JPH11221088A - トラコ―マクラミジア潜在プラスミドの増幅および検出による、トラコ―マクラミジアの検定 - Google Patents
トラコ―マクラミジア潜在プラスミドの増幅および検出による、トラコ―マクラミジアの検定Info
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- JPH11221088A JPH11221088A JP10312798A JP31279898A JPH11221088A JP H11221088 A JPH11221088 A JP H11221088A JP 10312798 A JP10312798 A JP 10312798A JP 31279898 A JP31279898 A JP 31279898A JP H11221088 A JPH11221088 A JP H11221088A
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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Abstract
(57)【要約】
【課題】遺伝子の発熱性鎖置換（ｔＳＤＡ）反応に対し
有用であるオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】試験されるサンプルにトラコーマクラミジ
アが存在するか否かを特異的に決定するための増幅検定
の実施において有用であるトラコーマクラミジア潜在プ
ラスミドの一つの領域を特定した。開示したオリゴヌク
レオチドは、トラコーマクラミジアの全ての鎖に対し特
異的であるが、他の微生物のゲノムやヒトＤＮＡと交差
反応性を示さない検定に使用可能である。
有用であるオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】試験されるサンプルにトラコーマクラミジ
アが存在するか否かを特異的に決定するための増幅検定
の実施において有用であるトラコーマクラミジア潜在プ
ラスミドの一つの領域を特定した。開示したオリゴヌク
レオチドは、トラコーマクラミジアの全ての鎖に対し特
異的であるが、他の微生物のゲノムやヒトＤＮＡと交差
反応性を示さない検定に使用可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、患者体内のトラコ
ーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）の存在の有
無を決定する方法に関する。この方法は、トラコーマク
ラミジア潜在プラスミドを特異的に増幅するための核酸
プライマーの使用を含み、鎖置換増幅（Strand Displac
ement Amplification：ＳＤＡ）、好熱性鎖置換増幅（T
hermophilic Strand Displacement Amplification：ｔ
ＳＤＡ ）もしくは蛍光リアルタイム型発鎖置換増幅（F
luorescent Real Time Thermal Strand Displacement A
mplification）のうちのいずれか一つの方法を使用する
ことが好ましい。
ーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）の存在の有
無を決定する方法に関する。この方法は、トラコーマク
ラミジア潜在プラスミドを特異的に増幅するための核酸
プライマーの使用を含み、鎖置換増幅（Strand Displac
ement Amplification：ＳＤＡ）、好熱性鎖置換増幅（T
hermophilic Strand Displacement Amplification：ｔ
ＳＤＡ ）もしくは蛍光リアルタイム型発鎖置換増幅（F
luorescent Real Time Thermal Strand Displacement A
mplification）のうちのいずれか一つの方法を使用する
ことが好ましい。
【０００２】
【従来の技術】トラコーマクラミジアは、トラコーマ
（単一原因での失明の最大原因）、封入体性結膜炎、乳
児肺炎、尿道炎および性病性リンパ肉芽腫の原因微生物
である。この微生物の分析および検出は、多くの場合病
理学的もしくは臨床的所見を基礎とし、隔離法および染
色法により確認されることもある。トラコーマクラミジ
アは、大きさ約7.5kbで、生体内に多数の複製が存在す
る潜在プラスミドを含む。多数の複製が存在するので、
このプラスミドは、核酸増幅法を用いた検定による診断
目的に好都合な標的である。
（単一原因での失明の最大原因）、封入体性結膜炎、乳
児肺炎、尿道炎および性病性リンパ肉芽腫の原因微生物
である。この微生物の分析および検出は、多くの場合病
理学的もしくは臨床的所見を基礎とし、隔離法および染
色法により確認されることもある。トラコーマクラミジ
アは、大きさ約7.5kbで、生体内に多数の複製が存在す
る潜在プラスミドを含む。多数の複製が存在するので、
このプラスミドは、核酸増幅法を用いた検定による診断
目的に好都合な標的である。
【０００３】本明細書中で使用する用語を以下に定義す
る。増幅プライマーは、標的配列とハイブリッド形成し
た後、このプライマーが伸長することで標的配列の増殖
を開始させる役割を果たすものである。増幅プライマー
の長さは通常、約10〜75ヌクレオチドであり、約10〜50
ヌクレオチドであることが好ましい。ＳＤＡ用の増幅プ
ライマーの全長は通常約25〜50ヌクレオチドである。Ｓ
ＤＡ増幅プライマーの３’末端（標的結合配列）は標的
配列の５’末端とハイブリッド形成する。標的結合配列
の長さは通常、約10〜25ヌクレオチドで、増幅プライマ
ーにハイブリッド形成特異性を与えている。ＳＤＡ増幅
プライマーは標的結合配列へのエンドヌクレアーゼ５’
の識別部位を有する。ウォーカーらが詳述しているよう
に（G.Walker, et al. 1992. PNAS 89：392-396 and 19
92 Nucl. Acids Res. 20：1691-1696）、この識別部位
は不完全修飾（hemimodify）される際の、ＤＮＡ二体鎖
のうちの一つを切断する制限エンドヌクレアーゼに対す
る識別部位である。制限酵素認識部位への核酸５’（尾
部（tai1））は、ＳＤＡ中に増幅プライマーの残りの部
分が切断され、変位した際にポリメラーゼ再開始（repr
iming）部位として機能する。尾部核酸の再開始機能
は、ＳＤＡ反応を持続させ単一の標的分子から多数のア
ンプリコンを合成するのを可能にする。尾部の長さは通
常、約10〜25ヌクレオチドである。その長さと配列は一
般に重要ではなく、通常のやり方で選択し、修正するこ
とができる。標的結合配列はプライマーの標的特部分で
あるので、標的末端部に特殊配列が要求されない増幅法
では、増幅プライマーは実質的に標的結合配列のみから
なる。中断可能な制限酵素認識部位とＳＤＡの尾部以外
に標的に付加する特殊配列が要求される増幅法（例え
ば、３ＳＲに対するＲＮＡポリメラーゼプロモーター、
ＮＡＳＢＡ、転写べ一スの増幅）では、要求される特殊
配列は、プライマーハイブリッド形成特異性を変えるこ
となしに、オリゴヌクレオチドを培養するごくありふれ
た方法で使用される標的結合直列に連鎖させてよい。
る。増幅プライマーは、標的配列とハイブリッド形成し
た後、このプライマーが伸長することで標的配列の増殖
を開始させる役割を果たすものである。増幅プライマー
の長さは通常、約10〜75ヌクレオチドであり、約10〜50
ヌクレオチドであることが好ましい。ＳＤＡ用の増幅プ
ライマーの全長は通常約25〜50ヌクレオチドである。Ｓ
ＤＡ増幅プライマーの３’末端（標的結合配列）は標的
配列の５’末端とハイブリッド形成する。標的結合配列
の長さは通常、約10〜25ヌクレオチドで、増幅プライマ
ーにハイブリッド形成特異性を与えている。ＳＤＡ増幅
プライマーは標的結合配列へのエンドヌクレアーゼ５’
の識別部位を有する。ウォーカーらが詳述しているよう
に（G.Walker, et al. 1992. PNAS 89：392-396 and 19
92 Nucl. Acids Res. 20：1691-1696）、この識別部位
は不完全修飾（hemimodify）される際の、ＤＮＡ二体鎖
のうちの一つを切断する制限エンドヌクレアーゼに対す
る識別部位である。制限酵素認識部位への核酸５’（尾
部（tai1））は、ＳＤＡ中に増幅プライマーの残りの部
分が切断され、変位した際にポリメラーゼ再開始（repr
iming）部位として機能する。尾部核酸の再開始機能
は、ＳＤＡ反応を持続させ単一の標的分子から多数のア
ンプリコンを合成するのを可能にする。尾部の長さは通
常、約10〜25ヌクレオチドである。その長さと配列は一
般に重要ではなく、通常のやり方で選択し、修正するこ
とができる。標的結合配列はプライマーの標的特部分で
あるので、標的末端部に特殊配列が要求されない増幅法
では、増幅プライマーは実質的に標的結合配列のみから
なる。中断可能な制限酵素認識部位とＳＤＡの尾部以外
に標的に付加する特殊配列が要求される増幅法（例え
ば、３ＳＲに対するＲＮＡポリメラーゼプロモーター、
ＮＡＳＢＡ、転写べ一スの増幅）では、要求される特殊
配列は、プライマーハイブリッド形成特異性を変えるこ
となしに、オリゴヌクレオチドを培養するごくありふれ
た方法で使用される標的結合直列に連鎖させてよい。
【０００４】「バンパープライマー」または「外部プライ
マー」は、等温反応でプライマー伸長生成物を転位する
のに使用されるプライマーである。バンパープライマー
はその伸長部分が増幅プライマーの標的配列下流部分お
よびその伸張生成物を置換することにより、増幅プライ
マーの標的配列上流部分にアニールする。
マー」は、等温反応でプライマー伸長生成物を転位する
のに使用されるプライマーである。バンパープライマー
はその伸長部分が増幅プライマーの標的配列下流部分お
よびその伸張生成物を置換することにより、増幅プライ
マーの標的配列上流部分にアニールする。
【０００５】「標的」もしくは「標的配列」という用語は増
幅される核酸配列を指す。これらは増幅される元の核酸
配列と相補関係にある第二ＤＮＡ鎖、増幅される核酸配
列の複製のうちのいずれかのＤＮＡ鎖を含む。これらの
複製は増幅プライマーとハイブリッド形成する配列の複
製を含むことにより、増幅可能な標的としての役割を担
う。
幅される核酸配列を指す。これらは増幅される元の核酸
配列と相補関係にある第二ＤＮＡ鎖、増幅される核酸配
列の複製のうちのいずれかのＤＮＡ鎖を含む。これらの
複製は増幅プライマーとハイブリッド形成する配列の複
製を含むことにより、増幅可能な標的としての役割を担
う。
【０００６】増幅反応中に生成する標的の複製は、増幅
生成物、アンプリマー（amplimer）またはアンプリコン
と呼ばれる。
生成物、アンプリマー（amplimer）またはアンプリコン
と呼ばれる。
【０００７】「伸張生成物（extension product）」とい
う用語は、プライマーのハイブリッド形成および鋳型と
して標的配列を用いたポリメラーゼによるプライマーの
伸張によって生成した標的配列の複製を指す。
う用語は、プライマーのハイブリッド形成および鋳型と
して標的配列を用いたポリメラーゼによるプライマーの
伸張によって生成した標的配列の複製を指す。
【０００８】「種特異性」という用語は、ある種の微生物
または一群の関連した種の微生物を、同一の属内の他の
種または他の属内の種の実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリッド形成を伴うことなく、検
出、増幅またはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成す
ることを指す。
または一群の関連した種の微生物を、同一の属内の他の
種または他の属内の種の実質的な検出、増幅またはオリ
ゴヌクレオチドハイブリッド形成を伴うことなく、検
出、増幅またはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成す
ることを指す。
【０００９】「検定プローブ（assay probe）」という用
語は、核酸の検出または同定を容易にするために使用す
るオリゴヌクレオチドを指す。例えば、本発明におい
て、検定プローブはトラコーマクラミジア潜在プラスミ
ド核酸の検出または同定に使用される。以下に詳述する
ように、検定プローブの実例には、検出プローブ、検出
プライマー、捕捉プローブおよび信号プライマーがあ
る。
語は、核酸の検出または同定を容易にするために使用す
るオリゴヌクレオチドを指す。例えば、本発明におい
て、検定プローブはトラコーマクラミジア潜在プラスミ
ド核酸の検出または同定に使用される。以下に詳述する
ように、検定プローブの実例には、検出プローブ、検出
プライマー、捕捉プローブおよび信号プライマーがあ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、トラコーマク
ラミジア（Chlamydia trachomatis）の特異的検出およ
び同定のための増幅プライマーおよび検定プローブとし
て有用なオリゴヌクレオチドを提供する。特異的プロー
ブはヒトのＤＮＡや他の微生物のＤＮＡを全く検出しな
いか、またはほとんど検出することなくトラコーマクラ
ミジア潜在プラスミドを増幅する。ヒトのＤＮＡや他の
微生物のＤＮＡと交差反応性を示すことなく、このプラ
スミドを特異的に増幅するため、二つの領域のトラコー
マクラミジア潜在プラスミドが選択された。
ラミジア（Chlamydia trachomatis）の特異的検出およ
び同定のための増幅プライマーおよび検定プローブとし
て有用なオリゴヌクレオチドを提供する。特異的プロー
ブはヒトのＤＮＡや他の微生物のＤＮＡを全く検出しな
いか、またはほとんど検出することなくトラコーマクラ
ミジア潜在プラスミドを増幅する。ヒトのＤＮＡや他の
微生物のＤＮＡと交差反応性を示すことなく、このプラ
スミドを特異的に増幅するため、二つの領域のトラコー
マクラミジア潜在プラスミドが選択された。
【００１１】本発明のオリゴヌクレオチドは、培養され
た微生物の同定を確認するために培養後に使用してもよ
い。また、既知の増幅法を用いたトラコーマクラミジア
潜在プラスミドの検出および同定のため、培養前または
培養時に使用してもよい。いずれかのケースにおいて、
本発明のオリゴヌクレオチドと検定法はトラコーマクラ
ミジアと他の微生物の迅速な識別法を提供し、医師が習
慣的に使用しているより伝統的な手順を利用することな
く本微生物を迅速に同定することを可能にする。伝染病
に含まれる特異的な病因学上の医薬の迅速な同定は、短
期問内に適切な治療法を決定するために使用する情報を
提供する。
た微生物の同定を確認するために培養後に使用してもよ
い。また、既知の増幅法を用いたトラコーマクラミジア
潜在プラスミドの検出および同定のため、培養前または
培養時に使用してもよい。いずれかのケースにおいて、
本発明のオリゴヌクレオチドと検定法はトラコーマクラ
ミジアと他の微生物の迅速な識別法を提供し、医師が習
慣的に使用しているより伝統的な手順を利用することな
く本微生物を迅速に同定することを可能にする。伝染病
に含まれる特異的な病因学上の医薬の迅速な同定は、短
期問内に適切な治療法を決定するために使用する情報を
提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、核酸増幅反応において
トラコーマクラミジア特異性を示すオリゴヌクレオチ
ド、増幅プライマーおよび検定プローブに関する。本発
明はまた、前記のオリゴヌクレオチドを用いたトラコー
マクラミジアの検出および同定のための方法を提供す
る。好ましい方法はＳＤＡ、ｔＳＤＡ、均一リアルタイ
ム型蛍光ｔＳＤＡのいずれかである。これらの方法は、
引用することにより本明細書の一部をなすものとする米
国特許第5,548,861号、5,648,211号、１９９７年５月３
０日出願の米国特許第08/865,675号および１９９７年５
月１３日出願の米国特許第08/855,085号等の引用文献に
より当業者に知られている。
トラコーマクラミジア特異性を示すオリゴヌクレオチ
ド、増幅プライマーおよび検定プローブに関する。本発
明はまた、前記のオリゴヌクレオチドを用いたトラコー
マクラミジアの検出および同定のための方法を提供す
る。好ましい方法はＳＤＡ、ｔＳＤＡ、均一リアルタイ
ム型蛍光ｔＳＤＡのいずれかである。これらの方法は、
引用することにより本明細書の一部をなすものとする米
国特許第5,548,861号、5,648,211号、１９９７年５月３
０日出願の米国特許第08/865,675号および１９９７年５
月１３日出願の米国特許第08/855,085号等の引用文献に
より当業者に知られている。
【００１３】本発明のプライマーは、GenBankより入手
可能なトラコーマクラミジア潜在プラスミド（C. trach
omatis cryptic plasmid）の配列を基に設計された。プ
ラスミド配列は整列され、管理可能な領域（300〜500b
p）にセクション化されている。以下の研究のために２
つの領域（BおよびF）が選定された。領域ＢおよびＦが
トラコーマクラミジアのいくつかの血清型に合わせて配
列され、ｔＳＤＡシステムがこれらの分野について設計
された。BおよびF領域への増幅および配列のために使用
されるプライマーはそれぞれ以下の通りである。Ｂ領域増幅・配列プライマー CTpB1P 5'-GAAGATCGAGTAGACGTAATAT-3'（配列番号１） CTpB2P 5'-ATAGCAGATATATCTAGAACCTT-3'（配列番号
２） CTpB3N 5'-TTGGATCGAA ATGTAATACCGA-3'（配列番号
３） CTpB4N 5'-ACTTCTGATTTTCAAGGTGG AT-3'（配列番号
４）Ｆ領域増幅・配列プライマー CTpFPL 5'-CAAAACTGCGTCTTTGCTGATA-3'（配列番号５） CTpFPR 5'-GGGTGTGACTGTGAATTTTCC-3'（配列番号６） CTpFSL 5'-AGTTGGGCAAATGACAGAGC-3'（配列番号７） CTpFSR 5'-TGAATAACCCGTTGCATTGA-3'（配列番号８）
可能なトラコーマクラミジア潜在プラスミド（C. trach
omatis cryptic plasmid）の配列を基に設計された。プ
ラスミド配列は整列され、管理可能な領域（300〜500b
p）にセクション化されている。以下の研究のために２
つの領域（BおよびF）が選定された。領域ＢおよびＦが
トラコーマクラミジアのいくつかの血清型に合わせて配
列され、ｔＳＤＡシステムがこれらの分野について設計
された。BおよびF領域への増幅および配列のために使用
されるプライマーはそれぞれ以下の通りである。Ｂ領域増幅・配列プライマー CTpB1P 5'-GAAGATCGAGTAGACGTAATAT-3'（配列番号１） CTpB2P 5'-ATAGCAGATATATCTAGAACCTT-3'（配列番号
２） CTpB3N 5'-TTGGATCGAA ATGTAATACCGA-3'（配列番号
３） CTpB4N 5'-ACTTCTGATTTTCAAGGTGG AT-3'（配列番号
４）Ｆ領域増幅・配列プライマー CTpFPL 5'-CAAAACTGCGTCTTTGCTGATA-3'（配列番号５） CTpFPR 5'-GGGTGTGACTGTGAATTTTCC-3'（配列番号６） CTpFSL 5'-AGTTGGGCAAATGACAGAGC-3'（配列番号７） CTpFSR 5'-TGAATAACCCGTTGCATTGA-3'（配列番号８）
【００１４】領域ＢおよびＦの分析に関する検出システ
ムを以下に示す。ｔＳＤＡ反応および蛍光リアルタイム
型ｔＳＤＡ反応における特異性と感度に関して、様々な
プライマーのコンビネーションが試験された。
ムを以下に示す。ｔＳＤＡ反応および蛍光リアルタイム
型ｔＳＤＡ反応における特異性と感度に関して、様々な
プライマーのコンビネーションが試験された。
【００１５】核酸はハイブリッド形成するための完全な
相補性は要求されないので、ここに示されているプロー
ブおよびプライマー配列は、トラコーマクラミジア特異
的なプローブおよびプライマーとしての実用性を損なう
ことなく、ある程度改変することができる。当業者に知
られているように、相補的または部分相補的核酸は、ス
トレンジェンシーの増加、または減少するためハイブリ
ッド形成条件の調整（例えば、ハイブリッド形成温度や
バンパー液の含有塩分量の調節）により得ることができ
る。開示されている配列の小規模の改変とトラコーマク
ラミジア特異性を維持するためのハイブリッド形成条件
の必要な調整は通常の日常的に行われている実験作業で
あり、当業者の能力の範囲内である。
相補性は要求されないので、ここに示されているプロー
ブおよびプライマー配列は、トラコーマクラミジア特異
的なプローブおよびプライマーとしての実用性を損なう
ことなく、ある程度改変することができる。当業者に知
られているように、相補的または部分相補的核酸は、ス
トレンジェンシーの増加、または減少するためハイブリ
ッド形成条件の調整（例えば、ハイブリッド形成温度や
バンパー液の含有塩分量の調節）により得ることができ
る。開示されている配列の小規模の改変とトラコーマク
ラミジア特異性を維持するためのハイブリッド形成条件
の必要な調整は通常の日常的に行われている実験作業で
あり、当業者の能力の範囲内である。
【００１６】発明のプライマーを用いて生成した増幅生
成物は、例えば、臭化エチジウムで着色したポリアクリ
ルアミドまたはアガロースゲルの特性サイズによって検
出してよい。また、増幅されたトラコーマクラミジア潜
在クラミジアは、検定プローブ（検出可能な標識により
標識付けされたオリゴヌクレオチド）により検出してよ
い。一つの実施態様において、最低一つの標識された検
定プローブを、ウォーカーらが記載しているような（Wa
lker, et al, Nucl. Acids Res, 前出）（検出用配列プ
ライマーの）ハイブリッド形成またはハイブリッド形成
とその後の伸長による増幅された標的配列の検出、もし
くは欧州特許公報第0 678 582号に記載されているよう
な（EP 0 678 582）、（単一のプライマーの）増幅、伸
長および二重鎖形状への転換による増幅された標的配列
の検出に使用してよい。検定プローブは、増幅プライマ
ーのうちのいずれかの標的中の一つの配列とハイブリッ
ド形成する、いわゆる内部検定プローブが選定されるこ
とが好ましい。また、増幅プライマーもしくはその標的
結合配列を検定プローブとして使用してよい。
成物は、例えば、臭化エチジウムで着色したポリアクリ
ルアミドまたはアガロースゲルの特性サイズによって検
出してよい。また、増幅されたトラコーマクラミジア潜
在クラミジアは、検定プローブ（検出可能な標識により
標識付けされたオリゴヌクレオチド）により検出してよ
い。一つの実施態様において、最低一つの標識された検
定プローブを、ウォーカーらが記載しているような（Wa
lker, et al, Nucl. Acids Res, 前出）（検出用配列プ
ライマーの）ハイブリッド形成またはハイブリッド形成
とその後の伸長による増幅された標的配列の検出、もし
くは欧州特許公報第0 678 582号に記載されているよう
な（EP 0 678 582）、（単一のプライマーの）増幅、伸
長および二重鎖形状への転換による増幅された標的配列
の検出に使用してよい。検定プローブは、増幅プライマ
ーのうちのいずれかの標的中の一つの配列とハイブリッ
ド形成する、いわゆる内部検定プローブが選定されるこ
とが好ましい。また、増幅プライマーもしくはその標的
結合配列を検定プローブとして使用してよい。
【００１７】検定プローブの検出可能な標識は、標的核
酸の存在の指標として直接、または間接的に検出可能な
部分（moiety）である。標識の直接検出については、当
業者に知られているように、検定プローブは放射性同位
体で標識して、オートラジオグラフ法で検出しても、蛍
光部分で標識して蛍光Ｘ線で検出してもよい。また、検
定プローブは、検出可能にするために追加の試薬が必要
な標識を用いて間接的に検出してもよい。間接的に検出
可能な標識の実例には、化学発光試薬、目視可能な反応
生成物を生成する酵素および標識された特定の結合パー
トナー（例：抗体、抗原／ペプトン）と結合することに
よって検出されるリガンド（例：ペプトン、抗体、抗
原）がある。リガンドはまた、リガンドで標識されたオ
リゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を検出を容易にする
ため、固体状態に固定するのにも有用である。特に有用
な標識はビオチン（標識付けされたアビジンやストレプ
トアビジンと結合することにより検出可能となる）と西
洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリポスフォターゼの
ような酵素（有色の反応生成物を生成するための酵素基
質を付加することにより目視可能となる）を含む。オリ
ゴヌクレオチドに標識を付加もしくは含有させるための
方法は当業者に良く知られており、そのうちのいくつか
の方法は本発明に適用可能である。
酸の存在の指標として直接、または間接的に検出可能な
部分（moiety）である。標識の直接検出については、当
業者に知られているように、検定プローブは放射性同位
体で標識して、オートラジオグラフ法で検出しても、蛍
光部分で標識して蛍光Ｘ線で検出してもよい。また、検
定プローブは、検出可能にするために追加の試薬が必要
な標識を用いて間接的に検出してもよい。間接的に検出
可能な標識の実例には、化学発光試薬、目視可能な反応
生成物を生成する酵素および標識された特定の結合パー
トナー（例：抗体、抗原／ペプトン）と結合することに
よって検出されるリガンド（例：ペプトン、抗体、抗
原）がある。リガンドはまた、リガンドで標識されたオ
リゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を検出を容易にする
ため、固体状態に固定するのにも有用である。特に有用
な標識はビオチン（標識付けされたアビジンやストレプ
トアビジンと結合することにより検出可能となる）と西
洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリポスフォターゼの
ような酵素（有色の反応生成物を生成するための酵素基
質を付加することにより目視可能となる）を含む。オリ
ゴヌクレオチドに標識を付加もしくは含有させるための
方法は当業者に良く知られており、そのうちのいくつか
の方法は本発明に適用可能である。
【００１８】適用可能な特定の検出法の実例には、米国
特許第5,470,723号に記載されているような（U.S. Pate
nt No. 5,470,723）、増幅プライマーをビオチニル化捕
捉プローブおよび酵素抱合型検出プローブを用いて検出
する化学発光法を含む。これら二つの検定プローブを標
識配列の検定領域内の異なる部位にハイブリッド形成さ
せた後、ストレプトアピジンでコーティングしたミクロ
タイタープレート上で鎖体を捕捉プローブを用いて検出
し、化学発光信号を発生させルミノメーターで読み取
る。増幅プライマーの他の検出法として、欧州特許公報
第0 678 582号（EP 0 678 582）に記載されているよう
な信号プライマーをＳＤＡ反応に含めてよい。本実施態
様において、標識された二次増幅生成物はＳＤＡ中に、
標的の増幅に依存する形で生成し、関連する標識を媒体
に用いて標的増幅の指標として検出してよい。
特許第5,470,723号に記載されているような（U.S. Pate
nt No. 5,470,723）、増幅プライマーをビオチニル化捕
捉プローブおよび酵素抱合型検出プローブを用いて検出
する化学発光法を含む。これら二つの検定プローブを標
識配列の検定領域内の異なる部位にハイブリッド形成さ
せた後、ストレプトアピジンでコーティングしたミクロ
タイタープレート上で鎖体を捕捉プローブを用いて検出
し、化学発光信号を発生させルミノメーターで読み取
る。増幅プライマーの他の検出法として、欧州特許公報
第0 678 582号（EP 0 678 582）に記載されているよう
な信号プライマーをＳＤＡ反応に含めてよい。本実施態
様において、標識された二次増幅生成物はＳＤＡ中に、
標的の増幅に依存する形で生成し、関連する標識を媒体
に用いて標的増幅の指標として検出してよい。
【００１９】 商業上の便宜のため、トラコーマクラミ
ジア潜在プラスミド特異性検出および同定のための増幅
プライマーは、キットの形でパッケージすることができ
る。本発明によれば、そのようなキットは通常、最低1
組の増幅プライマーを含む。核酸増幅反応を実施するた
めの試薬は、トラコーマクラミジア潜在プラスミド特異
増幅プライマーと共に、例えばバンパー、追加のプライ
マー、ヌクレオチド、三リン酸塩、酵素等を含めてもよ
い。キットの構成要素は共通のコンテナに梱包され、必
要に応じて本発明の特定の実施態様を実施するための指
示書を含めてもよい。検定プローブとして使用するた
め、適当な標識を付加したオリゴヌクレオチドや標識検
出用の試薬または手段といった任意の構成要素をキット
に含めることができる。
ジア潜在プラスミド特異性検出および同定のための増幅
プライマーは、キットの形でパッケージすることができ
る。本発明によれば、そのようなキットは通常、最低1
組の増幅プライマーを含む。核酸増幅反応を実施するた
めの試薬は、トラコーマクラミジア潜在プラスミド特異
増幅プライマーと共に、例えばバンパー、追加のプライ
マー、ヌクレオチド、三リン酸塩、酵素等を含めてもよ
い。キットの構成要素は共通のコンテナに梱包され、必
要に応じて本発明の特定の実施態様を実施するための指
示書を含めてもよい。検定プローブとして使用するた
め、適当な標識を付加したオリゴヌクレオチドや標識検
出用の試薬または手段といった任意の構成要素をキット
に含めることができる。
【００２０】増幅プライマーの標的結合配列は、オリゴ
ヌクレオチドに種ハイブリッド形成特異性を与え、従っ
て、増幅反応に種特異性を付与する。選択した増幅反応
の性能に関する要求に応じて、オリゴヌクレオチドの種
特異性を変更することなく、ここに開示した標的配列に
他の配列を選択的に追加してよい。例えば、本発明のト
ラコーマクラミジアの潜在プラスミド特異性の増幅プラ
イマーは、ＳＤＡ反応時に切断される（ニックされる）
制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位BsoBIを含ん
でいてもよい。欧州特許公報第0 684 315号（EP 0 684
315）に開示されている認識部位を含むBsoBI部位を他の
制限エンドヌクレチアーゼ認識部位に置換できることは
当業者にとって明白であろう、認識部位は増幅反応を好
熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）条件下でも実施できるよう、好
熱性制限エンドヌクレアーゼに対するものが好ましい。
同じく、増幅プライマーの尾部配列（制限エンドヌクレ
チアーゼ認識部位への５’）は一般に重要ではないが、
ＳＤＡを用いる認識サイトおよび自己の標的結合配列や
他のプライマーとハイブリッド形成する配列は避けるべ
きである。本発明によれば、ＳＤＡ用の増幅プライマー
のいくつかは、３’標的結合配列、標的結合配列に対す
る切断可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位５’およ
び長さが約10〜25ヌクレオチドの制限エンドヌクレチア
ーゼ認識部位に対する尾部配列５’からなる。切断可能
な制限エンドヌクレチアーゼ認識部位および尾部配列は
ＳＤＡ反応のために必要とされる配列である。他の増幅
反応に関して、本発明による増幅配列は、開示された標
的結合配列のみからなるもの（例：ＰＣＲに対する配
列）であったり、標的結合配列と選択された増幅反応の
ために必要とされる追加の配列（例：上述したようなＳ
ＤＡのために必要な配列や３ＳＲのためのＲＮＡポリメ
ラーゼによって認識されるプロモーター）からなるもの
であってよい。
ヌクレオチドに種ハイブリッド形成特異性を与え、従っ
て、増幅反応に種特異性を付与する。選択した増幅反応
の性能に関する要求に応じて、オリゴヌクレオチドの種
特異性を変更することなく、ここに開示した標的配列に
他の配列を選択的に追加してよい。例えば、本発明のト
ラコーマクラミジアの潜在プラスミド特異性の増幅プラ
イマーは、ＳＤＡ反応時に切断される（ニックされる）
制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位BsoBIを含ん
でいてもよい。欧州特許公報第0 684 315号（EP 0 684
315）に開示されている認識部位を含むBsoBI部位を他の
制限エンドヌクレチアーゼ認識部位に置換できることは
当業者にとって明白であろう、認識部位は増幅反応を好
熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）条件下でも実施できるよう、好
熱性制限エンドヌクレアーゼに対するものが好ましい。
同じく、増幅プライマーの尾部配列（制限エンドヌクレ
チアーゼ認識部位への５’）は一般に重要ではないが、
ＳＤＡを用いる認識サイトおよび自己の標的結合配列や
他のプライマーとハイブリッド形成する配列は避けるべ
きである。本発明によれば、ＳＤＡ用の増幅プライマー
のいくつかは、３’標的結合配列、標的結合配列に対す
る切断可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位５’およ
び長さが約10〜25ヌクレオチドの制限エンドヌクレチア
ーゼ認識部位に対する尾部配列５’からなる。切断可能
な制限エンドヌクレチアーゼ認識部位および尾部配列は
ＳＤＡ反応のために必要とされる配列である。他の増幅
反応に関して、本発明による増幅配列は、開示された標
的結合配列のみからなるもの（例：ＰＣＲに対する配
列）であったり、標的結合配列と選択された増幅反応の
ために必要とされる追加の配列（例：上述したようなＳ
ＤＡのために必要な配列や３ＳＲのためのＲＮＡポリメ
ラーゼによって認識されるプロモーター）からなるもの
であってよい。
【００２１】バンパープライマーはＳＤＡの際、その下
流側の種特異的な増幅プライマーを置換するよう機能す
るため、種特異性に関して必須なものではない。バンパ
ープライマーは伸長した際に増幅プライマーとその伸長
生成物を置換するように、増幅プライマーの上流側にハ
イブリッド形成することのみ要求されている。そのた
め、バンパープライマーの特定の配列は一般に重要では
なく、バンパープライマーの伸長の際に増幅プライマー
の伸長生成物を置換させるために増幅プライマーの結合
部位の十分近くにあるいかなる上流標的配列から得ても
よい。時折発生するバンパープライマー配列内の標的と
の誤配合や標的以外の配列とのクロスバイブリット形成
は、バンパープライマーが特異的な標的配列にハイブリ
ッド形成できるかぎり増幅効率に悪影響しない。しか
し、ここに記載されているバンパープライマーはトラコ
ーマクラミジアに対して種特異的であるため、必要があ
れば増幅プライマー内の標的結合配列として使用してよ
い。
流側の種特異的な増幅プライマーを置換するよう機能す
るため、種特異性に関して必須なものではない。バンパ
ープライマーは伸長した際に増幅プライマーとその伸長
生成物を置換するように、増幅プライマーの上流側にハ
イブリッド形成することのみ要求されている。そのた
め、バンパープライマーの特定の配列は一般に重要では
なく、バンパープライマーの伸長の際に増幅プライマー
の伸長生成物を置換させるために増幅プライマーの結合
部位の十分近くにあるいかなる上流標的配列から得ても
よい。時折発生するバンパープライマー配列内の標的と
の誤配合や標的以外の配列とのクロスバイブリット形成
は、バンパープライマーが特異的な標的配列にハイブリ
ッド形成できるかぎり増幅効率に悪影響しない。しか
し、ここに記載されているバンパープライマーはトラコ
ーマクラミジアに対して種特異的であるため、必要があ
れば増幅プライマー内の標的結合配列として使用してよ
い。
【００２２】本発明のプライマーを用いた増幅反応は、
ウォーカーらが指摘するように（Walker, et al, 前
出）、チミンを組入れてもよいし、欧州特許公報第0 62
4 643号に指摘されているように（EP 0624 643）、その
後の増幅反応のクロス汚染を減少させるため、反応中に
ＴＴＰの代わりに２’デオキシウリジン５’三リン酸塩
を完全にまたは部分的に代用してよい。ｄＵ（ウリジ
ン）は増幅生成物に組込まれ、ウラシルＤＮＡグリコシ
アーゼ（ＵＤＧ）を用いた処理によって切除され得る。
これらの塩基性喪失（abas1c）部位はその後の増幅反応
の際に増幅生成物を増幅不能にする。新たに形成した増
幅生成物中のｄＵの切除を防止するため、その後の増幅
反応を実施する前にＵＤＧをウラシルＤＮＡグリコシア
ーゼ阻害剤で処理してよい。
ウォーカーらが指摘するように（Walker, et al, 前
出）、チミンを組入れてもよいし、欧州特許公報第0 62
4 643号に指摘されているように（EP 0624 643）、その
後の増幅反応のクロス汚染を減少させるため、反応中に
ＴＴＰの代わりに２’デオキシウリジン５’三リン酸塩
を完全にまたは部分的に代用してよい。ｄＵ（ウリジ
ン）は増幅生成物に組込まれ、ウラシルＤＮＡグリコシ
アーゼ（ＵＤＧ）を用いた処理によって切除され得る。
これらの塩基性喪失（abas1c）部位はその後の増幅反応
の際に増幅生成物を増幅不能にする。新たに形成した増
幅生成物中のｄＵの切除を防止するため、その後の増幅
反応を実施する前にＵＤＧをウラシルＤＮＡグリコシア
ーゼ阻害剤で処理してよい。
【００２３】プライマー、バンパーおよび検出用配列
（detector）の異なるコンビネーションを用いてｔＳＤ
Ａを実施するため、他の系が開発された。しかし、これ
らの他の系は適切な特異性の欠如、最適条件の領域のせ
まさおよび確実性の欠如のような様々な理由のため好ま
しくなかった。
（detector）の異なるコンビネーションを用いてｔＳＤ
Ａを実施するため、他の系が開発された。しかし、これ
らの他の系は適切な特異性の欠如、最適条件の領域のせ
まさおよび確実性の欠如のような様々な理由のため好ま
しくなかった。
【００２４】図１に系Ｂのためのプライマー、バンパー
および検出用配列（detector）を示す。この系は例の中
で検討されている。系Ｂは領域Ｂの５’末端に位置す
る。初期実験において、２つの上流プライマーと２つの
下流プライマーが１つの上流バンパーと１つの下流バン
パーと共に設計された。これらは検出用配列と共に様々
なコンビネーションで使用された。系Ｂで使用されたプ
ライマー、バンパーおよび検出用配列を以下に示す。プ
ライマーのハイブリッド形成領域は下線にて表し、BsoB
O制限部位はイタリック体で表した。
および検出用配列（detector）を示す。この系は例の中
で検討されている。系Ｂは領域Ｂの５’末端に位置す
る。初期実験において、２つの上流プライマーと２つの
下流プライマーが１つの上流バンパーと１つの下流バン
パーと共に設計された。これらは検出用配列と共に様々
なコンビネーションで使用された。系Ｂで使用されたプ
ライマー、バンパーおよび検出用配列を以下に示す。プ
ライマーのハイブリッド形成領域は下線にて表し、BsoB
O制限部位はイタリック体で表した。
【化１】
【００２５】初期のスクリーニング実験において、1つ
の上流プライマーと1つの下流プライマーを含めるよう
プライマー混合物が調製された。4つの可能なプライマ
ー混合物を以下に示す。コンビネーション１ CTpB4.S1（配列番号９） CTpB4.S1（配列番号１２）コンビネーション２ CTpB4.S1.1（配列番号１０） CTpB4.S2（配列番号１２）コンビネーション３ CTpB4.S1（配列番号９） CTpB4.S2.1（配列番号１３）コンビネーション４ CTpB4.S1.1（配列番号１０） CTpB4.S2.2（配列番号１３）
の上流プライマーと1つの下流プライマーを含めるよう
プライマー混合物が調製された。4つの可能なプライマ
ー混合物を以下に示す。コンビネーション１ CTpB4.S1（配列番号９） CTpB4.S1（配列番号１２）コンビネーション２ CTpB4.S1.1（配列番号１０） CTpB4.S2（配列番号１２）コンビネーション３ CTpB4.S1（配列番号９） CTpB4.S2.1（配列番号１３）コンビネーション４ CTpB4.S1.1（配列番号１０） CTpB4.S2.2（配列番号１３）
【００２６】プライマー混合物は全て上流および下流の
バンパーをも含む。プライマーとバンパーはおのおの最
終濃度0.5および0.05μMで使用された。
バンパーをも含む。プライマーとバンパーはおのおの最
終濃度0.5および0.05μMで使用された。
【００２７】上記のプライマー混合物は潜在プラスミド
の領域Bに関する研究で使用されており、例の中でさら
に詳しく検討されている。潜在プラスミドの領域Fとハ
イブリッド形成し、トラコーマクラミジアの検定に対し
ても有用な池のプライマーについても例の中で検討され
ている。後程示す例では、均一リアルタイム型蛍光ｔＳ
ＤＡで使用する領域Fに対するプライマーを用いる方法
も開示している。系Bのプライマーおよびプローブは、
ｔＳＤＡリアルタイム型蛍光エネルギー転位法で使用す
るのが好ましい。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プライマー
の伸長、不完全修飾制限エンドヌクレアーゼ認識・切断
部位の切断（ニッキング）、一本鎖伸長生成物の置換、
伸長生成物（もしくは元の標的配列）へのプライマーの
アニーリングおよぴその後のプライマーの伸長が反応混
合物中で平行して起こる核酸増幅の等温方法である。こ
れは、反応のステップが不連続的に起こるか、もしくは
反応の熱サイクル特性の結果として循環するポリメラー
ゼ鎖反応（ＰＣＲ）とは対照的である。ＳＤＡは以下の
能力に基づく。すなわち、（１） 二重鎖認識・切断
部位のヘミモスホロチオ酸エステル体の無修飾鎖を切断
する制限エンドヌクレアーゼの能力と、（２）ある種の
ポリメラーゼの切り目での複製の開始および下流側の鋳
型のない鎖の置換を行う能力である。
の領域Bに関する研究で使用されており、例の中でさら
に詳しく検討されている。潜在プラスミドの領域Fとハ
イブリッド形成し、トラコーマクラミジアの検定に対し
ても有用な池のプライマーについても例の中で検討され
ている。後程示す例では、均一リアルタイム型蛍光ｔＳ
ＤＡで使用する領域Fに対するプライマーを用いる方法
も開示している。系Bのプライマーおよびプローブは、
ｔＳＤＡリアルタイム型蛍光エネルギー転位法で使用す
るのが好ましい。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プライマー
の伸長、不完全修飾制限エンドヌクレアーゼ認識・切断
部位の切断（ニッキング）、一本鎖伸長生成物の置換、
伸長生成物（もしくは元の標的配列）へのプライマーの
アニーリングおよぴその後のプライマーの伸長が反応混
合物中で平行して起こる核酸増幅の等温方法である。こ
れは、反応のステップが不連続的に起こるか、もしくは
反応の熱サイクル特性の結果として循環するポリメラー
ゼ鎖反応（ＰＣＲ）とは対照的である。ＳＤＡは以下の
能力に基づく。すなわち、（１） 二重鎖認識・切断
部位のヘミモスホロチオ酸エステル体の無修飾鎖を切断
する制限エンドヌクレアーゼの能力と、（２）ある種の
ポリメラーゼの切り目での複製の開始および下流側の鋳
型のない鎖の置換を行う能力である。
【００２８】プライマーのアニーリングに関し、二重鎖
標的配列を変性するために増加させた温度（約95℃）で
初期培養した後、その後の重合と新たに合成した鎖の転
位を一定温度で実施した。個々の標的配列の新たな複製
の生成は以下の5つのステップからなる。すなわち、
（１）元の標的配列または前もって重合した置換一本鎖
伸長生成物への増幅プライマーの結合、（２）αチオデ
オキジヌクレオチド三リン酸（α−チオｄＮＴＰ）を組
込んだ５’‐３’エキソヌクレチアーゼ欠失ポリメラー
ゼによるプライマーの伸長と、（３）半修飾二重鎖制限
部位の切断（ニッキング）と、（４）切れ目部位（ニッ
ク部位）からの制限酵素の分離と、（５）下流に新たに
合成した鎖の置換を伴う5'-3'エキソヌクレチアーゼ欠
失ポリメラーゼによる、切れ目（ニック）の３’末端か
らの伸長である。
標的配列を変性するために増加させた温度（約95℃）で
初期培養した後、その後の重合と新たに合成した鎖の転
位を一定温度で実施した。個々の標的配列の新たな複製
の生成は以下の5つのステップからなる。すなわち、
（１）元の標的配列または前もって重合した置換一本鎖
伸長生成物への増幅プライマーの結合、（２）αチオデ
オキジヌクレオチド三リン酸（α−チオｄＮＴＰ）を組
込んだ５’‐３’エキソヌクレチアーゼ欠失ポリメラー
ゼによるプライマーの伸長と、（３）半修飾二重鎖制限
部位の切断（ニッキング）と、（４）切れ目部位（ニッ
ク部位）からの制限酵素の分離と、（５）下流に新たに
合成した鎖の置換を伴う5'-3'エキソヌクレチアーゼ欠
失ポリメラーゼによる、切れ目（ニック）の３’末端か
らの伸長である。
【００２９】切れ目（ニック）からの伸長は他の切断
（ニック）可能な制限部位を再生させるため、切断（ニ
ック）、重合および置換は一定温度で平行して継続的に
起こる。おのおのが二重鎖標的配列の二本の鎖のうちの
いずれか一本の鎖とハイブリット形成する一組の増幅プ
ライマーを使用した際、増幅は指数関数的に増加する。
これは有効鎖および非転写鎖がその後の増幅ラウンドの
際に、他方のプライマーの鋳型の役割を果たすためであ
る。一本鎖増幅プライマーを使用した際、唯一の鎖はプ
ライマー伸長のための鋳型の役割を果たすため、増幅は
線形的に増加する。αチオシオキジヌクレオチド三リン
酸（ｄＮＴＰ）を組込んだ際、その二重鎖認識または切
断部位を切断する制限エンドヌクレチアーゼの実例は、
HinCH、Hindll、Aval、NciIおよびFnu4HIである。これ
らの制限エンドヌレチアーゼの全てと要求されるニッキ
ング活性を示す他の制限エンドヌクレチアーゼは、従来
通りのＳＤＡに適している。しかし、これらは比較的高
温感受性であり、40℃で活性を失う。
（ニック）可能な制限部位を再生させるため、切断（ニ
ック）、重合および置換は一定温度で平行して継続的に
起こる。おのおのが二重鎖標的配列の二本の鎖のうちの
いずれか一本の鎖とハイブリット形成する一組の増幅プ
ライマーを使用した際、増幅は指数関数的に増加する。
これは有効鎖および非転写鎖がその後の増幅ラウンドの
際に、他方のプライマーの鋳型の役割を果たすためであ
る。一本鎖増幅プライマーを使用した際、唯一の鎖はプ
ライマー伸長のための鋳型の役割を果たすため、増幅は
線形的に増加する。αチオシオキジヌクレオチド三リン
酸（ｄＮＴＰ）を組込んだ際、その二重鎖認識または切
断部位を切断する制限エンドヌクレチアーゼの実例は、
HinCH、Hindll、Aval、NciIおよびFnu4HIである。これ
らの制限エンドヌレチアーゼの全てと要求されるニッキ
ング活性を示す他の制限エンドヌクレチアーゼは、従来
通りのＳＤＡに適している。しかし、これらは比較的高
温感受性であり、40℃で活性を失う。
【００３０】ＳＤＡによる増幅の標的は、標的配列を切
断しないエンドヌクレチアーゼを用いでた制限による大
きな核酸の切断により調製することができる。しかし、
ウォーカーらが記載し（Walker et al. 1992, Nuc. Aci
ds Res., 前出）および引用することにより本明細書の
一部をなすものとする米国特許第5,270,184号（U.S.Pa1
ent No. 5,270,184）に記載されているように、ＳＤＡ
反応においてニッキングに関し、選択された制限エンド
ヌクレチアーゼ認定／切断部位を有する標的核酸を生成
することが好ましい。手短には、標的配列が二重鎖であ
る場合、4つのプライマーがこれとハイブリット形成す
る。プライマーのうち二つ（Ｓ１およびＳ２）はＳＤＡ
増幅プライマーであり、二つ（Ｂ１およびＢ２）は外部
もしくはバンパープライマーである。Ｓ１およびＳ２は
標的配列に隣接する二重鎖核酸の他方の鎖と結合する。
Ｂ１およびＢ２は、それぞれＳ１およびＳ２の標的配列
５’（上流側）に結合する。その後、３つのデオキジヌ
クレオチド三リン酸と最低一つの修飾されたデオキジヌ
クレオチド三リン酸（例：２’デオキシアデノシン５’
オルトチオ酸リン酸（2'-deoxyadenosine 5'-O-（1-thi
otriphosphate）：“ｄＡＴＰαＳ”）の存在下で4つ全
てのプライマーを同時に伸長させるためにエキソヌクレ
チアーゼ欠失ポリメラーゼが使用される。その結果、Ｓ
１およびＳ２の伸長生成物はＢ１およびＢ２の伸長によ
り、元の標的配列鋳型から置換される。増幅プライマー
の置換された一本鎖伸長生成物は他方の増幅およびバン
パープライマーとの結合の標的として作用する（例え
ば、Ｓ１の伸長生成物はＳ２およびＢ２と結合する）。
伸長および置換（displacement）の次のサイクルでは、
末端に不完全修飾制限エンドヌクレアーゼ認識・切断部
位を有する断片を生じる。これらはＳＤＡ増幅に対する
適当な基質である。ＳＤＡ実施中、標的生成反応の個々
のステップは平行して、かつ継続して起こり、ＳＤＡの
制限酵素によるニッキングに関し必要とされる末端に認
識・切断部位を有する標的配列を生成する。ＳＤＡ反応
の構成要素は全て標的生成反応中にすでに存在するの
で、生成した標的は自動的かつ継続的にＳＤＡサイクル
に入り、増幅される。
断しないエンドヌクレチアーゼを用いでた制限による大
きな核酸の切断により調製することができる。しかし、
ウォーカーらが記載し（Walker et al. 1992, Nuc. Aci
ds Res., 前出）および引用することにより本明細書の
一部をなすものとする米国特許第5,270,184号（U.S.Pa1
ent No. 5,270,184）に記載されているように、ＳＤＡ
反応においてニッキングに関し、選択された制限エンド
ヌクレチアーゼ認定／切断部位を有する標的核酸を生成
することが好ましい。手短には、標的配列が二重鎖であ
る場合、4つのプライマーがこれとハイブリット形成す
る。プライマーのうち二つ（Ｓ１およびＳ２）はＳＤＡ
増幅プライマーであり、二つ（Ｂ１およびＢ２）は外部
もしくはバンパープライマーである。Ｓ１およびＳ２は
標的配列に隣接する二重鎖核酸の他方の鎖と結合する。
Ｂ１およびＢ２は、それぞれＳ１およびＳ２の標的配列
５’（上流側）に結合する。その後、３つのデオキジヌ
クレオチド三リン酸と最低一つの修飾されたデオキジヌ
クレオチド三リン酸（例：２’デオキシアデノシン５’
オルトチオ酸リン酸（2'-deoxyadenosine 5'-O-（1-thi
otriphosphate）：“ｄＡＴＰαＳ”）の存在下で4つ全
てのプライマーを同時に伸長させるためにエキソヌクレ
チアーゼ欠失ポリメラーゼが使用される。その結果、Ｓ
１およびＳ２の伸長生成物はＢ１およびＢ２の伸長によ
り、元の標的配列鋳型から置換される。増幅プライマー
の置換された一本鎖伸長生成物は他方の増幅およびバン
パープライマーとの結合の標的として作用する（例え
ば、Ｓ１の伸長生成物はＳ２およびＢ２と結合する）。
伸長および置換（displacement）の次のサイクルでは、
末端に不完全修飾制限エンドヌクレアーゼ認識・切断部
位を有する断片を生じる。これらはＳＤＡ増幅に対する
適当な基質である。ＳＤＡ実施中、標的生成反応の個々
のステップは平行して、かつ継続して起こり、ＳＤＡの
制限酵素によるニッキングに関し必要とされる末端に認
識・切断部位を有する標的配列を生成する。ＳＤＡ反応
の構成要素は全て標的生成反応中にすでに存在するの
で、生成した標的は自動的かつ継続的にＳＤＡサイクル
に入り、増幅される。
【００３１】他の増幅の生成物によるＳＤＡ反応のクロ
ス汚染を防止するため、増幅反応の害することなく、ｄ
ＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡで増幅されたＤＮＡ
を組入れてよい。ウラシル修飾核酸はその後、ウラシル
ＤＮＡグリコジラーゼ（ＵＤＧ）で処理することによ
り、特異的に認識され、不活性化されてよい。それゆ
え、先の反応においてｄＵＴＰがＳＤＡで増幅したＤＮ
Ａに組み入れられた場合、その後のいかなるＳＤＡ反応
も二重鎖標的の増幅より前にＵＤＧで処理することがで
き、先の増幅反応からのＤＮＡに含まれるいかなるｄＵ
も増幅不能となる。その後の反応で増幅される標的ＤＮ
ＡはｄＵを含まず、ＵＤＧ処理により影響されない。Ｕ
ＤＧは標的の増幅より前に、Ｕｇｉを用いた処理で阻害
することができる。また、ＵＤＧは熱不活性であってよ
い。吸熱性ＳＤＡにおいて、反応自体による高い温度
（50℃以上）はＵＤＧの不活性化と標的の増幅の同時実
行に使用してよい。
ス汚染を防止するため、増幅反応の害することなく、ｄ
ＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡで増幅されたＤＮＡ
を組入れてよい。ウラシル修飾核酸はその後、ウラシル
ＤＮＡグリコジラーゼ（ＵＤＧ）で処理することによ
り、特異的に認識され、不活性化されてよい。それゆ
え、先の反応においてｄＵＴＰがＳＤＡで増幅したＤＮ
Ａに組み入れられた場合、その後のいかなるＳＤＡ反応
も二重鎖標的の増幅より前にＵＤＧで処理することがで
き、先の増幅反応からのＤＮＡに含まれるいかなるｄＵ
も増幅不能となる。その後の反応で増幅される標的ＤＮ
ＡはｄＵを含まず、ＵＤＧ処理により影響されない。Ｕ
ＤＧは標的の増幅より前に、Ｕｇｉを用いた処理で阻害
することができる。また、ＵＤＧは熱不活性であってよ
い。吸熱性ＳＤＡにおいて、反応自体による高い温度
（50℃以上）はＵＤＧの不活性化と標的の増幅の同時実
行に使用してよい。
【００３２】ＳＤＡは５’-３’エキソヌクラーゼ活性
を欠き、二重鎖核酸中の一本鎖切れ目（ニック）で重合
を開始し、鋳型としてニックされていない鎖を用いて新
たな相補鎖を生成しながらこの切れ目の下流側の鎖を置
換するポリメラーゼを必要とする。ポリメラーゼは遊離
３’水酸基にヌクレオチドを付加することで伸長する必
要がある。ＳＤＡ反応を最適化するため、ポリメラーゼ
は増幅される標的配列の長さを最大化するよう高進行的
であることが望ましい。高度に進行的なポリメラーゼは
解離または伸張生成物の合成の終了する前に、十分な長
さの新たな鎖を重合することができる。置換活性（disp
lacement activity）は標的をさらなる複製の合成のた
めに利用可能にし、指数関数的増幅反応で二次増幅プラ
イマーのハイブリット形成する可能性のある一本鎖生成
物を生成するため、置換活性は増幅反応にとって必要不
可欠である。ニッキングは反応を持続させ、さらに続く
標的増幅のラウンドを開始させるので、ニッキング活性
も大いに重要である。
を欠き、二重鎖核酸中の一本鎖切れ目（ニック）で重合
を開始し、鋳型としてニックされていない鎖を用いて新
たな相補鎖を生成しながらこの切れ目の下流側の鎖を置
換するポリメラーゼを必要とする。ポリメラーゼは遊離
３’水酸基にヌクレオチドを付加することで伸長する必
要がある。ＳＤＡ反応を最適化するため、ポリメラーゼ
は増幅される標的配列の長さを最大化するよう高進行的
であることが望ましい。高度に進行的なポリメラーゼは
解離または伸張生成物の合成の終了する前に、十分な長
さの新たな鎖を重合することができる。置換活性（disp
lacement activity）は標的をさらなる複製の合成のた
めに利用可能にし、指数関数的増幅反応で二次増幅プラ
イマーのハイブリット形成する可能性のある一本鎖生成
物を生成するため、置換活性は増幅反応にとって必要不
可欠である。ニッキングは反応を持続させ、さらに続く
標的増幅のラウンドを開始させるので、ニッキング活性
も大いに重要である。
【００３３】ウォーカーらが記載しているように（Walk
er, et a1., 1992, PNAS and Nuc. Acis Res., 前
出）、吸熱性ＳＤＡは従来通りのＳＤＡとして、望まし
い熱安定ポリメラーゼおよび熱安定制限エンドヌクレア
ーゼの置換を伴って必然的に実施される。もちろん、反
応温度は置換酵素にとって適当なより高い温度に調整さ
れ、HicII制限エンドヌクレチアーゼ認識・切断部位は
選択された熱安定エンドヌクレチアーゼにとって適切な
制限エンドヌクレアーゼ認識・切断部位に交換される。
また、ウォーカーらとは対照的に、酵素が変性温度で十
分安定である場合、実施者は初期の変性ステップの前に
反応混合物中に酵素を含めて良い。吸熱性ＳＤＡでの使
用に好ましい制限エンドヌクレアーゼは、BsrI、BsrtN
I、BsmAI、BslI、BsoBI（ニューイングランド生物学研
究所（New England BioLabs））とBstOI（Promega）で
ある。好ましい吸熱性ポリメラーゼはBca（Panvera）と
Bst（ニューイングランド生物学研究所（New Eng1and B
ioLabs））である。
er, et a1., 1992, PNAS and Nuc. Acis Res., 前
出）、吸熱性ＳＤＡは従来通りのＳＤＡとして、望まし
い熱安定ポリメラーゼおよび熱安定制限エンドヌクレア
ーゼの置換を伴って必然的に実施される。もちろん、反
応温度は置換酵素にとって適当なより高い温度に調整さ
れ、HicII制限エンドヌクレチアーゼ認識・切断部位は
選択された熱安定エンドヌクレチアーゼにとって適切な
制限エンドヌクレアーゼ認識・切断部位に交換される。
また、ウォーカーらとは対照的に、酵素が変性温度で十
分安定である場合、実施者は初期の変性ステップの前に
反応混合物中に酵素を含めて良い。吸熱性ＳＤＡでの使
用に好ましい制限エンドヌクレアーゼは、BsrI、BsrtN
I、BsmAI、BslI、BsoBI（ニューイングランド生物学研
究所（New England BioLabs））とBstOI（Promega）で
ある。好ましい吸熱性ポリメラーゼはBca（Panvera）と
Bst（ニューイングランド生物学研究所（New Eng1and B
ioLabs））である。
【００３４】均一リアルタイム型蛍光ｔＳＤＡはｔＳＤ
Ａの改良である。この方法は、標的に依存する形で還元
蛍光の消光を実施するため検出用オリゴヌクレアーゼを
使用する。検出用オリゴヌクレアーゼは、蛍光の消光が
標的が存在しない状態で起こるよう連鎖された供与体／
受容体色素対を含む。標的存在下での検出用配列オリゴ
ヌクレアーゼ中の分子間塩基対二次構造の展開および線
状化は、色素問の距離を増加させ、蛍光の消光を減少さ
せる。塩基対二次構造の展開は通常、二次構造を最小限
に部分分裂させるような、二次構造と相補鎖の間の分子
間塩基対を含む。十分な長さの相補鎖が存在する場合、
これは完全に線状化され得る。好ましい実施態様におい
て、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は二
次構造と相補鎖の間の分子間塩基対が制限エンドヌクレ
アーゼにより、ＲＥＲＳを二重鎖化し、切断可能もしく
は分裂可能な状態にできるよう、2つの色素の問に存在
する。制限エンドヌクレアーゼによる分裂または切断
は、供与体および受容体色素を、さらなる消光に寄与す
るように、別々の核酸断片上に分離する。いずれの実施
態様においても、蛍光パラメータに関連する変更（例：
供与体蛍光強度の増加、受容体蛍光強度または展開前後
での蛍光発光比率の減少）は標的配列の存在の指標とし
てモニタされる。蛍光寿命の変化のような他の蛍光パラ
メータをモニタしてもよい。
Ａの改良である。この方法は、標的に依存する形で還元
蛍光の消光を実施するため検出用オリゴヌクレアーゼを
使用する。検出用オリゴヌクレアーゼは、蛍光の消光が
標的が存在しない状態で起こるよう連鎖された供与体／
受容体色素対を含む。標的存在下での検出用配列オリゴ
ヌクレアーゼ中の分子間塩基対二次構造の展開および線
状化は、色素問の距離を増加させ、蛍光の消光を減少さ
せる。塩基対二次構造の展開は通常、二次構造を最小限
に部分分裂させるような、二次構造と相補鎖の間の分子
間塩基対を含む。十分な長さの相補鎖が存在する場合、
これは完全に線状化され得る。好ましい実施態様におい
て、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は二
次構造と相補鎖の間の分子間塩基対が制限エンドヌクレ
アーゼにより、ＲＥＲＳを二重鎖化し、切断可能もしく
は分裂可能な状態にできるよう、2つの色素の問に存在
する。制限エンドヌクレアーゼによる分裂または切断
は、供与体および受容体色素を、さらなる消光に寄与す
るように、別々の核酸断片上に分離する。いずれの実施
態様においても、蛍光パラメータに関連する変更（例：
供与体蛍光強度の増加、受容体蛍光強度または展開前後
での蛍光発光比率の減少）は標的配列の存在の指標とし
てモニタされる。蛍光寿命の変化のような他の蛍光パラ
メータをモニタしてもよい。
【００３５】均一リアルタイム型蛍光ｔＳＤＡに対する
検出用オリゴヌクレオチドは、標的とハイブリット形成
する一本鎖の５’または３’部分（標的結合配列）と標
的結合配列に隣接する分子内塩基対二次構造からなる。
発明の検出用オリゴヌクレオチドは、二次構造が分子内
塩基対を形成し、二次構造の展開または線状化により結
果的に蛍光の消光が減少した場合に、供与体蛍光が消光
するように連鎖した供与体／受容体色素対からなる。オ
リゴヌクレオチドの分裂は、ＤＮＡ二本鎖の両方の鎖の
リン酸ジエステル結合の切断または一本鎖ＤＮＡのリン
酸ジエステル結合の切断を指す。これはＤＮＡ二重鎖の
２つの鎖のうちの１本のみのリン酸ジエステル結合が切
断されるニッキングとは対照的である。
検出用オリゴヌクレオチドは、標的とハイブリット形成
する一本鎖の５’または３’部分（標的結合配列）と標
的結合配列に隣接する分子内塩基対二次構造からなる。
発明の検出用オリゴヌクレオチドは、二次構造が分子内
塩基対を形成し、二次構造の展開または線状化により結
果的に蛍光の消光が減少した場合に、供与体蛍光が消光
するように連鎖した供与体／受容体色素対からなる。オ
リゴヌクレオチドの分裂は、ＤＮＡ二本鎖の両方の鎖の
リン酸ジエステル結合の切断または一本鎖ＤＮＡのリン
酸ジエステル結合の切断を指す。これはＤＮＡ二重鎖の
２つの鎖のうちの１本のみのリン酸ジエステル結合が切
断されるニッキングとは対照的である。
【００３６】均一リアルタイム型蛍光ｔＳＤＡに対する
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、プライマー伸張
またはハイブリット形成のために選定された反応条件の
下、分子内塩基対二次構造を形成する配列を含む。二次
構造体は、標的配列の少なくとも一部分が一本鎖３’ま
たは５’尾部を形成するよう、検出用配列オリゴヌクレ
オチドの標的結合配列に隣接して配置される。ここで使
用されているように、「標的結合配列に隣接」という語
は、標的結合配列の全てまたは一部が標的とのハイブリ
ット形成に利用できるよう、５’または３’に一本鎖が
残されていることを意味する。つまり二次構造体は全て
の標的結合配列を含むものではない。標的結合配列の一
部は二次構造中の分子内塩基対合に含まれてよく、一次
配列の全てもしくは一部が二次構造中の分子内塩基対合
に関係するものを含んでよく、一次配列の全てもしくは
一部が二次構造中の分子内塩基対合に関連するが、好ま
しくはその相補配列へと伸張しないものを含んでよい。
例えば、二次構造がステム・ループ構造（stem-loop st
ructure）（例：「ヘアピン」）であり、検出用オリゴヌ
クレオチドが一本鎖化された３’尾部として存在してい
る場合、標的結合配列はステムの第1アームの全てもし
くは一部を介して伸張してもよく、随意にループの全て
または一部を介して伸張してもよい。しかし、標的結合
配列はステム分子内塩基対合に関わる配列の第２アーム
に伸張しないことが好ましい。検出用配列オリゴヌクレ
オチド二次構造体の分子内塩基対部分におけるミスマッ
チは、標的存在下での蛍光の変化の強度を減少させ得る
が、検定感度が重要でなければ許容し得る。一本鎖尾部
での標的結合配列でのミスマッチも許容できるものであ
るが、同様に検定感度および／または特異性を減少させ
る。しかし、二次構造と標的結合配列の両方における完
全な塩基対合が反応に悪影響を及ぼさないことは本発明
の特徴である。ハイブリット形成に関連する配列の完全
な適合は反応速度論の悪影響を及ぼすことなく、検定特
異性を改善する。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、プライマー伸張
またはハイブリット形成のために選定された反応条件の
下、分子内塩基対二次構造を形成する配列を含む。二次
構造体は、標的配列の少なくとも一部分が一本鎖３’ま
たは５’尾部を形成するよう、検出用配列オリゴヌクレ
オチドの標的結合配列に隣接して配置される。ここで使
用されているように、「標的結合配列に隣接」という語
は、標的結合配列の全てまたは一部が標的とのハイブリ
ット形成に利用できるよう、５’または３’に一本鎖が
残されていることを意味する。つまり二次構造体は全て
の標的結合配列を含むものではない。標的結合配列の一
部は二次構造中の分子内塩基対合に含まれてよく、一次
配列の全てもしくは一部が二次構造中の分子内塩基対合
に関係するものを含んでよく、一次配列の全てもしくは
一部が二次構造中の分子内塩基対合に関連するが、好ま
しくはその相補配列へと伸張しないものを含んでよい。
例えば、二次構造がステム・ループ構造（stem-loop st
ructure）（例：「ヘアピン」）であり、検出用オリゴヌ
クレオチドが一本鎖化された３’尾部として存在してい
る場合、標的結合配列はステムの第1アームの全てもし
くは一部を介して伸張してもよく、随意にループの全て
または一部を介して伸張してもよい。しかし、標的結合
配列はステム分子内塩基対合に関わる配列の第２アーム
に伸張しないことが好ましい。検出用配列オリゴヌクレ
オチド二次構造体の分子内塩基対部分におけるミスマッ
チは、標的存在下での蛍光の変化の強度を減少させ得る
が、検定感度が重要でなければ許容し得る。一本鎖尾部
での標的結合配列でのミスマッチも許容できるものであ
るが、同様に検定感度および／または特異性を減少させ
る。しかし、二次構造と標的結合配列の両方における完
全な塩基対合が反応に悪影響を及ぼさないことは本発明
の特徴である。ハイブリット形成に関連する配列の完全
な適合は反応速度論の悪影響を及ぼすことなく、検定特
異性を改善する。
【００３７】本発明の検出用オリゴヌクレオチド信号プ
ライマーは、増幅反応に添加された際、上述の増幅プラ
イマーのハイブリット形成および伸張により二重鎖体に
変換される。ポリメラーゼによる鎖置換もまた、相補鎖
の合成により二次構造を展開もしくは線状化させ二重鎖
体に転換させる。ＲＥＲＳが存在する場合には、ＲＥＲ
Ｓも二重鎖となり、制限エンドヌクレアーゼにより分解
もしくは切断可能となる。二次構造はポリメラーゼの鎖
置換活性により展開もしくは線状化されるので、受容体
および供用体色素間の距離は増加し、その結果供与体蛍
光の消光は減少する。供与体または受容体色素に関連す
る変更は標的配列の増幅の兆候としてモニターもしくは
検出してよい。ＲＥＲＳの分解もしくはニッキングは、
互いに連鎖した２つの色素のうちの１つを持った二重鎖
増幅生成物の２つの別々の断片を生成することにより、
蛍光の変化強度をはるかに増加させる。これらの断片は
反応溶液中を自由に拡散し、供与体・受容体色素対の間
の距離をはるかに増加させる。供与体蛍光強度の増加ま
たは受容体蛍光強度の減少は、標的配列の増幅の進行も
しくは完了の指標としてモニターまたは検出してよく、
また、受容体／供与体色素対の近接により影響される他
の蛍光パラメータをモニターしてもよい。受容体または
供与体の蛍光強度の変化は、受容体および/または供与
体の蛍光強度の比率の変化として検出してもよい。例え
ば、蛍光強度の変化は、二次構造の展開または線状化の
前後での検出用オリゴヌクレオチド中の供与体発蛍光団
の蛍光の比率の増加か、もしくは線状化または展開の前
後の検出用配列オリゴヌクレオチド中の受容体色素の比
率の減少として検出して良い。
ライマーは、増幅反応に添加された際、上述の増幅プラ
イマーのハイブリット形成および伸張により二重鎖体に
変換される。ポリメラーゼによる鎖置換もまた、相補鎖
の合成により二次構造を展開もしくは線状化させ二重鎖
体に転換させる。ＲＥＲＳが存在する場合には、ＲＥＲ
Ｓも二重鎖となり、制限エンドヌクレアーゼにより分解
もしくは切断可能となる。二次構造はポリメラーゼの鎖
置換活性により展開もしくは線状化されるので、受容体
および供用体色素間の距離は増加し、その結果供与体蛍
光の消光は減少する。供与体または受容体色素に関連す
る変更は標的配列の増幅の兆候としてモニターもしくは
検出してよい。ＲＥＲＳの分解もしくはニッキングは、
互いに連鎖した２つの色素のうちの１つを持った二重鎖
増幅生成物の２つの別々の断片を生成することにより、
蛍光の変化強度をはるかに増加させる。これらの断片は
反応溶液中を自由に拡散し、供与体・受容体色素対の間
の距離をはるかに増加させる。供与体蛍光強度の増加ま
たは受容体蛍光強度の減少は、標的配列の増幅の進行も
しくは完了の指標としてモニターまたは検出してよく、
また、受容体／供与体色素対の近接により影響される他
の蛍光パラメータをモニターしてもよい。受容体または
供与体の蛍光強度の変化は、受容体および/または供与
体の蛍光強度の比率の変化として検出してもよい。例え
ば、蛍光強度の変化は、二次構造の展開または線状化の
前後での検出用オリゴヌクレオチド中の供与体発蛍光団
の蛍光の比率の増加か、もしくは線状化または展開の前
後の検出用配列オリゴヌクレオチド中の受容体色素の比
率の減少として検出して良い。
【００３８】ＳＤＡに加えて、発明の検出用オリゴヌク
レオチドは、他のプライマー伸張増幅法（例：ＰＣＲ、
３ＳＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ）の信号プライマーとして
使用してもよい。例えば、ＰＣＲ増幅プライマーと５’
から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いた鎖置換Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（例：Sequencing Grade Taq fromPro
mega or exo-Vend or exo-Deep Vent from New End1and
Biolabs）を用いることにより、ＰＣＲでの使用に適用
してよい。検出用オリゴヌクレオチド信号プライマーは
ＰＣＲ信号増幅プライマーから標的の下流にハイブリッ
ト形成し、置換され、ＳＤＡについて記述したように必
然的に二重鎖となる。ＰＣＲでは通常、ＲＥＲＳの分裂
よりむしろニッキングを誘導する修飾デオキジヌクレオ
チド三リン酸は存在しないため、検出用オリゴヌクレオ
チドでの使用において、いかなるＲＥＲＳも随意に選定
してよい。ヒートサイクルはＰＣＲによる増幅の特徴で
あるので、制限エンドヌクレアーゼはプライマーのアニ
ーリングの最終サイクルおよび増幅の終点検出のための
伸張の後、低温で添加するのが好ましい。しかし、ＰＣ
Ｒ反応の高温段階での活性を維持する制限エンドヌクレ
アーゼはリアルタイム型の検定を提供するため増幅時に
存在することも可能である。ＳＤＡ系と同様に、二次構
造の線状化と色素対の分離は、標的増幅の指標として作
用する強度のような蛍光パラメータの変化を伴って、蛍
光の消光を減少させる。
レオチドは、他のプライマー伸張増幅法（例：ＰＣＲ、
３ＳＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ）の信号プライマーとして
使用してもよい。例えば、ＰＣＲ増幅プライマーと５’
から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いた鎖置換Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（例：Sequencing Grade Taq fromPro
mega or exo-Vend or exo-Deep Vent from New End1and
Biolabs）を用いることにより、ＰＣＲでの使用に適用
してよい。検出用オリゴヌクレオチド信号プライマーは
ＰＣＲ信号増幅プライマーから標的の下流にハイブリッ
ト形成し、置換され、ＳＤＡについて記述したように必
然的に二重鎖となる。ＰＣＲでは通常、ＲＥＲＳの分裂
よりむしろニッキングを誘導する修飾デオキジヌクレオ
チド三リン酸は存在しないため、検出用オリゴヌクレオ
チドでの使用において、いかなるＲＥＲＳも随意に選定
してよい。ヒートサイクルはＰＣＲによる増幅の特徴で
あるので、制限エンドヌクレアーゼはプライマーのアニ
ーリングの最終サイクルおよび増幅の終点検出のための
伸張の後、低温で添加するのが好ましい。しかし、ＰＣ
Ｒ反応の高温段階での活性を維持する制限エンドヌクレ
アーゼはリアルタイム型の検定を提供するため増幅時に
存在することも可能である。ＳＤＡ系と同様に、二次構
造の線状化と色素対の分離は、標的増幅の指標として作
用する強度のような蛍光パラメータの変化を伴って、蛍
光の消光を減少させる。
【００３９】検出用オリゴヌクレオチドの展開または線
状化から生じる蛍光の変化は、選定された反応の終了点
で検出してよい。しかし、線状化された二次構造はハイ
ブリット形成やプライマー伸張と同時に進行するため、
蛍光の変化は反応進行時にリアルタイムに検出してもよ
い。この均一なリアルタイム型の検定様式は標的の開始
時の存在量に関する半定量的または定量的な情報を提供
するために使用される。たとえば、展開反応または線状
化反応（標的増幅反応の一部か、もしくは非増幅検出法
に含まれる）の際の蛍光強度の変化速度は開始時の標的
のレベル指標である。結果的に、より多くの標的配列の
初期複製が存在する場合、供与体蛍光はより早く選定さ
れた敷居値に到達する（すなわち、より短時問で陽性と
なる）。受容体蛍光の減少も選定した最小値に到達する
のに要する時間として検出したが、同様に、より短時間
で陽性を示す。加えて、反応過程中の蛍光パラメータの
変化速度は、標的の初期量の高いサンプルの方が初期量
の低いサンプルに比べて速い。当業者に知られているよ
うに、これらの測定法または他の測定法は、標的の存在
に関する指標もしくは標的の増幅に関する指標として実
施してよい。通常、標的の初期量は標的の既知の量と実
験的結果を比較することで決定される。
状化から生じる蛍光の変化は、選定された反応の終了点
で検出してよい。しかし、線状化された二次構造はハイ
ブリット形成やプライマー伸張と同時に進行するため、
蛍光の変化は反応進行時にリアルタイムに検出してもよ
い。この均一なリアルタイム型の検定様式は標的の開始
時の存在量に関する半定量的または定量的な情報を提供
するために使用される。たとえば、展開反応または線状
化反応（標的増幅反応の一部か、もしくは非増幅検出法
に含まれる）の際の蛍光強度の変化速度は開始時の標的
のレベル指標である。結果的に、より多くの標的配列の
初期複製が存在する場合、供与体蛍光はより早く選定さ
れた敷居値に到達する（すなわち、より短時問で陽性と
なる）。受容体蛍光の減少も選定した最小値に到達する
のに要する時間として検出したが、同様に、より短時間
で陽性を示す。加えて、反応過程中の蛍光パラメータの
変化速度は、標的の初期量の高いサンプルの方が初期量
の低いサンプルに比べて速い。当業者に知られているよ
うに、これらの測定法または他の測定法は、標的の存在
に関する指標もしくは標的の増幅に関する指標として実
施してよい。通常、標的の初期量は標的の既知の量と実
験的結果を比較することで決定される。
【００４０】本発明の方法によれば、選定された標的配
列の存在に対する検定は、溶液中で実施しても、固体相
で実施してもよい。検出用オリゴヌクレオチドがプライ
マーとして機能するリアルタイムでの、もしくは終了点
での均一検定は、通常溶液中で実施される。発明の検出
用オリゴヌクレオチドを使用するハイブリット形成検定
は、均一リアルタイム型検定のように溶液中で実施して
もよいが、標的のリアルタイムでの、もしくは終了点で
の検出に関する固体相検定にも特によく適合する。固体
相検定において、検出用オリゴヌクレオチドは、当業者
に知られている方法を周して内部標識または末端標識経
由で固体相（床、隔膜、反応容器）に固定してよい。例
えば、ビオチンで標識した検出用配列オリゴヌクレオチ
ドは、適切なハイブリット形成条件の下で標的にさらし
た場合、蛍光に変化を生じるアビジン修飾固体相に固定
してよい。この方法での標的の捕捉はサンプルからの標
的の分離を容易にし、信号の検出の阻害や検定における
他の問題を引き起こす可能性のあるサンプル中の基質を
除去させる。
列の存在に対する検定は、溶液中で実施しても、固体相
で実施してもよい。検出用オリゴヌクレオチドがプライ
マーとして機能するリアルタイムでの、もしくは終了点
での均一検定は、通常溶液中で実施される。発明の検出
用オリゴヌクレオチドを使用するハイブリット形成検定
は、均一リアルタイム型検定のように溶液中で実施して
もよいが、標的のリアルタイムでの、もしくは終了点で
の検出に関する固体相検定にも特によく適合する。固体
相検定において、検出用オリゴヌクレオチドは、当業者
に知られている方法を周して内部標識または末端標識経
由で固体相（床、隔膜、反応容器）に固定してよい。例
えば、ビオチンで標識した検出用配列オリゴヌクレオチ
ドは、適切なハイブリット形成条件の下で標的にさらし
た場合、蛍光に変化を生じるアビジン修飾固体相に固定
してよい。この方法での標的の捕捉はサンプルからの標
的の分離を容易にし、信号の検出の阻害や検定における
他の問題を引き起こす可能性のあるサンプル中の基質を
除去させる。
【００４１】
【実施例】以下の実施例において、発明の具体的な実施
態様を示す。当業者にとって明らかなように、記載した
本発明の範囲内で様々な変更および改良が可能であり、
かつ計画されている。
態様を示す。当業者にとって明らかなように、記載した
本発明の範囲内で様々な変更および改良が可能であり、
かつ計画されている。
【００４２】例１確実性に関するプライマーコンビネーションの検定
【００４３】大半の条件においていずれのコンビネーシ
ョンが最も良く機能するかを決定するため、４つの全て
のコンビネーションが条件のマトリックスに対して試験
された。反応条件は以下のように変化させた。 増幅温度：52℃、54℃ リン酸カリウム（pH7.6）：35mM, 45mM 酢酸マグネシウム：5mM, 6mM ジメチルスルホン酸：3%、7%（体積％） グリセロール：3%、7%（体積％）
ョンが最も良く機能するかを決定するため、４つの全て
のコンビネーションが条件のマトリックスに対して試験
された。反応条件は以下のように変化させた。 増幅温度：52℃、54℃ リン酸カリウム（pH7.6）：35mM, 45mM 酢酸マグネシウム：5mM, 6mM ジメチルスルホン酸：3%、7%（体積％） グリセロール：3%、7%（体積％）
【００４４】反応（50μL）はまた、Bstポリメラーゼ9
ユニット、BsoB1制限エンドヌクレアーゼ165ユニット、
ヒト胎盤ＤＮＡ1,200mg、dATPおよびｄGTP 0.2mM、dCTP
1.4mM、dUTP 0.5mM、アセチル化年血清アルブミン0.lm
g/mL、トレハロース1.8％、ジチオドレイトール0.36mM
（DTT）および標的プラスミドＤＮＡの1×l06コピーを
含む。標的プラスミドはpUC18に挿入した潜在プラスミ
ド（血清型Ｊから）の領域ＢおよびＦを含むプラスミド
である。
ユニット、BsoB1制限エンドヌクレアーゼ165ユニット、
ヒト胎盤ＤＮＡ1,200mg、dATPおよびｄGTP 0.2mM、dCTP
1.4mM、dUTP 0.5mM、アセチル化年血清アルブミン0.lm
g/mL、トレハロース1.8％、ジチオドレイトール0.36mM
（DTT）および標的プラスミドＤＮＡの1×l06コピーを
含む。標的プラスミドはpUC18に挿入した潜在プラスミ
ド（血清型Ｊから）の領域ＢおよびＦを含むプラスミド
である。
【００４５】サンプルは30μL中にリン酸塩、ＤＭＳ
Ｏ、グリセロール、ヒトＤＮＡを含むように調製され
た。サンプルは湯浴で2分間熱変性させ、手短に遠心分
離した後、45℃ Themal-Lok Dry Bath（US Scientific,
Florida）に入れた。２，３分間平衡化させた後、体積
10μLのサンプルに対し、以下の要素を加えた。リン酸
カリウム、プライマー、バンパー、dGTP、dATP、dCsT
P、BSA、DTT、トレハロース、マグネシウム、ウラシル-
N-ＤＮＡグリコジラーゼ（ＵＤＧ）1ユニットを加え
た。次の30分間で発熱ＳＤＡを実施した。反応はサンプ
ルを5分間沸騰させることにより停止させた。増幅生成
物はアンプリコンの中央部に特異的にハイブリット形成
した32Ｐで標識したプローブCTpB4.D1（配列番号１５）
の伸張により検出した。検出されたサンプルは８％ポリ
アクリルアミトゲルを通した後、リン光分析もしくはオ
ートラジオグラフフィルムに終夜露出することで可視化
した。
Ｏ、グリセロール、ヒトＤＮＡを含むように調製され
た。サンプルは湯浴で2分間熱変性させ、手短に遠心分
離した後、45℃ Themal-Lok Dry Bath（US Scientific,
Florida）に入れた。２，３分間平衡化させた後、体積
10μLのサンプルに対し、以下の要素を加えた。リン酸
カリウム、プライマー、バンパー、dGTP、dATP、dCsT
P、BSA、DTT、トレハロース、マグネシウム、ウラシル-
N-ＤＮＡグリコジラーゼ（ＵＤＧ）1ユニットを加え
た。次の30分間で発熱ＳＤＡを実施した。反応はサンプ
ルを5分間沸騰させることにより停止させた。増幅生成
物はアンプリコンの中央部に特異的にハイブリット形成
した32Ｐで標識したプローブCTpB4.D1（配列番号１５）
の伸張により検出した。検出されたサンプルは８％ポリ
アクリルアミトゲルを通した後、リン光分析もしくはオ
ートラジオグラフフィルムに終夜露出することで可視化
した。
【００４６】図２、図３に試験条件マトリックスのリン
光分析を示す。プライマーコンビネーションは各欄の底
部に記した。特定の条件下でいくつかのプライマーコン
ビネーションのみが作用し、4つのコンビネーションの
うちいくつかのものについては他の条件が有利であっ
た。いくつかの条件下では、コンビネーション１および
２がよりよく作用するように思われたが、あるコンビネ
ーションが他の全てのコンビネーションよりも優れてい
るという明確な証拠はない。
光分析を示す。プライマーコンビネーションは各欄の底
部に記した。特定の条件下でいくつかのプライマーコン
ビネーションのみが作用し、4つのコンビネーションの
うちいくつかのものについては他の条件が有利であっ
た。いくつかの条件下では、コンビネーション１および
２がよりよく作用するように思われたが、あるコンビネ
ーションが他の全てのコンビネーションよりも優れてい
るという明確な証拠はない。
【００４７】同一の実験において、サンプル（52℃、KP
O4 35mM、MgOAc 5mM、DMSO ３％、グリセロール７％）
のうち４つは相補的検出用配列CTpB4.D2（配列番号１
６）により検出された。結果を図４に示す。有効鎖にハ
イブリット形成した検出用配列はリン光分析の強度にお
いて50 fo1dの増加を示した。これは上記の検出用配列
がその補体に比べ優れた感度を呈したことを示す。その
ため、Ｂ系を用いた以下の全てのサンプルにおいて検出
用配列CTpB4.D2（配列番号１６）を使用した。
O4 35mM、MgOAc 5mM、DMSO ３％、グリセロール７％）
のうち４つは相補的検出用配列CTpB4.D2（配列番号１
６）により検出された。結果を図４に示す。有効鎖にハ
イブリット形成した検出用配列はリン光分析の強度にお
いて50 fo1dの増加を示した。これは上記の検出用配列
がその補体に比べ優れた感度を呈したことを示す。その
ため、Ｂ系を用いた以下の全てのサンプルにおいて検出
用配列CTpB4.D2（配列番号１６）を使用した。
【００４８】例２最大感度を示す条件に関する検定
【００４９】最大感度を持つプライマーコンビネーショ
ンと緩衝条件を選定するため、上記の４種のプライマー
コンビネーション各々を例１での２つの最適条件で試験
した。これらの２つの条件を以下に示す。条件１ リン酸カリウム（pH7.6）：35mM 酢酸マグネシウム：６mM ジメチルスルホン酸：３％ グリセロール：３％増幅温度：54℃条件２ リン酸カリウム（pH7.6）：35mM 酢酸マグネシウム：６mM ジメチルスルホン酸：３％ グリセロール：７％ 増幅温度：54℃
ンと緩衝条件を選定するため、上記の４種のプライマー
コンビネーション各々を例１での２つの最適条件で試験
した。これらの２つの条件を以下に示す。条件１ リン酸カリウム（pH7.6）：35mM 酢酸マグネシウム：６mM ジメチルスルホン酸：３％ グリセロール：３％増幅温度：54℃条件２ リン酸カリウム（pH7.6）：35mM 酢酸マグネシウム：６mM ジメチルスルホン酸：３％ グリセロール：７％ 増幅温度：54℃
【００５０】他の全ての反応条件は例１に示した通りで
ある。ゲルのリン光分析を図５、図６に示す。これらの
結果はプライマーの全てのコンビネーションが条件2の
下でより良く作用したこと、および両条件においてプラ
イマーコンビネーション１および２がより高い感度を示
したことを表している。以降の研究において、プライマ
ーコンビネーション２が選定された。その結果、系Bで
の以降の全ての例ではプライマーコンビネーション２
（CTpB4.S1.1（配列番号１０）とCTpB4.S2（配列番号１
２））を使用する。
ある。ゲルのリン光分析を図５、図６に示す。これらの
結果はプライマーの全てのコンビネーションが条件2の
下でより良く作用したこと、および両条件においてプラ
イマーコンビネーション１および２がより高い感度を示
したことを表している。以降の研究において、プライマ
ーコンビネーション２が選定された。その結果、系Bで
の以降の全ての例ではプライマーコンビネーション２
（CTpB4.S1.1（配列番号１０）とCTpB4.S2（配列番号１
２））を使用する。
【００５１】例３系Bの特異性および交差反応性の検定
【００５２】トラコーマクラミジアの多数の血清型を増
幅するためのプライマー系Ｂの能力を試験するため検定
が実施された。14種の血清型を例２に記載した条件２を
用いて試験した。各々の血清型は104のゲノムコピーお
よび103のゲノムコピーで試験された（サンプル中に存
在する潜在プラスミドの実際の数は不明である）。14種
の血清型のうち13種が104のレベルで増幅され、14種の
血清型のうち７種が103のレベルで増幅された（図７参
照）。血清型Ｂは増幅しなかった。血清型Ｂはプライマ
ーおよびバンパーと100％同一であり、増幅の欠如は不
純なサンプルであるためか、もしくはプラスミドの複製
数が低いためであると信じられた。クラミジアの他の2
つの種とNeisseria gonorrhoeaeの一つの鎖が投入レベ
ル107のゲノムコピーで試験された。これらからは増幅
生成物は何ら生成しなかった。
幅するためのプライマー系Ｂの能力を試験するため検定
が実施された。14種の血清型を例２に記載した条件２を
用いて試験した。各々の血清型は104のゲノムコピーお
よび103のゲノムコピーで試験された（サンプル中に存
在する潜在プラスミドの実際の数は不明である）。14種
の血清型のうち13種が104のレベルで増幅され、14種の
血清型のうち７種が103のレベルで増幅された（図７参
照）。血清型Ｂは増幅しなかった。血清型Ｂはプライマ
ーおよびバンパーと100％同一であり、増幅の欠如は不
純なサンプルであるためか、もしくはプラスミドの複製
数が低いためであると信じられた。クラミジアの他の2
つの種とNeisseria gonorrhoeaeの一つの鎖が投入レベ
ル107のゲノムコピーで試験された。これらからは増幅
生成物は何ら生成しなかった。
【００５３】例４ヒトＤＮＡの存在下での感度検定
【００５４】ヒトＤＮＡ存在下での系の感度を試験する
ための検定を例２に記載した条件２を用いて実施した。
300〜3,000 ngのヒトＤＮＡの存在に対して、標的プラ
スミドが10コピーまで滴定された。結果を図８に示し
た。反応は各々のレベルのヒトＤＮＡに対して、標的プ
ラスミドＤＮＡを10（重複遺伝子）、100（重複遺伝
子）、1,000コピー合む。負の制御（標的プラスミドな
し）もヒトＤＮＡが1,200ngのレベルで実施された。系
はヒトＤＮＡが600〜2,500 ngで10コピーの感度、ヒト
ＤＮＡ300〜3,000 ngで100コピーの感度を示した。
ための検定を例２に記載した条件２を用いて実施した。
300〜3,000 ngのヒトＤＮＡの存在に対して、標的プラ
スミドが10コピーまで滴定された。結果を図８に示し
た。反応は各々のレベルのヒトＤＮＡに対して、標的プ
ラスミドＤＮＡを10（重複遺伝子）、100（重複遺伝
子）、1,000コピー合む。負の制御（標的プラスミドな
し）もヒトＤＮＡが1,200ngのレベルで実施された。系
はヒトＤＮＡが600〜2,500 ngで10コピーの感度、ヒト
ＤＮＡ300〜3,000 ngで100コピーの感度を示した。
【００５５】例５他の微生物との交差反応性の検定
【００５６】潜在的な泌尿生殖器汚染菌との交差反応性
の存在の有無を試験するため検定が実施された。例２に
概略を示した条件２が使用された。30種から抽出した合
計35種類の微生物が試験された。これらの微生物を表１
に示した。１つの種当り107のゲノムコピーで、各々３
ないし４つの種を包含する9つのプールを調製した。各
々のプールは標的プラスミドが存在しない状態、もしく
はプラスミドpCT16が200コピー存在する状態で増幅され
た。標的プラスミドを添加しなかったプールでは増幅は
示されなかったが、添加した全てのプールで特異生成物
が増幅した。これらの結果を図９に示す。
の存在の有無を試験するため検定が実施された。例２に
概略を示した条件２が使用された。30種から抽出した合
計35種類の微生物が試験された。これらの微生物を表１
に示した。１つの種当り107のゲノムコピーで、各々３
ないし４つの種を包含する9つのプールを調製した。各
々のプールは標的プラスミドが存在しない状態、もしく
はプラスミドpCT16が200コピー存在する状態で増幅され
た。標的プラスミドを添加しなかったプールでは増幅は
示されなかったが、添加した全てのプールで特異生成物
が増幅した。これらの結果を図９に示す。
【表１】
【００５７】例６ｔＳＤＡの実施に対する潜在プラスミド、領域Fからの
プライマー、バンパーお よび検出用配列
プライマー、バンパーお よび検出用配列
【００５８】トラコーマクラミジアの4種のヒト血清型
からの潜在プラスミドの配列データが、GenBankデータ
ベースから入手できた。4種の他の血清型がこの領域に
配列された。配列の変異を克服してｔＳＤＡプライマー
セットを設計するため、合成アラインメントが使用され
た。領域Fで使用するよう選定されたプライマー、バン
パーおよび検出用配列を以下に示す。ｔＳＤＡ内のBsoB
I部位をイタリック体で示し、ハイブリット形成領域を
下線で示した。検出用プローブD1LおよびD2Lを放射性同
位体標識伸張検定（Radiolabe1 extension assay）で使
用し、D3LおよびD4Lを捕捉検定（capture assay）また
は検出用配列検定（detector assay）で使用し、FD1を
蛍光標識検出用配列として使用した。
からの潜在プラスミドの配列データが、GenBankデータ
ベースから入手できた。4種の他の血清型がこの領域に
配列された。配列の変異を克服してｔＳＤＡプライマー
セットを設計するため、合成アラインメントが使用され
た。領域Fで使用するよう選定されたプライマー、バン
パーおよび検出用配列を以下に示す。ｔＳＤＡ内のBsoB
I部位をイタリック体で示し、ハイブリット形成領域を
下線で示した。検出用プローブD1LおよびD2Lを放射性同
位体標識伸張検定（Radiolabe1 extension assay）で使
用し、D3LおよびD4Lを捕捉検定（capture assay）また
は検出用配列検定（detector assay）で使用し、FD1を
蛍光標識検出用配列として使用した。
【化２】
【００５９】例７領域Fに関するプライマーのスクリーニング
【００６０】 異なる長さのプライマー（結果的にTm
（輸送速度）が異なる）を温度（50℃、52℃）、リン酸
カリウム（25 mM、35 mM）、グリセロール（3.5％、７
％）、DMSO（３％、８％）およびヒト胎盤ＤＮＡ（300
mg、1,200 mg、）を変えて実験することでスクリーニン
グした。ｔＳＤＡ反応の他の要素は以下の通りである。
BsoBI（160ユニット）、Bstポリメラーゼ（９ユニッ
ト）、dATP（0.2 mM）、dsCTP（1.4 mM）、dGTP（0.2 m
M）、dUTP（0.5 mM）、各プライマー（0.5μM）、各バ
ンパー（0.05μM）、UDG（1ユニット）、UD1（5ユニッ
ト）、BSA（100μg/ml）、DTT（0.36 mM）、トレハロー
ス（1.86％）。標的はトラコーマクラミジアLGVIIの106
ゲノムであった。汚染除去は45℃で30分間実施し、増幅
は50℃ないし52℃で30分間実施した。
（輸送速度）が異なる）を温度（50℃、52℃）、リン酸
カリウム（25 mM、35 mM）、グリセロール（3.5％、７
％）、DMSO（３％、８％）およびヒト胎盤ＤＮＡ（300
mg、1,200 mg、）を変えて実験することでスクリーニン
グした。ｔＳＤＡ反応の他の要素は以下の通りである。
BsoBI（160ユニット）、Bstポリメラーゼ（９ユニッ
ト）、dATP（0.2 mM）、dsCTP（1.4 mM）、dGTP（0.2 m
M）、dUTP（0.5 mM）、各プライマー（0.5μM）、各バ
ンパー（0.05μM）、UDG（1ユニット）、UD1（5ユニッ
ト）、BSA（100μg/ml）、DTT（0.36 mM）、トレハロー
ス（1.86％）。標的はトラコーマクラミジアLGVIIの106
ゲノムであった。汚染除去は45℃で30分間実施し、増幅
は50℃ないし52℃で30分間実施した。
【００６１】全てのプライマーコンビネーション（６）
が試験された。増幅生成物は、放射性同位体で標識した
検出プローブCtpF8.D1L（配列番号２０）を用いて伸張
反応により検出した。増幅生成物をアクリルアミトゲル
８％で分離した後、放射性同位体で標識した生成物の強
度の定量評価をMolecular Dynamics杜の445SI Phosphoi
magerとImage QUant杜のv1.1ソフトウェアにより実施し
た。
が試験された。増幅生成物は、放射性同位体で標識した
検出プローブCtpF8.D1L（配列番号２０）を用いて伸張
反応により検出した。増幅生成物をアクリルアミトゲル
８％で分離した後、放射性同位体で標識した生成物の強
度の定量評価をMolecular Dynamics杜の445SI Phosphoi
magerとImage QUant杜のv1.1ソフトウェアにより実施し
た。
【００６２】全てのプライマーコンビネーションは以下
の表２に示し、試験した８つの条件のうち最低5つの条
件で検出可能な増幅生成物を生成した。
の表２に示し、試験した８つの条件のうち最低5つの条
件で検出可能な増幅生成物を生成した。
【表２】
【００６３】一つのプライマーコンビネーションAL1/AR
lは、試験した条件のうち６つの条件で強い増幅を示し
た。最も良い増幅は、リン酸カリウム35 mM、DMSO３
％、グリセロール７％、ヒトＤＮＡ l,200mg、50℃増幅
で観察された。バンパーと共にこのプライマーコンディ
ションは、プライマーセットFを構成する。
lは、試験した条件のうち６つの条件で強い増幅を示し
た。最も良い増幅は、リン酸カリウム35 mM、DMSO３
％、グリセロール７％、ヒトＤＮＡ l,200mg、50℃増幅
で観察された。バンパーと共にこのプライマーコンディ
ションは、プライマーセットFを構成する。
【００６４】例８プライマーセットFに対する感度滴定
【００６５】トラコーマクラミジア血清型Ｊから標的領
域の１つの複製を含むように構築された１種のプラスミ
ドpCT16の滴定が106コピーから1コピーまで試験され
た。また、トラコーマクラミジアからの基本小体からの
ゲノムＤＮＡ培養物の滴定が比較のために実施された。
ｔＳＤＡのために使用した条件は、例７に記載した条件
と同じで、リン酸カリウム35 mM、DMSO３％、グリセロ
ール７％、酢酸マグネシウム６mM、ヒト胎盤ＤＮＡ 1,2
00ng、増幅温度50℃である。増幅後、生成物は放射性同
位体で標識したプローブ伸張反応においてCTpF8.D1L
（配列番号２５）を用いて検出され、lmageQuant vl.1
ソフトウェアを用いて定量された。結果を表３に示し
た。バックグラウンド値の２倍以下の強度はゼロと報告
した表に示したデータは、ｔＳＤＡプライマーが10コピ
ー（3/3複製）を検出可能で、標的領域の１コピー（1/3
複製）を検出可能であることを示している。
域の１つの複製を含むように構築された１種のプラスミ
ドpCT16の滴定が106コピーから1コピーまで試験され
た。また、トラコーマクラミジアからの基本小体からの
ゲノムＤＮＡ培養物の滴定が比較のために実施された。
ｔＳＤＡのために使用した条件は、例７に記載した条件
と同じで、リン酸カリウム35 mM、DMSO３％、グリセロ
ール７％、酢酸マグネシウム６mM、ヒト胎盤ＤＮＡ 1,2
00ng、増幅温度50℃である。増幅後、生成物は放射性同
位体で標識したプローブ伸張反応においてCTpF8.D1L
（配列番号２５）を用いて検出され、lmageQuant vl.1
ソフトウェアを用いて定量された。結果を表３に示し
た。バックグラウンド値の２倍以下の強度はゼロと報告
した表に示したデータは、ｔＳＤＡプライマーが10コピ
ー（3/3複製）を検出可能で、標的領域の１コピー（1/3
複製）を検出可能であることを示している。
【表３】
【００６６】例９トラコーマクラミジア血清型に対するプライマーセット
Fの特異性
Fの特異性
【００６７】系Fがトラコーマクラミジア血清型の全て
を増幅することができるか否かを決定するため、13種の
血清型からの全てのＤＮＡ培養物が試験された。血清型
LGV I試験用に入手できなかった。これらは例８と同一
の条件の下、108ゲノムを用いて試験された。個々の検
定は正副二通りで実施された。結果を表４に示した。バ
ックグランド強度の2倍以下のいかなる強度もゼロとし
て報告した。
を増幅することができるか否かを決定するため、13種の
血清型からの全てのＤＮＡ培養物が試験された。血清型
LGV I試験用に入手できなかった。これらは例８と同一
の条件の下、108ゲノムを用いて試験された。個々の検
定は正副二通りで実施された。結果を表４に示した。バ
ックグランド強度の2倍以下のいかなる強度もゼロとし
て報告した。
【表４】
【００６８】表４のデータは、例８のデータとともにプ
ライマーセットFが103ゲノムでのトラコーマクラミジア
の15種の血清型のうちの13種を検出可能であることを示
している。血清型LGV Iが入手できなかったため、15種
のうち14種のみが試験された。陰性の結果を示した一つ
の血清型は血清型Ｂであった。血清型ＢのゲノムＤＮＡ
は、トラコーマクラミジアに対するいかなる特異増幅系
で検出されず（上述の実施例を参照）、血清型ＢのＤＮ
Ａ培養物が疑わしいことを示唆している。
ライマーセットFが103ゲノムでのトラコーマクラミジア
の15種の血清型のうちの13種を検出可能であることを示
している。血清型LGV Iが入手できなかったため、15種
のうち14種のみが試験された。陰性の結果を示した一つ
の血清型は血清型Ｂであった。血清型ＢのゲノムＤＮＡ
は、トラコーマクラミジアに対するいかなる特異増幅系
で検出されず（上述の実施例を参照）、血清型ＢのＤＮ
Ａ培養物が疑わしいことを示唆している。
【００６９】例１０トラコーマクラミジアに対するプライマーセットＢとＦ
のさらなる特異性試験
のさらなる特異性試験
【００７０】例９で報告したように、血清型ＢのＤＮＡ
培養物の感受性の問題と血清型LGV Iが入手できなかっ
たことから、系ＢおよびＦがトラコーマクラミジアの血
清型BとLGV Iをも増幅できるか否かを決定するため、こ
れら２つの血清型が例９と同一の条件下で試験された。
個々の検定はl03コピーおよび104コピーで正副二通りで
実施した。結果を表５に示した。バックグランド値の２
倍以下のいかなる強度もゼロとして報告した。
培養物の感受性の問題と血清型LGV Iが入手できなかっ
たことから、系ＢおよびＦがトラコーマクラミジアの血
清型BとLGV Iをも増幅できるか否かを決定するため、こ
れら２つの血清型が例９と同一の条件下で試験された。
個々の検定はl03コピーおよび104コピーで正副二通りで
実施した。結果を表５に示した。バックグランド値の２
倍以下のいかなる強度もゼロとして報告した。
【表５】
【００７１】表５の結果から、系Ｆは血清型Ｂおよび血
清型LGV Iのいずれについても103ゲノムで増幅および検
出することが可能であり、系Ｂも血清型Ｂについては10
4ゲノムで、血清型LGV Iについては103ゲノムで増幅お
よび検出可能であると結論した。
清型LGV Iのいずれについても103ゲノムで増幅および検
出することが可能であり、系Ｂも血清型Ｂについては10
4ゲノムで、血清型LGV Iについては103ゲノムで増幅お
よび検出可能であると結論した。
【００７２】例１１プライマーセットＦに対する反応条件の最適化
【００７３】 プライマーセットＦは、様々な反応条件
を利用した一連の検定で使用された。検定はpCT16の100
コピーレベルの標的を使用した。増幅は以下の反応条件
領域の全てにおいて確認された。 増幅温度 ：50〜54℃ リン酸カリウム ：25〜35mM DMSO ：３〜７％（体積％） グリセロール ：３〜７％（体積％） 酢酸マグネシウム ：５〜６mM ヒト胎盤ＤＮＡ ：300〜3,050 ng
を利用した一連の検定で使用された。検定はpCT16の100
コピーレベルの標的を使用した。増幅は以下の反応条件
領域の全てにおいて確認された。 増幅温度 ：50〜54℃ リン酸カリウム ：25〜35mM DMSO ：３〜７％（体積％） グリセロール ：３〜７％（体積％） 酢酸マグネシウム ：５〜６mM ヒト胎盤ＤＮＡ ：300〜3,050 ng
【００７４】いくつかの実施例において、上記の領域は
試験された領域を限定するものであり、上記の領域以外
の反応条件でも増幅は起こる可能性があった。増幅生成
物の生成量が最大であった反応条件を以下に示す。 増幅温度 ：52℃ リン酸カリウム ：35mM DMSO ：７％（体積％） グリセロール ：7%（体積%）酢酸マグ ネシウム ：5mM ヒト胎盤ＤＮＡ ：l,200 ng
試験された領域を限定するものであり、上記の領域以外
の反応条件でも増幅は起こる可能性があった。増幅生成
物の生成量が最大であった反応条件を以下に示す。 増幅温度 ：52℃ リン酸カリウム ：35mM DMSO ：７％（体積％） グリセロール ：7%（体積%）酢酸マグ ネシウム ：5mM ヒト胎盤ＤＮＡ ：l,200 ng
【表６】
【００７５】例１２プライマーセットFの交差反応性の検定
【００７６】 泌尿生殖器の臨床試料の共通に見つかる
潜在的交差反応性を有するバクテリアとウイルスがあ
る。発熱性ＳＤＡ反応が、プライマーセットＦと例１１
の最適検定条件を用いて実施された。潜在的交差体試料
は107ゲノムで試験された。これらは、増幅の阻害が起
こらないことを示すため、内標準として100コピーのpCT
16を含む同一のプール管理条件を持つ4つの種のプール
サンプルで試験された。結果を表６に示した、いずれの
場合においても、交差反応体は増幅または検出されなか
った。
潜在的交差反応性を有するバクテリアとウイルスがあ
る。発熱性ＳＤＡ反応が、プライマーセットＦと例１１
の最適検定条件を用いて実施された。潜在的交差体試料
は107ゲノムで試験された。これらは、増幅の阻害が起
こらないことを示すため、内標準として100コピーのpCT
16を含む同一のプール管理条件を持つ4つの種のプール
サンプルで試験された。結果を表６に示した、いずれの
場合においても、交差反応体は増幅または検出されなか
った。
【００７７】例１３系ＢおよびＦでのトラコーマクラミジアの均一リアルタ
イム型蛍光ｔＳＤＡ検出
イム型蛍光ｔＳＤＡ検出
【００７８】 プライマーセットＦおよびＢは、均一蛍
光リアルタイム型ｔＳＤＡ反応の実施にも有用である。
この種の反応はヘアピン配列と受容体および供与体蛍光
分子を含む検出用配列を使用する。系Ｆプライマーセッ
トとの使用において有効に作用する検出用配列の一つが
CTpF8.FD1 5'-TAGCACCCGAGTGCTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA-3' （配列番号２９）である。系Ｂとの使用において有効に
作用にする検出用配列はCTpB4.FD1 5'-TAGCACCCGAGTGCTTTGACGATTTTCTCCAACCGATGAGTTGAT-
3' （配列番号17）である。これらの配列の最初の15塩基は
BsoBI制限部位と共にヘアピン構造を含む。塩基２〜６
は、塩基15〜11と塩基対合し得る。さらに、塩基1はFAM
の添加によって修飾され、塩基15はROXの添加によって
修飾される。このヘアピン構造（配列番号２９の最初の
15塩基）は
光リアルタイム型ｔＳＤＡ反応の実施にも有用である。
この種の反応はヘアピン配列と受容体および供与体蛍光
分子を含む検出用配列を使用する。系Ｆプライマーセッ
トとの使用において有効に作用する検出用配列の一つが
CTpF8.FD1 5'-TAGCACCCGAGTGCTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA-3' （配列番号２９）である。系Ｂとの使用において有効に
作用にする検出用配列はCTpB4.FD1 5'-TAGCACCCGAGTGCTTTGACGATTTTCTCCAACCGATGAGTTGAT-
3' （配列番号17）である。これらの配列の最初の15塩基は
BsoBI制限部位と共にヘアピン構造を含む。塩基２〜６
は、塩基15〜11と塩基対合し得る。さらに、塩基1はFAM
の添加によって修飾され、塩基15はROXの添加によって
修飾される。このヘアピン構造（配列番号２９の最初の
15塩基）は
【化３】 （配列番号３０）である。塩基６〜11はイタリック体で
表記し、BsoBI制限部位を表した。
表記し、BsoBI制限部位を表した。
【００７９】均一リアルタイム型蛍光ｔＳＤＡの実施に
関する実験計画は、通常のｔＳＤＡのものと類似してい
る。マイクロタイターウェル形式でのより大容量の反応
での使用に適用されていたものであるが、ｔＳＤＡの実
験計画が構成要素の比率に従う実験手順の一つを以下に
示す。すなわち、（１）ウェルを１ミリリットルの水で
満たした後、E1ectro-Them1ディジタル温度計を用いて1
つのThenmal-Lokバスを45℃に、もう一つのThermal-Lok
バスを52℃に平衡化させ、または、乾燥しているTherma
l-Lokバスを54℃に平衡化させ、（２）ｔＳＤＡ緩衝液
を調製し、汚染除去混合物を調製し、室温でこれらを保
存し、（３）個々の0.5ml EppendorfSafe1ok試験管にｔ
ＳＤＡ反応緩衝液0.65μlを添加し、（４）0.5μlの鋳
型を添加し、試験管当たりヒトＤＮＡ10ng／μ1に稀釈
し、（５）試験管をふっとう水バス中に２分間置き、
（６）試験管をマイクロ遠心分離機およびパルススピン
（Pulse spin）に移し、（７）試験管を45℃ Thermal-L
okに５分間移し、（８）個々の試験管に汚染除去混合物
を15μ1づつ添加し、短時間撹拝させ、20分間培養し、
（９）増幅混合物を調製し、室温で貯蔵し、（１０）マ
イクロタイターを金属トレイ内に置き、予熱のため54℃
Therma1-Lokの上部に置き、（１１）試験管を52℃Therm
al-Lokに５分間移し、（１２）反応液85μlを適当なマ
イクロタイターウェルに移し、終点反応のみのため、サ
ンプルを試験管内に放置し、（１３）個々のウェルに増
幅混合物15μlを添加し、自己粘着性酢酸塩シートでシ
ールし、終点反応のため、個々の試験管に増幅混合物15
μlを添加して撹絆し、引き続き60分問Therma1-Lok中で
培養し、（１４）トレイを52℃で蛍光板読取装置内に置
き、60分間かけてＲＦＵデータを収集する。終点反応の
ため、マイクロタイターウェルに試験管の内容物を移
し、個々のウェルを１回づつ読み取る。
関する実験計画は、通常のｔＳＤＡのものと類似してい
る。マイクロタイターウェル形式でのより大容量の反応
での使用に適用されていたものであるが、ｔＳＤＡの実
験計画が構成要素の比率に従う実験手順の一つを以下に
示す。すなわち、（１）ウェルを１ミリリットルの水で
満たした後、E1ectro-Them1ディジタル温度計を用いて1
つのThenmal-Lokバスを45℃に、もう一つのThermal-Lok
バスを52℃に平衡化させ、または、乾燥しているTherma
l-Lokバスを54℃に平衡化させ、（２）ｔＳＤＡ緩衝液
を調製し、汚染除去混合物を調製し、室温でこれらを保
存し、（３）個々の0.5ml EppendorfSafe1ok試験管にｔ
ＳＤＡ反応緩衝液0.65μlを添加し、（４）0.5μlの鋳
型を添加し、試験管当たりヒトＤＮＡ10ng／μ1に稀釈
し、（５）試験管をふっとう水バス中に２分間置き、
（６）試験管をマイクロ遠心分離機およびパルススピン
（Pulse spin）に移し、（７）試験管を45℃ Thermal-L
okに５分間移し、（８）個々の試験管に汚染除去混合物
を15μ1づつ添加し、短時間撹拝させ、20分間培養し、
（９）増幅混合物を調製し、室温で貯蔵し、（１０）マ
イクロタイターを金属トレイ内に置き、予熱のため54℃
Therma1-Lokの上部に置き、（１１）試験管を52℃Therm
al-Lokに５分間移し、（１２）反応液85μlを適当なマ
イクロタイターウェルに移し、終点反応のみのため、サ
ンプルを試験管内に放置し、（１３）個々のウェルに増
幅混合物15μlを添加し、自己粘着性酢酸塩シートでシ
ールし、終点反応のため、個々の試験管に増幅混合物15
μlを添加して撹絆し、引き続き60分問Therma1-Lok中で
培養し、（１４）トレイを52℃で蛍光板読取装置内に置
き、60分間かけてＲＦＵデータを収集する。終点反応の
ため、マイクロタイターウェルに試験管の内容物を移
し、個々のウェルを１回づつ読み取る。
【００８０】例１４均一検出を用いた系ｂおよびＦの感度
【００８１】均一リアルタイム型蛍光ｔＳＤＡ反応にお
ける使用中のプライマー系ＦおよびＢのCtpF8.FD1との
感度を試験するため、標的として異なるコピー数のpCT1
6プラスミドを用いてｔＳＤＡ反応を実施した。系Ｂに
関しては、例１２に記載した終点実施手順を使用した。
最終的な反応条件は以下の通りである。
ける使用中のプライマー系ＦおよびＢのCtpF8.FD1との
感度を試験するため、標的として異なるコピー数のpCT1
6プラスミドを用いてｔＳＤＡ反応を実施した。系Ｂに
関しては、例１２に記載した終点実施手順を使用した。
最終的な反応条件は以下の通りである。
【００８２】リン酸カリウム35mM、DMSO３％、グリセロ
ール７％、酢酸マグネシウム６mM、Bst 40ユニット、Bs
oBI 640ユニット、ヒト胎盤ＤＮＡ 2,400mg、dATP 0.2m
M、dGTP 0.2mM、dCsTP 0.4mM、dUTP 0.5mM、アセチル化
牛血清アルブミン0.1mg/m1、トレハロース1.8％、DTT
0.36mM、CTpB4.FD1（配列番号１７）。
ール７％、酢酸マグネシウム６mM、Bst 40ユニット、Bs
oBI 640ユニット、ヒト胎盤ＤＮＡ 2,400mg、dATP 0.2m
M、dGTP 0.2mM、dCsTP 0.4mM、dUTP 0.5mM、アセチル化
牛血清アルブミン0.1mg/m1、トレハロース1.8％、DTT
0.36mM、CTpB4.FD1（配列番号１７）。
【００８３】増幅は54℃で実施し、汚染除去酵素（UD
G）と阻害剤（UDl）が使用された。表８に示す結果は、
60分間の培養後のサンプルの読取りから得られたもので
ある（励起485nm、放射538nm）。
G）と阻害剤（UDl）が使用された。表８に示す結果は、
60分間の培養後のサンプルの読取りから得られたもので
ある（励起485nm、放射538nm）。
【表７】
【００８４】結果は、正の感度を平均バックグランド値
の２倍以上として定義した場合、３種類の複製のうち1
つに対する50コピーのpCT16の感度を示している。
の２倍以上として定義した場合、３種類の複製のうち1
つに対する50コピーのpCT16の感度を示している。
【００８５】系Fに関し、汚染除去および増幅混合物が
例１２に示した手順で調製された。ただし、全ての試薬
について濃度は10倍レベルとした。汚染除去混合物15μ
1もしくは増幅混合物10μ1をマイクロタイターウェルの
底にスポットし、低湿度乾燥室内で乾燥させた。汚染除
去ウェルと増幅ウェルは、使用時まで乾燥剤を用いて別
々に密封されている。
例１２に示した手順で調製された。ただし、全ての試薬
について濃度は10倍レベルとした。汚染除去混合物15μ
1もしくは増幅混合物10μ1をマイクロタイターウェルの
底にスポットし、低湿度乾燥室内で乾燥させた。汚染除
去ウェルと増幅ウェルは、使用時まで乾燥剤を用いて別
々に密封されている。
【００８６】汚染除去混合物がスポットされたウェルは
Thermal-Lok加熱ブロックで45℃で５分問予熱された。
純水、リン酸カリウム、グリセロール、DMSP、ヒト胎盤
DNA、プラスミドpCT16を含むサンプルは2分間沸騰した
後、プールするためにマイクロ遠心分離器中ですばやく
遠心分離された。個々のサンプル150μlがピペットを用
いて予熱された汚染除去ウェルに加えられ、粘着フィル
ムを用いて密封した後、45℃で20分問培養された。ウェ
ルは温度を52℃にするため、第二のThermal-Lok加熱ブ
ロックに移された。これに合わせて、汚染除去混合物が
スポットされたウェルと同数のウェルに上述の増幅混合
物をスポットし、予熱のため同じ加熱ブロック内に置い
た。５分から10分の後、汚染除去混合物ウェルから粘着
フィルムが取り除かれ、各々の汚染除去混合物ウェルか
ら10μlのサンプルが取り出され、増幅混合物ウェルに
ピペットを用いて滴下された（一つの増幅混合物ウェル
に対し一サンプルを投入）。増幅混合物スポットの再水
和作用後のマイクロウェル中の最終的な反応条件はリン
酸カリウム35mM、グリセロール７％、DMSO７％、酢酸マ
グネシウム5mM、アセチル化BSA 0.2mg/ml、トレハロー
ス0.36mM、ジチオドレイトール0.36mM、αチオラート化
dCTP 0.7mM、dUTP 0.25mM、dATP 0.lmM、dGTP 0.lmM、B
stポリメラーゼ40ユニット、ウラシルＤＮＡグルコジラ
ーゼ１ユニット、ウラシルＤＮＡグルコジラーゼ阻害剤
５ユニット、AR1（プライマー）0.3μM、BL1およびBR1
（バンパー）0.05μM、FD1（検出用オリゴ）0.2μM、ヒ
ト胎盤ＤＮＡ2,400ngである。増幅混合物ウェルは新し
い粘着フィルムシートを用いて密封され、常時培養温度
52℃を維持するように設定されたPerSeptivesプレート
リーダーに直ちに移された。ウェルの読取りは直ちに開
始され、１分間隔で60分間読取りが行われた。サンプル
は485nmで励起され、放出された蛍光は530nmでモニタさ
れた。結果を表８に示す。これらの結果は標的ＤＮＡ10
コピーの系の感度を表している。
Thermal-Lok加熱ブロックで45℃で５分問予熱された。
純水、リン酸カリウム、グリセロール、DMSP、ヒト胎盤
DNA、プラスミドpCT16を含むサンプルは2分間沸騰した
後、プールするためにマイクロ遠心分離器中ですばやく
遠心分離された。個々のサンプル150μlがピペットを用
いて予熱された汚染除去ウェルに加えられ、粘着フィル
ムを用いて密封した後、45℃で20分問培養された。ウェ
ルは温度を52℃にするため、第二のThermal-Lok加熱ブ
ロックに移された。これに合わせて、汚染除去混合物が
スポットされたウェルと同数のウェルに上述の増幅混合
物をスポットし、予熱のため同じ加熱ブロック内に置い
た。５分から10分の後、汚染除去混合物ウェルから粘着
フィルムが取り除かれ、各々の汚染除去混合物ウェルか
ら10μlのサンプルが取り出され、増幅混合物ウェルに
ピペットを用いて滴下された（一つの増幅混合物ウェル
に対し一サンプルを投入）。増幅混合物スポットの再水
和作用後のマイクロウェル中の最終的な反応条件はリン
酸カリウム35mM、グリセロール７％、DMSO７％、酢酸マ
グネシウム5mM、アセチル化BSA 0.2mg/ml、トレハロー
ス0.36mM、ジチオドレイトール0.36mM、αチオラート化
dCTP 0.7mM、dUTP 0.25mM、dATP 0.lmM、dGTP 0.lmM、B
stポリメラーゼ40ユニット、ウラシルＤＮＡグルコジラ
ーゼ１ユニット、ウラシルＤＮＡグルコジラーゼ阻害剤
５ユニット、AR1（プライマー）0.3μM、BL1およびBR1
（バンパー）0.05μM、FD1（検出用オリゴ）0.2μM、ヒ
ト胎盤ＤＮＡ2,400ngである。増幅混合物ウェルは新し
い粘着フィルムシートを用いて密封され、常時培養温度
52℃を維持するように設定されたPerSeptivesプレート
リーダーに直ちに移された。ウェルの読取りは直ちに開
始され、１分間隔で60分間読取りが行われた。サンプル
は485nmで励起され、放出された蛍光は530nmでモニタさ
れた。結果を表８に示す。これらの結果は標的ＤＮＡ10
コピーの系の感度を表している。
【表８】
【００８７】例１５均一検出を用いた系Fの感度
【００８８】系Fの感度をチェックするため、２組の実
験が実施された。例１４では標的としてpCT16が使用さ
れたが、今回の2組の実験ではトラコーマクラミジアの
基本小体LGV2が標的として使用された。反応は例１３に
示した手順で実施された。最終的な反応条件は以下に示
した点を除き、例１４と同様である。チオラート化dCTP
1.4mM、dUTP 0.5mM、dATPおよびdGTP 0.2mM。RFUデータ
が60分間の増幅時間を通して毎分収集された。個々のレ
ベルでの２種の複製に関して、時間０と時間60の間での
RFUの差を表９に示した。ふたたび、この蛍光検出用配
列べ一スの系Ｆは、10コピーのトラコーマクラミジア基
本小体を増幅し、バックグラウンド値を上回るレベルで
検出することができる。
験が実施された。例１４では標的としてpCT16が使用さ
れたが、今回の2組の実験ではトラコーマクラミジアの
基本小体LGV2が標的として使用された。反応は例１３に
示した手順で実施された。最終的な反応条件は以下に示
した点を除き、例１４と同様である。チオラート化dCTP
1.4mM、dUTP 0.5mM、dATPおよびdGTP 0.2mM。RFUデータ
が60分間の増幅時間を通して毎分収集された。個々のレ
ベルでの２種の複製に関して、時間０と時間60の間での
RFUの差を表９に示した。ふたたび、この蛍光検出用配
列べ一スの系Ｆは、10コピーのトラコーマクラミジア基
本小体を増幅し、バックグラウンド値を上回るレベルで
検出することができる。
【表９】
【００８９】例１６均一検出を用いた系Fの特異性
【００９０】均一リアルタイム型蛍光ｔＳＤＡでの使用
する際のCtpF811.FD1系の特異性が試験された。反応は
例１４と同様に実施した。交差反応体プールは反応当た
り10 7ゲノムで試験された。増幅反応はPerSeptive Bios
ys1ems CytoFluor 4000プレートリーダーで実施
された。RFUデータは60分間の増幅時間を通して毎分収
集された。時間０から時間60までＲＦＵの差を表１０に
示した。いずれのプールでも、試験した交差反応体の増
幅や検出は確認されなかった。
する際のCtpF811.FD1系の特異性が試験された。反応は
例１４と同様に実施した。交差反応体プールは反応当た
り10 7ゲノムで試験された。増幅反応はPerSeptive Bios
ys1ems CytoFluor 4000プレートリーダーで実施
された。RFUデータは60分間の増幅時間を通して毎分収
集された。時間０から時間60までＲＦＵの差を表１０に
示した。いずれのプールでも、試験した交差反応体の増
幅や検出は確認されなかった。
【表１０】
【００９１】発明はいくつかの特異性について記載され
ているが、発明の範囲から逸脱することなく、当業者に
とって明らかな改良を実施してよい。本発明の様々な特
徴を後述する請求の範囲に述べる。
ているが、発明の範囲から逸脱することなく、当業者に
とって明らかな改良を実施してよい。本発明の様々な特
徴を後述する請求の範囲に述べる。
【００９２】本発明の様々な目的、利点および新規な特
徴は、以下の詳細な説明を添付した図面と併せて読むこ
とにより、容易に理解できる。
徴は、以下の詳細な説明を添付した図面と併せて読むこ
とにより、容易に理解できる。
【００９３】
（１）一般情報 （i）出願人：Berger, Dolores M., Foxall, Paul A. （ii）発明の名称：トラコーマクラミジア潜在プラスミ
ドの増幅および検出によるトラコーマクラミジアの検定 （iii）配列数：３０ （iv）住所欄Richard J. Rodrick-Becton, Dickinson a
nd Company1 Becon Drive, Franklin Lakes, NJ, USA （v）読取り可能なコンピューター形式 （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBM PC互換機 （C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：PatenteIn Re1ease No.0, Version
No. 1.30 （vi）現在の出願情報 （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）弁理士情報 （Ａ）氏名：Highet, David W. （Ｂ）登録番号：30,265 （Ｃ）明細書番：p-3889 （ix）電話通信情報 （Ａ）電話番号：(201)847-5317 （Ｂ）ファクス番号：(201)848-9228 配列番号：１ 配列の長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GAAGATCGAG TAGACGTAAT AT 22 配列番号：２ 配列の長さ：23塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ATAGCAGATA TATCTAGAAC CTT 23 配列番号：３ 配列の長さ：22塩基対 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖 配列 TTGGATCGAA ATGTAATACC GA 22 配列番号：４ 配列の長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACTTCTGATT TTCAAGGTGG AT 22 配列番号：５ 配列長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CAAAACTGCG TCTTTGCTGA TA 22 配列番号：６ 配列の長さ：21塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GGGTGTGACT GTGAATTTTC C 21 配列番号：７配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 AGTTGGGCAA ATGACAGAGC 20 配列番号：８ 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TGAATAACCC GTTGCATTGA 20 配列番号：９配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCGATTA CTTGCAGTTG 40 配列番号：１０ 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGATTAC TTGCAGTTG 39 配列番号：１１ 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GAGTAGACGT AATATT 16 配列番号：１２ 配列の長さ：41塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGATATCT GCTATTTCAT T 41 配列番号：１３ 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGATATCT GCTATTTCAT 40 配列番号：１４ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CTCTTAAGGT TCTAG 15 配列番号：１５ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CTCATCGGTT GGAGA 15 配列番号：１６ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TCTCCAACCG ATGAG 15 配列番号：１７ 配列の長さ：45塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TAGCACCCGA GTGCTTTGAC GATTTTCTCC AACCGATGAG TTGAT 45 配列番号：１８ 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CAGCAAATAA TCCTTGG 17 配列番号：１９ 配列の長さ：19塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CATTGGTTGA TGAATTATT 19 配列番号：２０ 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGACAAAA TCAACACCTG 40 配列番号：２１ 配列の長さ：41塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGACAAAA TCAACACCTG T 41 配列番号：２２ 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGACT GTTAAAGATA 40 配列番号：２３ 配列の長さ：41塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGACT GTTAAAGATA T 41 配列番号：２４ 配列の長さ：42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGACT GTTAAAGATA TT 42 配列番号：２５ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GTCGCAGCCA AAATG 15 配列の番号：２６ 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACAGCTTCTG ATGGAA 16 配列番号：２７ 配列の長さ：14塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖 配列 GTCGCAGCCA AAAT 14 配列番号：２８ 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GACAGCTTCT GATGGAA 17 配列番号：２９ 配列の長さ：44塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TAGCACCCGA GTGCTCGCAG CCAAAATGAC AGCTTCTGAT GGAA 44 配列番号：３０ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TAGCACCCGA GTGCT 15
ドの増幅および検出によるトラコーマクラミジアの検定 （iii）配列数：３０ （iv）住所欄Richard J. Rodrick-Becton, Dickinson a
nd Company1 Becon Drive, Franklin Lakes, NJ, USA （v）読取り可能なコンピューター形式 （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBM PC互換機 （C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：PatenteIn Re1ease No.0, Version
No. 1.30 （vi）現在の出願情報 （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）弁理士情報 （Ａ）氏名：Highet, David W. （Ｂ）登録番号：30,265 （Ｃ）明細書番：p-3889 （ix）電話通信情報 （Ａ）電話番号：(201)847-5317 （Ｂ）ファクス番号：(201)848-9228 配列番号：１ 配列の長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GAAGATCGAG TAGACGTAAT AT 22 配列番号：２ 配列の長さ：23塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ATAGCAGATA TATCTAGAAC CTT 23 配列番号：３ 配列の長さ：22塩基対 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖 配列 TTGGATCGAA ATGTAATACC GA 22 配列番号：４ 配列の長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACTTCTGATT TTCAAGGTGG AT 22 配列番号：５ 配列長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CAAAACTGCG TCTTTGCTGA TA 22 配列番号：６ 配列の長さ：21塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GGGTGTGACT GTGAATTTTC C 21 配列番号：７配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 AGTTGGGCAA ATGACAGAGC 20 配列番号：８ 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TGAATAACCC GTTGCATTGA 20 配列番号：９配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCGATTA CTTGCAGTTG 40 配列番号：１０ 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGATTAC TTGCAGTTG 39 配列番号：１１ 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GAGTAGACGT AATATT 16 配列番号：１２ 配列の長さ：41塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGATATCT GCTATTTCAT T 41 配列番号：１３ 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGATATCT GCTATTTCAT 40 配列番号：１４ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CTCTTAAGGT TCTAG 15 配列番号：１５ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CTCATCGGTT GGAGA 15 配列番号：１６ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TCTCCAACCG ATGAG 15 配列番号：１７ 配列の長さ：45塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TAGCACCCGA GTGCTTTGAC GATTTTCTCC AACCGATGAG TTGAT 45 配列番号：１８ 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CAGCAAATAA TCCTTGG 17 配列番号：１９ 配列の長さ：19塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CATTGGTTGA TGAATTATT 19 配列番号：２０ 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGACAAAA TCAACACCTG 40 配列番号：２１ 配列の長さ：41塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列 CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGACAAAA TCAACACCTG T 41 配列番号：２２ 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGACT GTTAAAGATA 40 配列番号：２３ 配列の長さ：41塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGACT GTTAAAGATA T 41 配列番号：２４ 配列の長さ：42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGACT GTTAAAGATA TT 42 配列番号：２５ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GTCGCAGCCA AAATG 15 配列の番号：２６ 配列の長さ：16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 ACAGCTTCTG ATGGAA 16 配列番号：２７ 配列の長さ：14塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖 配列 GTCGCAGCCA AAAT 14 配列番号：２８ 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 GACAGCTTCT GATGGAA 17 配列番号：２９ 配列の長さ：44塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TAGCACCCGA GTGCTCGCAG CCAAAATGAC AGCTTCTGAT GGAA 44 配列番号：３０ 配列の長さ：15塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列 TAGCACCCGA GTGCT 15
【図１】システムＢに対して使用するバンパー、プライ
マー、および検出用配列（detector）を示すものであ
る。
マー、および検出用配列（detector）を示すものであ
る。
【図２】標的としてトラコーマプラスミド潜在プラスミ
ド（プラスミドpCT16）の一部分を用いてｔＳＤＡを実
施するために、プライマーや、バンパー条件温度の様々
に組み合わせた試験条件マトリックスを使用しりん光分
析の結果の一つを示すものである。
ド（プラスミドpCT16）の一部分を用いてｔＳＤＡを実
施するために、プライマーや、バンパー条件温度の様々
に組み合わせた試験条件マトリックスを使用しりん光分
析の結果の一つを示すものである。
【図３】標的としてトラコーマプラスミド潜在プラスミ
ド（プラスミドpCT16）の一部分を用いてｔＳＤＡを実
施するために、プライマーやバンパー条件温度の様々に
組み合わせた試験条件マトリックスを使用しりん光分析
の結果の別の一つを示すものである。
ド（プラスミドpCT16）の一部分を用いてｔＳＤＡを実
施するために、プライマーやバンパー条件温度の様々に
組み合わせた試験条件マトリックスを使用しりん光分析
の結果の別の一つを示すものである。
【図４】２つの異なるが、相補的な検出用配列のpCT16
を標的として用いて実施したｔＳＤＡ反応のりん光分析
を示すものである。反応はDMSO３%、グリセロール７%、
マグネシウム６mM、りん酸カリウム35mMを用いて実施
し、増幅は52℃で行った。４種のプライマーコンビネー
ション（1,2,3,4）が使用された。図４Ａの４種のプラ
イマーサンプルは図４Ｂの増幅生成物の非転写鎖ＤＮＡ
鎖とハイブリッド形成した伸長プライマーを用いて検出
された。同じ４種のサンプルが図４Ａで使用した検出用
配列の補体を用いて検出された。図４Ｂに示す実験に使
用された検出用配列は増幅生成物の有効鎖にハイブリッ
ド形成する。
を標的として用いて実施したｔＳＤＡ反応のりん光分析
を示すものである。反応はDMSO３%、グリセロール７%、
マグネシウム６mM、りん酸カリウム35mMを用いて実施
し、増幅は52℃で行った。４種のプライマーコンビネー
ション（1,2,3,4）が使用された。図４Ａの４種のプラ
イマーサンプルは図４Ｂの増幅生成物の非転写鎖ＤＮＡ
鎖とハイブリッド形成した伸長プライマーを用いて検出
された。同じ４種のサンプルが図４Ａで使用した検出用
配列の補体を用いて検出された。図４Ｂに示す実験に使
用された検出用配列は増幅生成物の有効鎖にハイブリッ
ド形成する。
【図５】標的としてpCT16を用い、感度試験のためにプ
ライマーやバンパー条件の様々なコンビネーションで行
ったｔＳＤＡのりん光分折の結果の一つを示すものであ
る。標的はl02コピーから106コピー存在していた。4種
のプライマーコンビネーションはそれぞれ、標的コピー
数の各々の範囲にわたって試験された。実験は、例２で
説明するように、２つのバンパー条件設定の下で実施し
た。
ライマーやバンパー条件の様々なコンビネーションで行
ったｔＳＤＡのりん光分折の結果の一つを示すものであ
る。標的はl02コピーから106コピー存在していた。4種
のプライマーコンビネーションはそれぞれ、標的コピー
数の各々の範囲にわたって試験された。実験は、例２で
説明するように、２つのバンパー条件設定の下で実施し
た。
【図６】標的としてpCT16を用い、感度試験のためにプ
ライマーやバンパー条件の様々なコンビネーションで行
ったｔＳＤＡのりん光分折の結果の別の一つを示すもの
である。
ライマーやバンパー条件の様々なコンビネーションで行
ったｔＳＤＡのりん光分折の結果の別の一つを示すもの
である。
【図７】プライマーコンビネーション２の特異性および
交差反応性をチェックするための検定の結果を示すもの
である。標的核酸は、特異性を試験用のトラコーマクラ
ミジアの14種の血清型（A,B,Ba,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L2,
L3）と交差反応性を試験用のC. pneumoniae、C. psitta
ci、N. gonrrhoeaeからなる。各々の血清型は103のゲノ
ムコピーおよび104のゲノムコピーで試験され、交差反
応性試験では107のゲノムコピーの微生物が使用され
た。試験サンプルにはpCT16（with controlと表記する
欄）と標的なしも含まれる。
交差反応性をチェックするための検定の結果を示すもの
である。標的核酸は、特異性を試験用のトラコーマクラ
ミジアの14種の血清型（A,B,Ba,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L2,
L3）と交差反応性を試験用のC. pneumoniae、C. psitta
ci、N. gonrrhoeaeからなる。各々の血清型は103のゲノ
ムコピーおよび104のゲノムコピーで試験され、交差反
応性試験では107のゲノムコピーの微生物が使用され
た。試験サンプルにはpCT16（with controlと表記する
欄）と標的なしも含まれる。
【図８】300ngから3,000ngの範囲の様々な量のヒトＤＮ
Ａの存在下でのトラコーマクラミジアに対するプライマ
ーコンビネーション２の感度を試験するための検定の結
果を示すものである。
Ａの存在下でのトラコーマクラミジアに対するプライマ
ーコンビネーション２の感度を試験するための検定の結
果を示すものである。
【図９】プライマーコンビネーション２を用いた交差反
応性に関する検定結果を示したものである。30種類の異
なる種を代表する合計35種類の異なる微生物からなる9
つのプールが交差反応性の有無を決定するために試験さ
れた。各々の種は107個のゲノムコピーで試験された。
各々のプールの左の欄はプールのみでの増幅を示し、右
の欄はpCT16 200コピー加えた場合の増幅を示す。
応性に関する検定結果を示したものである。30種類の異
なる種を代表する合計35種類の異なる微生物からなる9
つのプールが交差反応性の有無を決定するために試験さ
れた。各々の種は107個のゲノムコピーで試験された。
各々のプールの左の欄はプールのみでの増幅を示し、右
の欄はpCT16 200コピー加えた場合の増幅を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 ドロレス・エム・バーガー アメリカ合衆国メリーランド州21239，ボ ルチモア，ロック・ヒル・コート 6505
Claims (21)
- 【請求項１】 CTpB4.S1（配列番号９）とCTpB4.S1.1
（配列番号１０）からなるグループから選択した核酸。 - 【請求項２】 CT1pB4.S2（配列番号１２）とCTpB4.S2.
1（配列番号１３）からなるグループから選択した核
酸。 - 【請求項３】 CTpB4.B1（配列番号１１）とCTpB4.B2
（配列番号１４）からなるグループから選択した核酸。 - 【請求項４】 CTpB4.D1（配列番号１５）、配列番号１
５に相補する核酸、CTpB4.D2（配列番号１６）、配列番
号１６に相補する核酸、CT1pB4.FD1（配列番号１７）お
よび配列番号１７に相補する核酸からなるグループから
選択した核酸。 - 【請求項５】 CtpF8.AL1（配列番号２０）とCtpF8.AL2
（配列番号２１）から選択したグループからなる核酸。 - 【請求項６】 CtpF8.AR1（配列番号２２）、CtpF8.AR2
（配列番号２３）およびCtpF8.AR3（配列番号２４）か
らなるグループから選択した核酸。 - 【請求項７】 CtpF8.BL（配列番号１８）とCtpF8.BR
（配列番号１９）から選択したグループからなる核酸。 - 【請求項８】 CtpF8.D1L（配列番号２５）、配列番号
２５に相補する核酸、CtpF8.D2L（配列番号２６）、配
列番号２６に相補する核酸、CtpF8.D3L（配列番号２
７）、配列番号２７に相補する核酸、CtpF8.D4L（配列
番号２８）、配列番号２８に相補する核酸、CtpF8.FD1
（配列番号２９）および配列番号２９と相補する核酸か
らなるグループから選択した核酸。 - 【請求項９】 CtpB4.FD1（配列番号１７）、CtpF8.FD1
（配列番号２９）および配列番号３０からなるグループ
から選択した核酸。 - 【請求項１０】 CTpB1P（配列番号１）、CTpB2P（配列
番号２）、CTpB3N（配列番号３）およびCTpB4N（配列番
号４）からなるグループから選択した核酸。 - 【請求項１１】 CTpFPL（配列番号５）、CTpFPR（配列
番号６）、CTpFSL（配列番号７）およびCTpFSR（配列番
号８）からなるグループから選択した核酸。 - 【請求項１２】 （ａ）CTpB4.S1（配列番号９）とCTpB
4.S1.1（配列番号１０）からなるグループから選択した
１以上のプライマーと、 （ｂ）CTpB4.S2（配列番号１２）とCTpB4.S2.1（配列番
号１３）からなるグループから選択した1以上のプライ
マーと、 （ｃ）バンパーCTpB4.B1（配列番号１１）およびCTpB4.
B2（配列番号１４）と、 （ｄ）CTpB4.D1（配列番号１５）、配列番号１５に相補
する核酸、CTpB4.D2（配列番号１６）、配列番号１６に
相補する核酸、CtpB4.FD1（配列番号１７）および配列
番号１７に相補する核酸からなるグループから選択され
た1以上の検出用配列とからなるキット。 - 【請求項１３】 （ａ）CtpF8.AL1（配列番号２０）とC
tpF8.AL2（配列番号２１）からなるグループから選択さ
れた１以上のプライマーと、 （ｂ）CtpF8.AR1（配列番号２２）、CtpF8.AR2（配列番
号２３）およびCtpF8.AR3（配列番号２４）からなるグ
ループから選択した１以上のプライマーと、 （ｃ）バンパーCtpF8.BL（配列番号１８）およびCtpF8.
BR（配列番号１９）と、 （ｄ）CTpF8.D1L（配列番号２５）、配列番号２５に相
補する核酸、CTpF8.D2L（配列番号２６）、配列番号２
６に相補する核酸、CTpF8.D3L（配列番号２７）、配列
番号２７に相補する核酸、CTpF8.D4L（配列番号２
８）、配列番号２８に相補する核酸、CTpF8.FD1（配列
番号２９）および配列番号２９に相補する核酸からなる
グループから選択した1以上の検出用配列とからなるキ
ット。 - 【請求項１４】 サンブル中のトラコーマクラミジアの
存在の有無を検出するための方法であって、 （ａ）核酸増幅反応中に、第一の核酸プライマーがCTpB
4.S1（配列番号９）とCTpB4.S1.1（配列番号１０）から
なるグループから選択され、第二の核酸プライマーがCT
pB4.S2（配列番号１２）とCTpB4.S2.1（配列番号１３）
から選択された一組のプライマーを用いて前記のサンブ
ルを処理するステップと、 （ｂ）増幅生成物の検出がトラコーマクラミジアの存在
を表す、増幅核酸生成物の検出ステップと からなるサンプル中のトラコーマクラミジアの存在の有
無を検出するための方法。 - 【請求項１５】 前記の核酸増幅反応が鎖置換増幅反応
（ＳＤＡ）であることを特徴とする請求項１４に記載の
サンプル中のトラコーマクラミジアの存在の有無の検出
法。 - 【請求項１６】 前記のＳＤＡ反応がCTpB4.B1（配列番
号１１）およびCTpB4.B2（配列番号１４）をバンパーと
して利用する請求項１５に記載のサンプル中のトラコー
マクラミジアの存在の有無の検出法。 - 【請求項１７】 前記の増幅核酸生成物の検出を、該増
幅核酸生成物とCTpB4.D1（配列番号１５）、配列番号１
５に相補する核酸、CTpB4.D2（配列番号１６）、配列番
号１６に相補する核酸、CtpB4.FD1（配列番号１７）お
よび配列番号１７に相補する核酸からなるグループから
選択される検出用配列とのハイブリッド形成により実施
する請求項１４に記載のサンプル中のトラコーマクラミ
ジアの存在の有無の検出法。 - 【請求項１８】 サンプル中のトラコーマクラミジアの
存在の有無を検出するための方法であって、 （ａ）核酸増幅反応中に、第一のプライマーがCtpF8.AL
1（配列番号２０）とCtpF8.AL2（配列番号２１）からな
るグループから選択され、第二のプライマーがCtpF8.AR
l（配列番号２２）、CtpF8.AR2（配列番号２３）および
CtpF8.AR3（配列番号２４）からなるグループから選択
される一組のプライマーを用いて前記のサンプルを処理
するステップと、 （ｂ）増幅生成物の検出がトラコーマクラミジアの存在
を表す、増幅核酸生成物の検出ステップとからなるサン
プル中のトラコーマクラミジアの存在の有無を検出する
ための方法。 - 【請求項１９】 前記核酸増幅反応が鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）反応であることを特徴とする請求項１８に記載のサ
ンプル中のトラコーマクラミジアの存在の有無を検出す
るための方法。 - 【請求項２０】 前記ＳＤＡ反応がCtpF8.BL（配列番号
１８）およびCtpF8.BR（配列番号１９）をバンパーとし
て利用することを特徴とする請求項１９に記載のサンプ
ル中のトラコーマクラミジアの存否を検出するための方
法。 - 【請求項２１】 前記の増幅核酸生成物の検出を、該増
幅核酸生成物とCtpF8.D1L（配列番号２５）、配列番号
２５に相補する核酸、CtpF8.D2L（配列番号２６）、配
列番号２６に相補する核酸、CtpF8.D3L（配列番号２
７）、配列番号２７に相補する核酸、CtpF8.D4L（配列
番号２８）、配列番号２８と相補する核酸、CtpF8.FD1
（配列番号２９）および配列番号２９に相補する核酸か
らなるグループから選択される検出用配列とのハイブリ
ッド形成により実施する請求項１４のサンプル中のトラ
コーマクラミジアの存在の有無の検出法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/963927 | 1997-11-04 | ||
| US08/963,927 US6096501A (en) | 1997-11-04 | 1997-11-04 | Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis crytpic plasmid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11221088A true JPH11221088A (ja) | 1999-08-17 |
| JP4387479B2 JP4387479B2 (ja) | 2009-12-16 |
Family
ID=25507910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31279898A Expired - Lifetime JP4387479B2 (ja) | 1997-11-04 | 1998-11-04 | トラコーマクラミジア潜在プラスミドの増幅および検出による、トラコーマクラミジアの検定 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6096501A (ja) |
| EP (1) | EP0915170B1 (ja) |
| JP (1) | JP4387479B2 (ja) |
| DE (1) | DE69814559T2 (ja) |
| ES (1) | ES2197412T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017170376A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 和光純薬工業株式会社 | クラミジア・トラコマティス検出用プライマーセット及びこれを用いたクラミジア・トラコマティス検出方法、並びにそのための試薬キット |
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|---|---|---|---|---|
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| DE10123183A1 (de) * | 2000-05-18 | 2001-11-22 | Becton Dickinson Co | Modifizierte Amplifikationsprimer und ihre Verwendung |
| US6682889B1 (en) | 2000-11-08 | 2004-01-27 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of organisms of the Chlamydiaceae family |
| AU2002303645A1 (en) * | 2001-05-04 | 2002-11-18 | Axiom Biotechnologies, Inc. | Matrix assays in genomically indexed cells |
| WO2003008624A2 (en) * | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Nucleic acid amplification using nicking agents |
| CA2492007A1 (en) * | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Amplification of nucleic acid fragments using nicking agents |
| CN101305101A (zh) * | 2005-11-07 | 2008-11-12 | 西门子医疗保健诊断公司 | 沙眼衣原体特异性寡核苷酸序列 |
| CN100352943C (zh) * | 2006-04-14 | 2007-12-05 | 武汉大学 | 快速检测沙眼衣原体的荧光定量pcr试剂盒 |
| NL1033345C1 (nl) | 2007-02-06 | 2008-08-07 | Vereniging Voor Christelijk Ho | Werkwijze voor het detecteren van Chlamydia trachomatis en een kit daarvoor. |
| CN102918155B (zh) | 2010-03-23 | 2015-12-16 | 和光纯药工业株式会社 | 沙眼衣原体检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法 |
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1997
- 1997-11-04 US US08/963,927 patent/US6096501A/en not_active Expired - Lifetime
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1998
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| JPWO2017170376A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2019-02-07 | 富士フイルム和光純薬株式会社 | クラミジア・トラコマティス検出用プライマーセット及びこれを用いたクラミジア・トラコマティス検出方法、並びにそのための試薬キット |
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