CN101305101A - 沙眼衣原体特异性寡核苷酸序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及扩增引物和检测探针的寡核苷酸序列，并涉及它们在生物样品中沙眼衣原体的选择性和特异性检测的核酸扩增方法中的用途。本发明还提供了以试剂盒形式的寡核苷酸引物集和引物/探针集，用于衣原体感染的检测和诊断。本发明的寡核苷酸引物和探针也可以与其他特异性寡核苷酸引物和探针组合使用，用于同时检测沙眼衣原体和其他目标有机体，例如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)。

Description

沙眼衣原体特异性寡核苷酸序列
相关的申请
[1]本申请要求2005年11月7日提交的标题为“沙眼衣原体特异性寡核苷酸序列”的临时申请NO.60/734,155的优先权。该临时申请通过完全引用合并在此。
发明背景
[2]衣原体是对各种各样的重要的人类和动物感染负责的分布广泛的细胞内细菌性病原体。衣原体是专性的、非运动的革兰氏阴性细菌，特征是独特的双相性生命周期，具有功能上和形态上不同的二态的形式。衣原体科的四个主要物种之一的沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)几乎是专有的人类病原体，它是世界上性传播的疾病和可预防的失明的最常见原因。沙眼衣原体存在15种不同的血清型，包括引起沙眼(一种双侧性角膜炎，其主要在非洲、中东和亚洲影响超过4亿人)的血清型A、B、Ba和C；血清型D到K，其导致包涵体结膜炎和生殖道感染；以及血清型L1到L3，其与性病性淋巴肉芽肿(在美国和欧洲少有的、但在热带国家占患有生殖器溃疡疾病的患者的2-10％的性传播的疾病)相关。
[3]生殖器衣原体感染是在西方世界最常见的性传播疾病(STD)，是在美国最流行的细菌性STD。在2002年，超过800,000例新的生殖器衣原体病例被报告给CDC，超过了美国所有其他的应报告的疾病(疾病控制和预防中心，“性传播的疾病监督，2002”，美国卫生与人类服务署，亚特兰大，乔治亚州，2003年9月)。漏报是相当数量的，因为女性中多达70-80％的感染和男性中大约50％的感染是临床上沉默的(H.D.Davies等人，CMAJ，1996，153：1631-1644；S.D.Hillis等人，Sex.Transm.Dis.，1995，22：197-202；A.C.Gerbase等人，Sex.Transm.Infect.，1998，74：S12-S14；A.C.Gerbase等人，Lancet，1998，351：2-4)。未被识别和未被治疗，细菌可以在宿主中保持传染性达数月。沙眼衣原体感染的无症状特征可能促进它在风险群体中的传播并促进感染的储藏(reservoir)(S.E Thompson and A.E.Washington，Epidemiol.Rev.，1983，5：96-123；T.Ripa，Scand.J.Infect.Dis.Suppl.，1990，69：157-167)。
[4]当它们存在时，女性中的衣原体感染的症状包括增多的阴道排出物、性交后和/或经期出血、下腹疼痛和排尿困难(B.A.Cromer and F.P.Head，Sex.Transm.Dis.，1987，14：125-129；S.M.Garland and B.Johnson，Med.J.Austral.，1989，150：174-177；G.R.Scott等人，Br.J.Obstet Gynaecol.，1989，96：473-477；C.K.Malotte等人，Am.PublicHealth，1990，80：469-471；P.Oakeshott等人，Fam.Pract.，1992，9：421-424；J.T.Humphreys等人，Sex.Transm.Dis.，1992，19：47-53)。由感染的母亲生产的婴儿存在着结膜炎和肺炎的风险。在男性中，症状包括尿道分必物和排尿困难(J.Schachter，N.Engl.J.Med.，1978，298：428-435)。如果不治疗，衣原体感染可能发展到严重的生殖问题和其他健康问题，具有短期和长期的后果。与疾病本身一样，衣原体导致的损坏通常是“沉默的”。在女性中，未治疗的感染可以转播到子宫和/或输卵管，并引起骨盆炎症性疾病(N.S.Padian and A.E.Washington，Ann.Epidemiol.，1994，4：128-132)。这发生于具有未治疗的衣原体的40％的女性中。骨盆炎症性疾病(PID)可以引起对输卵管、子宫和周围组织的永久性损伤，其可以引起慢性的骨盆疼痛、不育和潜在致死的宫外孕(W.Cates Jr等人，Am.J.Obstet.Gynecol.，1991，164：1771-1781；J.Coste等人，Fertil.Steril.，1994，62：289-295；L.
Figure A20068004141700121
and P.Wolner-Hansen，Genitourin.Med.，1993，69：9-17)。在男性中，未治疗的衣原体可以引起前列腺炎、尿道的伤疤、不育和附睾炎。虽然患有任何性传播疾病的患者处于另一种STD的共感染的提高风险之中，衣原体和淋病的共感染是最常见的。具有衣原体感染的百分之四十(40％)和女性和20％的男性被淋病共感染。衣原体感染还被报告与发生子宫颈癌症的提高的风险相关(S.Hillis等人，Sex.Transm.Dis.，1995，22：197-202；T.Anttila等人，JAMA，2001，286：47-51)。
[5]由于衣原体感染的洽愈性抗生素治疗是易于获得和便宜的，早期诊断是控制这些感染的公共卫生程序的重要部分。早期检测的目标包括中断传播链和预防长期的后遗症(J.Paavonen等人，Obstet.Gynecol.，1998，92：292-298)。如果暴露，具有生殖器衣原体感染的患者也处于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的提高的风险中。通过早期诊断和治疗来缩短传染性的持续时间对于降低HIV感染的风险具有主要影响。
[6]细胞培养物中沙眼衣原体的分离已经是实验室诊断的传统方法，由于它的特异性而仍然是法医学样本的所选方法。然而，这种方法需要昂贵的设备、技术专家和严格的运输条件以保持样本生存力；它还具有2到3天的周转时间。在许多情况中，细胞培养已经被基于抗原检测的更快速的测试替代，通过直接的荧光抗体染色、酶免疫测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)，其较少需要转运要求并可以在同一天内提供结果。然而，这些方法仍然是费力和耗时的，并其更重要地，缺乏筛选分析的敏感性，特别是对于无症状的患者。
[7]近年来，基于核酸的杂交探针测试已经被开发用于沙眼衣原体的直接检测(R.Warren等人，J.Clin.Microbiol.，1993，31：1663-1666)。这些测试提供了更高的特异性，但对敏感性没有实质上的改善。此外，大多数这些测试是对子宫颈内或尿道的样本进行的，其是使用侵入性采样方法获得的。基于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、分支DNA或转录介导的扩增(TMA)技术的核酸扩增分析是现在可获得的(M.Buimer等人，J.Clin.Microbiol.，1996，34：2395-2400；M.A.Chernesky等人，Mol.and Cell Probes，1996，11：243-249；T.C.Quinn等人，J.Clin.Microbiol.，1996，34：1401-1406；G.L.Ridgway等人，J.Clin.Pathol.，1996，49：116-119；C.M.Black，Clin.Microbiol.Rev.，1997，10：160-184；K.A.Crotchfelt等人，J.Clin.Microbiol.，1997，35：1536-1540；P.O.Davies and G.L.Ridgway，Int.J.STD AIDS，1997，8：731-738；L.Grun等人，NMJ，1997，315：226-230；K.A.Crotchfelt等人，J.Clin.Microbiol.，1998，36：391-394；C.A.Gaydos等人，J.Infect.Dis.，1998，177：417-424；R.Pasternack等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，1999，18：142-144)。除了就周围样本转运、批次自动化和快速处理时间而言提供非培养测试的所有益处之外，这些分析提供了更高的特异性和接近100％的敏感性。此外，它们可以对较低侵入性的临床样本例如尿液来进行(J.E.Bauwens等人，J.Clin.Microbiol.，1993，31：3013-3116；M.Domeika等人，J.Clin.Microbiol.，1994，32：2350-2352；M.A.Chernesky等人，J.Clin.Microbiol.，1994，32：2682-2685；H.H.Lee等人，Lancet，1995，345：213-216；M.Bassiri等人，J.Clin.Microbiol.，1995，33：898-900；T.C.Quinn等人，J.Clin.Microbiol.，1996，34：1401-1406；R.Pasternack等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，1999，18：142-144；K.Templeton等人，Int.J.STD AIDS，2001，12：793-796；R.A.McCartney等人，Br.J.Biomed.Sci.，2001，58：235-238；L.A.Cosentino等人，J.Clin.Microbiol.，2003，41：3592-3596)。所有这些益处使得核酸扩增分析特别适合于无症状衣原体感染的检测以及作为筛选工具。
[8]然而，用于衣原体检测的现有的核酸扩增分析仍然展现了某些缺点和局限。虽然这些分析已经被设计以最小化污染，仍然存在这阻碍来以这种相对新的技术替换较低敏感性的测试。主要的考虑包括由于某些样本中存在扩增抑制物引起的假阴性结果，以及由于如果没有应用严格的质量控制操作的交叉污染的假阳性结果。其他考虑包括不能以相等的效力、成本和样品通量检测所有血清型的沙眼衣原体。明显地，用于检测衣原体感染的改进的核酸扩增分析的开发仍然是高度希望的。
发明概述
[9]本发明涉及用于生物样品中沙眼衣原体的快速、选择性和特异性检测的系统。具体地，本发明涵盖可用于开发检测和诊断衣原体感染的核酸扩增测试的试剂。更具体地，本发明提供了扩增引物的寡核苷酸序列以及用于沙眼衣原体的隐性质粒(cryptic plasmid)中任一目标核酸序列链的检测的检测探针。某些本发明的寡核苷酸序列具有识别沙眼衣原体的所有十五种血清型的优点。
[10]在某些实施方式中，作为引物集和引物/探针集来提供寡核苷酸序列，其可被用于包括涉及实时和多路(multiplex)检测的各种核酸扩增分析的任一种中。
[11]本发明还提供了在测试样品中检测沙眼衣原体的方法。一般地，这种方法包括用至少一种本发明的寡核苷酸接触怀疑含有沙眼衣原体核酸的测试样品，从而如果样品中存在沙眼衣原体核酸，所述寡核苷酸可以与沙眼衣原体核酸杂交；并检测与所述沙眼衣原体核酸杂交的任何寡核苷酸，其中与沙眼衣原体核酸杂交的寡核苷酸的检出表明样品中沙眼衣原体的存在。
[12]本发明的其他方法包括用在此描述的至少一种引物集或引物/探针集和扩增反应试剂接触怀疑含有沙眼衣原体核酸的测试样品以形成反应混合物。所述反应混合物然后置于扩增条件之下以扩增沙眼衣原体核酸，如果测试样品中存在沙眼衣原体核酸，并产生扩增产物。产生的扩增产物可以使用各种检测技术来检测。在某些实施方式中，利用本发明的检测探针形成扩增产物/探针杂交物，这种杂交物的检出表明测试样品中存在沙眼衣原体。
[13]另外，本发明的扩增引物和检测探针的寡核苷酸序列可以与处于核酸扩增形式的其他特异性引物和探针组合使用，用于同时检测沙眼衣原体和其他目标有机体。在某些实施方式中，本发明的扩增引物和检测探针与淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)特异性引物和探针组合使用，用于同时检测沙眼衣原体和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)。
[14]还提供了包含根据本发明的扩增引物和检测探针、任选地包含扩增反应试剂的试剂盒，用于检测测试样品中的衣原体感染。
[15]本发明的这些和其他目的、益处和特征对于阅读了以下的优选实施方式的详细说明的普通技术人员而言将是显而易见的。
图标的简要说明
[16]表1显示了来自沙眼衣原体隐性质粒L1血清型的本发明的沙眼衣原体特异性扩增引物序列和检测探针序列的实例。每个寡核苷酸的作图位置和SEQ ID NO.在表中示出。
[17]表2显示了可以用于多路检测形式分析的沙眼衣原体特异性扩增引物序列和检测探针的实例。
[18]附图3显示了用于测试十五(15)种不同沙眼衣原体(CT)血清型和四十六(46)种不同淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)(GC)分离物的多路TaqMan kPCR分析的结果(分析的实验细节参见实施例1)。
[19]表4是74中近相关的有机体的列表，对于它们，CT/GC多路PCR主混合物没有显示交叉反应性。
定义
[20]在整个说明书中，采用了以下段落中定义的一些术语。
[21]术语“个体”、“受试者”和“患者”在此可互换地使用。它们是指可以作为沙眼衣原体的宿主、但可能被或可能未被所述细菌感染的人类。该术语不指示特定的年龄，因而涵盖了成年人、儿童、新生儿以及胎儿。
[22]如在此使用的，术语“测试样品”是指怀疑含有沙眼衣原体核酸的任何液体或固体材料。测试样品可以是、或可以来自任何可以含有沙眼衣原体核酸的生物组织或液体。通常，样品将是“临床样品”，即，从要测试衣原体感染的患者获得或分离的样品。这种样品包括但不限于含有细胞材料并且可以或可以不含有细胞的体液，例如，血液、血浆、血清、尿液、精液、唾液、眼睛晶状体液、淋巴液、羊水，等等；子宫颈内的、尿道的、直肠的、阴道的、外阴-阴道的、鼻咽的和肺部的样品；以及具有已知的诊断结论的存档样品。测试样品还可以包括组织的切片，例如冷冻的切片。术语“测试样品”还涵盖通过加工生物样品衍生的任何材料。衍生的材料包括但不限于从样品分离的细胞(或它们的子代)、细胞成分、以及从样品提取的核酸分子。获得测试样品的生物样品的加工可以包括一种或多种的：过滤、蒸馏、离心、提取、浓缩、稀释、纯化、钝化干扰成分、添加试剂，等等。
[23]术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在此可互换地使用。它们是指处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有说明，包括可以与天然发生的核苷酸按类似方式起作用的天然核苷酸的已知类似物。该术语涵盖具有合成的主干的核酸样结构，以及扩增产物。
[24]如在此使用的，术语“寡核苷酸”是指可以用作扩增引物或检测探针的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的短的串列。这种短的核酸序列延伸通常是化学合成的，然而，它们可以通过任何其他适合的方法来制备。本领域技术人员将理解的是，寡核苷酸的长度(即，核苷酸的数目)可以广泛地变化，常常取决于它预期的功能或用途。一般地，寡核苷酸包含5到300个之间的核苷酸，例如约15到约100个核苷酸之间，或约15到约50个核苷酸之间。
[25]术语“分离的”当涉及寡核苷酸时是指寡核苷酸，根据它的来源或操作，分离自与之天然相关的至少某些成分。“分离的”，可选择地或另外地，是指感兴趣的寡核苷酸是通过人的手产生或合成的。
[26]在此关于寡核苷酸(例如，在此提供的寡核苷酸)所使用的术语“活性片段”是指任何核酸分子，其包含足够同源于或来自于所述寡核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列，其包括比所述全长寡核苷酸更少的核苷酸并且保持了完整序列的至少一种生物学性质。一般地，活性片段包括具有全长寡核苷酸的至少一种活性的序列。本发明的寡核苷酸序列的活性片段或部分可以是核酸分子，其长度是例如10、15、20、25、30或更多核苷酸，并且可以用作扩增引物和/或检测探针用于生物样品中沙眼衣原体的检测。
[27]当关于寡核苷酸的活性片段在此使用时，术语“足够同源”是指核酸分子，其具有与所述寡核苷酸相比至少35％的序列同源性。在某些实施方式中，所述序列同源性是至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
[28]术语“同源性”和“同一性”在此可互换地使用，是指两个核酸分子之间的序列相似性。两个核酸序列的同源性或同一性百分比的计算可以通过为最佳比较的目的比对两个序列来进行(例如，可以在第一和第二核酸序列之一或两者中引入缺口用于最佳的比对，为了比较的目的可以忽视非同源序列)。在某些实施方式中，为比较目的比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置的相同核苷酸占据时，则分子在该位置是同一的(或同源的)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一的位置的数量的函数，考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口的数量、每个缺口的长度。
[29]可以使用数学算法来完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用Meyers和Miller的算法(CABIOS，1989，4：11-17)来测定，其已经被合并到ALIGN程序(版本2.0)中，使用PAM120加权残基表，12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。做为选择，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序来测定，使用NWSgapdna.CMP矩阵。
[30]术语“杂交”是指核苷酸序列之间复合物的形成，所述核苷酸序列是足够互补的，以经由Watson-Crick碱基配对或非标准碱基配对形成复合物。当引物与目标序列(模板)杂交时，这种复合物(或杂交物)是足够稳定的，以提供例如DNA聚合酶所需的启动(priming)功能来启动DNA合成。要理解的是，杂交序列不必具有完美的互补性来提供稳定的杂交物。在许多情况下，稳定的杂交物将在少于10％的碱基错配的情况下形成。因而，如在此使用的，术语“互补的”是指在分析条件下与其互补物形成稳定双链体的寡核苷酸，一般其中有约90％或更高的同源性。本领域技术人员了解如何估计和调节杂交条件的严格度，从而具有至少期望水平的互补性的序列将稳定地杂交，而具有更低互补性的那些序列不会杂交。对于杂交条件和参数的实例，参见，例如，J.Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，1989，Second Edition，Cold Spring Harbor Press：Plainview，NY；F.M.Ausubel，“Current Protocols in Molecular Biology”，1994，John Wiley&Sons：Secaucus，NJ。
[31]如在此使用的，术语“扩增”是指提高样品中特定核酸序列群体的存在的方法。扩增方法(例如聚合酶链式反应或PCR)是本领域已知的，以下更详细地讨论。
[32]如在此使用的，术语“目标序列”是指要检测的特定核酸序列。优选的，目标序列包括寡核苷酸引物将与之复合的核酸序列。目标序列也可以包括探针杂交区域，探针将与所述探针杂交区域在期望的条件下形成稳定的杂交物。本领域普通技术人员将认识到的是，目标序列可以是单链或双链的。在本发明的上下文中，感兴趣的目标序列处在沙眼衣原体的隐性质粒中。
[33]术语“引物”和“扩增引物”在此可互换地使用。它们是指一种寡核苷酸，当处于适合的条件(例如，缓冲液、盐、温度和pH值)下，在存在核苷酸和用于核酸聚合化的试剂(例如，DNA依赖性或RNA依赖性聚合酶)的情况下，其可以作为引物延伸产物的合成的起始点。为了扩增中的最大效力，引物优选的是单链的，但作为选择可以是双链的。如果是双链的，在用于制备延伸产物之前，引物可以首先被处理(例如，变性)以容许它的链的分离。这种变性步骤一般使用热量来进行，但做为选择可以使用碱来进行，随后中和。典型的引物在序列的长度上含有与目标序列基本上互补的约10到约35个核苷酸。然而，引物也可以含有其他序列。例如，用于链置换扩增(SDA)的扩增引物优选的在目标结合序列的5′的位置包括限制性内切酶识别位点(参见，例如，美国专利NO.5,270,184和5,455,166)。基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持的序列复制(3SR)和转录介导的扩增(TMA)引物优选的包括与引物的目标结合序列连接的RNA聚合酶启动子。将这些专门化的序列连接到用于所选扩增反应的结合目标序列的方法是本领域公知的。
[34]术语“正向引物”和“正向扩增引物”在此可互换地使用，是指相对于反向引物与目标序列5′杂交(或退火)的引物。术语“反向引物”和“反向扩增引物”在此可互换地使用，是指相对于正向引物与目标序列3′杂交(或退火)的引物。
[35]如在此使用的，术语“扩增条件”是指促进引物序列的退火和/或延伸的条件。这种条件是本领域公知的，取决于所选的扩增方法。因而，例如，在PCR反应中，扩增条件一般包括热循环，即，反应混合物在两种或多种温度之间的循环。在等温扩增反应中，没有热循环地发生扩增，虽然可能需要初始的温度提高来启动反应。扩增条件涵盖所有反应条件，包括但不限于温度和温度循环、缓冲液、盐、离子强度、以及pH值，等等。
[36]如在此使用的，术语“扩增反应试剂”是指核酸扩增反应中使用的试剂，可以包括但不限于，缓冲液、具有逆转录酶和/或聚合酶活性或核酸外切酶活性的酶；酶辅助因子，例如镁或锰；盐；烟酰胺腺嘌呤二核酸(NAD)；和三磷酸脱氧核苷(dNTP)，例如三磷酸脱氧腺苷，三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷和三磷酸胸苷。扩增反应试剂可以由本领域技术人员取决于使用的扩增方法容易地选择。
[37]术语“探针”和“检测探针”在此可互换地使用，是指在合适的条件能够选择性地与目标序列的至少一部分杂交的寡核苷酸。一般地，探针序列被鉴定为“互补”于编码链或有义链，或“反向互补”于编码链或有义链。在某些优选的实施方式中，检测探针用可检测部分来标记。
[38]术语“标记的”或“用可检测试剂(或部分)标记的”在此可互换地使用，来指出，例如在与另一个实体(例如，扩增反应产物或扩增子)结合之后，实体(例如，寡核苷酸检测探针)可以被显现。优选的，选择可检测试剂或部分，从而它产生可以被测量的信号，信号的强度与结合的实体的数量相关(例如，成比例)。用于标记和/或检测核酸分子的各种各样的系统是本领域公知的。标记的核酸可以通过掺入、或结合于标记来制备，所述标记是可通过分光镜的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电学的、光学的或化学的方法直接或间接检测的。适合的可检测试剂包括但不限于，放射性核素、荧光基团、化学发光试剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标、和适体信标。
[39]术语“荧光团”、“荧光部分”和“荧光染料”在此可互换地使用。它们是指在一个波长吸收电磁辐射的量子、在不同的、一般更长的波长下响应发射一种或多种光子的分子。各种各样结构和特征的大量荧光染料适合用于本发明的实践。用于荧光标记核酸分子的方法和材料是已知的(参见，例如R.P.Haugland，“Molecular Probes：Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994”，5th Ed.，1994，Molecular Probes，Inc.)。优选的，荧光部分以高效率吸收并发射光(即，它在使用的激发波长下具有高摩尔吸光系数，和高荧光量子产量)，并且是不感光的(即，在进行分析所需的时间内在光激发时它不经历显著的降解)。不是自身可直接被检测的，某些荧光染料在荧光共振能量传递(FRET)的过程中将能量转移到另一个荧光染料，该第二染料产生检测信号。这种FRET荧光染料对也被术语“荧光部分”涵盖。物理上连接的荧光报告物/淬灭剂部分的使用也在本发明的范围内。在这些实施方式中，当荧光报告物或淬灭剂部分保持紧密接近时，例如处在核酸探针的末端，淬灭剂部分阻止了来自报告物部分的荧光信号的检测。当两个部分物理上分离时，例如，在被Taq DNA聚合酶裂解之后，来自报告物部分的荧光信号变得可检测。
[40]术语“可直接检测的”，当在此涉及标记或可检测部分使用时，是指标记或可检测部分不需要进一步的反应或操作来成为可检测的。例如，荧光部分是通过荧光光谱方法可直接检测的。术语“可间接检测的”，当在此涉及标记或可检测部分使用时，是指标记或可检测部分在进一步的反应或操作之后变成为可检测的。例如，在与附着于报告物如荧光染料的合适的抗体反应之后，半抗原变成为可检测的。
优选实施方式的详细说明
[41]如上所述，本发明涉及用于特异性和选择性地检测生物样品中的沙眼衣原体的方法和试剂。在某些实施方式中，本发明的方法利用沙眼衣原体特异性寡核苷酸序列和敏感的基于核酸扩增的技术，其容许检测含有甚至少量细菌的样品中的沙眼衣原体。
I-扩增引物和检测探针的寡核苷酸序列
发明的寡核苷酸序列
[42]在一个方面，本发明提供了寡核苷酸序列，其可以用于沙眼衣原体的隐性质粒中目标序列的任一链的特异性检测的核酸扩增测试。
[43]沙眼衣原体的7,493碱基对隐性质粒是衣原体感染的基于DNA的诊断的良好目标，因为它对该有机体是特异性的，并且以每个基因组约7-10个拷贝在基本上所有的临床菌株中存在(J.E.Tam等人，Plasmid，1992，27：231-236)。所有来自人类沙眼衣原体分离物的质粒是极其相似的，具有低于1％的核苷酸序列变异。沙眼衣原体的隐性质粒的完整DNA内容已经被测序(K.S.Sriprakash and E.S.Macavoy，Plasmid，1987，18：205-214；C.Hatt等人，Nucleic Acids Res.，1988，16：4053-4067；M.Comanducci等人，Mol.Microbiol.，1988，2：531-538；M.Comanducci等人，Plasmid，1990，23：149-154；N.S.Thomas and I.N.Clarke，Proc.2nd Meeting Eur.Soc.Chlamydia Res.1992，p.42，SocietaEditrice Esculapio：Bologna，Italy)并被保存在GenBank(Accession#X06707)中。
[44]本发明的寡核苷酸序列特异于沙眼衣原体的隐性质粒中的目标序列。更具体地，本发明提供了扩增引物和检测探针的寡核苷酸序列，其识别沙眼衣原体的一种或多种血清型。在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸序列识别沙眼衣原体的所有十五种血清型。本发明的示范性的寡核苷酸序列在表1和表2中示出(SEQ ID NO：1到41)，连同它们相应的作图位置。这些序列是本申请人利用载体NTI、ABI引物表达和Oligo6软件程序通过与沙眼衣原体隐性质粒pLGV440序列的序列比对鉴定的。
[45]本领域技术人员将理解的是，用于沙眼衣原体的扩增、检测或定量的在此公开的任何寡核苷酸序列(或其活性片段)可以被采用作为检测探针或扩增引物，取决于预期的用途或分析形式。例如，在一个分析中用作扩增引物的发明的寡核苷酸序列可以在另一个分析中用作检测探针。给出的序列可以被修饰，例如，通过在发明的寡核苷酸序列上附着所选扩增方法所需的专门化序列(例如，启动子序列)，或通过连接荧光染料以便于检测。还要理解的是，根据本发明的寡核苷酸可以包括一种或多种序列，所述序列可以充当间隔区、接头、用于标记或结合到酶的序列、可以为所述寡核苷酸赋予对降解过程增加的稳定性或敏感性或其他期望性质的序列。
[46]根据本发明所提供的寡核苷酸序列，可以制备一种或多种寡核苷酸类似物(参见下文)。这种类似物可以含有可选择的结构，例如肽核酸或“PNA”(即，具有肽样主干代替天然发生核酸的磷酸盐糖类主干的分子)等等。这些表现了本发明的序列的可选择的结构也是本发明的部分。类似地，理解的是，由本发明的序列构成的寡核苷酸可以含有核酸碱基的删除、添加和/或替换，达到这样的改变不消极地影响核酸分子的性质的程度。特别地，所述改变应当不引起寡核苷酸的杂交性质的显著降低。
引物集和引物/探针集
[47]在另一个方面，本发明涉及在此公开的寡核苷酸序列的组合，用于检测生物样品中的沙眼衣原体。更具体地，本发明提供了引物集和引物/探针集。
[48]如在此使用的，术语“引物集”是指两种或多种引物，其在一起能够启动感兴趣核苷酸序列(例如，沙眼衣原体的隐性质粒内的目标序列)的扩增。在某些实施方式中，术语“引物集”是指包括正向引物和反向引物的一对引物。这种引物集或引物对在PCR扩增反应中是特别有用的。
[49]包含正向扩增引物和反向扩增引物的引物集的实例包括：
引物集1，其包括包含SEQ ID NO：1(5′-GGATACTCATCAGGCGTTCCTAAT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：2(5′-CCCATACCACACCGCTTTCT-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集2，其包括包含SEQ  ID  NO  ：5(5′-TGTGACCTTCATTATGTCGGAGTCT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：6(5′-GTTCTCTCAAGCAGGACTACAAGCT-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集3，其包括包含SEQ ID NO：9(5′-GCTCCGGATAGTGAATTATAGAGACTAT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：10(5′-AGATCGTCTGTGCGCAAAG-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集4，其包括包含SEQ ID NO：13(5′-TTTGCGCACAGACGATCTA-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：14(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集5，其包括包含SEQ ID NO：16(5′-GAGCACCCTAGGCGTTTGT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：17(5′-CGTTCTCTCAAGCAGGACTACA-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集6，其包括包含SEQ ID NO：20(5′-GGATGCAACTTGGCCCAAT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：21(5′-GACACTAGCCCCCAATCCA-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集7，其包括包含SEQ ID NO：23(5′-AATTTTGTCTTTGCGCACAG-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：24(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集8，其包括包含SEQ ID NO：26(5′-TGTCTTTGCGCACAGACGA-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：27(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集9，其包括包含SEQ ID NO：29(5′-TGCGCACAGACGATCTATTT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：30(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集10，其包括包含SEQ ID NO：32(5′-TCTTTGCGCACAGACGATC-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：33(5′-TGCAACTCCTCCATTAAGCTG-3′)或其任何活性片段的反向引物；
引物集11，其包括包含SEQ ID NO：35(5′-TGCGCACAGACGATCTATTT-3′)或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO：36(5′-TGCAACTCCTCCATTAAGCTG-3′)或其任何活性片段的反向引物。
[50]本发明还提供了可以用于多路形式分析的引物集。这种引物集的实例是：
引物集CT(mpx)，其包括包含SEQ ID NO：38(5′-AGCCCTACGCCATTAGTTATGG-3′)或其任何活性片段的第一正向引物，包含SEQ ID NO：39(5′-GCCCTACGCGATTAGTTATGG-3′)或其任何活性片段的第二正向引物，以及包含SEQ ID NO：40(5′-CCCATACCACACCGCTTTCT-3′)或其任何活性片段的反向引物。
[51]这些引物集可以根据任何核酸扩增技术来使用，所述核酸扩增技术采用两种或多种寡核苷酸来扩增目标序列(如以下讨论的)。使用发明的引物集产生的扩增产物可以使用本领域公知的各种检测方法来检测。例如，扩增产物可以使用琼脂糖凝胶电泳、通过溴化乙锭染色来可视化、并暴露于紫外(UV)线来检测，或通过扩增产物的序列分析来确认沙眼衣原体身份。
[52]做为选择，可以使用多种的同质的或异质的方法采用探针序列来检测扩增产物。一般地，在所有这些方法中，探针与扩增产物的链(或扩增子)杂交来形成扩增产物/探针杂交物。因而可以直接或间接地检测杂交物，例如利用在引物、探针、或引物和探针两者上的标记。
[53]如在此使用的，术语“引物/探针”是指包含两种或多种引物、以及可以检测目标序列的至少一种探针的组合，所述两种或多种引物在一起能够启动感兴趣的核苷酸序列(例如，沙眼衣原体的隐性质粒内的目标序列)的扩增。探针可以与扩增产物(或扩增子)的链杂交来形成扩增产物/探针杂交物以容许扩增子的检测。
[54]因而，本发明提供了引物/探针集，其可以根据核酸扩增操作使用来特异性扩增和检测测试样品中的沙眼衣原体目标序列。发明的引物/探针集包含如上所述的引物集和至少一种检测探针。所述检测探针可以包含可检测部分。在某些实施方式中，所述检测探针包含附着在5′末端的荧光部分和附着在3′末端的淬灭剂。
[55]引物/探针集的实例包括：
引物/探针集CT1，其包括包含SEQ ID NO：1(5′-GGATACTCATCAGGCGTTCCTAAT-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：2(5′-CCCATACCACACCGCTTTCT-3′)或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO：3(5′-GACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTT-3′)或其活性片段的互补检测探针，和包含SEQ ID NO：4(5′-AACCGCCTACACGTAATGAATACGTTGTCG-3′)或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT2-P1，其包括包含SEQ ID NO：5(5′-TGTGACCTTCATTATGTCGGAGTCT-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：6(5′-GTTCTCTCAAGCAGGACTACAAGCT-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：7(5′-CCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGC-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT2-P2，其包括包含SEQ ID NO：5(5′-TGTGACCTTCATTATGTCGGAGTCT-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：6(5′-GTTCTCTCAAGCAGGACTACAAGCT-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：8(5′-ACCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGC-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT3，其包括包含SEQ ID NO：9(5′-GCTCCGGATAGTGAATTATAGAGACTAT-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：10(5′-AGATCGTCTGTGCGCAAAG-3′)或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO：11(5′-CAAGGGATCCGTAAGTTAGACGAAATTTTG-3′)或其活性片段的互补检测探针，和包含SEQ ID NO：12(5′-CAAAATTTCGTCTAACTTACGGATCCCTTG-3′)或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT4，其包括包含SEQ ID NO：13(5′-TTTGCGCACAGACGATCTA-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：14(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：15(5′-TTTGCATCCAATCAGATTTCCTTTCGCATTA-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT5，其包括包含SEQ ID NO：16(5′-GAGCACCCTAGGCGTTTGT-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：17(5′-CGTTCTCTCAAGCAGGACTACA-3′)或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO：18(5′-CAGCGGTTGCTCGAAGCACGTG-3′)或其活性片段的互补检测探针，和包含SEQ ID NO：19(5′-CACGTGCTTCGAGCAACCGCTG-3′)或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT6，其包括包含SEQ ID NO：20(5’-GGATGCAACTTGGCCCAAT-3’)或其活性片段的正向引物，包含SEQID NO：21(5′-GACACTAGCCCCCAATCCA-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：22(5′-TGCTGACCTAGACCCGCAATCCA-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT7，其包括包含SEQ ID NO：23(5′-AATTTTGTCTTTGCGCACAG-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：24(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：25(5′-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT8，其包括包含SEQ ID NO：26(5′-TGTCTTTGCGCACAGACGA-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：27(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：28(5′-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT9，其包括包含SEQ ID NO：29(5′-TGCGCACAGACGATCTATTT-3′)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：30(5′-ACTCCTCCATTAAGCTGATAGGA-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：31(5′-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3′)或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT10，其包括包含SEQ ID NO：32(5′-TCTTTGCGCACAGACGATC-3’)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：33(5′-TGCAACTCCTCCATTAAGCTG-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：34(5′-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3′)或其活性片段的互补检测探针；和
引物/探针集CT11，其包括包含SEQ ID NO：35(5′-TGCGCACAGACGATCTATTT-3’)或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO：36(5′-TGCAACTCCTCCATTAAGCTG-3′)或其活性片段的反向引物，和包含SEQ ID NO：37(5′-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3′)或其活性片段的互补检测探针。
[56]本发明还提供了可以用于多路检测形式的引物/探针集。这种引物/探针集的实例是：
引物/探针集CT(mpx)，其包括包含SEQ ID NO：38(5′-AGCCCTACGCCATTAGTTATGG-3′)或其活性片段的第一正向扩增引物，包含SEQ ID NO：39(5′-GCCCTACGCGATTAGTTATGG-3′)或其活性片段的第二正向扩增引物，包含SEQ ID NO：40(5′-CCCATACCACACCGCTTTCT-3′)或其活性片段的反向扩增引物，以及包含SEQ ID NO：41(5′--CGACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTT-3′)或其活性片段的检测探针。
寡核苷酸制备
[57]本发明的寡核苷酸可以通过多种方法的任一种来制备(参见，例如J.Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，1989，2nd Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press：New York，NY；“PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications”，1990，M.A.Innis(Ed.)，Academic Press：New York，NY；P.Tijssen“Hybridization withNucleic Acid Probes-Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(Parts I and II)”，1993，Elsevier Science；“PCRStrategies”，1995，M.A.Innis(Ed.)，Academic Press：New York，NY；and“Short Protocols in Molecular Biology”，2002，F.M.Ausubel(Ed.)，5th Ed.，John Wiley&Sons：Secaucus，NJ)。例如，寡核苷酸可以使用本领域公知的多种化学技术的任一种来制备，包括，例如化学合成和基于模板的聚合化，例如在S.A.Narang等人，Meth.Enzymol.1979，68：90-98；E.L.Brown等人，Meth.Enzymol.1979，68：109-151；E.S.Belousov等人，Nucleic Acids Res.1997，25：3440-3444；D.Guschin等人，Anal.Biochem.1997，250：203-211；M.J.Blommers等人，Biochemistry，1994，33：7886-7896；and K.Frenkel等人，Free Radic.Biol.Med.1995，19：373-380；and U.S.Pat.No.4,458,066)中描述的。
[58]例如，寡核苷酸可以使用根据亚磷酰胺方法的自动化的、固相过程来制备。在这样的方法中，每种核苷酸被分别地添加到生长中的寡核苷酸链的5′末端，所述寡核苷酸链在3′末端附着到固相支持物上。添加的核苷酸是三价的3′-亚磷酰胺的形式，其通过5′位置的二甲氧基三基(或DMT)基团被保护免于聚合化。在碱基诱导的亚磷酰胺联结之后，轻度氧化给出了五价的磷酸三酯中间物，DMT消除提供了寡核苷酸延伸的新位点。然后寡核苷酸从固相支持物上裂解下来，用氢氧化铵对磷酸二酯和环外的氨基解保护。这些合成可以在寡聚物合成仪上进行，例如可以从Perkin Elmer/Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)、DuPont(Wilmington，DE)或Milligen(Bedford，MA)商业上可获得的那些。做为选择，寡核苷酸可以被定制和从本领域公知的多种的商业来源获得，例如，Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)、ExpressGen，Inc.(Chicago，IL)、Operon Technologies，Inc.(Huntsville，AL)和许多其他公司。
[59]本发明的寡核苷酸的纯化，当必要或期望时，可以通过本领域公知的的多种方法的任一种来进行。寡核苷酸的纯化一般通过天然丙烯酰胺凝胶电泳、通过例如J.D.Pearson和F.E.Regnier(J.Chrom.，1983，255：137-149)所描述的阴离子交换HPLC、或通过反相HPLC(G.D.McFarland and P.N.Borer，Nucleic Acids Res.，1979，7：1067-1080)来进行。
[60]寡核苷酸的序列可以使用任何适合的测序方法来证实，包括但不限于，化学降解(A.M.Maxam and W.Gilbert，Methods ofEnzymology，1980，65：499-560)、基质辅助的激光脱附电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法(U.Pieles等人，Nucleic Acids Res.，1993，21：3191-3196)、在碱性磷酸酶和核酸外切酶消化的组合之后的质谱法(H.Wu and H.Aboleneen，Anal.Biochem.，2001，290：347-352)等等。
[61]如之前已经提及的，修饰的寡核苷酸可以使用本领域已知的几种方法的任一种来制备。这种修饰的非限制性实例包括甲基化、“帽”、一个或多个天然发生核苷酸用类似物替换、和核苷酸内修饰，例如，具有不带电的连键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸，等等)或带电的连键(例如，硫代磷酯、二硫代磷酸酯，等等)。寡核苷酸可以含有一种或多种其他的共价连接的部分，例如，蛋白质(例如，核酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸，等等)、嵌入剂(intercalator)(例如，吖啶、补骨脂素，等等)、螯合剂(例如，金属、放射性金属、铁、氧化的金属，等等)和烷化剂。寡核苷酸也可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯连键来衍生。此外，本发明的寡核苷酸序列也可以用标记来修饰。
寡核苷酸序列的标记
[62]在某些实施方式中，检测探针或扩增引物或探针与引物两者在用于扩增/检测分析之前用可检测的试剂或部分标记。在某些实施方式中，所述检测探针用可检测试剂标记。可检测试剂的作用是允许扩增的目标序列的可视化和检测。优选的，选择可检测试剂，从而它产生可以被测量的信号，信号的强度与被分析样品中扩增产物的数量相关(例如，成比例)。
[63]寡核苷酸和可检测试剂之间的缔合可以是共价的或非共价的。标记的检测探针可以通过掺入或结合于可检测部分来制备。标记可以直接附着到核酸序列，或间接地附着(例如，通过接头)。各种长度的接头或间隔区臂是本领域已知的并且是商业上可获得的，可以选择来降低位阻，或给产生的标记的分子赋予其他有用的或期望的性质(参见，例如E.S.Mansfield等人，Mol.Cell Probes，1995，9：145-156)。
[64]标记核酸分子的方法是本领域公知的。对于标记方案、标记检测技术和该领域的近期发展的综述，参见，例如，L.J.Kricka，Ann.Clin.Biochem.2002，39：114-129；R.P.van Gijlswijk等人，Expert Rev.Mol.Diagn.2001，1：81-91；and S.Joos等人，J.Biotechnol.1994，35：135-153。标准的核酸标记方法包括：放射性试剂的掺入、荧光染料(L.M.Smith等人，Nucl.Acids Res.，1985，13：2399-2412)或酶(B.A.Connoly andO.Rider，Nucl.Acids.Res.，1985，13：4485-4502)的直接连接；核酸分子的化学修饰，使得它们可免疫化学地或通过其他亲和性反应来检测(T.R.Broker等人，Nucl.Acids Res.1978，5：363-384；E.A.Bayer等人，Methods of Biochem.Analysis，1980，26：1-45；R.Langer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，78：6633-6637；R.W.Richardson等人，Nucl.Acids Res.1983，11：6167-6184；D.J.Brigati等人，Virol.1983，126：32-50；P.Tchen等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，1984，81：3466-3470；J.E.Landegent等人，Exp.Cell Res.1984，15：61-72；andA.H.Hopman等人，Exp.Cell Res.1987，169：357-368)；以及酶介导的标记方法，例如随机起到、切口翻译、PCR和用末端转移酶尾化(对于酶标记的综述，参见，例如，J.Temsamani and S.Agrawal，Mol.Biotechnol.1996，5：223-232)。更新近开发的核酸标记系统包括，但不限于：ULS(通用连接系统)，其是基于单体反应性顺式铂氨衍生物与DNA中鸟嘌呤部分的N7位置的反应(R.J.Heetebrij等人，Cytogenet.Cell.Genet.1999，87：47-52)，补骨脂素-生物素，其插入到核酸中在UV照射下变得与核苷酸碱基共价结合(C.Levenson等人，MethodsEnzymol.1990，184：577-583；以及C.Pfannschmidt等人，Nucleic AcidsRes.1996，24：1702-1709)，光反应性叠氮基衍生物(C.Neves等人，Bioconjugate Chem.2000，11：51-55)和DNA烷化试剂(M.G.Sebestyen等人，Nat.Biotechnol.1998，16：568-576)。
[65]任何各种可检测试剂可以用于本发明的实践。适合的可检测的试剂包括但不限于，各种配体、放射性核素(例如，32P、35S、3H、14C、125I、131I，等等)；荧光染料(对于特定的示范性荧光染料，参见下文)；化学发光试剂(例如，吖啶酯、稳定的dioxetanes，等等)；光谱地可分解的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳粒(例如，金、银、铜和铂)或纳簇；酶(例如，在ELISA中使用的那些，即，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；比色标记(例如，染料、胶体金，等等)；磁性标记(例如，DynabeadsTM)；和生物素、dioxigenin或其他半抗原和蛋白质，针对它们的抗血清或单克隆抗体是可获得的。
[66]在某些优选的实施方式中，发明的检测探针是荧光标记的。各种各样的化学结构和物理性质的大量已知的荧光标记部分适合于在本发明的实践中使用。适合的荧光染料包括但不限于，荧光素和荧光素染料(例如，荧光素异硫基花青素或FITC、naphthofluorescein、4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、oxonol染料、藻红素、藻红、曙红、玫瑰红染料(例如，羧基四甲基罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明或TMR)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基-香豆素、二烃基氨基香豆素、伞花内酯和氨基甲基香豆素或AMCA)、Oregon Green染料(例如，Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514)、得克萨斯红、得克萨斯红-X、Spectrum RedTM、Spectrum GreenTM、花青染料(例如，Cy-3TM、Cy-5TM、Cy-3.5TM、Cy-5.5TM)、Alexa Fluor染料(例如，Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、AlexaFluor 660和Alexa Fluor 680)、BODIPY染料(例如，BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、IRDyes(例如，IRD40、IRD 700、IRD 800)等等。对于适合的荧光染料以及连接或掺入荧光染料到核酸分子中的方法的更多实例，参见，例如，“The Handbook of FluorescentProbes and Research Products”，9th Ed.，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR。荧光染料以及标记试剂盒是商业上可获得的，来自，例如Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)、Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)和New England Biolabs Inc.(Berverly，MA)。
[67]不是自身可直接被检测荧光的，某些荧光基团(供体)在荧光共振能量传递(FRET)的过程中将能量转移到另一个荧光基团(接受体)，该第二基团产生检测荧光信号。在这些实施方式中，寡核苷酸检测探针可以，例如，当与扩增的目标序列杂交时变得可检测。适用于本发明的FRET接受体/供体配对的实例包括但不限于荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/FITC、IAEDANS/5-(iodoacetomido)荧光素、EDANS/Dabcyl和B-藻红素/Cy-5。
[68]物理上连接的荧光报告物/淬灭剂分子对的使用也在本发明的范围内。这种系统在TaqManTM分析中(例如，在美国专利5,210,015；5,804,375；5487,792和6214,979中描述的)或作为分子信标(例如，在S.Tyagi and F.R.Kramer，Nature Biotechnol.1996，14：303-308；S.Tyagi等人，Nature Biotechnol.1998，16：49-53；L.G.Kostrikis等人，Science，1998，279：1228-1229；D.L.Sokol等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95：11538-11543；S.A.Marras等人，Genet.Anal.1999，14：151-156；和美国专利No.5,846,726、5,925,517、6,277,581和6,235,504中所描述的)的使用是本领域公知的。使用TaqManTM分析形式，当形成之时或以所谓“实时”的方式，扩增反应的产物可以被检测。结果，当反应混合物处于扩增条件之下时，扩增产物/探针杂交物形成并被检测。
[69]在本发明的某些优选的实施方式中，PCR检测探针是TaqManTM样探针，它在5′末端用荧光部分标记，在3′末端用淬灭剂部分标记。例如，在美国专利NO.5,210,015、5,804,375、5,487,792和6,214,979以及WO 01/86001中公开了用于TaqManTM样探针的适合的荧光基团和淬灭剂。淬灭剂的实例包括但不限于DABCYL(即，4-(4′-二甲基氨基偶氮苯)-苯甲酸)琥珀酰亚胺基酯、二芳基罗丹明羧酸、琥珀酰亚胺基酯(或QSY-7)和4′，5′-二硝基荧光素羧酸、琥珀酰亚胺基酯(或QSY-33)(全部可从例如Molecular Probes获得)、quencher1((Q1；可从Epoch Biosciences，Bothell，WA获得)、或“Black HoleQuencher”BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3(可从BioSearch Technologies，Inc.，Novato，CA获得)。在本发明的某些优选的实施方式中，PCR检测探针是TaqManTM样探针，它在5′末端用FAM标记，在3′末端用BlackHole Quencher标记。
[70]正常的或修饰的核苷酸的“尾部”也可以被添加到寡核苷酸探针用于可检测目的。与互补于尾部并含有一种或多种可检测标记(例如，荧光基团、酶或被放射性标记的碱基)的核酸的第二次杂交容许扩增子/探针杂交物的可视化(参见，例如，从Enzo Biochem.Inc.，NewYork：NY商业上可获得的系统)。使用发明的寡核苷酸有用的分析的另一个实例是信号放大方法，例如在美国专利NO.5,124,246中描述的(通过完全引用将其合并在此)。在该方法中，信号通过使用扩增多聚体来放大，扩增多聚体是被构建以含有第一片段和多个相同的第二片段的多核苷酸，所述第一片段与添加到寡核苷酸探针的“尾部”特异性杂交，所述第二片段与标记的探针特异性地杂交。扩增的程度与第二片段的重复数是理论上成比例的。多聚体可以是线性的或者分支的。分支的多聚体可以是分岔或鸡冠的形状。
[71]特定核酸标记技术的选择将取决于形势并将取决于几个因素，例如标记方法的简易性和成本、期望的样品标记的质量、可检测部分对杂交反应的影响(例如，对杂交过程的速度和/或效力的影响)、使用的扩增方法的性质、检测系统的性质、可检测标记产生的信号的性质和强度，等等。
使用发明的引物的沙眼衣原体目标序列的扩增
[72]本发明的寡核苷酸序列扩增测试样品中沙眼衣原体目标序列的使用不局限于任何特定的核酸扩增技术或其任何特定的修改体。实际上，发明的寡核苷酸序列可以应用于本领域公知的的多种核酸扩增方法的任一种(参见，例如，A.R.Kimmel and S.L.Berger，MethodsEnzymol.1987，152：307-316；J.Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，1989，2nd Ed.，Cold Spring Harbour LaboratoryPress：New York，NY；“Short Protocols in Molecular Biology”，F.M.Ausubel(Ed.)，2002，5th Ed.，John Wiley&Sons：Secaucus，NJ)。
[73]这些公知的核酸扩增方法包括但不限于，聚合酶链式反应(或PCR，在例如“PCR Protocols ：A Guide to Methods and Applications”，M.A.Innis(Ed.)，1990，Academic Press：New York；“PCR Strategies”，M.A.Innis(Ed.)，1995，Academic Press：New York；“Polymerase chainreaction：basic principles and automation in PCR：APractical Approach”，McPherson等人(Eds.)，1991，IRL Press：Oxford；Saiki等人，Nature，1986，324：163；和美国专利No.4,683,195，4,683,202和4,889,818中描述的，它们每一个通过完全引用合并在此)；以及其各种变体，包括基于TaqManTM的分析(Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1991，88：7276-7280)，和逆转录酶聚合酶链式反应(或RT-PCR，例如在美国专利Nos.5,322,770和5,310,652中描述的)。
[74]在PCR中，采用一对过量的引物来与目标核酸的互补链杂交。使用目标序列作为模板通过DNA聚合酶延伸每个引物。延伸产物在从原始的目标链解离(变性)之后变得靶向自身。新的引物然后杂交并通过聚合酶延伸，该循环被重复以指数性地提高目标序列分子的拷贝数。能够在PCR反应中产生引物延伸产物的DNA聚合酶的实例包括但不限于：E.coli DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、分离自Thermus aquaticus的热稳定的DNA聚合酶(Taq)、可从各种来源(例如，Perkin Elmer)、Thermus thermophilus(United StatesBiochemicals)、Bacillus stereothermophilus(Bio-Rad)或Thermococcuslitoralis(“Vent”聚合酶，New England Biolabs)获得的。RNA目标序列可以通过将mRNA反转录成cDNA、然后进行PCR(RT-PCR)来扩增，如上所述的。做为选择，如在美国专利NO.5,322,770中描述的，可以对两个步骤使用单个的酶。
[75]除了如上所述的酶学热扩增之外，可以采用公知的等温的酶扩增反应来利用本发明的寡核苷酸引物扩增沙眼衣原体目标序列(S.C.Andras等人，Mol.Biotechnol.，2001，19：29-44)。这些方法包括但不限于，转录介导的扩增(或TMA，例如在D.Y.Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：1173-1177；C.Giachetti等人，J.Clin.Microbiol.，2002，40：2408-2419；和美国专利No.5,399,491中描述的)；自持的序列复制(或3SR，例如在J.C.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87：1874-1848；and E.Fahy等人，PCR Methods andApplications，1991，1：25-33中描述的)；基于核酸序列的扩增(或NASBA，例如在T.Kievits等人，J.Virol.，Methods，1991，35：273-286；and U.S.Pat.No.5,130,238在描述的)以及链置换扩增(或SDA，例如，在G.T.Walker等人，PNAS，1992，89：392-396；EP 0 500 224 A2中描述的)。在这个段落中引用的每个参考文献通过完全引用合并在此。
[76]链置换扩增(SDA)在固定的温度下组合了限制性内切酶切开它的目标DNA的未修饰链的能力和核酸外切酶缺陷性DNA聚合酶在切口处延伸3′末端并替换下游DNA链的作用(G.T.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89：392-396)。SDA中使用的引物包括目标结合序列5′的限制性内切酶识别位点(美国专利5,270,184和5,344,166，它们每一个通过完全引用合并在此)。
[77]基于核酸序列的扩增(NASBA)利用三种酶——例如，RNaseH、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶和T7RNA聚合酶——在低的等温温度、一般41℃下共同工作(J.Compton，Nature，1991，350：91-92；A.B.Chan and J.D.Fox，Rev.Med.Microbiol.，1999，10：185-196)。NASBA反应的产物主要是单链RNA。自持的序列复制(3SR)反应是目标DNA或RNA序列的等温扩增的非常有效的方法。3SR系统涉及AMV逆转录酶、E.Coli RNase H和DNA依赖性RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)的集体活性。转录介导的扩增(TMA)利用RNA聚合酶来从工程化到引物区域中的启动子产生RNA，利用逆转录酶来从DNA模板产生互补DNA，利用RNase H来从cDNA除去RNA(J.C.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87：1874-1878)。
[78]NASBA、3SR和TMA引物需要与引物的目标结合序列连接的RNA聚合酶启动子。启动子或用于掺入引物中的启动子序列是被RNA聚合酶特异性识别的核酸序列(是天然发生的、合成地产生的或是限制性消化的产物)，所述RNA聚合酶识别并结合该序列并启动转录过程，从而产生RNA转录产物。有用的启动子的实例包括被某些噬菌体聚合酶例如来自噬菌体T3、T7或SP6的聚合酶识别的那些，或来自E.coli的启动子。
扩增的沙眼衣原体目标序列的检测
[79]在本发明的某些实施方式中，寡核苷酸探针序列被用于检测扩增反应产生的扩增产物(即，扩增的沙眼衣原体目标序列)。本发明的探针序列可以使用多种公知的同质的或异质的方法来应用。
[80]同质的检测方法包括但不限于，在存在目标序列的情况下发射信号的、附着于所述探针的FRET标记的使用，分子信标(S.Tyagi andF.R.Kramer，Nature Biotechnol.1996，14：303-308；S.Tyagi等人，Nature Biotechnol.1998，16：49-53；L.G.Kostrikis等人，Science，1998，279：1228-1229；D.L.Sokol等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95：11538-11543；S.A.Marras等人，Genet.Anal.1999，14：151-156；and U.S.Pat.Nos.5,846,726，5,925,517，6,277,581和6,235,504)，和所谓的TaqManTM分析(美国专利Nos.5,210,015；5,804,375；5487,792和6214,979以及WO 01/86001)。利用这些检测技术，当形成之时或以所谓实时的方式，扩增反应的产物可以被检测，结果，当反应混合物处于扩增条件之下时，扩增产物/探针杂交物形成并被检测。
[81]在某些优选的实施方式中，本发明的检测探针用于TaqManTM分析中。TaqManTM分析也称为发荧光5′核酸酶分析，是用于核酸目标的强大和通用的基于PCR的检测系统。通过监视荧光信号的产生，与热循环一同进行分析。该分析系统具有产生定量数据的能力，容许确定目标拷贝数目。例如，可以使用预先定量的沙眼衣原体的悬浮液的连续稀释物来产生标准曲线，未知的样品可以针对它来比较。利用例如具有内源5′核酸酶活性的AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶来消化如上所述的用荧光报告物染料和淬灭剂部分标记的寡核苷酸探针，方便地进行TaqManTM分析。随着探针被消化，分开荧光和淬灭剂部分并引起与目标序列的扩增成比例的荧光信号的增强，通过测量在扩增循环期间发生的荧光方面的改变来获得分析结果。
[82]同质的检测方法的其他实例包括杂交保护分析(HPA)。在这种分析中，利用非基于核酸的接头臂化学作用(美国专利NO.5,585,481和5,185,439)、用一种高度化学发光的分子吖啶酯(AE)来标记探针(Weeks等人，Clin.Chem.，1983，29：1474-1479；Berry等人，Clin.Chem.，1988，34：2087-2090)。化学发光由碱性过氧化氢对AE的水解作用触发，其产生激发的N-甲基吖啶酮，其随后随着光子的发射而钝化。在不存在目标序列的情况下，AE水解作用是快速的。然而，当探针与目标序列结合时，AE水解作用的速度大大地降低。因而，杂交的和未杂交的AE标记的探针可以在溶液中直接地检测，而不需要物理分离。
[83]异质的检测系统是本领域公知的，一般采用捕获试剂来从反应混合物中的其他材料中分离扩增的序列。捕获试剂一般包括包被有一种或多种特异性结合序列的固相支持材料(例如，微量滴定孔、珠子、芯片等等)。结合序列可以与添加到本发明的寡核苷酸探针的尾部序列互补。做为选择，结合序列可以互补于捕获寡核苷酸的序列，其本身包含与发明的寡核苷酸探针的尾部序列互补的序列。在从其余的反应混合物中分离与捕获试剂结合的扩增产物/探针杂交物之后，扩增产物/探针杂交物可以使用如上所述的任何检测方法来检测。
II-测试样品中沙眼衣原体的检测方法
[84]在另一个方面，本发明提供了检测测试样品中沙眼衣原体的存在的方法。例如，发明的方法可以用于测试可能或可能不展现衣原体感染或其后遗症的症状的测试患者，和/或用于筛选有风险的群体。
[85]一般地，本发明的方法包括步骤：提供怀疑含有沙眼衣原体核酸(例如，包含沙眼衣原体的隐性质粒内的序列的核酸)的测试样品；用在此公开的至少一种寡核苷酸接触所述测试样品，从而如果沙眼衣原体核酸存在于测试样品中，所述寡核苷酸可以与所述沙眼衣原体核酸杂交；以及检测与沙眼衣原体核酸杂交的任何寡核苷酸，其中与沙眼衣原体核酸杂交的寡核苷酸的测出表明测试样品中沙眼衣原体的存在。
[86]在某些实施方式中，寡核苷酸是本发明的引物集的寡核苷酸扩增引物。在其他实施方式中，所述寡核苷酸是本发明的引物/探针集的寡核苷酸扩增引物或寡核苷酸检测探针。
[87]在某些实施方式中，检测的步骤包括扩增所有的或部分沙眼衣原体核酸来获得沙眼衣原体扩增子，并检测任何沙眼衣原体扩增子。
样品制备
[88]根据本发明的方法，测试样品中沙眼衣原体的存在可以通过检测任何沙眼衣原体核酸来确定，所述沙眼衣原体核酸包含沙眼衣原体的隐性质粒内的序列。因而，怀疑包含这种沙眼衣原体目标序列的任何液体或固体生物材料可以是适合的测试样品。优选的测试样品包括尿液(例如，首次排空尿)、精液、唾液、眼睛晶状体液、淋巴液、子宫颈内的、尿道的、直肠的、阴道的、外阴-阴道的、和鼻咽的样品。
[89]测试样品可以获自或分离自怀疑感染沙眼衣原体的患者。如已经提及的，可以在分离后没有进一步的处理/加工地使用测试样品，或做为选择，可以在分析之前加工。例如，测试样品可以被处理以从它可能含有的任何沙眼衣原体细胞中释放核酸。核酸提取的方法是本领域公知的，包括化学方法、温度方法和机械方法(参见，例如J.Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，1989，2nd Ed.，ColdSpring Harbour Laboratory Press：New York，NY)。存在着大量不同的和通用的试剂盒，可以用于从生物样品提取核酸，其可以商业上获自，例如，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)、BD Biosciences Clontech(Palo Alto，CA)、Epicentre Technologies(Madison，WI)、GentraSystems，Inc.(Minneapolis，MN)、MicroProbe Corp.(Bothell，WA)、Organon Teknika(Durham，NC)和Qiagen Inc.(Valencia，CA)。详细描述要遵循的方案的用户指南通常包括在这些试剂盒中。敏感性、处理时间和成本可能是试剂盒与试剂盒之间不同的。本领域普通技术人员可以容易地选择最适合于特定情况的试剂盒。
[90]在提取之前，沙眼衣原体细胞可以被纯化、浓缩或从原始生物样品的其他成分中分离，例如，通过过滤或离心。
样品分析
[91]本领域技术人员将理解的是，根据本发明的方法的沙眼衣原体目标序列的扩增和扩增的沙眼衣原体核酸的检测可以使用在此描述的任何扩增/检测方法来进行。在某些优选的实施方式中，测试样品中沙眼衣原体的检测使用TaqManTM分析来进行，扩增产物的形成通过荧光以实时的方式监视。在这些实施方式中，使用如上所述的在5′末端用荧光报告物标记和在3′末端用淬灭剂部分标记的探针。适合于TaqManTM分析形式的扩增条件的优化和扩增反应试剂的选择在技术人员的能力范围之内。
[92]在某些实施方式中，内部对照或内标准被添加到生物样品(或添加到从生物样品提取的纯化的核酸中)来充当提取和/或目标扩增的对照。优选的，内部对照包括不同于目标序列、并且能够被用于扩增目标沙眼衣原体核酸的引物所扩增的序列。内部对照的使用容许监视提取过程、扩增反应、和检测、以及分析性能的控制。扩增的对照和扩增的目标一般地通过使用用于检测对照和目标的不同探针(例如，用不同的可检测试剂标记的)来在检测步骤中辨别。
[93]测试样品中沙眼衣原体的存在可以通过使用不同等分量的相同生物测试样品、或使用不同的测试样品(例如，如果分析的第一样品是尿液样品则为子宫颈内棉拭，或在不同时间采集的尿液样品)重复根据本发明的分析来确认。做为选择或另外地，测试样品中沙眼衣原体的存在可以通过进行不同的分析(即，根据不同的方法的分析)来确认。例如，如果第一分析使用TaqManTM分析来进行，第二分析可以使用转录介导的扩增(TMA)反应来进行。
[94]做为选择，测试样品中沙眼衣原体的存在可以通过非本发明的分析来确认。
III-沙眼衣原体和其他有机体的同时检测
[95]如已经提及的，本发明的引物/探针集特异于沙眼衣原体。本申请人在具有表4所列74中近相关有机体的多路分析形式中挑战了引物/探针集CT5，没有发现交叉相关(参见实施例1)。
[96]因而，本发明还提供了使用至少两种引物/探针集(即，一种选自在此公开的沙眼衣原体特异性引物/探针集，另一种选自对要测试的其他有机体特异的引物/探针集)的组合来同时检测测试样品中沙眼衣原体与另一种有机体的存在的方法。
[97]可以与沙眼衣原体同时检测的其他有机体包括但不限于，在表4中列出的任何有机体。在某些实施方式中，其他有机体是淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)。
[98]特别地，本发明提供了检测测试样品中沙眼衣原体和/或淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)的方法，其包括步骤：提供怀疑含有沙眼衣原体核酸和/或淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)核酸的测试样品；使测试样品与引物/探针集CT(mpx)接触，从而如果沙眼衣原体核酸存在于测试样品中，所述引物/探针集CT(mpx)的至少一个引物或探针可以与沙眼衣原体核酸杂交；使测试样品与特异于淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhea)的至少一种引物/探针集接触，从而如果淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)核酸存在于测试样品中，所述特异于淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)的引物/探针集的至少一个引物或探针可以与淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)核酸杂交；检测与沙眼衣原体核酸杂交的引物/探针集CT(mpx)的任何引物或探针，其中与沙眼衣原体核酸杂交的引物或探针的检出表明测试样品中存在沙眼衣原体；以及检测与淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)核酸杂交的特异于淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhea)的引物/探针集的任何引物或探针，其中与淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)核酸杂交的引物或探针的检出表明测试样品中存在淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)。在某些实施方式中，特异于淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)的引物/探针集选自标题为“淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)特异性寡核苷酸序列”、2006年4月7日提交的临时申请NO.60/790,197中描述的引物/探针集。
IV-试剂盒
[99]在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包括对于根据在此描述的方法检测衣原体有用的材料。本发明的试剂盒可以由诊断实验室、实验性实验室或医师来使用。
[100]根据本发明检测沙眼衣原体所需的基本材料和试剂可以被一起组合到试剂盒中。在某些实施方式中，所述试剂盒包括至少一种本发明的引物集或引物/探针集，以及任选地，包含扩增反应试剂。每个试剂盒优选地包含使得操作变得特异性的试剂。因而，适用于NASBA的试剂盒优选地含有具有与目标结合序列连接的RNA聚合酶启动子的引物，而适用于SDA的试剂盒优选地含有包括目标结合序列5′的限制性内切酶识别位点的引物。类似地，当所述试剂盒适用于5′核酸酶分析，例如TaqManTM分析时，所述检测探针优选地含有至少一种荧光报告物部分和至少一种淬灭剂部分。
[101]适合的扩增反应试剂包括，例如，一种或多种的：缓冲液、试剂、具有逆转录酶和/或聚合酶活性或核酸外切酶活性的酶；酶辅助因子，例如镁或锰；盐；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；和适合于进行扩增反应的三磷酸脱氧核苷(dNTP)，例如三磷酸脱氧腺苷；三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷和三磷酸胸苷。例如，适用于NASBA的试剂盒可以含有适合数量的逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶。在适合于转录扩增反应例如NASBA的试剂盒中，可以包括含有例如DMSO的缓冲液，已知DMSO增强扩增反应。
[102]取决于操作，试剂盒可以进一步包含一种或多种的：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂、以及检测装置。包括在试剂盒内的缓冲液和/或试剂优选的为了该试剂盒预期的特定扩增/检测技术而优化。使用这些缓冲液和试剂进行操作的不同步骤的方案也可以被包括在试剂盒中。
[103]此外，试剂盒可以具有内部对照作为扩增操作的核对，并防止由于扩增操作的失败发生假阴性测试结果。这样选择最佳的对照序列，使得它将不会与扩增反应中的目标核酸序列竞争(如上所述)。
[104]试剂盒也可以含有试剂，用于在扩增之前从生物样本分离核酸，和/或用于在核酸提取之前纯化或分离沙眼衣原体细胞。
[105]试剂可以以固体(例如，冻干的)或液体形式提供。本发明的试剂盒任选地包含不同的容器(例如，小瓶、安瓿瓶、试管、烧瓶或瓶子)用于每种单独的缓冲液和/或试剂。每种成分一般作为相应容器中的等分量是适合的，或以浓缩的形式提供。也可以提供适合于进行扩增/检测分析的某些步骤的其他容器。试剂盒的独立容器优选的维持密封用于商业销售。
[106]试剂盒还可以包括根据本发明使用扩增反应试剂和引物集或引物/探针集的说明书。根据本发明的一种或多种方法使用试剂盒的说明书可以包含加工生物样品、提取核酸分子、和/或进行所述测试的说明；解释结果的说明以及管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构(例如，FDA)规定格式的注意事项。
实施例
[107]以下实施例描述了进行和实践本发明的一些优选的方式。然而，要理解的是，这个实施例仅是为说明性的目的，而不意味着限制本发明的范围。此外，除非实施例中的描述以过去时态存在，如同说明书的其余部分一样，该文本不意味着表明实际进行了实验或实际获得了数据。
实施例1：沙眼衣原体/淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)多路分析的特异性
[108]使用多路TaqMan kPCR分析来测试十五(15)种不同的沙眼衣原体(CT)血清型(即，A、B、Ba、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2和L3)以及四十六(46)种不同的淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhea)(GC)分离物。
[109]使用Stratagene’s Mx3000PTM实时PCR系统(Stratagene Inc.，San Diego，CA)在单独的、密封的反应孔中进行扩增和检测。这些实验中使用的分析主混合物含有Taq DNA聚合酶、缓冲液、参考染料(ROX)和MgCl2、AmpEraseTM UNG(1单位/μL)，来自AppliedBiosystems(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA)或QIAGEN(Hilden，Germany)；
Figure A20068004141700421
寡核苷酸引物和探针自身合成或购自BioSearch Inc.。kPCR反应混合物由25μL的主混合物和25μL纯化的DNA组成。
[110]获得的结果在表3中报告。这些结果显示，CT/GC多路分析可以检测广泛的CT血清型和GC分离物。
[111]还用107个拷贝的来自74种近相关有机体(表4中列出)的基因组DNA挑战了CT/GC多路PCR主混合物，没有显示交叉反应性。
其他实施方式
[112]根据在此公开的本发明的说明书或实践的考虑，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。意图是，说明书和实施例被认为仅是示范性的，本发明的真实范围和精神由以下的权利要求表明。
  SEQIDNO. 序列名称＊ 作图位置 序列(5’→3’) 链
  12345678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637   CT1-5285-FPCT1-5402-RPCT1-5352-“c”探针CT1-5352-“r.c.”探针CT2-1218-FPCT2-1341-RPCT2-1248-“c”探针1CT2-1247-“c”探针2CT3-5893-FPCT3-691-RPCT3-642-“c”探针CT3-642-“r.c.”探针CT4-674-FPCT4-789-RPCT4-696-“c”探针CT5-1243-FPCT5-1342-RPCT5-1271-“c”探针CT5-1271-“r.c.”探针CT6-5966-FPCT6-6058-RPCT6-6007-“c”探针CT4FW01-665-FPCT4-789-RPCT4-698-“c”探针02CT4FW03-670-FPCT4-789-RPCT4-698-“c”探针02CT4FW06-676-FPCT4-789-RPCT4-698-“c”探针02CT4FW04-672-FPCT4RV04-793-RPCT4-698-“c”探针02CT4FW06-676-FPCT4RV04-793-RPCT4-698-“c”探针02   5285-53085383-54025352-53815352-51811218-12421317-13411248-12741248-1275593-620673-691642-671642-671674-692767-789696-7261243-12611321-13421271-12921271-12925966-59846039-60586007-6026665-684767-789698-721670-688767-789698-721676-695767-789698-721672-690773-793698-721676-695773-793698-721   GGATACTCATCAGGCGTTCCTAATCCCATACCACACCGCTTTCTCGACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTTAACCGCCTACACGTAATGAATACGTTGTCGTGTGACCTTCATTATGTCGGAGTCTGTTCTCTCAAGCAGGACTACAAGCTCCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGCACCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGCGCTCCGGATAGTGAATTATAGAGACTATAGATCGTCTGTGCGCAAAGCAAGGGATCCGTAAGTTAGACGAAATTTTGCAAAATTTCGTCTAACTTACGGATCCCTTGTTTGCGCACAGACGATCTAACTCCTCCATTAAGCTGATAGGATTTGCATCCAATCAGATTTCCTTTCGCATTAGAGCACCCTAGGCGTTTGTCGTTCTCTCAAGCAGGACTACACAGCGGTTGCTCGAAGCACGTGCACGTGCTTCGAGCAACCGCTGGGATGCAACTTGGCCCAATGACACTAGCCCCCAATCCATGCTGACCTAGACCCGCAATCCAAATTTTGTCTTTGCGCACAGACTCCTCCATTAAGCTGATAGGATGCATCCAATCAGATTTCCTTTCGTGTCTTTGCGCACAGACGAACTCCTCCATTAAGCTGATAGGATGCATCCAATCAGATTTCCTTTCGTGCGCACAGACGATCTATTTACTCCTCCATTAAGCTGATAGGATGCATCCAATCAGATTTCCTTTCGTCTTTGCGCACAGACGATCTGCAACTCCTCCATTAAGCTGTGCATCCAATCAGATTTCCTTTCGTGCGCACAGACGATCTATTTTGCAACTCCTCCATTAAGCTGTGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG   (+)(-)(+)(-)(+)(-)(+)(+)(+)(-)(+)(-)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(-)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)
*“c”代表互补于编码链或有义链(+)，“r.c.”代表反向互补于编码链或有义链(-)。
  SEQIDNO. 序列名称＊ 作图位置 序列(5’→3’) 链
  38394041   CT-5265-FP1(mpx)CT-5266-FP2(mpx)CT1-5402-RPCT1-5352-探针   5265-52865266-52865383-54025352-5381   AGCCCTACGCCATTAGTTATGGGCCCTACGCGATTAGTTATGGCCCATACCACACCGCTTTCTCGACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTT   (+)(+)(-)(+)
*“mpx”代表多路的。
  CT/GC多路分析   CT   GC
 10IFU/mL的沙眼衣原体(A，B，Ba，C，D，E，F，G，H，I，J，K，L1，L2和L3)50拷贝/rxn的Neisseria gonorrhea(IA1-22，IB1-32)   +N/A   N/A+
  ID   有机体   ID   有机体
  1   Acinetobacter calcoaceticus   38   N.lactamica
  2   Bacteroides thetaiotaomicron   39   N.lactamica
  3   Candida albicans   40   N.lactamica
  4   Candida glabrata   41   N.lactamica
  5   Chlamydia pneumoniae   42   N.lactamica
  6   Chlamydia psittaci   43   N.meningitidis A
  7   Citrobacter freundi   44   N.meningitidis A
  8   Corynebacterium renale   45   N.meningitidis B
  9   E.coli   46   N.meningitidis C
  10   Enterobacter aerogenes   47   N.meningitidis C
  11   Garnerella vaginalis   48   N.meningitidis C
  12   Streptococcus pyogenes(GroupAbeta)   49   N.meningitidis D
  13   Streptococcus agalactiae(Group B beta)   50   N.meningitidis X
  14   Haemophilus influenzae   51   N.meningitidis Y
  15   Helicobacter pylori   52   N.meningitidis Z
  16   Herpes simplex virus I   53   N.mucosa
  17   Herpes simplex virus II   54   N.mucosa
  18   Kingella kingae(as Moraxella kingae)   55   N.mucosa var.heidelbergenesis
  19   Klebsiella oxytoca   56   N.perflava
  20   Klebsiella pneumoniae   57   N.perflava
  21   Lactobacillus brevis   58   N.perflava
  22   Lactobacillus delbrueckii subsp lactis   59   N.perflava
  23   Moraxella catarrhalis   60   N.polysacchareae
  24   Moraxella Branhamella catarrhalis   61   N.sicca
  25   Moraxella lacunata   62   N.sicca
  26   Moraxella osloensis   63   N.sicca
  27   Mycoplasma hominis   64   N.subflava
  28   N.cinerea   65   N.subflava
  29   N.elongata   66   Proteus mirabilis
  30 N.elongata subsp.glycolytica   67   Ruminococcus productus(asPepetostreptococcus)
  31   N.elongata subsp.nitroreducens   68   Salmonella minnesota
  32   N.elongata subsp.nitroreducens   69   Salmonella typhimurium
  33   N.flava   70   Staphylococcus agalactiae
  34   N.flavescens   71   Staphylococcus aureus
  35   N.flavescens   72   Trichomonas vaginalis
  36   N.flavescens   73   Ureaplasma urealyticum
  37   N.flavescens   74   Vibrio Cholerae
序列表
<110>Ku，et al.
<120>沙眼衣原体特异性寡核苷酸序列
<130>2007674-0035
<140>PCT/US/2006/043394
<141>2006-11-07
<160>41
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ggatactcat caggcgttcc taat                        24
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cccataccac accgctttct                    20
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>30
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<210>8
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<212>DNA
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caaaatttcg tctaacttac ggatcccttg            30
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<210>22
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<212>DNA
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tgctgaccta gacccgcaat cca       23
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aattttgtct ttgcgcacag                20
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actcctccat taagctgata gga            23
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<220>
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tgcatccaat cagatttcct ttcg           24
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tgtctttgcg cacagacga                19
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actcctccat taagctgata gga           23
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tgcatccaat cagatttcct ttcg          24
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tgcgcacaga cgatctattt                20
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actcctccat taagctgata gga            23
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tgcatccaat cagatttcct ttcg            24
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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tgcaactcct ccattaagct g               21
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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tgcatccaat cagatttcct ttcg                24
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
agccctacgc cattagttat gg                  22
<210>39
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
gccctacgcg attagttatg g                21
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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cccataccac accgctttct                  20
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
cgacaacgta ttcattacgt gtaggcggtt       30

Claims (39)

1.一种分离的寡核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO：1-41、其活性片段及其组合构成的组的核酸序列。
2.权利要求1的寡核苷酸用于检测测试样品中的沙眼衣原体的用途。
3.一种分离的寡核苷酸扩增引物，其包含选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、其活性片段及其组合构成的组的核酸序列。
4.一种分离的寡核苷酸检测探针，其包含选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、其活性片段及其组合构成的组的核酸序列。
5.权利要求4的寡核苷酸检测探针，其进一步包含可检测标记。
6.权利要求5的寡核苷酸检测探针，其中所述可检测标记直接地附着于所述寡核苷酸上。
7.权利要求5的寡核苷酸检测探针，其中所述可检测标记间接地附着于所述寡核苷酸上。
8.权利要求5的寡核苷酸检测探针，其中所述可检测标记是直接地可检测的。
9.权利要求5的寡核苷酸检测探针，其中所述可检测标记是间接地可检测的。
10.权利要求5的寡核苷酸检测探针，其中等等可检测标记包含附着在所述寡核苷酸的5′末端的荧光部分。
11.权利要求10的寡核苷酸检测探针，其中所述寡核苷酸进一步包含附着在3′末端的淬灭剂部分。
12.权利要求11的寡核苷酸检测探针，其中所述荧光部分包含6-羧基荧光素，所述淬灭剂部分包含Black Hole Quencher。
13.用于检测测试样品中的沙眼衣原体的寡核苷酸的集合，其包含选自由引物集1、引物集2、引物集3、引物集4、引物集5、引物集6、引物集7、引物集8、引物集9、引物集10、引物集11和引物集CT(mpx)构成的组的引物集，其中：
引物集1包括包含SEQ ID NO：1或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：2或其任何活性片段的反向引物；
引物集2包括包含SEQ ID NO：5或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：6或其任何活性片段的反向引物；
引物集3包括包含SEQ ID NO：9或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：10或其任何活性片段的反向引物；
引物集4包括包含SEQ ID NO：13或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：14或其任何活性片段的反向引物；
引物集5包括包含SEQ ID NO：16或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：17或其任何活性片段的反向引物；
引物集6包括包含SEQ ID NO：20或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：21或其任何活性片段的反向引物；
引物集7包括包含SEQ ID NO：23或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：24或其任何活性片段的反向引物；
引物集8包括包含SEQ ID NO：26或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：27或其任何活性片段的反向引物；
引物集9包括包含SEQ ID NO：29或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：30或其任何活性片段的反向引物；
引物集10包括包含SEQ ID NO：32或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：33或其任何活性片段的反向引物；
引物集11包括包含SEQ ID NO：35或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：36或其任何活性片段的反向引物；以及
引物集CT(mpx)包括包含SEQ ID NO：38或其任何活性片段的第一正向引物、包含SEQ ID NO：39或其任何活性片段的第二正向引物以及包含SEQ ID NO：40或其任何活性片段的反向引物。
14.用于检测测试样品中的沙眼衣原体的寡核苷酸的集合，其包含选自由引物/探针集CT1、引物/探针集CT2-P1、引物/探针集CT2-P2、引物/探针集CT3、引物/探针集CT4、引物/探针集CT5、引物/探针集CT6、引物/探针集CT7、引物/探针集CT8、引物/探针集CT9、引物/探针集CT10、引物/探针集CT11和引物/探针集CT(mpx)构成的组的引物/探针集，其中：
引物/探针集CT1包括包含SEQ ID NO：1或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：2或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：3或其活性片段的互补检测探针以及包含SEQ ID NO：4或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT2-P1包括包含SEQ ID NO：5或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：6或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：7或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT2-P2包括包含SEQ ID NO：5或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：6或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：8或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT3包括包含SEQ ID NO：9或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：10或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：11或其活性片段的互补检测探针以及包含SEQ ID NO：12或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT4包括包含SEQ ID NO：13或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：14或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：15或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT5包括包含SEQ ID NO：16或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：17或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：18或其活性片段的互补检测探针以及包含SEQ ID NO：19或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT6包括包含SEQ ID NO：20或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：21或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：22或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT7包括包含SEQ ID NO：23或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：24或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：25或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT8包括包含SEQ ID NO：26或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：27或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：28或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT9包括包含SEQ ID NO：29或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：30或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：31或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT10包括包含SEQ ID NO：32或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：33或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：34或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT11包括包含SEQ ID NO：35或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：36或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：37或其活性片段的互补检测探针；以及
引物/探针集CT(mpx)包括包含SEQ ID NO：38或其活性片段的第一正向扩增引物、包含SEQ ID NO：39或其活性片段的第二正向扩增引物、包含SEQ ID NO：40或其活性片段的反向扩增引物以及包含SEQID NO：41或其活性片段的检测探针。
15.权利要求14的寡核苷酸的集合，其中至少一种检测探针包含可检测标记。
16.权利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可检测标记直接地附着于至少一个检测探针。
17.权利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可检测标记间接地附着于至少一个检测探针。
18.权利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可检测标记是直接地可检测的。
19.权利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可检测标记是间接地可检测的。
20.权利要求15的寡核苷酸的集合，其中所述可检测标记包含附着在至少一个检测探针的5′末端的荧光部分。
21.权利要求20的寡核苷酸的集合，其中所述至少一个检测探针进一步包含附着在3′末端的淬灭剂部分。
22.权利要求21的寡核苷酸的集合，其中所述荧光部分包含6-羧基荧光素，所述淬灭剂部分包含Black Hole Quencher。
23.用于检测测试样品中的沙眼衣原体的试剂盒，所述试剂盒包含：
扩增反应试剂；和
选自由引物集1、引物集2、引物集3、引物集4、引物集5、引物集6、引物集7、引物集8、引物集9、引物集10、引物集11和引物集CT(mpx)构成的组的至少一个引物集，其中：
引物集1包括包含SEQ ID NO：1或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：2或其任何活性片段的反向引物；
引物集2包括包含SEQ ID NO：5或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：6或其任何活性片段的反向引物；
引物集3包括包含SEQ ID NO：9或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：10或其任何活性片段的反向引物；
引物集4包括包含SEQ ID NO：13或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：14或其任何活性片段的反向引物；
引物集5包括包含SEQ ID NO：16或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：17或其任何活性片段的反向引物；
引物集6包括包含SEQ ID NO：20或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：21或其任何活性片段的反向引物；
引物集7包括包含SEQ ID NO：23或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：24或其任何活性片段的反向引物；
引物集8包括包含SEQ ID NO：26或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：27或其任何活性片段的反向引物；
引物集9包括包含SEQ ID NO：29或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：30或其任何活性片段的反向引物；
引物集10包括包含SEQ ID NO：32或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：33或其任何活性片段的反向引物；
引物集11包括包含SEQ ID NO：35或其任何活性片段的正向引物以及包含SEQ ID NO：36或其任何活性片段的反向引物；以及
引物集12包括包含SEQ ID NO：38或其任何活性片段的第一正向扩增引物、包含SEQ ID NO：39或其任何活性片段的第二正向扩增引物以及包含SEQ ID NO：40或其任何活性片段的反向扩增引物。
24.用于检测测试样品中的沙眼衣原体的试剂盒，所述试剂盒包含：
扩增反应试剂；和
选自由引物/探针集CT1、引物/探针集CT2-P1、引物/探针集CT2-P2、引物/探针集CT3、引物/探针集CT4、引物/探针集CT5、引物/探针集CT6、引物/探针集CT7、引物/探针集CT8、引物/探针集CT9、引物/探针集CT10、引物/探针集CT11和引物/探针集CT(mpx)构成的组的至少一个引物/探针集，其中：
引物/探针集CT1包括包含SEQ ID NO：1或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：2或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：3或其活性片段的互补检测探针以及包含SEQ ID NO：4或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT2-P1包括包含SEQ ID NO：5或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：6或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：7或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT2-P2包括包含SEQ ID NO：5或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：6或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：8或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT3包括包含SEQ ID NO：9或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：10或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：11或其活性片段的互补检测探针以及包含SEQ ID NO：12或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT4包括包含SEQ ID NO：13或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：14或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：15或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT5包括包含SEQ ID NO：16或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：17或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：18或其活性片段的互补检测探针以及包含SEQ ID NO：19或其活性片段的反向互补检测探针；
引物/探针集CT6包括包含SEQ ID NO：20或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：21或其活性片段的反向引物、包含SEQ ID NO：22或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT7包括包含SEQ ID NO：23或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：24或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：25或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT8包括包含SEQ ID NO：26或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：27或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：28或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT9包括包含SEQ ID NO：29或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：30或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：31或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT10包括包含SEQ ID NO：32或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：33或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：34或其活性片段的互补检测探针；
引物/探针集CT11包括包含SEQ ID NO：35或其活性片段的正向引物、包含SEQ ID NO：36或其活性片段的反向引物以及包含SEQ IDNO：37或其活性片段的互补检测探针；以及
引物/探针集CT(mpx)包括包含SEQ ID NO：38或其活性片段的第一正向引物、包含SEQ ID NO：39或其活性片段的第二正向引物、包含SEQ ID NO：40或其活性片段的反向引物以及包含SEQ ID NO：41或其活性片段的检测探针。
25.权利要求24的试剂盒，其中至少一种检测探针包含可检测标记。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记直接地附着于至少一个检测探针。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记间接地附着于至少一个检测探针。
28.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记是直接地可检测的。
29.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记是间接地可检测的。
30.权利要求25的试剂盒，其中所述可检测标记包含附着在至少一个检测探针的5′末端的荧光部分。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述至少一个检测探针进一步包含附着在3′末端的淬灭剂部分。
32.权利要求31的试剂盒，其中所述荧光部分包含6-羧基荧光素，并且所述淬灭剂部分包含Black Hole Quencher。
33.一种检测测试样品中的沙眼衣原体的方法，所述方法包括以下步骤：
提供怀疑含有沙眼衣原体核酸的测试样品；
用至少一种权利要求1的寡核苷酸接触所述测试样品，从而如果沙眼衣原体核酸存在于测试样品中，则所述至少一种寡核苷酸可以与所述沙眼衣原体核酸杂交；以及
检测与沙眼衣原体核酸杂交的任何寡核苷酸，其中与沙眼衣原体核酸杂交的寡核苷酸的检出表明测试样品中沙眼衣原体的存在。
34.一种检测测试样品中的沙眼衣原体的方法，所述方法包括以下步骤：
提供怀疑含有沙眼衣原体核酸的测试样品；
使所述测试样品与权利要求13的寡核苷酸的集合的至少一个引物集接触，从而如果沙眼衣原体核酸存在于测试样品中，则所述引物集的至少一种引物可以与所述沙眼衣原体核酸杂交；以及
检测与沙眼衣原体核酸杂交的任何引物，其中与沙眼衣原体核酸杂交的引物的检出表明测试样品中沙眼衣原体的存在。
35.一种检测测试样品中的沙眼衣原体的方法，所述方法包括以下步骤：
提供怀疑含有沙眼衣原体核酸的测试样品；
使所述测试样品与权利要求14的寡核苷酸的集合的至少一个引物/探针集接触，从而如果沙眼衣原体核酸存在于测试样品中，所述引物/探针集的至少一种引物或探针可以与所述沙眼衣原体核酸杂交；以及
检测与沙眼衣原体核酸杂交的任何引物或探针，其中与沙眼衣原体核酸杂交的引物或探针的检出表明测试样品中沙眼衣原体的存在。
36.权利要求33、34或35的方法，其中检测的步骤包括扩增所有或部分沙眼衣原体核酸来获得沙眼衣原体扩增子，并检测任何沙眼衣原体扩增子。
37.权利要求36的方法，其中扩增所有或部分沙眼衣原体核酸包括使所述测试样品经历在适合的扩增条件之下以及在存在适合的扩增反应试剂的情况下进行的核酸扩增反应。
38.权利要求37的方法，其中所述扩增反应利用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)或Taq-ManTM分析来进行。
39.权利要求33、34或35的方法，其中所述测试样品包括选自由尿液、精液、唾液、眼睛晶状体液、淋巴液、子宫颈内的、尿道的、直肠的、阴道的、外阴-阴道的和鼻咽的样品构成的组的体液。
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