 50ºC o 52ºC durante 30
minutos.
Se probaron todas las combinaciones de cebadores
(6). Los productos amplificados se detectaron en una reacción de
extensión utilizando la sonda de detección radioetiquetada CtpF8.D1L
(ID SEC Nº: 20). Tras separación de los productos amplificados sobre
un gel de acrilamida al 8%, se efectuó la cuantificación de la
intensidad de los productos radioetiquetados con un equipo
PhosphorImager 445SI de Molecular Dynamics y el software ImageQuant
v1.1.
Todas las combinaciones de cebadores produjeron
productos de amplificación detectables en al menos cinco de las ocho
condiciones probadas y listadas a continuación.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|l|l|}\hline
\+ 1 \+ 2 \+ 3 \+ 4 \+ 5 \+ 6 \+ 7 \+ 8 \\\hline Temp \+
50º \+ 50º \+ 50º \+ 50º \+ 52º \+ 52º \+ 52º \+ 52º \\\hline
Fosfato \+ 25 mM \+ 25 mM \+ 35 mM \+ 35 mM \+ 25 mM \+ 25 mM
\+ 35 mM \+ 35 mM \\\hline Glicerol \+ 3,5% \+ 7% \+ 3,5% \+
7% \+ 3,5% \+ 7% \+ 3,5% \+ 7% \\\hline DMSO \+ 3% \+ 8% \+
8% \+ 3% \+ 8% \+ 3% \+ 3% \+ 8% \\\hline ADNph \+ 1200ng \+
300ng \+ 300ng \+ 1200ng \+ 1200ng \+ 300ng \+ 300ng \+ 1200
ng
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Una combinación de cebadores, AL1/AR1, produjo
amplificación fuerte en seis de las condiciones probadas. La mejor
amplificación se observó cuando se usó fosfato potásico 35 mM, 3% de
DMSO, 7% de glicerol, 1200 ng de ADN humano y amplificación a 50ºC.
Esta combinación de cebadores, junto con los deflectores, compone el
conjunto de cebadores F.
Se probó una titulación de un plásmido, pCT16,
construido para contener una copia de la región blanco del serovar J
de Chlamydia trachomatis, desde 10^{6} copias hasta tan
solo 1 copia. Asimismo, se llevó a cabo una titulación de una
preparación de ADN genómico procedente de cuerpos elementales de
C. trachomatis para comparación. Las condiciones utilizadas
para la tSDA fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 7:
fosfato potásico 35 mM, 3% de DMSO, 7% de glicerol, acetato
magnésico 6 mM, 1200 ng de ADN placental humano y una temperatura de
amplificación de 50ºC. Tras amplificación, los productos se
detectaron usando CtpF8.D1L (ID SEC Nº: 25) en una reacción de
extensión con sondas radioetiquetadas y se cuantificaron usando el
software ImageQuant v1.1. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Cualquier intensidad por debajo de 2 veces el fondo se informa como
cero. Los datos demuestran que el conjunto F de cebadores para tSDA
puede detectar 10 copias (3/3 réplicas) y puede detectar 1 copia
(1/3 réplicas) de la región blanco.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline
Copias de pCT16 \+ Intensidad \+ Copias genómicas \+ Intensidad
\\ \+ \+ del serovar LGV II \+ (pixeles) \\\hline 10 ^{6} \+
54336500 \+ 10 ^{6} \+ 64616550 \\\hline 10 ^{5} \+ 62185822
\+ 10 ^{5} \+ 76821582 \\\hline 10 ^{4} \+ 61722424 \+
10 ^{4} \+ 57716379 \\\hline 10 ^{3} \+ 44104645 \+ 10 ^{3}
\+ 14191912 \\\hline 10 ^{3} \+ 37944957 \+ \+ \\\hline 10 ^{2}
\+ 6427450 \+ 10 ^{2} \+ 1534883 \\\hline 10 ^{2} \+ 14184075
\+ \+ \\\hline 10 ^{2} \+ 9067676 \+ \+ \\\hline 10 \+ 2004088
\+ 10 \+ 32110 \\\hline 10 \+ 717772 \+ \+ \\\hline 10 \+
2178641 \+ \+ \\\hline 1 \+ 101144 \+ 1 \+ 31291 \\\hline 1 \+
0 \+ \+ \\\hline 1 \+ 0 \+ \+ \\\hline 0 \+ 0 \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Para determinar si el sistema F podía amplificar
todos los serovares de C. trachomatis, se probaron
preparaciones de ADN genómico entero procedentes de trece serovares.
El serovar LGV I no estaba disponible para prueba. Éstas se probaron
en las mismas condiciones de amplificación del Ejemplo 8 y usando
10^{3} genomas. Cada ensayo se efectuó por duplicado. Los
resultados se muestran en la Tabla 3. Cualquier intensidad inferior
a 2 veces el nivel del fondo se informó como cero.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline
Serovar \+ Intensidad (pixeles) \+ Intensidad (pixeles) \\\hline
A \+ 218413 \+ 56556 \\\hline B \+ 0 \+ 0 \\\hline Ba \+
187056 \+ 122053 \\\hline C \+ 178899 \+ 126053 \\\hline D \+
51968 \+ 205425 \\\hline E \+ 256928 \+ 715980 \\\hline F \+
309899 \+ 402525 \\\hline G \+ 0 \+ 53155 \\\hline H \+ 465217
\+ 553424 \\\hline I \+ 265694 \+ 446492 \\\hline J \+ 250981
\+ 281921 \\\hline K \+ 60013 \+ 148717 \\\hline LIII \+ 220077
\+ 119152 \\\hline Negativo \+ 0 \+ 0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Los datos de la Tabla 3 junto con los datos del
Ejemplo 8 demuestran que el conjunto de cebadores F puede detectar
al menos 13 de los 15 serovares de C. trachomatis a 10^{3}
genomas. Sólo se probaron 14 de los 15 porque el serovar LGV I no
estaba disponible. El único serovar que dio un resultado negativo es
el serovar B. El ADN genómico del serovar B no lo detectó ninguno de
los sistemas de amplificación específicos de C. trachomatis
(véanse los Ejemplos anteriores), lo que sugiere que la preparación
de ADN del serovar B es sospechosa.
Debido a la susceptibilidad del ADN del serovar B
y la no disponibilidad de ADN del serovar LGV I como se informó en
el Ejemplo 9 anterior, se utilizaron las mismas condiciones del
Ejemplo 9 con únicamente ADN de esos dos serovares para determinar
si los sistemas B y F podían amplificar también los serovares B y
LGV I de C. trachomatis. Cada ensayo se efectuó por duplicado
para 10^{3} y 10^{4} genomas. Los resultados se muestran en la
Tabla 4. Cualquier intensidad menos de 2 veces por encima del nivel
del fondo se informó como cero.
\dotable{\tabskip6pt\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Serovar \+ Nº de genomas \+ Sistema F \+ Sistema B\cr B \+
10 ^{4} \+ 14592 \+ 71\cr B \+ 10 ^{4} \+ 8072 \+ 1286\cr B \+
10 ^{3} \+ 9859 \+ 0\cr B \+ 10 ^{3} \+ 134 \+ 52\cr LGV I \+
10 ^{4} \+ 8888 \+ 8260\cr LGV I \+ 10 ^{4} \+ 15663 \+ 5371\cr
LGV I \+ 10 ^{3} \+ 1032 \+ 140\cr LGV I \+ 10 ^{3} \+ 6728 \+
0\cr}
Así pues, se concluyó que el Sistema F podía
amplificar y detectar tanto el serovar B como el serovar LGV I a
10^{3} genomas, y que el Sistema B podía amplificar y detectar el
serovar B a 10^{4} genomas y el serovar LGV I a 10^{3}
genomas.
Se utilizó el conjunto de cebadores F en una
serie de ensayos utilizando una variedad de condiciones de reacción.
Los ensayos utilizaron un nivel de blanco de 100 copias de pCT16. Se
vio amplificación en todos los rangos de condiciones de reacción
siguientes:
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Temperatura de amplificación \+ 50 - 54ºC\cr Fosfato potásico \+
25 - 35 mM\cr DMSO \+ 3 - 7% (vol/vol)\cr Glicerol \+ 3 - 7%
(vol/vol)\cr Acetato magnésico \+ 5 - 6 mM\cr ADN placental humano
\+ 300 - 3050
ng\cr}
En varios casos, los rangos anteriores fueron los
límites de lo que se probó y es probable que la amplificación ocurra
con condiciones de reacción más allá de los rangos arriba mostrados.
Las condiciones identificadas como las que producían la mayor
amplificación fueron:
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Temperatura de amplificación \+ 52ºC\cr Fosfato potásico \+ 35
mM\cr DMSO \+ 7% (vol/vol)\cr Glicerol \+ 7% (vol/vol)\cr Acetato
magnésico \+ 5 mM\cr ADN placental humano \+ 1200
ng\cr}
Hay bacterias y virus con potencial reactividad
cruzada que se encuentran habitualmente en especímenes clínicos
genitourinarios. Se efectuaron reacciones SDA térmicas usando el
conjunto de cebadores F y usando las mejores condiciones de ensayo
del Ejemplo 11. Los especímenes con potencial reactividad cruzada se
probaron a 10^{7} genomas. Se probaron en muestras mezcla de
cuatro especies, con un control de la misma mezcla dopado con 100
copias de pCT16 para mostrar que no ocurría inhibición alguna de la
amplificación. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Ninguno de
los posibles reactivos cruzados fue amplificado ni detectado por el
conjunto de cebadores F.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|}\hline
Organismo \+ Cepa \+ Res. \+ Organismo \+ Cepa \+ Res.
\\\hline Chlamydia psittaci \+ TWAR \+ - \+
Branhamella \+ ATCC 25240 \+ - \\ \+ \+ \+
catarrhalis \+ \+ \\\hline Chlamydia \+ Borg \+ -
\+ Moraxella lacunata \+ ATCC 17967 \+ - \\
pneumoniae \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline Neisseria \+ BDMS
1632 \+ - \+ Kingella kingae \+ ATCC 23330 \+ - \\
gonorrhoeae \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline Neisseria \+
ATCC 19424 \+ - \+ Salmonella \+ ATCC 13311 \+ - \\
gonorrhoeae \+ \+ typhimurium \+ \+ \+ \\\hline
Neisseria \+ BDMS 2900 \+ - \+ Salmonella \+ ATCC
9700 \+ - \\ gonorrheae \+ \+ \+ minnesota \+ \+
\\\hline Neisseria \+ ATCC 35541 \+ - \+ Staph.
aureus \+ ATCC 12598 \+ - \\ gonorrhoeae \+ \+ \+ \+
\+ \\\hline Neisseria \+ ATCC 13090 \+ - \+
Acinetobacter \+ ATCC 19001 \+ - \\ meningitidis
\+ \+ \+ lwoffi \+ \+ \\\hline Neisseria \+ ATCC
13077 \+ - \+ E. coli \+ ATCC 11775 \+ - \\
meningitidis \+ \+ \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA 5
(continuación)
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|}\hline
Organismo \+ Cepa \+ Res. \+ Organismo \+ Cepa \+ Res.
\\\hline Neisseria lactamica \+ ATCC 23970 \+ - \+
Klebsiella \+ ATCC 13883 \+ - \\ \+ \+ \+
pneumoniae \+ \+ \\\hline Neisseria lactamica \+
ATCC 23972 \+ - \+ Gardnerella \+ ATCC 14018 \+ - \\ \+
\+ \+ vaginalis \+ \+ \\\hline Neisseria \+ ATCC
13120 \+ - \+ Streptococcus \+ ATCC 16915 \+ - \\
flavecens \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline Neisseria sicca \+
ATCC 29193 \+ - \+ Streptococcus \+ ATCC 12386 \+ - \\
\+ \+ \+ Grupo B \+ \+ \\\hline Neisseria subflava \+
ATCC 14799 \+ - \+ Proteus mirabilis \+ ATCC 29906 \+ -
\\\hline Neisseria cinerea \+ ATCC 14685 \+ - \+
Haemophilus \+ ATCC 33533 \+ - \\ \+ \+ \+
influenzae \+ \+ \\\hline Neisseria elongata \+ ATCC
25295 \+ - \+ Mycoplasma orale \+ ATCC 23714 \+ \\\hline
Neisseria mucosa \+ ATCC 19696 \+ - \+ V - 1
Herpes simplex \+ McINTYRE \+ - \\\hline Streptococcus \+
ATCC 27340 \+ - \+ V - 2 Herpes simplex \+ Cepa G
\+ - \\ faecalis \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline Candida
albicans \+ ATCC 44808 \+ - \+ Trichomonas \+ ATCC
30001 \+ - \\ \+ \+ \+ vaginalis \+ \+ \\\hline
Peptostreptococcus \+ ATCC 27340 \+ - \+ \+ \+ \\
productus \+ \+ \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Los conjuntos de cebadores F y B fueron también
útiles para efectuar reacciones de tSDA fluorescente en tiempo real
homogénea. Tales reacciones utilizan un detector que incluye una
secuencia horquilla y moléculas fluorescentes aceptor y donor. Uno
de tales detectores que funciona bien para uso con el conjunto de
cebadores sistema F es CTpF8.FD1
5'-TAGCACCCGAGTGCTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA-3'
(ID SEC Nº: 29). Un detector que funciona bien para uso con el
sistema B es CTpB4.FD1 5'-
TAGCACCCGAGTGCTTTGACGATTTTCTCCAACCGATGAGTTGAT-3' (ID
SEC Nº: 17). Las 15 primeras bases de estas secuencias incluyen una
estructura horquilla así como un sitio de restricción para
BsoBI. Las bases 2 a 6 pueden formar un apareamiento de bases
con las bases 15 a 11. Además, la base 1 es modificada por adición
de FAM y la base 15 es modificada por adición de ROX. Esta
estructura horquilla (las primeras 15 bases de ID SEC Nº: 29) es
5'-(FAM)*TAGCACCCGAGTGCT*(ROX) -3' (ID SEC Nº: 30). Las bases
6 a 11 se muestran en cursiva y representan el sitio de restricción
para BsoBI.
El protocolo para efectuar tSDA fluorescente en
tiempo real homogénea es similar al de la tSDA normal. Uno de tales
protocolos, que se ha adaptado para reacciones de mayor volumen para
uso con formatos de pocillo de microtitulador, pero que sigue el
protocolo tSDA en las relaciones de componentes es como sigue:
- 1.
- Equilibrar un baño Thermal-Lok a 45ºC y equilibrar otro baño Thermal-Lok a 52ºC usando un termómetro digital Electro-Therm tras llenar los pocillos con 1 ml de agua. Equilibrar también un baño Thermal-Lok seco a 54ºC.
- 2.
- Preparar el tampón de la reacción tSDA y preparar la mezcla de descontaminación. Mantener éstos a temperatura ambiente.
- 3.
- Añadir 65 \mul de tampón de la reacción tSDA a cada tubo Eppendorf Safelok de 0,5 ml.
- 4.
- Añadir 5 \mul de molde diluido en 10 ng/\mul de ADN humano por tubo.
- 5.
- Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 2 minutos.
- 6.
- Transferir los tubos a una microcentrífuga y pulsar el giro.
- 7.
- Transferir los tubos al Thermal-Lok a 45ºC durante 5 minutos.
- 8.
- Añadir 15 \mul de mezcla de descontaminación a cada tubo, formar un vórtice brevemente, e incubar durante 20 minutos.
- 9.
- Preparar mezcla de amplificación y almacenarla a temperatura ambiente.
- 10.
- Colocar los pocillos de microtitulación en una bandeja metálica y colocarla encima del Thermal-Lok a 54ºC para precalentar.
- 11.
- Transferir los tubos al Thermal-Lok a 52ºC durante 5 minutos.
- 12.
- Transferir 85 \mul de la reacción a un pocillo de microtitulación apropiado. Para reacciones de punto final únicamente, dejar la muestra en el tubo.
- 13.
- Añadir 15 \mul de mezcla de amplificación a cada pocillo. Sellar los pocillos con una hoja de acetato autoadhesiva. Para reacciones de punto final, añadir 15 \mul de mezcla de amplificación a cada tubo, formar un vórtice y continuar incubando en el Thermal-Lok durante 60 minutos.
- 14.
- Colocar la bandeja en un lector de placas fluorescentes a 52ºC y recoger datos de RFU durante 60 minutos. Para reacciones de punto final, transferir los contenidos de los tubos a pocillos de microtitulación y tomar una lectura sencilla de cada pocillo.
Para probar la sensibilidad del uso de los
sistemas de cebadores F y B con los detectores CtpF8.FD1 y CtpB4.FD1
en una reacción de tSDA fluorescente en tiempo real homogénea, se
efectuaron una serie de tales reacciones usando el plásmido pCT16
como blanco a diferentes números de copias. Para el sistema B, se
utilizó el protocolo de punto final descrito en el Ejemplo 12. Las
condiciones finales de reacción fueron: fosfato potásico 35 mM, 3%
de DMSO, 7% de glicerol, acetato magnésico 6 mM, 40 unidades de
Bst, 640 unidades de BsoBI, 2400 ng de ADN placental humano, dATP y
dGTP 0,2 mM, dCsTP 1,4 mM, dUTP 0,5 mM, 0,1 mg/ml de albúmina sérica
bovina acetilada, 1,8% de trehalosa, DTT 0,36 mM y CTpB4.FD1 (ID SEC
Nº: 17) 200 mM. La amplificación se hizo a 54ºC y se utilizaron
enzima de descontaminación (UDG) e inhibidor (UDI). Se obtuvieron
los resultados siguientes leyendo las muestras tras 60 minutos de
incubación (excitación a 485 nm, emisión a 538 nm):
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\multicolumn{1}{c}{Copias
de plásmido }\+\multicolumn{1}{c}{RFU punto final
}\+\multicolumn{1}{c}{RFU punto final
/}\\\multicolumn{1}{c}{ }\+\multicolumn{1}{c}{
}\+\multicolumn{1}{c}{fondo medio}\\\hline 500 \+ 2,52 \+ 4,8
\\\hline \+ 7,27 \+ 14,0 \\\hline \+ 14,35 \+ 27,6 \\\hline
200 \+ 6,72 \+ 12,9 \\\hline \+ 2,14 \+ 4,1 \\\hline \+ 11,64
\+ 22,4 \\\hline 50 \+ 1,20 \+ 2,3 \\\hline \+ 0,66 \+ 1,3
\\\hline \+ 0,43 \+ 0,8 \\\hline 0, fondo \+ 0,57 \+ \\\hline
\+ 0,51 \+ \\\hline \+ 0,48 \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Los resultados indican una sensibilidad de 50
copias de pCT16 para una de cada tres réplicas, cuando el positivo
se define como 2 veces por encima del fondo medio.
Para el sistema F, se prepararon mezclas de
descontaminación y amplificación como se describió previamente en el
Ejemplo 12 pero a un nivel de concentración 10x para todos los
reactivos. Se cargaron quince microlitros de mezcla de
descontaminación o diez microlitros de mezcla de amplificación en el
fondo de pocillos de microtitulación y se secaron en una cámara de
secado con baja humedad. Los pocillos de descontaminación y los
pocillos de amplificación se empaquetaron por separado con desecante
hasta su uso.
Los pocillos que contenían cargas de
descontaminación se precalentaron a 45ºC en un bloque térmico
Thermal-Lok durante cinco minutos. Se llevaron a
ebullición durante dos minutos muestras que contenían agua
purificada, fosfato potásico, glicerol, DMSO, ADN placental humano y
plásmido pCT16 y se hicieron girar rápidamente en una
microcentrífuga para mezclarlas. Se pipetearon ciento cincuenta
microlitros de cada muestra en los pocillos de descontaminación
precalentados, que se sellaron con película adhesiva y se incubaron
durante veinte minutos a 45ºC. Los pocillos se trasladaron a un
segundo bloque térmico Thermal-Lok fijado para
alcanzar una temperatura de 52ºC en los pocillos. De forma
coincidente, se colocaron en el mismo bloque térmico para
precalentar un número equivalente de los pocillos de amplificación
cargados anteriormente descritos. Tras entre cinco y diez minutos,
se retiró la película de los pocillos de descontaminación y se
retiraron de cada pocillo y pipetearon en un pocillo de
amplificación (un pocillo de amplificación por muestra) cien
microlitros de muestra. Las condiciones finales de reacción en los
micropocillos tras la rehidratación de la carga de amplificación
fueron: fosfato potásico 35 mM, 7% de glicerol, 7% de DMSO, acetato
magnésico 5 mM, 0,2 mg/ml de BSA acetilada, 1,86% de trehalosa,
ditiotreitol 0,36 mM, dCTP \alpha-tiolado 0,7 mM,
dUTP 0,25 mM, dATP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM, 40 unidades de polimerasa
Bst, 640 unidades de BsoBI, 1 unidad de uracil ADN
glicosilasa, 5 unidades de inhibidor de uracil ADN glicosilasa, AR1
(cebador) 0,5 \muM, AL1 (cebador) 0,3 \muM, BL1 y BR1
(deflectores) 0,05 \muM, FD1 (detector oligo) 0,2 \muM y 2400 ng
de ADN placental humano. Los pocillos de amplificación se sellaron
usando una hoja nueva de película adhesiva y se transfirieron
inmediatamente a un lector de placas PerSeptives que se había
ajustado para mantener una temperatura de incubación constante de
52ºC. Los pocillos se leyeron inmediatamente y a intervalos de un
minuto durante los sesenta minutos siguientes. Las muestras se
excitaron a 485 nm y se monitorizó la fluorescencia emitida a 530
nm. La tabla 6 muestra los resultados. Esos resultados indican una
sensibilidad del sistema de 10 copias de ADN blanco.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline
Nº de copias \+ RFU iniciales \+ RFU finales \+ Diferencia \\
de plásmido \+ \+ \+ \\\hline 0 \+ 298 \+ 334 \+ 36 \\\hline 0
\+ 361 \+ 407 \+ 46 \\\hline 10 \+ 370 \+ 726 \+ 356 \\\hline
10 \+ 295 \+ 299 \+ 4 \\\hline 50 \+ 390 \+ 718 \+ 328
\\\hline 50 \+ 357 \+ 1076 \+ 719 \\\hline 100 \+ 299 \+ 1164
\+ 865 \\\hline 100 \+ 391 \+ 1706 \+ 1315
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se efectuó un segundo conjunto de experimentos
para comprobar la sensibilidad del sistema F. Mientras el Ejemplo 14
usaba el plásmido pCT16 como blanco, para este segundo conjunto de
experimentos se utilizaron como blanco cuerpos elementales de C.
trachomatis LGV2. Las reacciones se efectuaron como en el
Ejemplo 13. Las condiciones de reacción finales fueron como se
describió en el Ejemplo 14 excepto las siguientes: dCTP tiolado 1,4
mM, dUTP 0,5 mM, dATP y dGTP 0,2 mM. Los datos de RFU se recogieron
cada minuto durante el tiempo de amplificación de 60 minutos. La
diferencia en RFU entre el tiempo 0 y el tiempo 60 se muestra en la
Tabla 7 para dos réplicas a cada nivel. De nuevo, este sistema F
basado en detectores fluorescentes puede amplificar y detectar por
encima del nivel de fondo tan poco como 10 cuerpos elementales de
C. trachomatis.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline
Número de cuerpos \+ Cambio en RFU \+ Cambio en RFU \\
elementales \+ Réplica 1 \+ Réplica 2 \\\hline 300 \+ 1142 \+
769 \\\hline 250 \+ 1430 \+ 1015 \\\hline 200 \+ 836 \+ 813
\\\hline 150 \+ 401 \+ 307 \\\hline 100 \+ 262 \+ 573 \\\hline
80 \+ 717 \+ 407 \\\hline 60 \+ 381 \+ 424 \\\hline 40 \+
257 \+ 461 \\\hline 20 \+ 468 \+ 349 \\\hline 10 \+ 158 \+ 66
\\\hline Control positivo \+ 586, 215, 524 \+ \\ pCT16 - 150
copias \+ \+ \\\hline Control negativo \+ 75 \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se probó la especificidad del sistema CtpF811.FD1
como se usa en tSDA fluorescente en tiempo real homogénea. Las
reacciones se efectuaron como en el Ejemplo 14. Se probaron mezclas
de reactivos cruzados a 10^{7} genomas por reacción. Las
amplificaciones se efectuaron en un lector de placas CytoFluor 4000
de PerSeptive Biosystems. Los datos de RFU se recogieron cada minuto
durante el tiempo de amplificación de 60 minutos. La diferencia en
RFU entre el tiempo 0 y el tiempo 60 se muestra en la Tabla 8.
Ninguna de las mezclas mostró amplificación ni detección de los
posibles reactivos cruzados que se probaron.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
Mezcla \+ Reactivo cruzado \+ Cambio en RFU \\\hline 1 \+
Neisseria gonorrhoeae ATCC 19424 \+ 25 \\ \+ Neisseria
gonorrhoeae ATCC 35541 \+ \\ \+ Neisseria gonorrhoeae
BDMS 2900 \+ \\ \+ Neisseria gonorrhoeae BDMS 1632 \+
\\\hline 2 \+ Neisseria meningitidis ATCC 13077 \+ 24 \\
\+ Neisseria meningitidis ATCC 13090 \+ \\\hline 3 \+
Staph. aureus ATCC 12598 \+ 13 \\ \+ Streptococcus
Grupo A ATCC 16915 \+ \\ \+ Streptococcus Grupo B ATCC
12386 \+ \\ \+ Streptococcus faecalis ATCC 29212 \+
\\\hline 4 \+ Salmonella minnesota ATCC 9700 \+ 20 \\ \+
Salmonella typhimurium ATCC 13311 \+ \\ \+ E. coli
ATCC 11775 \+ \\ \+ Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 \+
\\\hline 5 \+ Proteus mirabilis ATCC 29906 \+ 13 \\ \+
Moraxella lacunata ATCC 17967 \+ \\ \+ Haemophilus
influenzae ATCC 33533 \+ \\\hline 6 \+ Gardnerella
vaginalis ATCC 14018 \+ 28 \\ \+ Mycoplasma orale ATCC
23714 \+ \\ \+ Trichomonas vaginalis ATCC 30001 \+ \\ \+
Candida albicans ATCC 44808 \+ \\\hline 7 \+ HVS 1 McIntyre
\+ 13 \\ \+ HVS 2 G \+ \\ \+ Peptostreptococcus
productus ATCC 44808 \+ \\\hline 8 \+ Neisseria
flavescens ATCC 13120 \+ -1 \\ \+ Neisseria sicca ATCC
29193 \+ \\ \+ Neisseria cinerea ATCC 14685 \+ \\ \+
Neisseria elongata ATCC 25295 \+ \\\hline 9 \+ Neisseria
mucosa ATCC 19696 \+ 23 \\ \+ Neisseria subflava ATCC
14799 \+ \\ \+ Branhamella catarrhalis ATCC 25240 \+ \\
\+ Kingella kingae ATCC 23330 \+ \\\hline 10 \+
Neisseria meningitidis ATTC 14632 \+ 0 \\ \+ Neisseria
meningitidis ATTC 13077 \+ \\ \+ Neisseria meningitidis
ATTC 13102 \+ \\ \+ Neisseria meningitidis ATTC 13113 \+ \\
\+ Neisseria meningitidis ATTC 35559 \+ \\\hline 11 \+
Neisseria lactamica ATTC 44418 \+ 15 \\ \+ Neisseria
lactamica ATTC 49142 \+ \\ \+ Neisseria lactamica ATTC
23971 \+ \\ \+ Neisseria lactamica ATTC 23972 \+ \\\hline
12 \+ Neisseria lactamica ATTC 23970 \+ 30 \\\hline 13 \+
Control positivo pCT16 - 100 copias \+ 401, 150 \\\hline 14 \+
Control negativo \+ 22, 27
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Si bien la invención ha sido descrita con alguna
especificidad, pueden hacerse modificaciones evidentes para aquellos
expertos en la técnica sin alejarse del alcance de la invención.
Varias características de la invención se exponen en las
reivindicaciones siguientes.
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Becton, Dickinson and Company 1
Becton Drive, Franklin Lakes, 07417 NJ, EE.UU
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Ensayo de Chlamydia Trachomatis
mediante amplificación y detección del plásmido tríptico de
Chlamydia Trachomatis
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn release 1.0, versión 1.30
Disquete compatible IBM
PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmgaagatcgag tagacgtaat at
\hfill22
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmatagcagata tatctagaac ctt
\hfill23
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmttggatcgaa atgtaatacc ga
\hfill22
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmacttctgatt ttcaaggtgg at
\hfill22
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcaaaactgcg tctttgctga ta
\hfill22
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmgggtgtgact gtgaattttc c
\hfill21
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmagttgggcaa atgacagagc
\hfill20
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmtgaataaccc gttgcattga
\hfill20
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcgattccgct ccagacttct cgggcgatta cttgcagttg
\hfill40
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcgattccgct ccagacttct cggggattac ttgcagttg
\hfill39
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmgagtagacgt aatatt
\hfill16
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmaccgcatcga atgcatgtct cgggatatct gctatttcat t
\hfill41
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmaccgcatcga atgcatgtct cgggatatct gctatttcat
\hfill40
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmctcttaaggt tctag
\hfill15
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmctcatcggtt ggaga
\hfill15
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmtctccaaccg atgag
\hfill15
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmtagcacccga gtgctttgac gattttctcc aaccgatgag ttgat
\hfill45
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcagcaaataa tccttgg
\hfill17
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcattggttga tgaattatt
\hfill19
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcgattccgct ccagacttct cgggacaaaa tcaacacctg
\hfill40
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmcgattccgct ccagacttct cgggacaaaa tcaacacctg t
\hfill41
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmaccgcatcga atgcatgtct cggggagact gttaaagata
\hfill40
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmaccgcatcga atgcatgtct cggggagact gttaaagata t
\hfill41
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmaccgcatcga atgcatgtct cggggagact gttaaagata tt
\hfill42
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmgtcgcagcca aaatg
\hfill15
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmacagcttctg atggaa
\hfill16
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmgtcgcagcca aaat
\hfill14
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmgacagcttct gatggaa
\hfill17
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmtagcacccga gtgctcgcag ccaaaatgac agcttctgat ggaa
\hfill44
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> Ácido nucleico, monohebra,
lineal
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmtagcacccga gtgct
\hfill15
Claims (21)
1. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CTpB4.S1 (ID SEC Nº: 9) y CTpB4.S1.1 (ID SEC
Nº: 10).
2. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CTpB4.S2 (ID SEC Nº: 12) y CTpB4.S2.1 (ID SEC
Nº: 13).
3. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CTpB4.B1 (ID SEC Nº: 11) y CTpB4.B2 (ID SEC Nº:
14).
4. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CTpB4.D1 (ID SEC Nº: 15), el ácido nucleico
complementario al de ID SEC Nº: 15, CTpB4.D2 (ID SEC Nº: 16), el
ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 16, CtpB4.FD1 (ID SEC
Nº: 17) y el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 17.
5. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CtpF8.AL1 (ID SEC Nº: 20) y CtpF8.AL2 (ID SEC
Nº: 21).
6. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CtpF8.AR1 (ID SEC Nº: 22), CtpF8.AR2 (ID SEC
Nº: 23) y CtpF8.AR3 (ID SEC Nº: 24).
7. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CtpF8.BL (ID SEC Nº: 18) y CtpF8.BR (ID SEC Nº:
19).
8. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CtpF8.D1L (ID SEC Nº: 25), el ácido nucleico
complementario al de ID SEC Nº: 25, CtpF8.D2L (ID SEC Nº: 26), el
ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 26, CtpF8.D3L (ID SEC
Nº: 27), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 27,
CtpF8.D4L (ID SEC Nº: 28), el ácido nucleico complementario al de ID
SEC Nº: 28, CtpF8.FD1 (ID SEC Nº: 29) y el ácido nucleico
complementario al de ID SEC Nº: 29.
9. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CtpB4.FD1 (ID SEC Nº: 17), CtpF8.FD1 (ID SEC
Nº: 29) y ID SEC Nº: 30.
10. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CTpB1P (ID SEC Nº: 1), CTpB2P (ID SEC Nº: 2),
CTpB3N (ID SEC Nº: 3) Y CTpB4N (ID SEC Nº: 4).
11. Un ácido nucleico seleccionado de entre el
grupo consistente en CTpFPL (ID SEC Nº: 5), CTpFPR (ID SEC Nº: 6),
CTpFSL (ID SEC Nº: 7) y CTpFSR (ID SEC Nº: 8).
12. Un estuche que comprende:
- a)
- uno o más cebadores seleccionados de entre el grupo consistente en CTpB4.S1 (ID SEC Nº: 9) y CTpB4.S1.1 (ID SEC Nº: 10);
- b)
- uno o más cebadores seleccionados de entre el grupo consistente en CTpB4.S2 (ID SEC Nº: 12) y CTpB4.S2.1 (ID SEC Nº: 13);
- c)
- deflectores CTpB4.B1 (ID SEC Nº: 11) y CTpB4.B2 (ID SEC Nº: 14), y
- d)
- uno o más detectores seleccionados de entre el grupo consistente en CTpB4.D1 (ID SEC Nº: 15), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 15, CTpB4.D2 (ID SEC Nº: 16), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 16, CtpB4.FD1 (ID SEC Nº: 17) y el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 17.
13. Un estuche que comprende:
- a)
- uno o más cebadores seleccionados de entre el grupo consistente en CtpF8.AL1 (ID SEC Nº: 20) y CtpF8.AL2 (ID SEC Nº: 21);
- b)
- uno o más cebadores seleccionados de entre el grupo consistente en CtpF8.AR1 (ID SEC Nº: 22), CtpF8.AR2 (ID SEC Nº: 23) y CtpF8.AR3 (ID SEC Nº: 24);
- c)
- deflectores CtpF8.BL (ID SEC Nº: 18) y CtpF8.BR (ID SEC Nº: 19), y
- d)
- uno o más detectores seleccionados de entre el grupo consistente en CtpF8.D1L (ID SEC Nº: 25), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 25, CtpF8.D2L (ID SEC Nº: 26), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 26, CtpF8.D3L (ID SEC Nº: 27), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 27, CtpF8.D4L (ID SEC Nº: 28), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 28, CtpF8.FD1 (ID SEC Nº: 29) y el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 29.
14. Un método para detectar la presencia o
ausencia de Chlamydia trachomatis en una muestra,
comprendiendo dicho método los pasos de:
- a)
- tratar dicha muestra utilizando un par de cebadores de ácidos nucleicos en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que se selecciona un primer cebador de entre el grupo consistente en CTpB4.S1 (ID SEC Nº: 9) y CTpB4.S1.1 (ID SEC Nº: 10) y se selecciona un segundo cebador de entre el grupo consistente en CTpB4.S2 (ID SEC Nº: 12) y CTpB4.S2.1 (ID SEC Nº: 13), y
- b)
- detectar cualquier producto ácido nucleico amplificado,
donde la detección del producto amplificado
indica la presencia de Chlamydia trachomatis.
15. El método de la reivindicación 14 en el que
dicha reacción de amplificación de ácidos nucleicos es una reacción
de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA).
16. El método de la reivindicación 15 en el que
dicha reacción SDA utiliza CTpB4.B1 (ID SEC Nº: 11) Y CTpB4.B2 (ID
SEC Nº: 14) como deflectores.
17. El método de la reivindicación 14 en el que
la detección de dicho producto de ácido nucleico amplificado se
realiza mediante hibridación de dicho producto de ácido nucleico
amplificado con un detector seleccionado de entre el grupo
consistente en CTpB4.D1 (ID SEC Nº: 15), el ácido nucleico
complementario al de ID SEC Nº: 15, CTpB4.D2 (ID SEC Nº: 16), el
ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 16, CTpB4.FD1 (ID SEC
Nº: 17) y el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 17.
18. Un método para detectar la presencia o
ausencia de Chlamydia trachomatis en una muestra,
comprendiendo dicho método los pasos de:
- a)
- tratar dicha muestra utilizando un par de cebadores de ácidos nucleicos en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que se selecciona un primer cebador de entre el grupo consistente en CtpF8.AL1 (ID SEC Nº: 20) y CtpF8.AL2 (ID SEC Nº: 21) y se selecciona un segundo cebador de entre el grupo consistente en CtpF8.AR1 (ID SEC Nº: 22), CtpF8.AR2 (ID SEC Nº: 23) y CtpF8.AR3 (ID SEC Nº: 24), y
- b)
- detectar cualquier producto de ácido nucleico amplificado,
donde la detección del producto amplificado
indica la presencia de Chlamydia trachomatis.
19. El método de la reivindicación 18 en el que
dicha reacción de amplificación de ácidos nucleicos es una reacción
de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA).
20. El método de la reivindicación 19 en el que
dicha reacción SDA utiliza CtpF8.BL (ID SEC Nº: 18) Y CtpF8.BR (ID
SEC Nº: 19) como deflectores.
21. El método de la reivindicación 18 en el que
la detección de dicho producto de ácido nucleico amplificado se
realiza mediante hibridación de dicho producto ácido nucleico
amplificado con un detector seleccionado de entre el grupo
consistente en CtpF8.D1L (ID SEC Nº: 25), el ácido nucleico
complementario al de ID SEC Nº: 25, CtpF8.D2L (ID SEC Nº: 26), el
ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 26, CtpF8.D3L (ID SEC
Nº: 27), el ácido nucleico complementario al de ID SEC Nº: 27,
CtpF8.D4L (ID SEC Nº: 28), el ácido nucleico complementario al de ID
SEC Nº: 28, CtpF8.FD1 (ID SEC Nº: 29) y el ácido nucleico
complementario al de ID SEC Nº: 29.
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