JPWO2002101042A1 - 核酸増幅又は検出反応用試薬の安定化方法ならびに保存方法 - Google Patents

Abstract

キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法のための反応用試薬の安定化方法ならびに長期保存方法、病原性微生物ならびにウイルスの高感度検出方法。

Description

技術分野
本発明は、遺伝子工学分野並びに臨床分野において有用な標的核酸の増幅及び／又は検出方法のための反応用試薬の安定化ならびに保存方法に関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）があるが、それは米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号に詳細に記述されている。もう一つの例としては、トレンズ イン バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１０巻、１４６〜１５２頁（１９９２）に記載の逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙げられる。
さらに、別法としては、欧州第３２０，３０８号公開公報に記述されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、あるいはＰＣＲ プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，１９９０）２４５〜２５２頁に記述されている転写増幅システム（ＴＡＳ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）法が挙げられる。上記４法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうため設定温度にするために要する時間が必要であり、そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平７−１１４７１８号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２７１０１５９号に記載のＱβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第５，８２４，５１７号、国際公開第９９／０９２１１号パンフレット、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットあるいは、国際公開第９９／４９０８１号パンフレット等に記載の種々の改良ＳＤＡ法が挙げられる。米国特許番号第５，９１６，７７７号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライマーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチド３リン酸を大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたＤＮＡ断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のＤＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことがある。
また、米国特許番号第５，８２４，５１７号記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、少なくとも３’末端にＤＮＡが配置された構造を必須要件とするキメラプライマーを使用するＤＮＡ増幅方法である。また、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、３’突出末端を生じさせる制限酵素が必要である。また、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とする。さらに、国際公開第９９／４９０８１号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少なくとも１種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を必要とする。一方、米国特許番号第５，９１６，７７７号は、オリゴヌクレオチドを合成するために、３’末端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使用してＤＮＡを合成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを回収して再利用するというものである。該方法では、プライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要がある。また、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は増幅に４種類のプライマーを必要とし、また、増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しないＤＮＡである。
さらに、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いた等温核酸増幅方法として、国際公開第００／５６８７７号パンフレットあるいは国際公開第０２／７１３９号パンフレットに記載のＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法がある。
しかしながら、上記の方法に用いる反応用試薬は、室温では不安定なものが多く、当該試薬を使用する際には、氷上で保冷しながら作業をすることがほとんどであった。また、これらの反応用試薬は４℃以下あるいは−２０℃以下で保存するものがほとんどであり、その保存方法にも厳重な注意が必要であった。そのため室温でも長時間安定であり、保存のための冷蔵庫あるいは冷凍庫を必要としない反応用試薬の安定化方法及び／又は保存方法が求められていた。
発明の目的
本発明の主な目的は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法のための反応用試薬の安定化方法ならびに長期保存方法、さらに病原性微生物ならびにウイルスの高感度検出方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、エンドリボヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下に目的とする領域のＤＮＡを増幅する方法を用いたウイルスあるいは病原性微生物の高感度検出方法を見出した。さらに、上記目的とする領域のＤＮＡを増幅する方法のための試薬の安定化方法ならびに長期保存法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１の発明は、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅及び／又は検出方法に用いられる反応用試薬の安定化方法であって、
（ｉ）マグネシウム塩、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）からなる群より選択される少なくとも一つの試薬が他の試薬と反応前は分別されており、
（ｉｉ）分別された酵素含有の試薬においては塩濃度を上げることなく酵素濃度を上げており、分別した試薬を混合した後の増幅工程においての至適塩濃度条件を満たすように他の分別された試薬の塩濃度が調整されている、
ことを特徴とする反応用試薬の安定化方法に関する。
本発明の第１の発明において、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する試薬と、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）、マグネシウム塩を含有する試薬の２種からなる反応用試薬であってもよく、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の塩濃度が増幅工程においての至適塩濃度以下の塩濃度であってもよく、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が増幅工程においての酵素濃度より高濃度であってもよく、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が分別された試薬を混合後の増幅工程において至適酵素濃度となるように調整されていてもよい。
本発明の第２の発明は、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅及び／又は検出方法に用いられる反応用試薬キットであって、
（ｉ）マグネシウム塩、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）からなる群より選択される少なくとも一つの試薬が他の試薬と反応前は分別されており、
（ｉｉ）分別された酵素含有の試薬においては塩濃度を上げることなく酵素濃度を上げており、分別した試薬を混合した後の増幅工程においての至適塩濃度条件を満たすように他の分別された試薬の塩濃度が調整されている、
ことを特徴とする反応用試薬キットに関する。
本発明の第２の発明において、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する試薬と、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）、マグネシウム塩を含有する試薬の２種からなる反応用試薬であってもよく、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の塩濃度が増幅工程においての至適塩濃度以下の塩濃度であってもよく、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が増幅工程においての酵素濃度より高濃度であってもよく、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が分別された試薬を混合後の増幅工程において至適酵素濃度となるように調整されていてもよく、分別された試薬混合物の塩濃度調整用試薬を包含してもよい。
本発明の第３の発明は、試料中の病原性微生物及び／又はウイルスの存在を検出するための方法であって、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程；および、
（ｃ）（ｂ）工程により増幅された標的核酸を検出する工程、
を包含し、
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、下記一般式で表される病原性微生物検出用のキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、病原性微生物が結核菌、ＨＣＶ、クラミジア、非定型抗酸菌、淋菌、ＨＢＶ、ＨＩＶ、黄色ブドウ球菌、マイコプラズマ又はＭＲＳＡからなる群から選択されることを特徴とするキメラオリゴヌクレオチドプライマーであることを特徴とする病原性微生物及び／又はウイルスの検出方法に関する。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
本発明の第３の発明において、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用しても良い。
本発明の第４の発明は、下記群から選択される病原性微生物及び／又はウイルスの検出のためのプライマーに関する。
（１）配列表の配列番号７、８、２１、２２、１６２、１６３、１７０又は１７１でそれぞれ表される核酸配列を有する結核菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（２）配列表の配列番号１５、１６、８１〜８６又は８８〜９１でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＣＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（３）配列表の配列番号１７〜２０、１２１〜１２７、１３０〜１３５、１６６又は１６７でそれぞれ表される核酸配列を有するクラミジア検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（４）配列表の配列番号２５〜３１でそれぞれ表される核酸配列を有する非定型抗酸菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（５）配列表の配列番号３８〜６３、１６４又は１６５でそれぞれ表される核酸配列を有する淋菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（６）配列表の配列番号７１〜７８でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＢＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（７）配列表の配列番号９５〜１０３でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＩＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（８）配列表の配列番号１０８〜１１７でそれぞれ表される核酸配列を有する黄色ブドウ球菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（９）配列表の配列番号１３９〜１４６でそれぞれ表される核酸配列を有するマイコプラズマ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、及び
（１０）配列表の配列番号１５２〜１５５でそれぞれ表される核酸配列を有するＭＲＳＡ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー。
本発明の第５の発明は、下記群から選択される病原性微生物及び／又はウイルスの検出のためのプローブに関する。
（１）配列表の配列番号１１、１２又は１７２でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される結核菌検出用プローブ、
（２）配列表の配列番号８７又は９２でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＨＣＶ検出用プローブ、
（３）配列表の配列番号１２８、１３６又は１６８でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるクラミジア検出用プローブ、
（４）配列表の配列番号３２又は３３でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される非定型抗酸菌検出用プローブ、
（５）配列表の配列番号６４〜６８でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される淋菌検出用プローブ、
（６）配列表の配列番号７９又は８０でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＨＢＶ検出用プローブ、
（７）配列表の配列番号１０４又は１０５でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＨＩＶ検出用プローブ、
（８）配列表の配列番号１１８又は１１９でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される黄色ブドウ球菌検出用プローブ、
（９）配列表の配列番号１４７〜１４９でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるマイコプラズマ検出用プローブ、及び
（１０）配列表の配列番号１５６又は１５７でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＭＲＳＡ検出用プローブ。
本発明の第６の発明は、本発明の第３の発明の病原性微生物及び／又はウイルスの検出方法に使用されるキットであって、本発明の第９の発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする病原性微生物及び／又はウイルスの検出用キットに関する。
本発明の第６の発明において、さらに本発明の第５の発明のプローブを含有する病原性微生物及び／又はウイルスの検出用キットであってもよい。
発明の詳細な説明
本明細書においてデオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド（本明細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、ＤＮＡ鎖の伸長に寄与することができ、さらに、その３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の３’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは１以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、当該リボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）リボヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、ＤＮＡポリメラーゼがその３’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で１以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは７−デアザグアニンのような修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さらに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的なエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によるプライマーの分解を防ぐ観点からは、例えば、（α−Ｓ）リボヌクレオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用できる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第５，００３，０９７号記載の硫化反応用試薬（グレンリサーチ社製）を用いた方法で調製した（α−Ｓ）リボヌクレオチド３リン酸、あるいは２−ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＣＥ ホスホアミダイド試薬（グレンリサーチ社製）を用いて作製することができる。
また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定するものではないが、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を３’末端又は３’末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のＤＮＡ合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーよりＤＮＡポリメラーゼで伸長されたＤＮＡ鎖（プライマー伸長鎖）に含まれるリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで認識あるいは切断されるような構造を有しており、当該リボヌクレオチドはその３’末端又は３’末端側に配置されている。本発明を特に限定するものではないが、例えば、鋳型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮａｓｅＨを作用させた場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴヌクレオチドプライマーと伸長により合成されたＤＮＡ鎖の間にニックの入った二本鎮ＤＮＡが生じる。さらに、該ニックの入った部位からＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換反応がおこる。従って、プライマーの３’末端から核酸鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアーゼにより切断されることができ、そしてＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは全て本発明の方法に使用することができる。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、その３’末端がＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な形に修飾されており、エンドヌクレアーゼによる切断によって生じた３’末端からＤＮＡの伸長が行われるものが包含される。
また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側には、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいてもよい。該ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼあるいはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが例示される。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
言い換えれば、鋳型核酸にアニーリングした上記のキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。即ち、上記の二本鎖ＤＮＡのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。特に限定されるものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、特にＤＮＡとＲＮＡとから形成された二本鎖核酸のＲＮＡ部分に作用するエンドリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すように、約５０℃〜約７０℃での反応では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨが本発明の方法に使用することができる。また、本発明の方法においては、耐熱性のリボヌクレアーゼも好適に使用できる。該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市販のＨｙｂｒｉｄａｓｅ^ＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）の他、好熱性バチルス属細菌、サーマス属細菌、ピロコッカス属細菌、サーモトガ属細菌、アルカエオグロバス属細菌、メタノコッカス属細菌、サーモコッカス属細菌等由来のＲＮａｓｅＨ等も好適に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。
また、上記ＲＮａｓｅＨは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。さらに、細胞性ＲＮａｓｅＨあるいはウイルス性ＲＮａｓｅＨのいずれであってもよい。例えば、上記細胞性ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌ＲＮａｓｅＨＩが、ウイルス性ＲＮａｓｅＨとしてはＨＩＶ−１由来ＲＮａｓｅＨが例示される。本発明の方法においてＲＮａｓｅＨは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のいずれもが使用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来ＲＮａｓｅＨＩ、ピロコッカス属細菌由来、アルカエオグロバス属細菌由来あるいはサーモコッカス属細菌由来のＲＮａｓｅＨＩＩが好適に使用できる。
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅＨの切断反応の効率は上記プライマーの３’末端近傍の塩基配列に左右され、所望のＤＮＡの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するＲＮａｓｅＨに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。
本明細書において使用されている「ニックを入れる」もしくは「ニッキング」という語は、二本鎖核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。たとえば、ＲＮａｓｅＨはＤＮＡとリボヌクレオチドを含むＤＮＡとのハイブリッド二本鎖核酸に作用し、二本鎖のうちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部分を選択的に切断することにより、当該ハイブリッド二本鎖核酸にニックを入れる。
なお、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えばＭｎ^２＋の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明の方法を実施することができる。すなわち、Ｍｎ^２＋を含有する緩衝液中で上記のＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮａｓｅＨ活性を示すことができる、上記の態様はＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。
すなわち、上記のようにＲＮａｓｅＨ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現するような条件で使用することができる。
当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド３リン酸としてＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。また、ｄＵＴＰを基質として用いてもよい。さらに、当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）のアナログ、たとえば７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰの３リン酸等を含んでいてもよい。また、ｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有する誘導体、例えばアミノ基を有するｄＵＴＰを含んでいてもよい。当該方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該プライマーは、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。さらに、本発明の方法においては、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと通常のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて使用することもできる。
本発明の方法においては、使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。特に限定するものではないが、例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨを使用する反応の途中で該ＲＮａｓｅＨをさらに添加してもよい。添加する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素であってもよい。すなわち、反応途中で添加することにより、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性質には何ら限定はない。
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。
上記のＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。
本明細書において、鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド２本鎖のいずれもが本発明において鋳型となる核酸として好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）を施したものあるいは一本鎖ＤＮＡに変性する工程を施さないもののいずれもが好適に使用できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の標的核酸の増幅又は検出方法のための反応用試薬の安定化方法ならびに長期保存方法
本発明の反応用試薬は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを少なくとも１種類使用し、さらにエンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを用いる標的核酸の増幅方法あるいは検出方法において使用することができる。
本発明の反応用試薬は、鋳型核酸に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、置換鎖に相補的なもう１種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの２種のプライマーを使用して実施することができる標的核酸の増幅方法に使用できる。この場合、一方のプライマーは鋳型となるＤＮＡ鎖に結合して鎖置換反応を起し、そして他方のプライマーは上記の鎖置換反応によって遊離した置換鎖に結合し、新たな鎖置換反応を開始する。この態様を使用すると、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機能できることは明らかである。このように鋳型量が増加することにより、非直線的に増幅産物が増加していく。
さらに、別の態様としては、二本鎖の鋳型ＤＮＡと２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法のための反応用試薬が例示される。当該方法において、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が再度生成される。
本発明の反応用試薬は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法に使用することができる。当該鋳型交換反応においては、鋳型となる二本鎖核酸と、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下に、該鋳型に相補的な２種のプライマー伸長鎖が合成される。該プライマー伸長鎖の合成の途中において、プライマー伸長鎖のそれぞれの鋳型から他方のプライマー伸長鎖への鋳型の交換が起こる。
ここで、鋳型交換反応とは、２本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際に、ＤＮＡポリメラーゼがその鋳型を交換し、他方のＤＮＡポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鋳型として、以降の相補鎖合成を行うことを言う。言い換えれば、鋳型となる２本鎖核酸をそれぞれのプライマー及び鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼで処理し、該鋳型に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応において、該伸長鎖を合成中に、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマー伸長鎖が当初の鋳型から、他方のプライマー伸長鎖へと能動的にスイッチングせしめる反応を言う。ＤＮＡポリメラーゼが鋳型交換反応を行う能力を有することは、特に限定するものではないが、たとえば後述の実施例中の参考例３に記載の方法によって確認することができる。
本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＵ１２０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２０）より日本特許第２９７８００１号に記載の方法によって調製することもできる。
本発明の反応用試薬を用いた標的核酸の増幅方法においては、増幅領域が連なった重合体を生成する場合がある。このような重合体は増幅領域が複数個、いずれも同じ向きに連なったものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。当該重合体の生成は、増幅される領域、該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるいは反応の条件等により影響を受けることが考えられている。
上記の重合体は、増幅領域を複数個含むものである。当該重合体は、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズし、当該重合体が強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、重合体より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得ることもできる。
本発明の核酸の増幅方法の１つの特徴としては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸の合成方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があり、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置を必要とするが、本発明の方法においては一定温度を保持できる装置のみでも実施することができる。このように、本発明の方法は、単一の温度で実施することができる。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリングが低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシーのレベルを設定して実施される。特に限定するものではないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜約７０℃である。特に高温条件下で反応を行う場合には、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマーを使用することが好ましい。このように反応温度を上げることの効果としては、鋳型ＤＮＡの二次構造を解消できることが挙げられ、ＧＣ含量の高い鋳型核酸を使用した場合にも所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域を増幅する場合においても同様の効果がある。該効果は、約６０ｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲で、さらに約６０ｂｐ〜約１５００ｂｐの範囲で認められる。
さらに、鋳型となる核酸のＧＣ含量に応じて反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができる。例えば、鋳型となる核酸としてＧＣ含量の低いものを使用する場合には、増幅する鎖長やプライマーのＴｍ値にもよるが、５０〜５５℃で本発明の増幅反応を行うことができる。
また、本発明の方法において、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来の核酸の増幅を１種類の酵素のみで簡便に実施することができる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方法に鋳型ＤＮＡとして使用することもできる。
いずれの場合においても、本発明の方法においては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応温度を低下させて反応を停止させるか、または基質のうちのいずれか一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰り返される。
本発明の核酸の増幅方法は、核酸の増幅を利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、標識、塩基配列の決定に使用することができる。
また、本発明の核酸の増幅方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ核酸増幅方法、ＤＮＡチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増幅方法として使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法において使用するプライマーの利用効率は、ほぼ１００％であり、従来の方法、例えばＰＣＲ法の利用効率に比べて５倍〜１０倍高くすることができる。
また、本発明の核酸増幅方法は、鋳型となる核酸の塩基配列に忠実に増幅産物を生成することができる。本発明の方法におけるＤＮＡ合成の誤りの頻度を得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって確認したところ、高い忠実度で核酸を増幅できることが知られているＬＡ−ＰＣＲ法と本発明の方法のそれぞれで得られた増幅産物中に見出された誤りの頻度は同程度であった。すなわち、本発明の方法はＬＡ−ＰＣＲ法に匹敵する忠実度を有している。
本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば２００ｂｐ以下、さらに好ましくは１５０ｂｐ以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、ｄＵＴＰを基質として取り込ませることができる。したがって、ｄＵＴＰを基質に用いた場合には、ウラシル Ｎ−グリコシダーゼ（ｕｒａｃｉｌ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：ＵＮＧ）を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができる。
標的核酸の検出には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。また、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。さらに、標的核酸の増幅工程時に生成するピロリン酸をマグネシウム塩のような不溶性物質とさせた後に、その濁度を測定してもよい。さらに上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、検出工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド（ＲＮＡ）プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅ＤＮＡにアニーリングした場合、ＲＮａｓｅＨは該プローブを分解する。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。ＲＮａｓｅＨを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、ＦＲＥＴ則の標識対である６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−６−ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ）との組み合わせ、あるいは非−ＦＲＥＴ則の標識対である６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）が好適に使用できる。
さらに、本発明は前記の標的核酸の検出方法に使用されるプローブを提供する。本発明のプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば１９８９年、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、使用するプローブのＴｍ値より約２５℃低い温度で４時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用するプライマーを１種類もしくは２種類と従来法よりも少なくすることができる。ｄＮＴＰのような試薬もＰＣＲ等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はＰＣＲ法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
本発明の方法に用いる反応液を調製するための反応用試薬は、反応液に含有される各種構成成分をそれぞれ別のコンポーネントとして保存することができるが、操作の簡便性の観点からは、複数の構成成分があらかじめ混合されたプレミックス溶液とすることができる。該反応用試薬の場合、試薬の安定性の観点から、該溶液中のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの本来のプライマーとしての機能を消失させる反応を抑制するような組成のプレミックス溶液が好ましい。特に限定はされないが、該キメラオリゴヌクレオチドプライマーの高分子化及び／又は分解が起こらないような組成のプレミックス溶液にすることが好ましい。本発明の方法の一態様としては、例えば、プレミックス溶液の本発明の方法で用いる核酸合成反応に必要な構成成分から、該反応にかかわるものを少なくとも一つを除くかあるいは可逆的に不活性化することが好ましい。特に限定はされないが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム塩、ｄＮＴＰ混合物からなる群から選択される少なくとも一つを除くかあるいは不活性化することにより実施することができる。前記方法により、本発明の方法に用いる反応用試薬は、いずれの温度でも安定化させることができる。さらに、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）の失活を抑制するために酵素を分別してもよい。
すなわち、本発明には、前記分別された成分を含む溶液と、他の成分を含む溶液の２つのプレミックス溶液からなる反応用試薬が包含される。なお、所望により、３種類以上のプレミックス溶液からなる反応用試薬としてもよい。
本発明の方法に用いる反応用試薬の長期保存方法としては、上記安定化方法を利用することができる。長期保存形態としては特に限定はされないが、例えば反応用試薬をキメラオリゴヌクレオチドプライマー溶液と、酵素ならびにマグネシウム塩及びｄＮＴＰ混合物を含む反応用緩衝液の２つに分別した形態にすることが好ましい。さらに本発明の長期保存方法の一態様としては、前記反応用緩衝液には、それぞれ塩を含有させることが好ましい。ここで、塩濃度とは、緩衝成分、マグネシウム塩、イオン強度を調整するための塩（例えば酢酸カリウム等）を含めた塩濃度を意味する。含有塩濃度は、使用するＤＮＡポリメラーゼならびにＲＮａｓｅＨの種類によって適宜調整することができ、好ましくは、前記酵素が安定となるイオン強度を与えるように調整される。その場合、実施例４記載の方法をもちいて至適化することができる。特に限定はされないが、例えば酵素を含有する反応用緩衝液の含有塩濃度は、最終反応時の塩濃度付近、例えば最終反応時の塩濃度の５倍以下、好ましくは３倍以下、さらに好ましくは１．５倍以下である。さらに最終反応時の塩濃度以下でもよい。
特に限定はされないが例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ及びアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨを用いる反応系の場合、ヘペス−水酸化カリウム緩衝液の濃度は、０ｍＭを超えて１６０ｍＭまでの範囲、好ましくは３０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲、特に好ましくは３２ｍＭ〜１０２ｍＭの範囲である。また、マグネシウム塩として、酢酸マグネシウムを用いる場合、その濃度は、０ｍＭを超えて２０ｍＭの範囲、好ましくは３ｍＭ〜１５ｍＭの範囲、特に好ましくは４ｍＭ〜１３ｍＭの範囲である。
さらにイオン強度調整のために酢酸カリウムを用いる場合、その濃度は、０、ｍＭを超えて５００ｍＭの範囲、好ましくは９０ｍＭ〜３６０ｍＭの範囲、特に好ましくは、１００ｍＭ〜３１７ｍＭの範囲である。さらに、必要に応じて塩濃度を調整するための塩濃度調整用試薬が分別されていてもよい。
また、前記キメラオリゴヌクレオチドプライマー溶液に反応液の塩濃度を調整するための塩を含有させてもよい。この場合には、２種類のプレミックス溶液を用いて反応液を調製することができる。
遺伝子増幅反応のための試薬を調製する際、通常プライマーは滅菌水またはＴＥ緩衝液のような低塩濃度の溶液に溶解されており、その必要量が反応液調製に供されていた（モレキュラークローニング第２版、１４．１８参照）。
本発明において、プライマー溶液中に反応液の構成成分である塩を含有させることにより、酵素を含むプレミックス溶液の塩濃度を酵素の安定化に適したものとすることが可能となった。
本発明の長期保存方法の別態様としては、キメラオリゴヌクレオチドプライマー溶液と、酵素ならびにマグネシウム塩及びｄＮＴＰ混合物を含む反応用緩衝液の２つに分ける形態の場合、反応用緩衝液の酵素含有濃度を高くすることが好ましい。該酵素含有濃度は、使用するＤＮＡポリメラーゼならびにＲＮａｓｅＨの種類によって適宜調整することができる。その場合、実施例４記載の方法をもちいて至適化することができる。特に限定はされないが例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ及びアルカエオグロバス属細菌由来あるいはサーモコッカス属細菌由来のＲＮａｓｅＨを用いる反応系の場合の酵素を含有する反応用緩衝液における含有酵素濃度は、含有酵素が失活しない範囲で高い方が好ましい。
また、鋳型となる核酸に応じて、プライマーを容易に変更できる反応用試薬の態様としては、前記プライマー溶液がプライマーを含まない、プライマー溶解用溶液とすることもできる。
さらに、別の態様としては、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーにかえて、ｄＮＴＰ混合物を他の成分と分別し、この２つのプレミックス溶液との間で酵素の安定性を考慮した塩濃度を設定することもできる。
本発明において、酵素を含むプレミックス溶液の酵素濃度と塩濃度の関係について、最終反応時の酵素濃度ならびに塩濃度を×１倍とすると、塩濃度濃縮率を×１倍周辺値に保ちつつ、酵素濃度濃縮率を×１を越える率にすることが好ましい。
上記酵素濃度の濃縮率と塩濃度の濃縮率は、酵素濃度の濃縮率（Ｅ）／塩濃度の濃縮率（Ｓ）は、１を超えることが好ましく、１００≧Ｅ／Ｓ＞１の範囲、さらに好ましくは、１０≧Ｅ／Ｓ＞１の範囲、特に好ましくは５≧Ｅ／Ｓ＞１の範囲である。
さらに、本発明の方法において、反応用試薬に防腐剤あるいは防カビ剤を添加してもよい。当該防腐剤あるいは防カビ剤は、市販のものが利用でき、特に限定はされないが、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸あるいはその誘導体ならびにその塩、チメロサール又はプロクリン等が好適に使用できる。当該防腐剤あるいは防カビ剤の濃度は、反応用試薬に含有される酵素が試薬保存時及び反応時においても失活しない濃度範囲にすることは当然のことである。
本発明の長期保存方法により約１ヶ月以上保存することができる。この場合、保存温度は特に限定されないが、例えば、５０℃以下の範囲、好ましくは３０℃以下の範囲である。
（２）本発明の病原性微生物及び／又はウイルスの検出方法に用いるプライマー
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方法は、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程；および、
（ｃ）（ｂ）工程により増幅された標的核酸を検出する工程、
を包含する。
上記（ａ）行程において、ＲＮＡを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を１段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせとして例えば、ＡＭＶ ＲＴａｓｅ、ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅあるいはＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅとＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。
さらに、本発明の標的核酸の検出方法により、標的核酸上の塩基配列の違いを判別することができる。この態様においては、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するように、たとえば、該塩基とプライマーの３’末端の塩基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。このようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの３’末端部分の塩基配列と鋳型の塩基配列との間にミスマッチが存在する場合には標的核酸からの増幅が起こらず、増幅産物の生成が見られない。当該方法により、点突然変異、一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ、ＳＮＰ）のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
本発明の標的核酸の検出方法においては、特に限定はされないが例えば、下記群から選択される病原性微生物及び／又はウイルスの検出のためのプライマーが好適に使用できる。
（１）配列表の配列番号７、８、２１、２２、１６２、１６３、１７０又は１７１でそれぞれ表される核酸配列を有する結核菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（２）配列表の配列番号１５、１６、８１〜８６又は８８〜９１でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＣＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（３）配列表の配列番号１７〜２０、１２１〜１２７、１３０〜１３５、１６６又は１６７でそれぞれ表される核酸配列を有するクラミジア検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（４）配列表の配列番号２５〜３１でそれぞれ表される核酸配列を有する非定型抗酸菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（５）配列表の配列番号３８〜６３、１６４又は１６５でそれぞれ表される核酸配列を有する淋菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（６）配列表の配列番号７１〜７８でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＢＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（７）配列表の配列番号９５〜１０３でそれぞれ表される核酸配列を有するＨＩＶ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（８）配列表の配列番号１０８〜１１７でそれぞれ表される核酸配列を有する黄色ブドウ球菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、
（９）配列表の配列番号１３９〜１４６でそれぞれ表される核酸配列を有するマイコプラズマ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー、及び
（１０）配列表の配列番号１５２〜１５５でそれぞれ表される核酸配列を有するＭＲＳＡ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー。
さらに本発明の検出方法においては、下記群から選択される病原性微生物及び／又はウイルスの検出のためのプローブが好適に使用できる。
（１）配列表の配列番号１１、１２又は１７２でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される結核菌検出用プローブ、
（２）配列表の配列番号８７又は９２でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＨＣＶ検出用プローブ、
（３）配列表の配列番号１２８、１３６又は１６８でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるクラミジア検出用プローブ、
（４）配列表の配列番号３２又は３３でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される非定型抗酸菌検出用プローブ、
（５）配列表の配列番号６４〜６８でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される淋菌検出用プローブ、
（６）配列表の配列番号７９又は８０でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＨＢＶ検出用プローブ、
（７）配列表の配列番号１０４又は１０５でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＨＩＶ検出用プローブ、
（８）配列表の配列番号１１８又は１１９でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択される黄色ブドウ球菌検出用プローブ、
（９）配列表の配列番号１４７〜１４９でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるマイコプラズマ検出用プローブ、及び
（１０）配列表の配列番号１５６又は１５７でそれぞれ表される核酸配列を含有する領域から選択されるＭＲＳＡ検出用プローブ。
（３）本発明のキット
本発明のキットは、上記（２）記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを含有することを特徴とする。本発明のキットは、本発明の核酸の増幅方法、または上記の本発明の核酸の検出方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、鎖置換反応におけるＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記の本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、エンドヌクレアーゼは、上記のエンドヌクレアーゼから選択することができる。さらに、該鎖置換反応用緩衝液は、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
また、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー、増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。上記キットのコンポーネントは、本発明の反応用試薬の安定化方法ならびに長期保存方法に従って構築された反応用試薬により構成されたものが好適に使用できる。さらに、本発明のキットにおいて、偽陰性を判断するための内部コントロール（Ｉ．Ｃ．；Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）となる核酸を含んでいてもよい。特に限定はされないが、例えば、配列表の配列番号１７０及び１７１に記載の塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー、配列表の配列番号１７２記載の塩基配列を有する結核菌検出用プローブ並びに内部コントロールとして配列表の配列番号１６９記載の塩基配列を含むプラスミドと配列表の配列番号１７３記載の塩基配列を有する内部コントロール検出用プローブを含むキットが例示される。他の病原性微生物及び／又はウイルスの検出においても同様の内部コントロールを含んだキットが例示される。
実施例
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。
参考例１
（１）本発明の方法に使用される耐熱性ＲＮａｓｅＨのユニット数は、次の方法により算出した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｒＡ）溶液、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに任意に希釈した酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２×（１１０／１００）×希釈率
参考例２ ＲＮａｓｅＨの調製
本発明で用いるＲＮａｓｅＨは、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製した。すなわち、以下の大腸菌組換体を培養し、該菌体から目的のＲＮａｓｅＨを調製した。
（１）ピロコッカス フリオサス由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド
ピロコッカス フリオサス由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６５４として寄託されている。］を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。参考例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
（２）ピロコッカス ホリコシイ由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド
ピロコッカス ホリコシイ由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＰＨＯ２３８で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＨＯ２３８と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９２として寄託されている。］を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３４．３ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、３３．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分３５．０ｍｌををバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２リットルを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液３４．５ｍｌをバッファーＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（ファルマシア ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５５ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
この画分４．０ｍｌにＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにバッファーＢを添加し、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約１６０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分６．９ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を２回に分けて１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、２４．５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。参考例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
（３）アルカエオグロバス フルギダス由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド
アルカエオグロバス フルギダス由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＡＦＵ２０４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＡＦＵ２０４と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９１として寄託されている。］を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３７．１ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、４０．３ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分４０．０ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２リットルを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液４０．２ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２４０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分７．８ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約６００μｌの濃縮液を４回に分けて１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３０．０キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。参考例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
（４）サーモコッカス リトラリス由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＴＬＩ２０４で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＴＬＩ２０４と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９３として寄託されている。］を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、熱処理上清液を得た。該熱処理上清液を、参考例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
（５）サーモコッカス セラー由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド
サーモコッカス セラー由来ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＴＣＥ２０７で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＴＣＥ２０７と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９４として寄託されている。］を上記（４）と同じ方法で培養、精製し、熱処理上清液を得た。該熱処理上清液について上記（４）と同様の方法で測定した結果、ＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例３
本発明の増幅方法について検討した。
（１）配列表の配列番号１および２記載の配列を有するｐＵＣ１９ ｕｐｐｅｒ １５０ ＰＣＲプライマー、ｐＵＣ１９ ｌｏｗｅｒ ＰＣＲプライマーを使用し、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ１００ｐｇを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られた増幅断片は、マイクロコン−１００で精製後、ＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、ｐＵＣ１９プラスミドのＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングした。上記増幅断片の挿入されたプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体を培養し、その菌体よりＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡ挿入プラスミドｐＵＣ１９−１５０を精製した。このＤＮＡ挿入プラスミドを鋳型にし、配列表の配列番号３及び４記載のＭＣＳ−Ｆ、ＭＣＳ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行った後、マイクロコン−１００（ミリポア社製）で精製し、５３４ｂｐのＰＣＲ増幅断片を得た。上記ＰＣＲ断片１５ｎｇに３０ｐｍｏｌの５’末端を［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルした配列表の配列番号５記載の塩基配列を有するＭＦ２プライマー及び滅菌蒸留水で５μｌとした反応液、さらに配列表の配列番号６記載の塩基配列を有するＭＲ１プライマー３０ｐｍｏｌを加えた反応液を用意した。これらの反応液を９８℃、２分間熱変性後、５５℃まで冷却した後、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液（４２．５ｍＭ トリシン緩衝液（ｐＨ８．７）、１２．５ｍＭ 塩化カリウム、１２．５ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭｄＮＴＰ）２０μｌを添加し５５℃で１５分間反応した。反応終了後、５μｌの反応液に２．５μｌの反応停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノルブルー、０．５％キシレンシアノール）を加えて、９４℃、３分間の熱変性を行った。この反応液１．６μｌを８Ｍ 尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＢＡＳ２０００（フジックス社製）でシグナルを読みとり、ＭＲ１プライマーからの伸長産物を検出した。その結果を図１Ａに示す。図１Ａ中のシークエンスラダーは［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＦ２プライマーを用いてＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（宝酒造社製）を配列決定したものであり、伸長産物の長さを決定するのに使用した。さらに、レーン１はＭＦ２及びＭＲ１プライマーの組み合わせ、レーン２はＭＲ１を用いた場合である。
図１Ａに示したように上記鋳型にＭＲ１プライマーのみを加えて伸長反応した場合はＭＲ１プライマーより鋳型の末端まで伸長した４４８ｂｐのバンドが検出されたが、さらにＭＦ２プライマーを加えることにより、上記のバンドに加えて、ＭＲ１プライマーとＭＦ２プライマーに挟まれた３７３ｂｐのバンドが検出された。従って、最初、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼにより、ＰＣＲ増幅断片を鋳型にしてＭＲ１プライマーより伸長していたものが、途中、鋳型交換により、ＭＦ２プライマーからの伸長鎖を鋳型として伸長したことが確認できた。さらに、鎖置換活性を有する常温菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしてクレノウ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合について、上記と同様の条件で検討を行ったところ、鋳型交換が起こっていることが確認できた。一方、鎖置換活性を有さないタカラ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた場合には鋳型交換は確認できなかった。（２）上記鋳型交換反応に、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖について検討した。最初にＭＦ２プライマー及びＭＲ１プライマーがアニーリングできるＤＮＡ断片を以下のように調製した。ｐＵＣ１９プラスミドを鋳型にＭＣＳＦプライマーとＲＶプライマー（宝酒造社製）およびＭ４プライマー（宝酒造社製）とＭＣＳＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、マイクロコン−１００で精製し、２３６ｂｐと２７１ｂｐのＰＣＲ増幅断片、ＭＳＣＦ−ＲＶ断片及びＭ４−ＭＣＳＲ断片を得た。この２つのＰＣＲ増幅断片の中でＭ４プライマーとＲＶプライマーにはさまれた領域は共通配列である。
次に、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしていない形態の鋳型−プライマー（２）−１とプライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしている形態の鋳型−プライマー（２）−２を以下のように作製した。
（２）−１
ＭＣＳＦ−ＲＶ断片、３０ｎｇに４０ｐｍｏｌの５’末端を［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＦ２プライマーとプロピレンジアミンを最終濃度０．０１％になるよう添加し滅菌蒸留水で５μｌとした反応液およびＭ４−ＭＣＳＲ断片 ３０ｎｇに４０ｐｍｏｌのＭＲ１プライマーとプロピレンジアミンを最終濃度０．０１％になるよう添加し、滅菌蒸留水で５μｌとした反応液を別々に９８℃、２分間熱変性後、５５℃まで冷却した後、それぞれの反応液２．５μｌずつ混合して鋳型−プライマーを調製した。
（２）−２
１５ｎｇのＭＣＳＦ−ＲＶ断片、１５ｎｇのＭ４−ＭＣＳＲ断片、２０ｐｍｏｌの５’末端を［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＦ２プライマー、２０ｐｍｏｌのＭＲ１プライマー、及びプロピレンジアミンを最終濃度０．０１％になるよう添加し、滅菌蒸留水で５μｌとした反応液を９８℃、２分間熱変性後、５５℃まで冷却して鋳型−プライマーを調製した。
上記、鋳型−プライマー反応液５μｌに１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液（４２．５ｍＭトリシン緩衝液（ｐＨ８．７）、１２．５ｍＭ 塩化カリウム、１２．５ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ）２０μｌを添加し５５℃で１５分間反応した。反応終了後、５μｌの反応液に２．５μｌの反応停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノルブルー、０．５％キシレンシアノール）を加えて、９４℃３分間の熱変性を行った。この反応液１．６μｌを８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＢＡＳ２０００（フジックス）でシグナルを読みとりＭＦ２プライマーからの伸長産物を検出した。その結果を図１Ｂに示す。図１Ｂ中のシークエンスラダーは［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＲ１プライマーを用いてＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡを配列決定したものであり、伸長産物の長さを決定するのに使用した。さらに、レーン１は鋳型ＤＮＡ鎖がアニーリングしていない場合、レーン２は鋳型ＤＮＡ鎖がアニーリングしている場合である。
図１Ｂに示したようにプライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしていない形態の鋳型−プライマーの場合にはＭＦ２プライマーより鋳型の末端まで伸長した１６１ｂｐのバンドのみが検出されたが、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしている形態の鋳型−プライマーの場合には、上記のバンドに加えて、ＭＦ２プライマーとＭＲ１プライマーに挟まれた２２３ｂｐのバンドが検出された。従って、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしている場合は、鋳型交換反応が起こることが確認できた。
実施例１
結核菌を対象とした本発明の検出方法について検討した。まず、結核菌ゲノムのうち、比較的ＧＣ含量が低い領域を目的の増幅領域として、ジーンバンク登録番号ＡＬ１２３４５６記載の結核菌ゲノムの塩基配列に従って配列表の配列番号７及び８記載の塩基配列を有するＫ−Ｆ−１０３３−２及びＫ−Ｆ−１１３３−２プライマーをそれぞれ合成した。該プライマー対で挟まれる領域はプライマー部を含めて１０５ｂｐである。次に、鋳型として、乾燥ＢＣＧワクチン（日本ビーシージー製造社製）より結核菌ゲノムを常法により抽出した。該ゲノムを滅菌水にて１μｌあたり１００ｆｇ〜１０ｐｇの範囲で段階希釈した。反応は、以下のようにして行った。即ち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各５０ｐｍｏｌのＫ−Ｆ−１０３３−２及びＫ−Ｆ−１１３３−２プライマーの組み合わせ、９．３７５ＵのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、４．３７５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは４ＵのＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨ、２．７５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、各鋳型量１μｌを添加し滅菌水で最終容量を２５μｌにした。該反応液はあらかじめ６２℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨＩＩにおいてもゲノムＤＮＡを鋳型とした場合において、１００ｆｇ〜１０ｐｇのいずれの濃度においても検出できることを確認した。
実施例２
（１）ＲＮＡプローブを用いた標的核酸の検出方法を検討した。対象としては、結核菌を選択した。鋳型となるＢＣＧゲノムＤＮＡは実施例１で調製したものを用い、反応液５０μｌあたり１ｎｇあるいは１００ｐｇを添加した。次に、使用するプライマーは配列表の配列番号１６２〜１６３に記載の塩基配列を有するＭＴＩＳ２Ｆ及びＭＴＩＳ２Ｒ、検出用プローブは配列表の配列番号１１及び１２に記載の塩基配列を有するＲＮＡプローブＭＴＩＳ及びＭＴＩＳ−２をＤＮＡ合成機を用いて合成した。該プローブは５’末端に６−ＦＡＭ（グレーンリサーチ社製）、３’末端にＴＡＭＲＡ（グレーンリサーチ社製）の蛍光標識を有している。反応条件は、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ及び１８．７５ＵのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩを用いる以外は、実施例１記載と同様にした。上記反応液には、５ｐｍｏｌのＲＮＡプローブを添加し、最終液量を５０μｌにした。該反応液５０μｌのうち２５μｌを５８℃のＩＣＡＮ反応に用いた。ＩＣＡＮ反応及び増幅産物の検出は、スマートサイクラー（宝酒造社製）を用いた。その結果を図２Ａに示す。図２Ａ、Ｂ、Ｃの縦軸は蛍光強度、横軸は時間を示す。図２Ａに示すようにスマートサイクラーによる解析の結果、上記鋳型ＤＮＡ １ｎｇ及び１００ｐｇのいずれの場合でも目的の増幅断片のみをモニターリングすることができた。また、いずれのＲＮＡプローブもリアルタイム検出に好適であることが確認できた。
（２）インターカレーターを用いたｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮ検出系について検討した。対象としてＨＣＶゲノムを選択した。鋳型となるＲＮＡは、以下のようにして調製した。インフォームド コンセントの得られたＣ型肝炎患者の血清３００μｌからトライゾール試薬（ライフテック社製）を使用して該試薬添付の説明書に従い調製し、最終的に注射用水（大塚製薬製）２０μｌに溶かした。このＲＮＡサンプルを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行なった。反応は以下のようにして行った。上記ＲＮＡサンプル２μｌと配列表の配列番号１３、１４に記載のＳＰ６−ＨＣＶ−Ｆプライマー及びＴ７−ＨＣＶ−Ｒプライマーのそれぞれ２０ｐｍｏｌを用いてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（宝酒造社製）でマニュアル通りに反応液量５０μｌを調製した。サーマルサイクラーパーソナルにセットし、５０℃ １５分、９４℃ ２分反応後、９４℃ ３０秒、６０℃３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとして４０サイクル反応を行った。反応終了後、該反応液を２％ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧ アガロースゲルによる電気泳動に供し、目的増幅産物３５０ｂｐを切り出した。その後、ＥＡＳＹＴＲＡＰＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて該キット添付の説明書に従いＤＮＡを回収した。これを鋳型にＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ キット（宝酒造社製）を用いて該キット添付の説明書に従いトランスクリプトＲＮＡを合成した。これをＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮの検討用鋳型とした。
鋳型ＲＮＡ量は、０、１×１０^５、１×１０^６及び１×１０^７コピーになるように添加した。反応液組成は、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５００μＭ ｄＮＴＰｓ、配列表の配列番号１５と１６に記載のプライマー各５０ｐｍｏｌ、５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、２．５ＵのＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬ（宝酒造社製）、各コピー数のトランスクリプトＲＮＡ １μｌ、さらにインターカーレーターとして原液のサイバーグリーン Ｉ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を滅菌水で３０００倍希釈したものを５μｌ添加し、最終液量を５０μｌにした。該反応液２５μｌを５３℃のＩＣＡＮ反応に用いた。ＩＣＡＮ反応及び検出は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ７７００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。その結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示したようにｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮ法においてもリアルタイムに標的核酸を検出できることが確認できた。
（３）インターカレーターを用いたＩＣＡＮ検出系について検討した。対象としてクラミジアゲノムを選択した。ジーンバンク登録番号Ｘ０６７０７記載のクラミジア トラコーマ プラスミドの塩基配列に従って配列表の配列番号１７、１８記載の塩基配列を有するプライマーＣＴ２Ｆプライマー、ＣＴ２Ｒプライマーをそれぞれ合成した。該プライマー対で挟まれる領域は、プライマー部分を含めて１０９ｂｐである。さらに、クラミジア増幅用プライマーとして、配列表の配列番号１９及び２０記載の塩基配列を有するＣＴ−ＦＢ１９−３、ＣＴ−ＲＢ２３−２プライマーも用いた。該プライマー対で挟まれる領域は、プライマー部分を含めて１０７ｂｐである。反応液組成は、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各５０ｐｍｏｌのＣＴ２Ｆ及びＣＴ２ＲプライマーあるいはＣＴ−ＦＢ１９−３及びＣＴ−ＲＢ２３−２プライマー、３５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、８ＵＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、サンプル１μｌを添加し滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液２２．５μｌを分注し、インターカーレーターとして原液を滅菌水で３０００倍希釈した。サイバーグリーン Ｉを２．５μｌ添加し、５５℃でＩＣＡＮ反応に供した。ＩＣＡＮ反応及び検出機器は、スマートサイクラーを用いた。その結果を図２Ｃに示す。図２Ｃに示したように、クラミジア検出系において、インターカレーターを用いた場合でもリアルタイムに標的核酸を検出できることが確認できた。
以上のことから、本発明の方法は標的核酸をリアルタイムで特異的に検出することができることを確認した。
実施例３
本発明の方法に用いる試薬の保存安定性について以下のように検討した。
（１）１．６ｍＭのｄＮＴＰ混合液、１０１ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、３１７ｍＭ 酢酸カリウム、１２．７ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０３％ウシ血清アルブミン、３．２％ジメチルスルホキシド、０．５６Ｕ／μｌのＡｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ及び、０．３５Ｕ／μｌのＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含むＩＣＡＮ反応プレミックス溶液を作製し、４℃および３０℃で約１ヶ月間保存した。
上記ＩＣＡＮプレミックス溶液 ７．８７５μｌに配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各５０ｐｍｏｌの結核菌検出用プライマーＫ−Ｆ−１０３３（６８）及びＫ−Ｒ−１１３３（６８）を含む水溶液１６．１２５μｌを添加した。さらに、上記混合液に実施例１で調製した１００ｐｇ／μｌあるいは１０ｐｇｌ／μｌの濃度のＢＣＧゲノムＤＮＡを含む水溶液１μｌを添加し、６４℃で１時間ＩＣＡＮ反応を行った。反応終了後、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅を確認した。この上記操作を適当な保存日数の間隔で繰り返し行い、電気泳動により得られたＩＣＡＮ増幅産物により、ＩＣＡＮ反応プレミックス溶液の安定性を評価した。その結果を図３に示す。すなわち、図３は、本発明の反応プレミックス溶液の保存安定性を示す電気泳動の結果を示す図であり、図３Ａは４℃保存の場合であり、レーン１は反応プレミックス溶液調製直後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン２は反応プレミックス溶液調製直後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン３は反応プレミックス溶液調製９日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン４は反応プレミックス溶液調製９日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン５は反応プレミックス溶液調製１８日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン６は反応プレミックス溶液調製１８日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン７は反応プレミックス溶液調製２８日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン８は反応プレミックス溶液調製２８日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合を示す。
図３Ｂは３０℃保存の場合であり、レーン１は反応プレミックス溶液調製直後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン２は反応プレミックス溶液調製直後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン３は反応プレミックス溶液調製６日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン４は反応プレミックス溶液調製６日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン５は反応プレミックス溶液調製１０日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン６は反応プレミックス溶液調製１０日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合を示す。
図３に示したように、４℃で保存した場合において、反応プレミックス溶液調製後２８日以上の間、該反応液を用いて安定にＩＣＡＮ反応を行う事ができることを確認した。また、３０℃で保存した場合において、反応プレミックス溶液調製後１０日以上の間、該反応液を用いて安定にＩＣＡＮ反応を行う事ができることを確認した。すなわち、上記条件で反応プレミックス溶液を調製・保存することによりＩＣＡＮ法増幅試薬の長期間保存ができることを確認した。
さらに、Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩの使用量を上記の３、１０、３０倍としたＩＣＡＮプレミックス溶液を調製し、上記の条件で保存試験を行ったところ、上記と同様の結果が得られた。
実施例４
本発明の方法に用いる試薬の安定性及び長期保存性について以下のように検討した。
（１）保存用プレミックス溶液の組成について検討した。すなわち、１４２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、４４４ｍＭ 酢酸カリウム、０．０４４％ウシ血清アルブミン、４．４４％ジメチルスルホキシド、０．８Ｕ／μｌ Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ、及び０．５Ｕ／μｌ ＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液（Ｉ）を調製した。この溶液（Ｉ）５．６２５μｌにさらに、１００ｍＭ 酢酸マグネシウム １μｌと、ｄＮＴＰ混合液 １．２５μｌの割合で添加した割合で添加したプレミックス［Ａ（プライマーなし）］、５０ｐｍｏｌ／μｌの結核菌検出用プライマーＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）各１μｌと、１００ｍＭ 酢酸マグネシウム １μｌの割合で添加したプレミックス［Ｂ（ｄＮＴＰなし）］、５０ｐｍｏｌ／μｌのＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）各１μｌと、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １．２５μｌの割合で添加したプレミックス［Ｃ（酢酸マグネシウムなし）］、５０ｐｍｏｌ／μｌのＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）各１μｌ、１００ｍＭ 酢酸マグネシウム １μｌと、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １．２５μｌの割合で添加したプレミックス［Ｄ］を調製した。該プレミックス溶液のそれぞれを３０℃で２時間保存した後、プレミックス［Ａ］７．８７５μｌに５０ｐｍｏｌ／μｌのＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）を各１μｌ、プレミックス［Ｂ］８．６２５μｌに１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １．２５μｌ添加をしたもの、プレミックス［Ｃ］８．８７５μｌに１００ｍＭ 酢酸マグネシウム１μｌを添加したもの、およびプレミックス［Ｄ］９．８７５μｌをそれぞれ注射用水で２４μｌに調製した後、１００ｐｇ／μｌの濃度のＢＣＧゲノムＤＮＡを１μｌ添加して、６４℃で１時間保持した。反応終了後、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅を確認した。その結果、プレミックス［Ａ］、［Ｂ］あるいは［Ｃ］のような組成が試薬の安定化に好適であることが確認できた。
（２）ＩＣＡＮ反応に必要な全ての構成物質を含む保存用プレミックス溶液と、この溶液からプライマーまたはＭｇ^２＋等を除いた保存用プレミックス溶液について保存中の変化について検討した。すなわち、６９ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、２１５ｍＭ 酢酸カリウム、０．０２２％ウシ血清アルブミン、２．２％ジメチルスルホキシド、８．６ｍＭ 酢酸マグネシウム、１．１ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、０．３８Ｕ／μｌのＡｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ、０．２４Ｕ／μｌのＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、８０ｋＢｑ／μｌの［α−^３３Ｐ］−ｄＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）及び各５．２μＭの結核菌検出用プライマーＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）を含むプレミックス（Ｉ）を調製した。さらに、プレミックス（Ｉ）からプライマーを除いたプレミックス（ＩＩ）、プレミックス（Ｉ）から酢酸マグネシウムを除いたプレミックス（ＩＩＩ）を調製し、これらのプレミックスを３０℃で２時間、５時間、２０時間保存した時点で、各プレミックス３μｌをサンプリングして−２０℃で凍結した。これらのサンプルを１５％アクリルアミドゲル電気泳動に供して、１．５時間泳動した後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。その結果を図４に示す。図４は、オートラジオグラフィーの結果を示す図であり、レーン１はプレミックス（ＩＩＩ）２時間保存の場合、レーン２はプレミックス（ＩＩＩ）５時間保存の場合、レーン３はプレミックス（ＩＩＩ）２０時間保存の場合、レーン４はプレミックス（ＩＩ）２時間保存の場合、レーン５はプレミックス（ＩＩ）５時間保存の場合、レーン６はプレミックス（ＩＩ）２０時間保存の場合、レーン７はプレミックス（Ｉ）２時間保存の場合、レーン８はプレミックス（Ｉ）５時間保存の場合、レーン９はプレミックス（Ｉ）２０時間保存の場合を示す。
図４に示したように、プレミックス（Ｉ）において検出されるような保存中に生成された高分子ＤＮＡは、プレミックス（Ｉ）からプライマーまたは酢酸マグネシウムを除いたプレミックス（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の組成にすることにより、その生成が抑制されることが確認できた。すなわち、反応液中からキメラオリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム塩、ｄＮＴＰ混合物のいずれかを除くことにより、キメラオリゴヌクレオチドプライマー副反応を抑えることができ、試薬を安定化できることを確認した。
（３）プライマー以外のＩＣＡＮ反応に必要な全ての構成物質を含む保存用プレミックス溶液を作成した場合の、保存用プレミックス溶液の濃縮度合い（塩濃度）について検討した。すなわち、１．６ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、１０２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、３１７ｍＭ 酢酸カリウム、１３ｍＭ 酢酸マグネシウム、３．２％ジメチルスルホキシド、０．０３％ウシ血清アルブミン、０．５５６Ｕ／μｌ Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ及び、０．３４９Ｕ／μｌ ＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含むＩＣＡＮ反応プレミックスＡ溶液、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、６４ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、２００ｍＭ 酢酸カリウム、８ｍＭ 酢酸マグネシウム、２％ジメチルスルホキシド、０．０２％ウシ血清アルブミン、０．３５Ｕ／μｌ Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ及び、０．２２Ｕ／μｌ ＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含むＩＣＡＮ反応プレミックスＢ溶液、０．５７ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３６ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１１４ｍＭ酢酸カリウム、４．５ｍＭ 酢酸マグネシウム、１．１％ジメチルスルホキシド、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．２Ｕ／μｌ Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ及び、０．１２５Ｕ／μｌ ＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応プレミックスＣ溶液を調製し、３０℃で保存した。
プレミックスＡ溶液７．８７５μｌ、プレミックスＢ溶液１２．５μｌ、プレミックスＣ溶液２２μｌに、各５０ｐｍｏｌの結核菌検出用プライマーＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）を添加し、注射用水で２４μｌになるように調製した後、ＢＣＧゲノムＤＮＡ １００ｐｇ／μｌまたは１０ｐｇ／μｌを含む水溶液１μｌを添加し６４℃で１時間ＩＣＡＮ反応を行った。反応終了後、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅を確認した。上記操作を適当な時間間隔をおいて行い、電気泳動の結果、得られたＩＣＡＮ増幅産物により反応プレミックス溶液の安定性を評価した。その結果を図５に示す。すなわち、図５は、本発明の反応プレミックスＡ、Ｂ及びＣ溶液の保存安定性を示す電気泳動の結果を示す図であり、レーン１はプレミックスＡ溶液調製１３日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン２はプレミックスＡ溶液調製１３日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン３はプレミックスＢ溶液調製１３日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン４はプレミックスＢ溶液調製１３日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン５はプレミックスＣ溶液調製１３日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン６はプレミックスＣ溶液調製１３日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン７はプレミックスＢ溶液調製１８日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン８はプレミックスＢ溶液調製１８日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン９はプレミックスＣ溶液調製１８日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン１０はプレミックスＣ溶液調製１８日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合を示す。
図５に示したように３０℃保存では、プレミックスＡ溶液で約２週間、プレミックスＢ溶液で約３週間保存できることを確認した。さらに、プレミックスＣ溶液においては、調製後１８日以上たっても安定にＩＣＡＮ反応を行なうことができた。
すなわち、酵素を含有する反応用緩衝液の含有塩濃度は、最終反応時の塩濃度値付近が好適であることが確認できた。従ってその範囲は、最終反応時塩濃度を×１と表した場合、１．５倍以下が好適であった。
（４）酵素を含む溶液を保存する場合、一般的に酵素濃度は高い方が安定である。そこで、保存用プレミックス中の酵素濃度を高濃度に保つために、保存プレミックス中の塩濃度を低濃度に設定し、ＩＣＡＮ反応に不足な分を反応直前に補うように設計した保存用プレミックスの安定性について検討した。すなわち、２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０５％ウシ血清アルブミン、０．８７５Ｕ／μｌのＡｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ及び、０．５５Ｕ／μｌのＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含むＩＣＡＮ反応プレミックス溶液を調製し３０℃で保存した。
上記ＩＣＡＮプレミックス溶液５μｌに各５０ｐｍｏｌの結核菌検出用プライマーＫ−Ｆ−１０３３（６８）、Ｋ−Ｒ−１１３３（６８）、３３．６４ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１０５．２２ｍＭ 酢酸カリウム、４．２１ｍＭ 酢酸マグネシウム、１．３２％ジメチルスルホキシドを含む水溶液１９μｌを添加した。上記混合液に１００ｐｇ／μｌあるいは１０ｐｇ／μｌの濃度のＢＣＧゲノムＤＮＡを含む水溶液１μｌを添加し、６４℃で１時間ＩＣＡＮ反応を行った。反応終了後、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅を確認した。
上記操作を適当な時間間隔をおいて行い、電気泳動の結果得られたＩＣＡＮ増幅産物により、本発明の反応プレミックス溶液の安定性を評価した。その結果を図６に示す。すなわち、図６は、本発明の反応プレミックス溶液の保存安定性を示す電気泳動の結果を示す図であり、レーン１は反応プレミックス溶液調製直後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン２は反応プレミックス溶液調製直後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン３は反応プレミックス溶液調製２１日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン４は反応プレミックス溶液調製２１日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン５は反応プレミックス溶液調製２５日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン６は反応プレミックス溶液調製２５日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合、レーン７は反応プレミックス溶液調製３２日後でＢＣＧゲノム１００ｐｇの場合、レーン８は反応プレミックス溶液調製３２日後でＢＣＧゲノム１０ｐｇの場合を示す。
図６に示したように、３０℃で保存した場合でも、反応プレミックス溶液調製後３２日以上の間、該反応液を用いて安定にＩＣＡＮ反応を行う事ができることを確認した。すなわち、上記条件で反応プレミックス溶液を調製・保存することによりＩＣＡＮ法増幅試薬の長期間保存ができることを確認した。
また、上記（１）〜（４）についてＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼとＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨの組み合わせについて検討をしたところ、同様の結果を得た。
すなわち、最終反応時の酵素濃度（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）ならびに塩濃度を×１としたときの濃縮度合の比、酵素濃縮率／塩濃縮率の比は、１超えると好適であることが確認できた。また当該比率は、５以下が好適であることが確認できた。
さらに上記（１）〜（４）について、使用するＲＮａｓｅＨを３、１０、３０倍量に増やして同様の実験を行ったところ、同じ結果が得られた。
実施例５
本発明の方法を用いた非定型抗酸菌の検出について検討した。まず、マイコバクテリウム アビウムとマイコバクテリウム イントラセルラーの陽性コントロールを作製した。まず７４ｍｅｒの合成プライマー１０本を用意し、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．３、ｐ２９８〜ｐ３００（１９９０）記載の方法に従い、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応とそれに続くＰＣＲ反応を行い、配列表の配列番号２３と２４記載の塩基配列を有するマイコバクテリウム アビウムとマイコバクテリウム イントラセルラー由来１６ｓ ＲＮＡ遺伝子配列の一部である増幅産物５６０ｂｐを得た。該増幅産物をｐＴ７ Ｂｌｕｅ ＴベクターにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アビウム陽性コントロールプラスミドとイントラセルラー陽性コントロールを調製した。次に配列表の配列番号２５〜３１記載の塩基配列を有するＭｙｃｏ−Ｆ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３、Ｍｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｒ−２Ｉ、Ｍｙｃｏ−Ｒ−２Ａプライマーをそれぞれ合成した。反応は以下のようにして行った。すなわち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰ混合物、４．４ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは４ＵのＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨ、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となるアビウム陽性コントロール１０^５コピーまたはイントラセルラー陽性コントロール１０^５コピー及び各２５ｐｍｏｌの上流プライマーと下流プライマーを添加して最終容量を２５μｌにした。該反応液はあらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間保持した。アビウム陽性コントロールを鋳型にした場合、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもＭｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａの各プライマー対で、それぞれ１０１ｂｐ、９６ｂｐ、９６ｂｐ、１０１ｂｐ、９６ｂｐ、９６ｂｐ、１０６ｂｐ、１０１ｂｐ、１０１ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認できた。一方、Ｍｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ｉ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ｉ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ｉの各プライマー対については増幅産物は得られなかった。
また、イントラセルラー陽性コントロールを鋳型にした場合、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもＭｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ｉ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ｉ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−１、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−１−２、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ｉの各プライマー対のとき、それぞれ１０１ｂｐ、９６ｂｐ、９６ｂｐ、１０１ｂｐ、９６ｂｐ、９６ｂｐ、１０６ｂｐ、１０１ｂｐ、１０１ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認できた。一方、Ｍｙｃｏ−Ｆ−１とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−２とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａ、Ｍｙｃｏ−Ｆ−３とＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａの各プライマー対については増幅産物は得られなかった。
以上の結果からＭｙｃｏ−Ｒ−２ＩまたはＭｙｃｏ−Ｒ−２Ａのプライマーを用いることにより、鋳型特異的に反応し、アビウムとイントラセルラーの識別が可能であることが確認できた。さらに上記増幅断片について、配列表の配列番号３２及び３３記載の塩基配列を有する５’末端がビオチン標識されたアビウム プローブ（ａｖｉｕｍ−ｐｒｏｂｅ）あるいはイントラセルラープローブ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ−ｐｒｏｂｅ）を用いてドットハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは以下の条件で行った。すなわち、９８℃、５分間変性後、氷上にて急冷させた反応液１μｌをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ^ＴＭ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）にスポットし、ＵＶ照射後、ハイブリバックに入れ、０．５Ｍ リン酸水素二ナトリウム（ｐＨ７．２）、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、７％ラウリル硫酸ナトリウムのハイブリ溶液１０ｍｌを添加し、４２℃でプレハイブリダイゼーションを３０分間行なった。次に１０μｌの上記ａｖｉｕｍ−ｐｒｏｂｅ又はｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ−ｐｒｏｂｅ １００ｎｇ／μｌ溶液を熱変性後、プレハイブリダイゼーション反応系に添加した。４２℃、６０分間ハイブリダイゼーション後、６６．６ｍＭ 塩化ナトリウム、６６．６ｍＭ クエン酸三ナトリウム水和物、０．１％ラウリル硫酸ナトリウムの溶液で室温にて５分間２回洗浄し、洗浄バッファー（０．３Ｍ 塩化ナトリウム、１７．３ｍＭ リン酸二水素ナトリウム二水和物，２．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム）６ｍｌに５ｍｇ／ｍｌのＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ製）を２μｌ添加し、４２℃、１２分間インキュベート後、洗浄バッファーで、室温で２回洗浄した。その後、０．１Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）１０ｍｌ室温で洗浄し、０．１Ｍ クエン酸バッファー５ｍｌ、３％過酸化水素５μｌ、２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンエタノール溶液（ＴＭＢ、ナカライ社製）２５０μｌの混合溶液で暗室にて約１０分間反応させた。発色後、脱イオン水にて反応停止させた。
その結果、アビウム陽性コントロール由来増幅産物は５’末端ビオチン標識ａｖｉｕｍ−ｐｒｏｂｅのみでシグナルが確認でき、５’末端ビオチン標識ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ−ｐｒｏｂｅではシグナルが得られなかった。一方、イントラセルラー陽性コントロール由来増幅産物は、５’末端ビオチン標識ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ−ｐｒｏｂｅのみでシグナルが確認でき、５’末端ビオチン標識ａｖｉｕｍ−ｐｒｏｂｅではシグナルが得られなかった。このことから、これらのプローブを使用することによりアビウムとイントラセルラーの識別が可能であることが確認できた。
実施例６
本発明の方法を用いた淋菌の検出について検討した。すなわち、実施例５に記載の方法と同じ方法で、配列表の配列番号３４〜３７記載の塩基配列を有するナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来ＣｐｐＢ遺伝子、ナイセリア ゴノレア プラスミド ｐＪＤ４遺伝子、及びナイセリア ゴノレアＤＮＡ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ（Ｍ．ＮｇｏＭＩＩＩ）遺伝子の各５６０ｂｐの増幅断片を得た。また、ナイセリア ゴノレア Ｎ−４ Ｃｙｔｏｓｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子については、６７ｍｅｒの合成プライマー１０本を用意し、同じ方法で４９０ｂｐの増幅断片を得た。この増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入し、陽性コントロールＡ、陽性コントロールＢ、陽性コントロールＣ及び陽性コントロールＤとした。
次に配列表の配列番号３８〜６３、１６４〜１６５に記載の塩基配列を有するＮＥＩ−５１０３、ＮＥＩ−５１５０、ＣｐｐＢ−Ｆ１、ＣｐｐＢ−Ｆ２、ＣｐｐＢ−Ｆ３、ＣｐｐＢ−Ｒ１、ＣｐｐＢ−Ｒ２、ＣｐｐＢ−Ｒ３、ｐＪＤＢ Ｆ−１、ｐＪＤＢ Ｆ−２、ｐＪＤＢ Ｒ−１、ｐＪＤＢ Ｒ−２、ｐＪＤＢ Ｒ−３、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−１、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−２、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−３、Ｍ．Ｎｇｏ Ｒ−１、Ｍ．Ｎｇｏ Ｒ−２、Ｍ．Ｎｇｏ Ｒ−３、Ｍ．Ｎｇｏ Ｒ−４、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−１、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−２、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−３、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−１、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−２、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−３、ｐＪＤＢ１０Ｆ、ならびにｐＪＤＢ１０Ｒプライマーをそれぞれ合成した。実施例５に記載の条件と同じ条件下、上記陽性コントロールＢ １０^６コピーを鋳型にＮＥＩ−５１０３、ＮＥＩ−５１５０プライマー対でＩＣＡＮ反応を行った。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨを使用しても６９ｂｐの増幅断片をアガロース電気泳動により確認できた。さらに上記増幅断片をナイロンメンブレンにスポット後、配列表の配列番号６４記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＮＥＩ−５１３０ｐｒｏｂｅにより実施例５記載の方法でドットハイブリダイゼーションを行ったところ、目的のシグナルが確認できた。
また、同様に陽性コントロールＡ １０^６コピーを鋳型にＣｐｐＢ−Ｆ１とＣｐｐＢ−Ｒ１、ＣｐｐＢ−Ｆ１とＣｐｐＢ−Ｒ２、ＣｐｐＢ−Ｆ１とＣｐｐＢ−Ｒ３、ＣｐｐＢ−Ｆ２とＣｐｐＢ−Ｒ１、ＣｐｐＢ−Ｆ２とＣｐｐＢ−Ｒ２、ＣｐｐＢ−Ｆ２とＣｐｐＢ−Ｒ３、ＣｐｐＢ−Ｆ３とＣｐｐＢ−Ｒ１、ＣｐｐＢ−Ｆ３とＣｐｐＢ−Ｒ２、ＣｐｐＢ−Ｆ３とＣｐｐＢ−Ｒ３の各プライマー対で実施例５と同じ条件下でＩＣＡＮ反応を行ったところ、全て６０ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認できた。さらに上記増幅断片について、配列表の配列番号６５記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＮＥＩ−ＣｐｐＢｐｒｏｂｅ−１を用いて実施例５に示す方法と同じ方法でドットハイブリダイゼーションを行ったところ、目的のシグナルが確認できた。
さらに陽性コントロールＡ １０^６コピーを鋳型にｐＪＤＢ Ｆ−１とｐＪＤＢ Ｒ−１、ｐＪＤＢ Ｆ−１とｐＪＤＢ Ｒ−２、ｐＪＤＢ Ｆ−１とｐＪＤＢ Ｒ−３、ｐＪＤＢ Ｆ−２とｐＪＤＢ Ｒ−１、ｐＪＤＢ Ｆ−２とｐＪＤＢ Ｒ−２、ｐＪＤＢ Ｆ−２とｐＪＤＢ Ｒ−３の各プライマー対で実施例５と同じ条件下でＩＣＡＮ反応を行ったところ、全て９１ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認できた。また、ｐＪＤＢ１０ＦとｐＪＤＢ１０Ｒのプライマー対で実施例５と同じ条件下でＩＣＡＮ反応を行ったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもすべて７１ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動で確認できた。上記増幅断片をナイロンメンブレンにスポット後、配列表の配列番号６６に示した塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＮＥＩ−ＣｐｐＢｐｒｏｂｅ−２を用いて実施例５記載の方法でドットハイブリダイゼーションを行ったところ、目的のシグナルが確認できた。
また、上記と同様に陽性コントロールＣ １０^６コピーを鋳型にＭ．ＮｇｏＦ−１とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−１、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−１とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−２、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−１とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−３、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−１とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−４、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−２とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−１、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−２とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−２、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−２とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−３、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−２とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−４、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−３とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−１、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−３とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−２、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−３とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−３、Ｍ．Ｎｇｏ Ｆ−３とＭ．Ｎｇｏ Ｒ−４の各プライマー対で実施例５と同じ条件下でＩＣＡＮ反応を行ったところ、全て６０ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認でき、さらに配列表の配列番号６７記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＭ．Ｎｇｏ−ｐｒｏｂｅを用いたドットハイブリダイゼーションを行ったところ、目的のシグナルが確認できた。さらに同条件下、陽性コントロールＤ １０^６コピーを鋳型にＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−１とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−１、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−１とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−２、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−１とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−３、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−２とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−１、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−２とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−２、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−２とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−３、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−３とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−１、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−３とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−２、Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｆ−３とＣｙｔｏｓｉｎｅ Ｒ−３の各プライマー対で実施例５と同じ条件下でＩＣＡＮ反応を行ったところ、全て７０ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認でき、配列表の配列番号６８記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＣｙｔｏｓｉｎｅ−ｐｒｏｂｅを用いたドットハイブリダイゼーションにおいても、目的のシグナルが確認できた。
実施例７
本発明の方法を用いたヒトＢ型肝炎ウイルスＨＢＶ検出について検討した。すなわち、実施例５記載の方法で、配列表の配列番号６９及び７０に示すＨＢＶ Ｘプロテイン遺伝子の一部５６０ｂｐを増幅後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入し、それぞれＨＢＶ陽性コントロール１−Ｔ、ＨＢＶ陽性コントロール１−Ｇとした。次に配列表の配列番号７１〜７８記載の塩基配列を有するＨＢＶ−Ｆ−１、ＨＢＶ−Ｆ−２、ＨＢＶ−Ｆ−３、ＨＢＶ−Ｆ−４、ＨＢＶ−Ｒ−１、ＨＢＶ−Ｒ−２、ＨＢＶ−Ｒ−３、ＨＢＶ−Ｒ−４プライマーをそれぞれ合成した。実施例５の条件下、ＨＢＶ陽性コントロール１−Ｇ １０^６コピーまたはＨＢＶ陽性コントロール１−Ｔ １０^６コピーを鋳型にＨＢＶ−Ｆ−１とＨＢＶ−Ｒ−１、ＨＢＶ−Ｆ−１とＨＢＶ−Ｒ−２、ＨＢＶ−Ｆ−２とＨＢＶ−Ｒ−１、ＨＢＶ−Ｆ−２とＨＢＶ−Ｒ−２の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行なったところ、それぞれ８１ｂｐ、７６ｂｐ、７６ｂｐ、７１ｂｐの目的の増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。
また、実施例５と同じ条件下でＨＢＶ陽性コントロール１−Ｔ又は１−Ｇのそれぞれ１０^６コピーを鋳型にＨＢＶ−Ｆ−３とＨＢＶ−Ｒ−３、ＨＢＶ−Ｆ−３とＨＢＶ−Ｒ−４、ＨＢＶ−Ｆ−４とＨＢＶ−Ｒ−３、ＨＢＶ−Ｆ−４とＨＢＶ−Ｒ−４の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行なったところ、それぞれ８４ｂｐ、７９ｂｐ、７８ｂｐ、７３ｂｐの目的の増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。さらに、ＨＢＶ−Ｆ−１とＨＢＶ−Ｒ−１、ＨＢＶ−Ｆ−１とＨＢＶ−Ｒ−２、ＨＢＶ−Ｆ−２とＨＢＶ−Ｒ−１、ＨＢＶ−Ｆ−２とＨＢＶ−Ｒ−２の各プライマー対による増幅断片をナイロンメンブレンにスポット後、配列表の配列番号７９記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＨＢＶ−ｐｒｏｂｅ１を用いたドットハイブリダイゼーションを行なったところ、目的のシグナルが確認できた。同様に、ＨＢＶ−Ｆ−３とＨＢＶ−Ｒ−３、ＨＢＶ−Ｆ−３とＨＢＶ−Ｒ−４、ＨＢＶ−Ｆ−４とＨＢＶ−Ｒ−３、ＨＢＶ−Ｆ−４とＨＢＶ−Ｒ−４の各プライマー対による増幅断片についても、配列表の配列番号８０記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＨＢＶ−ｐｒｏｂｅ２を用いてドットハイブリダイゼーションを行なったところ、目的のシグナルが確認できた。
実施例８
本発明の方法を用いたＨＣＶ検出について検討した。最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸マグネシウム、１％ジメチルスルホキシド、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５００μＭ ｄＮＴＰｓ、配列表の配列番号８１〜８６、８８〜９１記載のＨＣＶ−Ａ２−ＳとＨＣＶ−Ａ２−Ａ、ＨＣＶ−Ａ４−ＳとＨＣＶ−Ａ４−Ａ、ＨＣＶ−Ａ４−Ｓ１９とＨＣＶ−Ａ４−Ａ１９、ＨＣＶ−Ｆ１とＨＣＶ−Ｒ１、ＨＣＶ−Ｆ２とＨＣＶ−Ｒ２のそれぞれのプライマー対各５０ｐｍｏｌ、２０ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは４ＵのＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨ、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１．２５ＵのＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬ及び実施例２−（２）に記載のＲＮＡトランスクリプト１０^６コピーを鋳型として用い、最終容量を５０μｌにした。該反応液は、あらかじめ５３℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもそれぞれ７４ｂｐ、７６ｂｐ、７８ｂｐ、６１ｂｐ、６１ｂｐの目的の増幅断片を確認した。さらにＨＣＶ−Ａ２−ＳとＨＣＶ−Ａ２−Ａ、ＨＣＶ−Ａ４−ＳとＨＣＶ−Ａ４−Ａ、ＨＣＶ−Ａ４−Ｓ１９とＨＣＶ−Ａ４−Ａ１９の各プライマー対による増幅断片について、配列表の配列番号８７記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＨＣＶ−Ｃ ｐｒｏｂｅを用いてドットハイブリダイゼーションを行ったところ、目的のシグナルを確認できた。同様に、ＨＣＶ−Ｆ１とＨＣＶ−Ｒ１、ＨＣＶ−Ｆ２とＨＣＶ−Ｒ２の各プライマー対による増幅断片についても、配列表の配列番号９２に示す塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＨＣＶ−Ｄ ｐｒｏｂｅを用いたドットハイブリダイゼーションを行ったところ、目的のシグナルが確認できた。
実施例９
本発明の方法において、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮ増幅方法への応用について検討した。対象は、ＨＩＶを選択した。
（１）トランスクリプトＲＮＡの調製
まず、鋳型となるトランスクリプトＲＮＡの調製をおこなった。ＨＩＶ ｇａｇ領域が挿入されたプラスミド（ＡＴＣＣ４０８２９）を購入した。これを鋳型に配列表の配列番号９３と９４記載の塩基配列を有するＳＰ６−ＨＩＶ−Ｆ及びＨＩＶ−Ｒプライマー対、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＨＩＶのｇａｇ領域配列の一部である約１．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を得た。その後、このＰＣＲ増幅産物を鋳型にＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（宝酒造社製）を用いて該キットの説明書に従い、トランスクリプトＲＮＡを合成した。これをＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮの検討用ＲＮＡ鋳型とした。
（２）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮでのＨＩＶ検出用プライマーの検討
配列表の配列番号９５〜１０３記載の塩基配列を有するＨＩＶ−Ｆ１、ＨＩＶ−Ｆ２、ＨＩＶ−Ｆ３、ＨＩＶ−Ｆ４、ＨＩＶ−Ｒ１、ＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｒ４Ｍプライマーをそれぞれ合成した。また、反応は以下のようにして行った。すなわち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、７ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭのｄＮＴＰ混合物、２．２ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは４ＵのＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨ、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、０．６２５ＵのＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬ、１０^６コピーの上記トランスクリプトＲＮＡ及び各２５ｐｍｏｌの上流プライマーと下流プライマーを添加して最終容量を２５μｌにした。該反応液はあらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間保持した。いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもＨＩＶ−Ｆ１とＨＩＶ−Ｒ１、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ４Ｍ、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ４Ｍ、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ４Ｍの各プライマー対より、それぞれ１００ｂｐ、７４ｂｐ、７６ｂｐ、７２ｂｐ、７２ｂｐ、７２ｂｐ、７４ｂｐ、７０ｂｐ、７０ｂｐ、７６ｂｐ、７８ｂｐ、７４ｂｐ、７４ｂｐの目的の増幅断片がアガロース電気泳動により確認できた。さらに上記増幅断片について、配列表の配列番号１０４及び１０５に記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＨＩＶ−Ａ ｐｒｏｂｅ及びＨＩＶ−Ｂ ｐｒｏｂｅを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。その結果、５’末端ビオチン標識ＨＩＶ−Ａプローブの場合はＨＩＶ−Ｆ１とＨＩＶ−Ｒ１プライマー対による増幅産物、５’末端ビオチン標識ＨＩＶ−Ｂプローブの場合はＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｆ２とＨＩＶ−Ｒ４Ｍ、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｆ３とＨＩＶ−Ｒ４Ｍ、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ２、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ３、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ４、ＨＩＶ−Ｆ４とＨＩＶ−Ｒ４Ｍプライマーによる増幅産物において目的のシグナルが確認できた。
実施例１０
本発明の方法を用いた黄色ブドウ球菌の検出について検討した。目的とする増幅領域は、黄色ブドウ球菌由来コアギュラーゼ遺伝子から選択した。まず、配列表の配列番号１０６及び１０７記載の塩基配列を有するｃｏａ−ＰＣＲ−Ｆとｃｏａ−ＰＣＲ−Ｒプライマーを用いて黄色ブドウ球菌ゲノムを鋳型にＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ反応を行い、２２１ｂｐの増幅産物を得た。該増幅断片をｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入し、ｃｏａ遺伝子陽性コントロールとした。
次に配列表の配列番号１０８〜１１７記載の塩基配列を有するｃｏａ−Ｆ１、ｃｏａ−Ｆ２、ｃｏａ−Ｆ３、ｃｏａ−Ｆ４、ｃｏａ−Ｆ５、ｃｏａ−Ｒ１、ｃｏａ−Ｒ２、ｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｒ５プライマーをそれぞれ合成した。実施例５記載の条件下、ｃｏａ遺伝子陽性コントロール １０^６コピーを鋳型にｃｏａ−Ｆ１とｃｏａ−Ｒ１、ｃｏａ−Ｆ１とｃｏａ−Ｒ２、ｃｏａ−Ｆ２とｃｏａ−Ｒ１、ｃｏａ−Ｆ２とｃｏａ−Ｒ２、ｃｏａ−Ｆ３とｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｆ３とｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｆ３とｃｏａ−Ｒ５、ｃｏａ−Ｆ４とｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｆ４とｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｆ４とｃｏａ−Ｒ５、ｃｏａ−Ｆ５とｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｆ５とｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｆ５とｃｏａ−Ｒ５の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行ったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもそれぞれ５９ｂｐ、６９ｂｐ、７５ｂｐ、８５ｂｐ、９５ｂｐ、１０１ｂｐ、９８ｂｐ、８９ｂｐ、９５ｂｐ、９２ｂｐ、１０７ｂｐ、１１３ｂｐ、１１０ｂｐの目的の増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。さらに、ｃｏａ−Ｆ１とｃｏａ−Ｒ１、ｃｏａ−Ｆ１とｃｏａ−Ｒ２、ｃｏａ−Ｆ２とｃｏａ−Ｒ１、ｃｏａ−Ｆ２とｃｏａ−Ｒ２の各プライマー対による増幅産物について、配列表の配列番号１１８に示す配列を有し、５’末端がビオチン標識されたｃｏａ−Ａ ｐｒｏｂｅを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行ったところ、すべてのスポットで目的のシグナルが確認できた。同様に、ｃｏａ−Ｆ３とｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｆ３とｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｆ３とｃｏａ−Ｒ５、ｃｏａ−Ｆ４とｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｆ４とｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｆ４とｃｏａ−Ｒ５、ｃｏａ−Ｆ５とｃｏａ−Ｒ３、ｃｏａ−Ｆ５とｃｏａ−Ｒ４、ｃｏａ−Ｆ５とｃｏａ−Ｒ５の各プライマー対による増幅産物について、配列表の配列番号１１９に示す配列を有し、５’末端がビオチン標識されたｃｏａ−Ｂ ｐｒｏｂｅを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行ったところ、すべてのスポットで目的のシグナルが確認できた。
実施例１１
（１）本発明の方法を用いたクラミジアの検出について検討した。まず、実施例５記載の方法で、配列表の配列番号１２０に示すクラミジア遺伝子の一部である５６０ｂｐを増幅後、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入し、クラミジア陽性コントロールとした。次に配列表の配列番号１２１〜１２７記載の塩基配列を有するＣＴ−ＦＢ１９，ＣＴ−ＦＢ１９−３，ＣＴ−ＦＢ−１９−３−２１，ＣＴ−ＦＢ１９−３−２３，ＣＴ−ＲＢ２１，ＣＴ−ＲＢ２３−２，ＣＴ−ＲＢ２３−２−２４プライマーをそれぞれ合成した。次に実施例５記載の条件下、クラミジア陽性コントロール １０^６コピーを鋳型にＣＴ−ＦＢ１９とＣＴ−ＲＢ２１、ＣＴ−ＦＢ１９とＣＴ−ＲＢ２３−２、ＣＴ−ＦＢ１９−３とＣＴ−ＲＢ２１、ＣＴ−ＦＢ１９−３とＣＴ−ＲＢ２３−２、ＣＴ−ＦＢ１９−３とＣＴ−ＲＢ２３−２−２４、ＣＴ−ＦＢ−１９−３−２１とＣＴ−ＲＢ２３−２、ＣＴ−ＦＢ−１９−３−２１とＣＴ−ＲＢ２３−２−２４、ＣＴ−ＦＢ１９−３−２３とＣＴ−ＲＢ２３−２、ＣＴ−ＦＢ１９−３−２３とＣＴ−ＲＢ２３−２−２４の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行なったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもそれぞれ１２５ｂｐ、１１６ｂｐ、１１６ｂｐ、１０７ｂｐ、１０７ｂｐ、１０７ｂｐ、１０７ｂｐ、１０７ｂｐ、１０７ｂｐの増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。さらに上記増幅断片について、配列表の配列番号１２８記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＣＴ−ｐｒｏｂｅを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行なったところ、全てのスポットで目的のシグナルが確認できた。
（２）さらに、別の領域をターゲットとしたクラミジアの検出について検討した。上記（１）と同じ方法で、配列表の配列番号１２９に示すクラミジア クリプティック遺伝子の一部である５６０ｂｐを増幅後、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入し、クラミジア陽性コントロール２とした。次に配列表の配列番号１３０〜１３５、１６６〜１６７記載の塩基配列を有するＣＴ−Ｆ１２１２−２０、ＣＴ−Ｆ１２１２−２１、ＣＴ−Ｆ１２１２−２２、ＣＴ−Ｒ１２７２−２０、ＣＴ−Ｒ１２７２−２１、ＣＴ−Ｒ１２７２−２２、ＣＴ−Ｆ１２１５−４Ｒ−２２、ならびにＣＴ−Ｒ１２６７−３Ｒ−１８プライマーをそれぞれ合成した。上記（１）記載と同条件下、クラミジア陽性コントロール２ １０^６コピーを鋳型にＣＴ−Ｆ１２１２−２０とＣＴ−Ｒ１２７２−２０、ＣＴ−Ｆ１２１２−２０とＣＴ−Ｒ１２７２−２１、ＣＴ−Ｆ１２１２−２０とＣＴ−Ｒ１２７２−２２、ＣＴ−Ｆ１２１２−２１とＣＴ−Ｒ１２７２−２０、ＣＴ−Ｆ１２１２−２１とＣＴ−Ｒ１２７２−２１、ＣＴ−Ｆ１２１２−２１とＣＴ−Ｒ１２７２−２２、ＣＴ−Ｆ１２１２−２２とＣＴ−Ｒ１２７２−２０、ＣＴ−Ｆ１２１２−２２とＣＴ−Ｒ１２７２−２１、ＣＴ−Ｆ１２１２−２２とＣＴ−Ｒ１２７２−２２の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行なったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもすべて６１ｂｐの目的の増幅産物がアガロース電気泳動により確認できた。さらに上記増幅断片について、配列表の配列番号１３６記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＣＴ−１２３４ｐｒｏｂｅを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行なったところ、全てのスポットで目的のシグナルが確認できた。また、ＣＴ−Ｆ１２１５−４Ｒ−２２とＣＴ−Ｒ１２６７−３Ｒ−１８のプライマー対でＩＣＡＮ反応を行ったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用しても５３ｂｐの目的の増幅産物がアガロース電気泳動により確認できた。さらに上記増幅断片について、配列表の配列番号１６８記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＣＴ−１２３６ｐｒｏｂｅを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行なったところ、全てのスポットで目的のシグナルが確認できた。
実施例１２
本発明の方法を用いたマイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の検出について検討した。まず、実施例５記載の方法で、配列表の配列番号１３７〜１３８記載の塩基配列を有するマイコプラズマニューモニエ由来ＡＴＰａｓｅオペロン遺伝子の一部である５６０ｂｐを増幅後、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入し、それぞれマイコプラズマ ニューモニエ陽性コントロールＡ、マイコプラズマ ニューモニエ陽性コントロールＢとした。次に配列表の配列番号１３９〜１４６記載の塩基配列を有するＭｙｃｏ−１４０、Ｍｙｃｏ１４０−２２、Ｍｙｃｏ−７０６、ＭＰＦ−９１０、Ｍｙｃｏ−１９０、Ｍｙｃｏ−１９０−２２、Ｍｙｃｏ−８５０、ＭＰＲ−１０１６プライマーをそれぞれ合成した。実施例５記載の条件下、マイコプラズマ ニューモニエ陽性コントロールＡ １０^６コピーを鋳型にＭｙｃｏ−１４０とＭｙｃｏ−１９０、Ｍｙｃｏ１４０−２２とＭｙｃｏ−１９０、Ｍｙｃｏ１４０−２２とＭｙｃｏ−１９０−２２、Ｍｙｃｏ−１４０とＭｙｃｏ−１９０−２２の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行なったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもすべて６３ｂｐの目的の増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。また実施例５記載の条件下でマイコプラズマ ニューモニエ陽性コントロールＢ １０^６コピーを鋳型にＭｙｃｏ−７０６とＭｙｃｏ−８５０、ＭＰＦ−９１０とＭＰＲ−１０１６の各プライマー対でＩＣＡＮ反応を行なったところ、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもそれぞれ８５ｂｐ、１０７ｂｐの目的の増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。さらにＭｙｃｏ−１４０とＭｙｃｏ−１９０、Ｍｙｃｏ１４０−２２とＭｙｃｏ−１９０、Ｍｙｃｏ１４０−２２とＭｙｃｏ−１９０−２２、Ｍｙｃｏ−１４０とＭｙｃｏ−１９０−２２の各プライマー対による増幅断片について、配列表の配列番号１４７記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＭｙｃｏ−１７０−ｐｒｏｂｅを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行なったところ、全てのスポットで目的のシグナルが確認できた。同様に、Ｍｙｃｏ−７０６とＭｙｃｏ−８５０のプライマー対による増幅断片についても、配列表の配列番号１４８記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＭｙｃｏ−７３０−ｐｒｏｂｅを用いて同様にドットハイブリダイゼーションを行なったところ、目的のシグナルが確認できた。さらに、ＭＰＦ−９１０とＭＰＲ−１０１６のプライマー対による増幅断片についても、配列表の配列番号１４９記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＭｙｃｏ−９５２−ｐｒｏｂｅを用いたドットハイブリダイゼーションを行なったところ、目的のシグナルが確認できた。
実施例１３
本発明の方法を用いたＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）検出について検討した。目的とする増幅領域は、Ｍｅｃ Ａ遺伝子を選択した。実施例５記載の方法で、配列表の配列番号１５０及び１５１記載のＭｅｃＡ遺伝子の一部、ＭｅｃＡ−Ａ、ＭｅｃＡ−Ｂ、５６０ｂｐを増幅後、ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入し、それぞれＭｅｃＡ陽性コントロールＡ、ＭｅｃＡ陽性コントロールＢとした。次に配列表の配列番号１５２〜１５５記載の塩基配列を有するＭｅｃＡ−Ｓ５２５、ＭｅｃＡ−Ａ６１１、ＭｅｃＡ−Ｓ１２８１、ＭｅｃＡ−Ａ１３４１プライマーを合成した。実施例５記載の条件下、ＭｅｃＡ陽性コントロールＡ １０^６コピーを鋳型にＭｅｃＡ−Ｓ５２５とＭｅｃＡ−Ａ６１１のプライマー対、また、ＭｅｃＡ陽性コントロールＢ １０^６コピーを鋳型にＭｅｃＡ−Ｓ１２８１とＭｅｃＡ−Ａ１３４１のプライマー対でＩＣＡＮ反応を行った。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨを使用してもそれぞれ１０６ｂｐあるいは８３ｂｐの増幅断片がアガロースゲル電気泳動により確認できた。
さらに、ＭｅｃＡ−Ｓ５２５とＭｅｃＡ−Ａ６１１プライマー対により増幅断片が得られたＩＣＡＮ反応液１μｌをナイロンメンブレン ハイボンドＮにスポットした後、配列表の配列番号１５６記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＭｅｃＡ−Ａ ｐｒｏｂｅにより実施例５に示す方法と同じ方法でドットハイブリダイゼーションを行った。また、ＭｅｃＡ−Ｓ１２８１とＭｅｃＡ−Ａ１３４１プライマー対による増幅断片を同様にナイロンメンブレンにスポットした後、配列表の配列番号１５７に示す配列を有し、５’末端がビオチン標識されたＭｅｃＡ−Ｂ ｐｒｏｂｅを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。その結果、いずれのプローブを用いた場合においても、シグナルを確認することができ、目的の増幅領域を増幅できることを確認した。
実施例１４
本発明の方法に使用できるＲＮａｓｅＨについて検討した。
（１）ベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）のパッケージング領域の塩基配列に従って、配列表の配列番号１５８及び１５９記載の塩基配列を有するｐＤＯＮ−ＡＩ−１（２２）及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２（２３）プライマーをそれぞれ合成した。次に、１０ｆｇのｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ １μｌあるいは陰性対照の水１μｌとこれに上記各１００ｐｍｏｌのプライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１．０％ジメチルスルホキシド、２．６４ＵのＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨＩＩとして８．７５、４．３８、２．１９、１．０９、０．５５、０．２７ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは４．６９、２．３４、１．１７、０．５９、０．２９、０．１５、０．０７ＵのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは１４、７、３．５、１．７５、０．８７５、０．４３８ＵのＰｈｏ由来ＲＮａｓｅＨＩＩのそれぞれを含む全液量２５μｌの反応液を調製し、サーマルサイクラーで６４℃で１時間保時した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロース電気泳動により分析した。その結果、Ａｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩにおいてはいずれのＵ数においても目的の増幅産物が確認できた。また、Ｐｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩにおいては特に４．６９〜０．５９Ｕの範囲で、Ｐｈｏ由来ＲＮａｓｅＨＩＩにおいては特に１４〜１．７５Ｕの範囲で目的の増幅産物が確認できた。このことから、上記耐熱性ＲＮａｓｅＨＩＩのいずれもが本発明の方法に好適に使用できることを確認した。
（２）マウス誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡの塩基配列に従って、すなわち、配列表の配列番号１６０及び１６１に記載の塩基配列を有する各５０ｐｍｏｌのプライマーと市販のマウス由来細胞より常法で調製したｃＤＮＡ １μｌ（ＲＮＡとして５０ｎｇ相当）を含む１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（宝酒造社製） ５μｌ、１．２５Ｕ タカラ Ｅｘタック ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物を含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーを用い、９４℃ ２分間を１サイクル、次に９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとする３０サイクル、さらに７２℃ ５分間の１サイクルのプログラムで反応を行った。得られたマウス（ｉＮＯＳ）ｃＤＮＡ由来ＰＣＲ増幅断片をプラスミドベクターｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にクローニングし、本発明の方法の鋳型として使用した。１０ｆｇの上記プラスミドＤＮＡを含む鋳型溶液１μｌあるいは陰性対照の水１ｍｌと、これに配列表の配列番号９及び１０に記載の塩基配列を有するＮＳ５及びＮＳ６プライマー各１００ｐｍｏｌ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１．０％ジメチルスルホキシド、２．６４ＵのＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨＩＩとして各１０、５、２．５、１．２５、０．２５、０．１２５Ｕのメタノコッカス・ヤナシ（Ｍｊａ：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｈｉ）由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、Ｔｃｅ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいはＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨＩＩをそれぞれ含む全液量２５μｌの反応液を調製し、サーマルサイクラーで６２℃、１時間保持した。なお、Ｍｊａ由来ＲＮａｓｅＨＩＩは、ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、第８巻、第８９７〜９０４頁に記載の方法で調製した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロース電気泳動により分析した。その結果を図７に示す。すなわち図７は、３種類のＲＮａｓｅＨを用いた場合の増幅産物のアガロース電気泳動を示す図であり、図７Ａはメタノコッカス・ヤナシ由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、図７Ｂはサーモコッカス セラー由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、図７Ｃはサーモコッカス リトラリス由来ＲＮａｓｅＨＩＩを用いた結果である。それぞれ、レーン１は１０ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した場合、レーン２は１０ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した陰性対照の場合、レーン３は５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した場合、レーン４は５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した陰性対照の場合、レーン５は２．５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した場合、レーン６は２．５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した陰性対照の場合、レーン７は１．２５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した場合、レーン８は１．２５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した陰性対照の場合、レーン９は０．２５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した場合、レーン１０は０．２５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した陰性対照の場合、レーン１１は０．１２５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した場合、レーン１２は．０１２５ＵのＲＮａｓｅＨＩＩを使用した陰性対照の場合を示す。
図７に示したように、Ｍｊａ由来ＲＮａｓｅＨＩＩにおいては０．１２５〜１０Ｕの範囲、Ｔｃｅ由来ＲＮａｓｅＨＩＩにおいては１〜５Ｕの範囲、Ｔｌｉ由来ＲＮａｓｅＨＩＩにおいて０．１２５〜５Ｕの範囲で特に目的の増幅産物のが確認できた。このことから、上記耐熱性ＲＮａｓｅＨＩＩのいずれもが本発明の方法に好適に使用できることを確認した。
（３）さらに、ＲＮａｓｅＨの種類、使用量が異なる以外は、実施例５記載の反応条件下で本発明の方法について検討した。ＲＮａｓｅＨは、１Ｕのサーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは８．７５Ｕのサーモコッカス セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）由来ＲＮａｓｅＨＩＩを使用した。鋳型にはＨＢＶ陽性コントロール１−Ｔ １０^６コピーを使用し、実施例７で調製したＨＢＶ−Ｆ−２とＨＢＶ−Ｒ−１のプライマー対で増幅反応を行った。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨにおいてもアガロースゲル電気泳動により７６ｂｐの目的の増幅断片が確認できた。以上のことから、上記ＲＮａｓｅＨＩＩのいずれもが本発明に好適に使用できることを確認した。
実施例１５
本発明の検出方法において、内部コントロール（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を含んだ反応系の場合について検討した。まず、結核菌用内部コントロールを実施例５に記載の方法に従って作製した。まず６０ｍｅｒの合成プライマー４本を用意し、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．３、ｐ２９８〜ｐ３００（１９９０）記載の方法に従い、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応とそれに続くＰＣＲ反応を行い、配列表の配列番号１６９記載の塩基配列を有する増幅産物１６９ｂｐを得た。該増幅産物をｐＴ７ Ｂｌｕｅ ＴベクターにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、得られたプラスミドを結核菌内部コントロールとした。次に配列番号１７０、１７１に記載の塩基配列を有するＭＴＩＳ２Ｆ１６とＭＴＩＳ２ＲＡＡＣをそれぞれ合成した。該プライマー対で増幅される領域は、プライマー部を含めて９８ｂｐである。
反応は以下のようにして行った。すなわち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、０．１％プロピレンジアミン、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各２５ｐｍｏｌのＭＴＩＳ２Ｆ１６及びＭＴＩＳ２ＲＡＡＣプライマー対、結核菌内部コントロール１０^３コピー、２．２ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩまたは８ＵのＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、各鋳型量１μｌを添加し滅菌水で最終容量を２５μｌにした。鋳型は実施例１で使用のＢＣＧゲノムＤＮＡ無添加、１ｐｇ、あるいは１０ｐｇを用いた。該反応液は予め６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。これらのＩＣＡＮ反応後サンプル液をナイロンメンブレンにスポット後、配列番号１７２に記載の塩基配列を有し、５‘末端がビオチン標識された結核菌検出用プローブＭＴＩＳ−Ｓ−ＰＲＯＢＥ、または配列番号１７３に記載の塩基配列を有し、５’末端がビオチン標識された内部コントロール検出用プローブＩＮＴＥＲ−ＰＲＯＢＥを用いて実施例５と同様にドットハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＢＣＧゲノムＤＮＡ無添加のＩＣＡＮ反応後サンプル液をスポットした場合、ＭＴＩＳ−Ｓ−ＰＲＯＢＥによるシグナルは得られず、ＩＮＴＥＲ−ＰＲＯＢＥによるシグナルは得られた。ＢＣＧゲノムＤＮＡ１ｐｇのＩＣＡＮ反応後サンプル液をスポットした場合、ＭＴＩＳ−Ｓ−ＰＲＯＢＥ，ＩＮＴＥＲ−ＰＲＯＢＥともにシグナルが得られた。ＢＣＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇのＩＣＡＮ反応後サンプル液をスポットした場合、ＭＴＩＳ−Ｓ−ＰＲＯＢＥによるシグナルは得られ、ＩＮＴＥＲ−ＰＲＯＢＥによるシグナルは得られなかった。以上のことから、ターゲットであるＢＣＧゲノムが増幅しているときは、ＭＴＩＳ−Ｓ−ＰＲＯＢＥでシグナルが得られることが確認でき、内部コントロールが増幅しているときは、ＩＮＴＥＲ−ＰＲＯＢＥによるシグナルが得られることを確認した。すなわち、本発明の方法において内部コントロールが存在しても標的核酸を特異的に検出できることを確認した。
産業上の利用の可能性
本発明により、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＤＮＡ合成反応により標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適した領域を増幅することを特徴とする標的核酸の増幅方法あるいは当該増幅方法で得られた標的核酸の増幅断片を検出する工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法のための反応用試薬の安定化方法ならびに長期保存方法が提供される。また、本発明によりウイルス、細菌、カビ、酵母などの微生物、特に病原性微生物等の高感度、特異的検出、定量のための標的核酸の検出方法及び該方法のためのキメラオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブが提供される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す図である。
図２：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のリアルタイム検出を示すチャートである。
図３：本発明の方法に用いる試薬の保存・安定試験結果を示すアガロース電気泳動の結果を示す図である。
図４：本発明の方法に用いる試薬の保存・安定試験結果を示すラジオオートグラフィーの結果を示す図である。
図５：本発明の方法に用いる試薬の保存・安定試験結果を示すアガロース電気泳動の結果を示す図である。
図６：本発明の方法に用いる試薬の保存・安定試験結果を示すアガロース電気泳動の結果を示す図である。
図７：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動の結果を示す図である。

Claims (11)

1. （ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；および、
   （ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
   を包含することを特徴とする標的核酸の増幅及び／又は検出方法に用いられる反応用試薬の安定化方法であって、
   （ｉ）マグネシウム塩、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）からなる群より選択される少なくとも一つの試薬が他の試薬と反応前は分別されており、
   （ｉｉ）分別された酵素含有の試薬においては塩濃度を上げることなく酵素濃度を上げており、分別した試薬を混合した後の増幅工程においての至適塩濃度条件を満たすように他の分別された試薬の塩濃度が調整されている、
   ことを特徴とする反応用試薬の安定化方法。
2. キメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する試薬と、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）、マグネシウム塩を含有する試薬の２種からなる反応用試薬である請求項１記載の反応用試薬の安定化方法。
3. 酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の塩濃度が増幅工程においての至適塩濃度以下の塩濃度である請求項１記載の反応用試薬の安定化方法。
4. 酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が増幅工程においての酵素濃度より高濃度である請求項１記載の反応試薬の安定化方法。
5. 酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が分別された試薬を混合後の増幅工程において至適酵素濃度となるように調整されている請求項４記載の反応用試薬の安定化方法。
6. （ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；および、
   （ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
   を包含することを特徴とする標的核酸の増幅及び／又は検出方法に用いられる反応用試薬キットであって、
   （ｉ）マグネシウム塩、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）からなる群より選択される少なくとも一つの試薬が他の試薬と反応前は分別されており、
   （ｉｉ）分別された酵素含有の試薬においては塩濃度を上げることなく酵素濃度を上げており、分別した試薬を混合した後の増幅工程においての至適塩濃度条件を満たすように他の分別された試薬の塩濃度が調整されている、
   ことを特徴とする反応用試薬キット。
7. キメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する試薬と、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）、マグネシウム塩を含有する試薬の２種からなる反応用試薬である請求項６記載の反応用試薬キット。
8. 酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の塩濃度が増幅工程においての至適塩濃度以下の塩濃度である請求項６記載の反応用試薬キット。
9. 酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が増幅工程においての酵素濃度より高濃度である請求項６記載の反応用試薬キット。
10. 酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨ）含有試薬の酵素濃度が分別された試薬を混合後の増幅工程において至適酵素濃度となるように調整されている請求項９記載の反応用試薬キット。
11. 分別された試薬混合物の塩濃度調整用試薬を包含する請求項６記載のキット。

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