EA006679B1 - Способ стабилизации реагента для амплификации или детекции нуклеиновой кислоты и способ хранения - Google Patents

Abstract

Описываются способ стабилизации реагента для реакции для высокочувствительной и специфической амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в образце с использованием химерного олигонуклеотидного праймера и способ его хранения в течение длительного времени и способ высокочувствительной детекции патогенного микроорганизма и вируса.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу стабилизации и хранения реагента для способа модификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, полезного в области генной инженерии и клинической медицины.

Уровень техники

Синтез ДНК используют в исследованиях в области генной инженерии для различных целей. Большинство синтезов ДНК, за исключением синтеза короткоцепочечной ДНК (например, олигонуклеотида), осуществляют с использованием ферментативного способа, при котором используют ДНК-полимеразу. Примером такого способа является способ полимеразной цепной реакции (ПЦР, РСВ), подробно описанный в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является способ ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР, ВТ-РСВ), описанный в Тгепйк ίη Вю1сс1шо1оду. 10:146-152 (1992).

С другой стороны, можно использовать способ лигазной цепной реакции (ЛЦР, ЬСВ), описанный в ЕР 320308, или способ с системой амплификации на основе транскрипции (ТАЗ), описанный в РСВ РгоЮсо1к, Асайешю Ргекк 1пс., 1990, рр. 245-252. В указанных выше четырех способах требуется несколько раз повторить реакцию при высокой температуре и при низкой температуре для того, чтобы получить одноцепочечную молекулу-мишень для последующего цикла амплификации. Систему реакций следует проводить с использованием непрерывных фаз или циклов, поскольку реакция ограничивается температурами, как описано выше. Таким образом, в таких способах требуется использование дорогостоящих термоячеек, в которых можно в широком интервале точно регулировать температуры во времени. Кроме того, при реакции требуется время для достижения двух или трех предварительно установленных температур. Потеря времени возрастает пропорционально числу циклов.

Для того чтобы решить проблемы, разрабатываются способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно осуществить изотермически. Их примерами являются способ амплификации с замещением цепи (ЗИА), описанный в 1Р-В 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (3ЗВ), способ амплификации на основе нуклеотидной последовательности (ΝΑ3ΒΑ), описанный в патенте Японии № 2650159, способ амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), способ с Οβрепликазой, описанный в патенте Японии № 2710159, и различные способы модифицированной ЗИА, описанные в патенте США № 5825517, АО 99/09211, АО 95/25180 и АО 99/49081. Способ изотермического ферментативного синтеза описывается в патенте США № 5916777. Достраивание с праймера и/или отжиг праймера к одноцепочечному продукту достраивания (или к исходной последовательности-мишени) с последующим достраиванием с праймера при реакции в таком способе изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтезе олигонуклеотидов происходят параллельно в реакционной смеси, инкубированной при постоянной температуре.

Среди способов изотермической амплификации нуклеиновых кислот способ ЗИА является примером системы, в которой в конечном счете аплифицируется ДНК. Способ ЗИА представляет собой способ амплификации нуклеотидной последовательности-мишени (и комплементарной ей цепи) в образце путем замещения двух цепочек с использованием ДНК-полимеразы и рестриктазы. Для способа требуется четыре праймера, используемых для амплификации, два из которых должны быть сконструированы таким образом, чтобы они содержали сайт узнавания для рестриктазы. Способ требует для синтеза ДНК в больших количествах применения в качестве субстрата модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. Примером модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата является (а-З)дезоксирибонуклеотидтрифосфат, в котором атом кислорода в фосфатной группе в α-положении заменен атомом серы (З). Проблема меняющейся стоимости, связанная с применением модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата, становится серьезной, если взаимодействие проводят традиционным способом, например, в случае генетического испытания. Кроме того, введение в таком способе модифицированного нуклеотида (например, (а-З)-дезоксирибонуклеотида) в амплифицированный фрагмент ДНК может лишить амплифицированный фрагмент ДНК способности к расщеплению рестриктазой, например, когда его подвергают анализу на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, ВЕЬР).

Модифицированный способ ЗИА, описанный в патенте США № 5824517, представляет собой способ амплификации ДНК, в котором используют химерный праймер, состоящий из РНК и ДНК и содержащий в качестве обязательного элемента структуру, в которой ДНК располагается, по меньшей мере, в 3'-конце. Модифицированный способ ЗИА, описанный в АО 99/09211, требует применения рестрикционного фермента, который генерирует 3'-выступающий конец. Модифицированный способ ЗИА, описанный в АО 95/25180, требует применения по меньшей мере двух пар праймеров. Модифицированный способ ЗИА, описанный в АО 99/49081, требует применения по меньшей мере двух пар праймеров и по меньшей мере одного модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотидов, описанный в патенте США № 5916777, включает синтез ДНК с использованием праймера, содержащего рибонуклеотид в 3'-конце, завершение реакции с использованием праймера, введение ника между праймером и достраиваемой цепью в цепи, достраиваемой с праймера с помощью эндонуклеазы, для отделения их друг от друга, расщепление матрицы и извлечение праймера для его повторного использования. Необходимо выделить праймер из реакционной смеси и затем снова от

- 1 006679 жечь его к матрице для того, чтобы праймер использовать в способе повторно. Кроме того, для способа изотермической амплификации при посредничестве петли (ЬАМР), описанного в νθ 00/28082, требуется четыре праймера для амплификации, и продукты, амплифицированные с использованием такого способа, представляют собой ДНК разного размера, в которых повторяются области-мишени.

Кроме того, известен способ изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием химерного олигонуклеотидного праймера - способ изотермической и инициируемой химерным праймером амплификации нуклеиновых кислот (ΙΡΑΝ). описанный в νθ 00/56877 или νθ 02/7139.

Так как многие реагенты для реакции, используемые в вышеуказанных способах, неустойчивы при комнатной температуре, реагенты в операциях в большинстве случаев используют при охлаждении льдом. Кроме того, так как большинство реагентов следует хранить при температуре 4°С или ниже или при -20°С или ниже, необходимо уделять серьезное внимание способам хранения. Таким образом, нужен способ стабилизации и/или хранения реагента, который допускает стабильное длительное хранение при комнатной температуре при отсутствии при хранении потребности в холодильнике или морозильнике.

Цели изобретения

Основной целью настоящего изобретения является способ стабилизации и длительного хранения реагента для реакции в способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, посредством которого нуклеиновую кислоту-мишень в образце специфически амплифицируют с высокой чувствительностью с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, а также высокочувствительного способа детекции патогенного микроорганизма или вируса.

Сущность изобретения

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения нашли высокочувствительный способ детекции вируса или патогенного микроорганизма, при котором участок ДНК, представляющий интерес, амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Авторы настоящего изобретения также нашли способ стабилизации и длительного хранения реагента для способа амплификации участка ДНК, представляющего интерес. Таким образом, осуществлено настоящее изобретение.

Первый аспект настоящего изобретения относится к способу стабилизации реагента для реакции, используемого для способа амплификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающему (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'конце или со стороны 3'-конца праймера; и (b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, где (ί) по меньшей мере один компонент реагента, выбранный из группы, состоящей из магниевой соли, химерного олигонуклеотидного праймера и ферментов (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н), перед реакцией отделяют от других компонентов реагента; и (ίί) концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы), высокая(ие), в то время как концентрация соли в указанном растворе не является высокой, и концентрацию соли в другом растворе реагента регулируют таким образом, что оптимальная концентрация соли для стадии амплификации достигается после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.

Согласно первому аспекту реагент для реакции может состоять из двух растворов реагента: раствора реагента, содержащего химерный олигонуклеотидный праймер; и раствора реагента, содержащего фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), и можно использовать магниевую соль. Концентрация соли в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть равна или меньше оптимальной концентрации соли для стадии амплификации. Концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть выше концентрации(ий) фермента(ов) для стадии амплификации. Концентрацию(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), можно отрегулировать так, что оптимальная концентрация(и) фермента(ов) для стадии амплификации достигается(ются) после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.

Второй аспект настоящего изобретения относится к набору реагента для реакции, используемому в способе амплификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающему (а) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, со

- 2 006679 стоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'конце или со стороны З'-конца праймера; и (Ь) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции, где (ί) по меньшей мере один компонент реагента, выбранный из группы, состоящей из магниевой соли, химерного олигонуклеотидного праймера и ферментов (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н), перед реакцией отделяют от других компонентов реагента; и (й) концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы), высокая(ие), в то время как концентрация соли в указанном растворе не является высокой, и концентрацию соли в другом растворе реагента регулируют таким образом, что оптимальная концентрация соли для стадии амплификации достигается после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.

Согласно второму аспекту реагент для реакции может состоять из двух растворов реагента: раствора реагента, содержащего химерный олигонуклеотидный праймер; и раствора реагента, содержащего фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н) и магниевую соль. Концентрация соли в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть равна или меньше оптимальной концентрации соли для стадии амплификации. Концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть выше концентрации(ий) фермента(ов) для стадии амплификации. Концентрацию(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), можно отрегулировать так, что оптимальная концентрация(и) фермента(ов) для стадии амплификации достигается(ются) после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом. Набор может содержать реагент для регулирования концентрации соли в смеси отдельных растворов реагента.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу детекции патогенного микроорганизма и/или вируса в образце, включающему (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'конце или со стороны З'-конца праймера;

(b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции; и (c) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени со стадии (Ь), где химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер для детекции патогенного микроорганизма, представленный приведенной далее общей формулой, и патогенный микроорганизм выбирают из группы, состоящей из МусоЬас1егшт 1иЬсгси1о515. НСУ, сЫатуШа, МусоЬайегшт аушт сотр1ех, допососсик, НВУ, ВИЧ, 81арЬу1ососси§ аигеик, микоплазмы и МК.8Л.

Общая формула: 5'-6№-№-ά№-3' (а - целое число, равное 11 или большее; Ь - целое число, равное 1 или большее; с - 0 или целое число, равное 1 или большее; 6Ν - дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, где некоторые б№ в 6Νη могут быть заменены N и нуклеотид в З'-конце может быть модифицирован так, что достраивания с З'-конца под действием ДНК-полимеразы не происходит).

Согласно третьему аспекту реакционная смесь также может содержать химерный олигонуклеотидный праймер с последовательностью, по существу, гомологичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к праймеру для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса, причем праймер выбирают из группы, состоящей из (1) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции МусоЬас1епит ШЬегсШокщ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО N08: 7, 8, 21, 22, 162, 163, 170 и 171;

(2) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции НСУ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N08: 15,16, 81-86 и 88-91;

(3) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции сЫатуШа, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N08: 17-20,121-127, 130-135, 166 и 167;

(4) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции МусоЬас1егшт аушт сотр1ех, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N08: 25-31;

- 3 006679 (5) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции допососсик, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3ЕО Ш N03: 38-63, 164 и 165;

(6) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции ΗΒV, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 71-78;

(7) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции ВИЧ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 95-103;

(8) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции 31арЬу1ососси8 аитеик, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 108-117;

(9) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции микоплазмы, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 139-146; и (10) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции МК3А, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 152-155.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к зонду для детекции патогенного микроорганзма и/или вируса, причем зонд выбирают из группы, состоящей из (1) зонда для детекции МусоЬас1епит ШЬегси1о515. выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 11, 12 и 172;

(2) зонда для детекции НОУ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 87 и 92;

(3) зонда для детекции сЫатуШа, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 128, 136 и 168;

(4) зонда для детекции МусоЬас1епит аушт сотр1ех, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 32 и 33;

(5) зонда для детекции допососсик, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 64-68;

(6) зонда для детекции НВV, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 79 и 80;

(7) зонда для детекции ВИЧ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 104 и 105;

(8) зонда для детекции 31арЬу1ососси8 аитеик, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 118 и 119;

(9) зонда для детекции микоплазмы, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 147-149; и (10) зонда для детекции МК3А, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 3Е0 Ш N03: 156 и 157.

Шестой аспект изобретения относится к набору для способа детекции патогенного микроорганизма и/или вируса по третьему аспекту, который содержит химерный олигонуклеотидный праймер по девятому аспекту.

Набор по шестому аспекту также может дополнительно содержать зонд по пятому аспекту.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения.

Фиг. 2 представляет собой графики, показывающие детекцию в реальном времени фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения.

Фиг. 3 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле, который представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения.

Фиг. 4 представляет собой фигуру, показывающую авторадиографию, которая представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения.

Фиг. 5 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле, который представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения.

Фиг. 6 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле, который представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения.

Фиг. 7 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения.

Подробное описание изобретения

Используемый в данном случае дезоксирибонуклеотид (также называемый 6И) представляет нуклеотид, в котором углеводная часть состоит из Ό-2-дезоксирибозы. К дезоксирибонуклеотидам относятся, например, нуклеотиды, содержащие в качестве оснований аденин, цитозин, гуанин или тимин. Кроме того, к дезоксирибонуклеотидам также относится дезоксирибонуклеотид, содержащий модифицирован

- 4 006679 ное основание, такое как 7-деазагуанозин, и дезоксирибонуклеотидный аналог, такой как дезоксиинозиннуклеотид.

Используемый в данном случае рибонуклеотид (также называемый Ν) представляет нуклеотид, в котором углеводная часть состоит из Л-рибозы. К рибонуклеотидам относятся, например, нуклеотиды, содержащие в качестве оснований аденин, цитозин, гуанин или урацил. К рибонуклеотидам также относятся модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода фосфатной группы в α-положении заменен атомом серы (также называемый (а-8)рибонуклеотидом или (α-δ)-Ν), или другие производные.

Химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, включают любой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, располагающийся в 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты в способе настоящего изобретения, можно расщепить эндонуклеазой и можно использовать для осуществления реакции замещения цепи.

В данном случае сторона З'-конца означает часть от центра к З'-концу нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Подобным образом, сторона 5'-конца означает часть от центра к 5'-концу нуклеиновой кислоты.

Химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога. К таким праймерам также относится олигорибонуклеотидный праймер, содержащий немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, по существу, комплементарную части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы. Он может вносить вклад в достраивание цепи ДНК в используемых условиях. Кроме того, рибонуклеотид располагается в З'-конце или со стороны З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера. Как правило, праймер конструируют таким образом, что он комплементарен части перед амплифицируемым участком, т.е. части 3' к нуклеотидной последовательности, соответствующей амплифицируемому участку в нуклеиновой кислоте как матрице. Используемый в данном описании термин по существу комплементарная нуклеотидная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться к ДНК как матрице в используемых условиях реакции.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. Рибонуклеотид может представлять собой немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, который может располагаться в З'-конце или со стороны З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера и который узнается или расщепляется эндонуклеазой. Рибонуклеотиды включают как немодифицированные рибонуклеотиды, так и модифицированные рибонуклеотиды, как описано выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание можно использовать для химерного олигонуклеотидного праймера настоящего изобретения до тех пор, пока они не уничтожают функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменен на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксигруппа в положении 2 рибозы заменена на метоксигруппу, и другие рибонуклеотиды. Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Иными словами, в химерном олигонуклеотидном праймере настоящего изобретения могут содержаться один или несколько нуклеотидных аналогов до тех пор, пока не уничтожается функция праймера для осуществления реакции достраивания с З'-конца под действием ДНК-полимеразы. Многие типы нуклеотидных аналогов можно использовать в сочетании. Примерами нуклеотидных аналогов, которые можно использовать, являются дезоксиинозиннуклеотид, дезоксиурацилнуклеотид, дезоксирибонуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7-деазагуанин, нуклеотидный аналог с производным рибозы и т.п., и другие вещества. Кроме того, химерные олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут содержать дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или нуклеотидные аналоги с различными модификациями, такими как присоединение меченых соединений, до тех пор, пока они сохраняют функцию, описанную выше.

Введение нуклеотидного аналога в праймер эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самого праймера и стабилизации индукции отжига к матрице. В праймер можно ввести рибонуклеотид для такой же цели. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, можно, предпочтительно, использовать модифицированный рибонуклеотид, такой как (а-8)-рибонуклеотид, для того, чтобы предотвратить расщепление праймера неспецифической эндонуклеазой (РНКазой). Такой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий модифицированный рибонуклеотид, можно получить с использованием, например, (а-8)-рибонуклеотидтрифосфата, полученного способом с использованием реагента для реакции сульфурирования (введение серы) (О1еп Кекеагсй), как описывается в патенте США № 500З097, или реагента 2-ОМе-^А-СЕ-фосфорамидита (О1еп Кекеагсй).

- 5 006679

Химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации настоящего изобретения, можно сконструировать таким, чтобы он содержал модифицированный рибонуклеотид, придающий устойчивость к расщеплению эндонуклеазой. Такой праймер полезен в том отношении, что можно регулировать сайт расщепления эндонуклеазой на стадиях реакции амплификации.

Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения, конкретно не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте как матрице, так что она отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице в используемых условиях реакции. Праймер содержит последовательность, узнаваемую эндонуклеазой, которая используется на стадии, описываемой ниже, в З'-конце или со стороны З'-конца.

Например, в способе синтеза ДНК настоящего изобретения в качестве праймера можно использовать олигонуклеотид структуры, представленной далее формулой, хотя он не предназначен для ограничения.

Общая формула: 5'-άΝα-Ν6-άΝο-3' (а - целое число, равное 11 или большее; Ь - целое число, равное 1 или большее; с - 0 или целое число, равное 1 или большее; άΝ - дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, где некоторые из й№ в άΝα могут быть заменены на № и нуклеотид в З'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с З'-конца под действием ДНК-полимеразы не происходит).

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, имеет структуру, в которой эндонуклеаза узнает или расщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь), в сайте, содержащем рибонуклеотид, располагающийся в З'-конце или со стороны З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, когда РНКаза Н действует на двухцепочечную ДНК, образовавшуюся путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного приведенной выше общей формулой, отжигаемую к нуклеиновой кислоте как матрице, химерный олигонуклеотидный праймер расщепляется в рибонуклеотидной части. Затем получают двухцепочечную ДНК, в которую вводят ник между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезируемой путем достраивания. Затем из ник-сайта с помощью ДНК-полимеразы проводят реакцию замещения цепи. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты с З'-конца праймера, который можно расщепить эндонуклеазой и с которым ДНК-полимераза может осуществить реакцию замещения цепи. Кроме того, к химерным олигонуклеотидным праймерам настоящего изобретения относятся праймеры, чьи З'-концы модифицированы, так что не может происходить достраивания под действием ДНК-полимеразы, и достраивание ДНК происходит с З'-конца, образовавшегося после расщепления эндонуклеазой.

Кроме того, со стороны 5'-конца химерного олигонуклеотидного праймера может быть включена промоторная последовательность для РНК-полимеразы. Примерами таких РНК-полимераз являются РНК-полимераза Т7 и РНК-полимераза 8Р6.

Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную нуклеотидную последовательность, можно синтезировать с использованием, например, синтезатора ДНК типа З94 от Аррйей Вюкуйетк 1пс. (АВ1) согласно фосфорамидитному методу. С другой стороны, для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера можно использовать любые способы, включая триэфирфосфатный способ, Н-фосфонатный способ и тиофосфонатный способ.

Можно использовать фермент, который может действовать на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, описанного выше, который отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице, и расщеплять достроенную цепь для осуществления реакции замещения цепи. Иными словами, это фермент, который может генерировать ник в части химерного олигонуклеотидного праймера двухцепочечной ДНК. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются рибонуклеазы и другие нуклеазы. Из них можно использовать предпочтительно эндорибонуклеазу Н (РНКазу Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из ДНК и РНК. Любую рибонуклеазу, обладающую вышеуказанными активностями, можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении, включая мезофильные и теплоустойчивые рибонуклеазы. Например, РНКазу Н из Е. сой можно использовать в способе настоящего изобретения для реакции при примерно 50-70°С, как описывается ниже в примерах. В способе настоящего изобретения можно использовать, предпочтительно, теплоустойчивую рибонуклеазу. Примерами теплоустойчивых рибонуклеаз, которые можно предпочтительно использовать, являются коммерчески доступные рибонуклеаза теплоустойчивая РНКаза Н НуЬпйаке™ (ЕркеШег Тесйпо1още5). а также РНКаза Н из термофильной бактерии рода ВасПйк бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Тйегто1ода, бактерии рода АгсйаеоДоЬи^ бактерии рода МеШапососсик, бактерии рода Тйегтососсик

- 6 006679 или подобной бактерии и другие рибонуклеазы. Кроме того, можно предпочтительно использовать как рибонуклеазы, встречающиеся в природе, так и другие рибонуклеазы.

Конкретных ограничений для РНКазы Н не существует до тех пор, пока ее можно использовать в способе настоящего изобретения. Например, РНКаза Н может происходить от разных вирусов, фагов, прокариот или эукариот. Она может представлять собой или клеточную РНКазу Н, или вирусную РНКазу Н. Примером клеточной РНКазы Н является РНКаза ΗΙ из ЕксйепсЫа сой, и примером вирусной РНКазы Н является РНКаза ВИЧ-1. В способе настоящего изобретения можно использовать РНКазу Н типа Ι, типа ΙΙ или типа ΙΙΙ. Например, предпочтительно без ограничений можно использовать РНКазу ΗΙ из ЕксйепсЫа сой или РНКазу ΗΙΙ из бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Лгсйаеод1оЬи8 или бактерии рода Тйеттососсик.

Эффективность реакции расщепления эндонуклеазой, такой как РНКаза Н, используемая в способе настоящего изобретения, может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности вблизи З'-конца праймера и влияния на эффективность амплификации нужной ДНК. Поэтому обычно конструируют праймер, оптимальный для используемой РНКазы Н.

Используемый в данном описании термин введение ника или никирование означает расщепление в пределах одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и рибонуклеотидсодержащей ДНК, селективно расщепляя из двух цепей рибонуклеотидсодержащую цепь в рибонуклеотидной части, посредством чего в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводится ник.

Известно, что некоторые ДНК-полимеразы в определенных условиях обладают эндонуклеазной активностью, такой как активность РНКазы Н. Такую ДНК-полимеразу можно использовать в способе настоящего изобретения. В одном аспекте ДНК-полимеразу можно использовать в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, например, в присутствии Мп²⁺. В таком случае способ настоящего изобретения можно осуществлять без добавления РНКазы Н. ДНК-полимераза Вса может обнаруживать РНКазную активность в буфере, содержащем Мп²⁺. Вышеуказанный аспект не ограничивается применением ДНК-полимеразы Вса. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, о которых известно, что они обладают активностью РНКазы Н, такие как ДНК-полимераза Т1й из Тйегтик 1йегторЫ1и8.

Таким образом, ДНК-полимеразу, обладающую активностью РНКазы Н, можно использовать в условиях, в которых проявляется активность РНКазы Н.

В качестве нуклеотидтрифосфатов, служащих в способе в качестве субстратов при реакции достраивания, можно использовать предпочтительно άΝΤΡδ, используемые для ПЦР, или подобные άΝΤΡδ (смесь ЙАТР, ЙСТР, ЙОТР и ЙТТР). Кроме того, в качестве субстрата можно использовать ЙИТР. Й№ТР§ могут содержать аналог Й№ТР (дезоксирибонуклеотидтрифосфата), такой как 7-деаза-йОТР, трифосфат Й1ТР или подобное вещество, до тех пор, пока оно служит в качестве субстрата для используемой ДНКполимеразы. Можно использовать производное й№ТР или аналог й№ТР. Может содержаться производное с функциональной группой, такое как ЙИТР, содержащий аминогруппу. В способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер можно получить, например, с использованием синтезатора ДНК согласно обычному способу синтеза. В способе настоящего изобретения можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и обычного олигонуклеотидного праймера.

Если активность используемого фермента может снижаться в ходе реакции, в способе настоящего изобретения фермент можно добавлять в ходе реакции. Например, без намерения ограничивать настоящее изобретение, во время реакции, в которой используют РНКазу Н, можно дополнительно добавлять РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой. Добавляемый фермент может быть таким же, какой содержится в реакционной смеси в начале реакции, или он может быть другим ферментом, проявляющим такую же активность. Таким образом, тип или свойство добавляемого фермента не ограничивается одним конкретным ферментом до тех пор, пока добавление во время реакции производит действие, такое как повышение чувствительности при детекции или повышение количества амплифицированного продукта.

Используемая в данном случае ДНК-полимераза относится к ферменту, синтезирующему цепь ДНК Йе поуо с использованием цепи ДНК как матрицы. К ДНК-полимеразам относятся ДНК-полимеразы, встречающиеся в природе, и другие ферменты с вышеуказанной активностью. Например, к таким ферментам относится ДНК-полимераза с активностью замещения цепи, ДНК-полимераза, утратившая 5Ά3'экзонуклеазную активность, и ДНК-полимераза с обратнотранскриптазной активностью или эндонуклеазной активностью.

Используемый в данном описании термин активность замещения цепи относится к активности, которая может влиять на замещение цепи, т.е. которая может производить дупликацию ДНК на базе последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, в то же время заменяя цепь ДНК, с высвобождением комплементарной цепи, отожженной к цепи матрицы. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная из нуклеиновой кислоты как матрицы в результате замещения цепи, в данном описании относится к замещенной цепи.

Можно использовать ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи в ДНК. В частности, можно предпочтительно использовать ДНК-полимеразу, по существу, лишенную 5'^3'-экзонуклеазной активности.

- 7 006679

В настоящем изобретении можно использовать любую ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи. Ее примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишенные их 5'^3'-экзонуклеазной активности, полученные из термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик саШобепах (далее называемые В. са), и ВасШик кбеагоШегторййик (далее называемые В. к1). а также большой фрагмент (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I из Ексйепсйба сой (Е. сой). Как мезофильные, так и теплоустойчивые ДНК-полимеразы можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении.

В. са представляет собой термофильную бактерию с оптимальной температурой роста примерно 70°С. Известно, что ДНК-полимераза Вса из такой бактерии обладает ДНК-зависимой ДНКполимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратнотранскриптазной активностью), 5'^3'-экзонуклеазной активностью и 3'^5'-экзонуклеазной активностью. Фермент может представлять собой или фермент, выделенный в чистом виде из источника своего происхождения, или рекомбинантный белок, полученный с использованием методов генной инженерии. Фермент можно подвергнуть модификации, такой как замещение, делеция, присоединение или вставка, используя методы генной инженерии или другие способы. Примером таких ферментов является ДНК-полимераза ВсаВЕЗТ (Такага ЗИи/о), представляющая собой ДНК-полимеразу Вса, лишенную ее 5'^3'-экзонуклеазной активности.

Нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), используемую по настоящему изобретению в качестве матрицы, можно получить или выделить из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. С другой стороны, согласно настоящему изобретению при реакции амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать непосредственно образец. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные от организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, урина, фекалии, цереброспинальная жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, загрязненные или инфицированные, как предполагается, микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Образец может представлять собой препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, полученную переработкой вышеуказанных образцов согласно известным способам. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный путем фракционирования такого продукта, нуклеиновая кислота в образце или образец, в котором в большом количестве содержатся молекулы определенной нуклеиновой кислоты, такой как мРНК. Кроме того, можно использовать, предпочтительно, нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, полученную амплификацией нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце.

Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, можно получить из указанных выше материалов с использованием, например, лизиса с помощью детергента, ультразвука, встряхивания/перемешивания с использованием стеклянных шариков или пресса Френча, без огранчений. В некоторых случаях выгодно дополнительно обработать препарат для очистки полученной нуклеиновой кислоты (например, в случае, когда присутствует эндонуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают с использованием известного способа, такого как фенольная экстракция, хроматография, ионный обмен, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности.

Когда нужно амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, полученной от РНК, способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной с использованием обратнотранскриптазной реакции, в которой в качестве матрицы используют РНК. В способе настоящего изобретения можно использовать любую РНК, для которой можно создать праймер, используемый в обратнотранскриптазной реакции, включая полную РНК в образце, молекулы РНК, такие как мРНК, тРНК и рРНК, а также определенные РНК-молекулярные препараты.

В качестве матричной нуклеиновой кислоты в настоящем изобретении можно использовать двухцепочечную ДНК, такую как геномная ДНК, выделенная так, как описано выше, или фрагмент ПЦР, одноцепочечную ДНК, такую как кДНК, полученная с использованием обратнотранскриптазной реакции из полной РНК или мРНК, и гибридную двойную цепь, состоящую из ДНК и РНК. Двухцепочечную ДНК можно предпочтительно использовать после ее денатурации в одноцепочечные ДНК или без такой денатурации.

Далее настоящее изобретение будет описываться подробнее.

(1) Способ стабилизации и длительного хранения реагента для реакции для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения.

Реагент для реакции согласно настоящему изобретению можно использовать для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты-мишени с использованием по меньшей мере одного химерного олигонуклеотидного праймера, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы.

Реагент для реакции настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, который можно осуществить с использованием двух праймеров, т. е. химер

- 8 006679 ного олигонуклеотидного праймера, комплементарного нуклеиновой кислоте как матрице, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного замещенной цепи. Один праймер связывается с цепью ДНК как матрицы, вызывая реакцию замещения цепи, в то время как другой праймер связывается с замещенной цепью, высвобождаемой в результате реакции замещения цепи, инициируя другую реакцию замещения цепи. Ясно, что продукт реакции с одним праймером может функционировать как матрица для другого праймера, если используется такой аспект. Таким образом, количество продукта амплификации нелинейно возрастет с возрастанием количества матрицы.

Реагент для реакции в способе настоящего изобретения, в котором используют двухцепочечную ДНК как матрицу и два химерных олигонуклеотидных праймера, является примером другого аспекта. В таком способе, хотя имеются изменения в зависимости от условий реакции, переключение матриц в промежуточных цепях, достраиваемых с матрицы, может происходить во время реакций достраивания с праймеров с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймера цепей, отжигающихся одна с другой. Двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит химерные олигонуклеотидные праймеры на обоих концах. Затем можно снова инициировать реакции достраивания комплементарных цепей, включая замещение цепи, с обоих концов. В результате реакций получают продукт амплификации с последовательностью праймера на одном конце. Кроме того, если переключение матриц происходит во время реакций, снова получают двухцепочечную нуклеиновую кислоту, подобную кислоте, описанной выше.

Реагент для реакции настоящего изобретения можно использовать в способе амплификации нуклеиновой кислоты, который включает стадию использования ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи для осуществления реакции переключения матрицы. При реакции переключения матрицы в присутствии двухцепочечной нуклеиновой кислоты как матрицы, двух химерных олигонуклеотидных праймеров, по существу, комплементарных нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи синтезируются две достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Переключение матрицы каждой из достраиваемых с праймеров цепей с матрицы на другую достраиваемую с праймера цепь происходит во время синтеза достраиваемых с праймеров цепей.

В данном случае реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой, когда комплементарные цепи синтезируются реакциями замещения цепи с обеих сторон двухцепочечной нуклеиновой кислоты, ДНК-полимераза переключает матрицу и затем синтезирует комплементарную цепь с использованием в качестве матрицы другой комплементарной цепи, синтезированной вновь с помощью другой ДНК-полимеразы. Иными словами, реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой двухцепочечную нуклеиновую кислоту как матрицу обрабатывают праймерами и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи с образованием достроенных цепей, комплементарных матрице, где ДНКполимераза, которая синтезирует достроенные с примеров цепи, во время синтеза достраиваемых цепей активно переключает матрицу от исходных матриц на другие достраиваемые с праймеров цепи. Способность ДНК-полимеразы осуществлять реакцию переключения матрицы можно определить, например, согласно способу, описанному ниже в ссылочном примере 3, хотя такой способ не предназначен для ограничения настоящего изобретения.

ДНК-полимеразу, способную осуществлять реакцию переключения матрицы во время реакции замещения цепи, можно предпочтительно использовать для настоящего изобретения. Например, предпочтительно использовать, в частности, фермент ДНК-полимеразу Вса, лишенную 5'^3'-экзонуклеазной активности. Такой фермент коммерчески доступен как ДНК-полимераза ВсаВЕ8Т (Такага 81шхо). Ее также можно получить из ЕксйепсЫа со11 ИВ101/рИ1205 (ЕЕЯМ ВР-3720), которая содержит ген для фермента, согласно способу, описанному в патенте Японии № 2978001.

В способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени с использованием реагента для реакции настоящего изобретения может образоваться полимер, в котором амплифицируемые участки соединены друг с другом. Полимер имеет структуру, в которой множество амплифицируемых участков повторяется в одном и том же направлении. Полимеры обнаруживают при анализе продуктов амплификации методом электрофореза в виде мультимерных полос. Полагают, что на образование таких полимеров влияет амплифицируемый участок, размер участка, фланкирующие области, нуклеотидная последовательность используемого химерного олигонуклеотидного праймера, условия реакции и т. п.

Полимер, описанный выше, содержит множество амплифицируемых участков. Например, полимер полезен, когда производится детекция нуклеиновой кислоты, содержащей амплифицируемый участок, поскольку он гибридизируется с рядом зондов после гибридизации с использованием соответствующего зонда и образует интенсивный сигнал. Амплифицируемый участок или его часть можно получить из полимера в виде мономера с использованием расщепления рестриктазой или подобным ферментом в сочетании.

Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является то, что способ не требует повышения и понижения температуры во время синтеза нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу изотермического синтеза нуклеиновой кислоты. Во многих известных способах амплификации нуклеиновых кислот требуется повышение и понижение температуры для отделения мишени от синтезированной цепи. Такие способы для ука

- 9 006679 занной цели требуют специального обрудования для реакции, такого как термоячейка. Однако способ настоящего изобретения можно проводить с использованием только оборудования, позволяющего поддерживать постоянную температуру. Как описано выше, способ настоящего изобретения можно осуществлять при одной температуре. Предпочтительно его осуществляют, выбирая температуру реакции и уровень точности такими, чтобы уменьшить неспецифический отжиг праймера, и такими, чтобы праймер специфически отжигался к нуклеиновой кислоте как матрице. Без намерения ограничивать настоящее изобретение способ настоящего изобретения можно осуществить в условиях высокой температуры, используя теплоустойчивый фермент, как описано выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ настоящего изобретения при температуре, соответствующей достаточному поддержанию активности используемого фермента для того, чтобы сохранить эффективность реакции на высоком уровне. Таким образом, температура реакции составляет предпочтительно от примерно 20 до примерно 80°С, предпочтительнее от примерно 30 до примерно 75°С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70°С, хотя она изменяется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию проводят, в частности, в высокотемпературных условиях, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем в случае реакции при нормальной температуре. Примером влияния, привносимого повышенной температурой реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры ДНК как матрицы. Повышенная температура реакции создает возможность амплификации нужной нуклеиновой кислоты даже в том случае, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с высоким содержанием ОС. Кроме того, она также эффективна при амплификации участка с большой длиной цепи. Такое действие наблюдают в интервале от примерно 60 п.о. до примерно 20 т.п.о., конкретно от примерно 60 до примерно 1500 п.о.

Эффективность амплификации можно повысить путем подбора температуры реакции в соответствии с содержанием ОС в нуклеиновой кислоте как матрице. Например, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с низким содержанием ОС, реакцию амплификации по настоящему изобретению можно проводить при 50-55°С, хотя температура зависит от длины амплифицируемой цепи и величины Тт праймера.

Использование ДНК-полимеразы с обратнотранскриптазной активностью (например, ДНКполимеразы ВсаВЕБТ) в способе настоящего изобретения может позволить удобно провести амплификацию нуклеиновой кислоты от РНК, включающую стадию получения кДНК из РНК (обратнотранскриптазная реакция), с использованием только одного фермента. С другой стороны, продукт, полученный путем независимого проведения стадии получения кДНК из РНК (т.е. кДНК), можно использовать в способе настоящего изобретения в качестве ДНК как матрицы.

В каждом случае реакцию в способе настоящего изобретения повторяют до обрыва ее подходящим способом, например путем инактивации фермента, или путем снижения температуры реакции, или до тех пор, пока реакционная смесь не лишится одного из субстратов.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для различных экспериментальных процедур, в которых используют амплификацию нуклеиновых кислот, включая детекцию, мечение и секвенирование нуклеиновой кислоты.

Кроме того, способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты ίη δίΐιι. способа амплификации нуклеиновой кислоты на твердом субстрате, таком как ДНК-чип, или метода множественной амплификации нуклеиновых кислот, при котором одновременно амплифицируют несколько участков.

Эффективность использования праймера в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем эффективность при обычном способе, таком как ПЦР.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для получения продукта амплификации с высоким соответствием нуклеотидной последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Когда определяли частоту ошибок при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения путем анализа нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации, частота ошибок, найденная в продуктах амплификации, полученных по способу настоящего изобретения, была эквивалента частоте ошибок при ЬА-РСК, которая, как известно, позволяет амплифицировать нуклеиновую кислоту с высоким соответствием. Иными словами, способ настоящего изобретения имеет соответствие, эквивалентное соответствию при ЬА-РСК.

Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно осуществить путем амплификации нуклеиновой кислоты-мишени непосредственно из образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В таком случае длина цепи амплифицируемой нуклеиновой кислоты-мишени не ограничивается определенной длиной. Например, для чувствительной детекции нуклеиновой кислоты-мишени эффективен участок в 200 п.о. или короче, предпочтительно в 150 п.п. или короче. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в образце с высокой чувствительностью, конструируя химерные олигонуклеотидные праймеры настоящего изобретения для того, чтобы получить в результате длину амплифицируемой цепи, указанную выше.

- 10 006679

Кроме того, при способе детекции настоящего изобретения нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить с большей чувствительностью даже в следовом количестве образца нуклеиновой кислоты с использованием буфера для реакции, содержащего в качестве буферирующего компонента бицин, трицин, НЕРЕ8, фосфат или трис, и раствора для отжига, содержащего спермидин или пропилендиамин. В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНК-полимераза не ограничиваются конкретными веществами. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из ЕксепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬи8 и ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т. Полагают, что предпочтительные количества эндонуклеазы и ДНК-полимеразы могут изменяться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подобрать с использованием в качестве показателя повышения чувствительности детекции или количества продукта амплификации.

В способе детекции настоящего изобретения во время амплификации нуклеиновой кислотымишени в качестве субстрата можно вводить бИТР. Так, если в качестве субстрата используют бИТР, с использованием урацил-Ы-гликозидазы (ϋΝΟ) возможно предотвратить ложноположительные результаты из-за распространения загрязнения продуктов амплификации за счет разрушения продуктов амплификации.

Для детекции нуклеиновой кислоты-мишени можно использовать известные способы детекции нуклеиновой кислоты. Примерами таких способов являются детекция продукта реакции специфического размера методом электрофореза и детекция путем гибиридизации с зондом. Кроме того, можно использовать предпочтительно способ детекции, при котором используют в сочетании магнитные гранулы. Пирофосфорную кислоту, образовавшуюся на стадии амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, можно превратить в нерастворимое вещество, такое как магниевая соль, и затем можно измерить мутность. При детекции методом электрофореза, как правило, используют флуоресцирующее вещество, такое как этидия бромид. Гибридизацию с зондом можно сочетать с детекцией методом электрофореза. Зонд можно пометить радиоизотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование на стадии детекции меченого олигонуклеотида может облегчить детекцию продукта амплификации, в который включен меченый нуклеотид, или, используя метку, можно усилить сигнал для детекции. Также можно использовать для детекции метод поляризации флуоресценции, метод передачи энергии флуоресценции или подобный метод. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить автоматизированным способом или определить количественно, сконструировав подходящую систему детекции. Кроме того, можно использовать предпочтительно детекцию невооруженным глазом с помощью метода гибридной хроматографии.

В способе детекции настоящего изобретения можно использовать рибонуклеотидный (РНК) зонд или химерный олигонуклеотидный зонд, состоящий из рибонуклеотида и дезоксирибонуклеотида, меченный двумя или большим числом флуоресцирующих веществ, расположенных на расстоянии, что приводит к состоянию тушения. Зонд не дает флуоресценции. Когда его отжигают к ДНК, амплифицированной от нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарной зонду, РНКаза Н расщепляет зонд. Затем повышается расстояние между флуоресцирующими веществами на зонде, что приводит к появлению флуоресценции. Таким образом, испускание показывает присутствие нуклеиновой кислоты-мишени. Если в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения используют РНКазу Н, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить только путем добавления зонда в реакционную смесь. Например, в качестве флуоресцирующих веществ для мечения зонда можно предпочтительно использовать сочетание флуоресцирующих веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-ЕЛМ) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-бкарбоксиродамина (ТЛМРЛ). которые составляют пару меток для ЕКЕТ, или сочетание 6-карбоксифлуоресцеина (6-ЕЛМ) и 4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойной кислоты (ΌΛΒΟΎΕ), которые составляют пару меток для не-ЕКЕТ.

Настоящее изобретение также относится к зонду, используемому в вышеописанном способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Зонд настоящего изобретения на ограничивается конкретным зондом до тех пор, пока он в нормальных условиях гибридизации может гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, амплифицированной с использованием способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. С учетом специфической детекции продукта амплификации предпочтителен зонд, гибридизирующийся в условиях, например, известных специалистам в данной области техники как строгие. Строгие условия гибридизации описываются, например, в Т. МашаЛ е1 а1., (ебк.). Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 2пб еб., 1989, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу. Конкретно, примером строгих условий являются следующие условия: инкубация при температуре примерно на 25°С ниже Тт используемого зонда на протяжении от 4 ч до ночи в 6 х 88С (1 х 88С: 0,15 М №С1, 0,015 М цитрата натрия, рН 7,0), содержащем 0,5% 8Ό8, 5 х растворе Денхардта (0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8А), 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% фиколла 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Зонд с меткой, описанной выше, можно использовать в качестве зонда для облегчения детекции нуклеиновой кислотымишени.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует применения обрудования, такого как термоячейка. Число праймеров, используемых в способе амплификации настоящего изобретения, может равняться одному или двум, что меньше, чем

- 11 006679 число праймеров, используемых в обычном способе. Так как реагенты, такие как 6ΝΤΡ8, используемые для ПЦР и подобных способов, можно применять в способе настоящего изобретения, стоимость работы может быть уменьшена по сравнению с обычным способом. Следовательно, способ настоящего изобретения можно использовать предпочтительно, например, в области генетических испытаний, при которых обычно проводят детекцию. Способ настоящего изобретения дает большее количество продукта амплификации за более короткий промежуток времени, чем ПЦР. Поэтому способ настоящего изобретения можно использовать как удобный, быстрый и чувствительный способ детекции гена.

Что касается реагента для реакции для получения реакционной смеси, используемой в способе настоящего изобретения, то соответствующие компоненты, составляющие реакционную смесь, можно хранить отдельно. С другой стороны, для удобства работы можно получить заранее раствор-премикс, в котором смешаны несколько компонентов. В случае такого реагента для реакции предпочтительно получить раствор-премикс, имеющий такой состав, что подавляется реакция, которая может разрушить в растворе основную функцию химерного олигонуклеотидного праймера как праймера с учетом устойчивости реагента. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, раствор-премикс предпочтительно имеет такой состав, который не приводит к полимеризации и/или разрушению химерного олигонуклеотидного праймера. В одном из воплощений способа настоящего изобретения, например, предпочтительно исключить или обратимо инактивировать по меньшей мере один из компонентов раствора-премикса, которые требуются для и участвуют в реакции синтеза нуклеиновой кислоты, используемой в способе настоящего изобретения. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, можно исключить или инактивировать по меньшей мере одно из веществ, выбранных из группы, состоящей из ДНК-полимеразы, химерного олигонуклеотидного праймера, магниевой соли и άΝΤΡδ. Посредством вышеописанного способа реагент для реакции, используемый в способе настоящего изобретения, можно стабилизировать при любой температуре. Кроме того, для того чтобы подавить инактивацию фермента(ов), фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н) можно отделить.

Таким образом, настоящее изобретение относится к реагенту для реакции, состоящему из двух растворов-премиксов, т. е. одного раствора, содержащего отделенный компонент (отделенные компоненты), и другого раствора, содержащего другие компоненты. Необязательно реагент для реакции может состоять из трех или большего числа растворов-премиксов.

Вышеуказанный способ стабилизации можно использовать как способ длительного хранения реагента для реакции, используемого в способе настоящего изобретения. Хотя не существует определенного ограничения, касающегося форм длительного хранения, например, предпочтительно получить реагент для реакций в форме, состоящей из двух частей, т. е. раствора химерного олигонуклеотидного праймера и буфера для реакции, содержащего фермент(ы), магниевую соль и 6ΝΤΡ§. В одном из воплощений способа длительного хранения настоящего изобретения буфер для реакции предпочтительно содержит соль. В данном случае концентрация соли означает концентрацию солей, включая буферирующий компонент, магниевую соль и соль для регулирования ионной силы (например, ацетат калия). Концентрацию содержащейся соли можно отрегулировать подходящим образом в зависимости от типов используемых ДНКполимеразы и РНКазы Н. Предпочтительно, концентрацию соли регулируют таким образом, что она создает ионную силу, которая стабилизирует фермент(ы). В таком случае концентрацию соли можно оптимизировать с использованием способа, описанного в примере 4. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, концентрация соли, содержащейся в буфере для реакции, содержащем фермент(ы), соответствует примерно конечной концентрации соли после реакции, например составляет 5 или меньше крат, предпочтительно 3 или меньше крат, предпочтительнее 1,5 или меньше крат, от конечной концентрации соли после реакции.

Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в случае реакционной системы, в которой используют ДНК-полимеразу Вса и РНКазу Н из бактерии рода Лгсйаеод1оЬи8, концентрация ΗΕΡΕδ-калийгидроксидного буфера может составлять более 0 и до 160 мМ, предпочтительно находиться в интервале от 30 до 120 мМ, предпочтительнее в интервале от 32 до 102 мМ. Если в качестве магниевой соли используют ацетат магния, концентрация может составлять более 0 и до 20 мМ, предпочтительно - находиться в интервале от 3 до 15 мМ, предпочтительнее в интервале от 4 до 13 мМ.

Если для регулирования ионной силы используют ацетат калия, концентрация может составлять более 0 и до 500 мМ, предпочтительно находиться в интервале от 90 до 360 мМ, предпочтительнее в интервале от 100 до 317 мМ. Необязательно можно включать отдельно реагент для регулирования концентрации соли, который используют для регулирования концентрации соли.

Раствор химерного олигонуклеотидного праймера может содержать соль для регулирования концентрации соли в реакционной смеси. В таком случае реакционную смесь можно получить с использованием двух растворов-премиксов.

Если следует получить реагент для реакции амплификации гена, праймер обычно растворяют в растворе на стерильной воде с низким содержанием соли (например, буфере ТЕ) и получают реакционную смесь с его необходимым количеством (см. Мо1еси1аг С1ошид, 2пб еб., 14.18).

- 12 006679

Согласно настоящему изобретению концентрацию соли в растворе-премиксе, содержащем фермент/ы), можно сделать подходящей для стабилизации фермента(ов), включая в раствор праймера соль, которая является компонентом реакционной смеси.

В другом воплощении способа длительного хранения по настоящему изобретению, где реагент для реакций находится в форме, состоящей из двух отдельных частей (т. е. раствора химерного олигонуклеотидного праймера и буфера для реакции, содержащего ферменты, магниевую соль и άΝΤΡδ), предпочтительно повышать концентрации ферментов в буфере для реакции. Концентрации содержащихся ферментов можно соответствующим образом отрегулировать в зависимости от типов используемых ДНК-полимеразы и РНКазы Н. В таком случае концентрацию соли можно оптимизировать с использованием способа, описанного в примере 4. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в случае реакционной системы, в которой используют ДНК-полимеразу Вса и РНКазу Н из бактерии рода Лгсйаеод1оЬи8 или рода Тйегшососсш, концентрации ферментов, содержащихся в буфере для реакции, предпочтительно повышать до тех пор, пока содержищиеся ферменты не инактивируются.

В воплощении реагента для реакции, в котором праймер можно легко заменить в зависимости от нуклеиновой кислоты как матрицы, для растворения праймера вместо раствора праймера можно использовать раствор, не содержащий праймер.

В другом воплощении от других компонентов можно отделить άΝΤΡδ, а не химерный олигонуклеотидный праймер, и можно определить концентрации соли в двух растворах-премиксах, учитывая устойчивость ферментов.

Что касается соотношения между концентрацией(ями) фермента(ов) и концентрацией соли в ферментсодержащем растворе-премиксе по настоящему изобретению, то предпочтительно установить норму содержания фермента выше 1, в то время как норма содержания соли поддерживается на уровне примерно 1, определяя конечную концентрацию фермента или соли после реакции как 1.

Предпочтительно, отношение (норма содержания фермента (Е))/(норма содержания соли (8)) составляет более 1. Отношение составляет предпочтительно 100>Е/8>1, предпочтительнее 10>Е/8>1, наиболее предпочтительно 5>Е/8>1.

В реагент для реакции по способу настоящего изобретения можно добавлять антисептическое средство или противогрибковое средство. Можно использовать коммерчески доступное антисептическое средство или противогрибковое средство. Примерами таких средств, которые можно использовать предпочтительно, являются азид натрия, параоксибензойная кислота, а также ее производные и соли, тимеросал и РтоС1ш и другие средства. Естественно, концентрацию антисептического средства или противогрибкового средства определяют такой, чтобы фермент, содержащийся в реагенте для реакции, не инактивировался во время хранения или реакции.

Реагент для реакции согласно способу длительного хранения настоящего изобретения можно хранить на протяжении примерно 1 месяца или дольше. В таком случае, хотя определенного ограничения по температуре хранения не существует, например, температура составляет 50°С или ниже, предпочтительно - 30°С или ниже.

(2) Праймер, используемый в способе детекции патогенного микроорганизма и/или вируса по настоящему изобретению.

Нуклеиновую кислоту-мишень в образце можно обнаружить с использованием способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Способ включает (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты как матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в З'-конце или со стороны З'-конца праймера;

(b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции; и (c) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени со стадии (Ь).

Если на указанной выше стадии (а) в качестве матрицы используют РНК, обратнотранскриптазную реакцию и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно проводить в одну стадию. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в качестве сочетания обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы типа с активностью замещения цепи можно использовать, предпочтительно, сочетание обратной транскриптазы АМУ, обратной транскриптазы ММЬУ или обратной транскриптазы ДАУ-2 и ДНК-полимеразы Вса.

Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы распознать отличие в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В таком аспекте используемый химерный олигонуклеотидный праймер конструируют таким, чтобы 3'концевая часть праймера располагалась вблизи специфического основания распознаваемой нуклеотид

- 13 006679 ной последовательности-мишени. Например, его конструируют так, что между основанием и 3'-концевым основанием праймера образуется водородная связь. Если имеет место ошибочное спаривание между нуклеотидной последовательностью 3'-концевой части праймера и нуклеотидной последовательностью матрицы, амплификации от нуклеиновой кислоты-мишени не происходит, и с использованием для реакции амплификации вышеуказанного химерного олигонуклеотидного праймера продукт амплификации не образуется. С использованием способа можно получить информацию о специфическом основании в гене, таком как точечная мутация или полиморфизм одного нуклеотида (8ΝΡ).

Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно предпочтительно использовать праймер для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса, выбранный из группы, состоящей из следующих праймеров:

(1) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции МусоЬас1егшт 1нЬсгсн1о515. имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО Ш N08: 7, 8, 21, 22, 162, 163, 170 и 171;

(2) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции НСУ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 15, 16, 81-86 и 88-91;

(3) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции сЫашуШа, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 17-20, 121-127, 130-135, 166 и 167;

(4) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции МусоЬас1етшш аушт сотр1ех, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 25-31;

(5) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции допососсик, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 38-63, 164 и 165;

(6) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции НВУ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 71-78;

(7) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции ВИЧ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 95-103;

(8) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции 81арйу1ососсп8 аигеик, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 108-117;

(9) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции микоплазмы, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 139-146; и (10) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции МК.8Л, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 152-155.

Для способа детекции настоящего изобретения можно предпочтительно использовать зонд для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса, выбранный из группы, состоящей из следующих зондов:

(1) зонда для детекции МусоЬасЮгшт 1иЬегси1о818, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 11, 12 и 172;

(2) зонда для детекции НСУ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 87 и 92;

(3) зонда для детекции сЫатуШа, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 128, 136 и 168;

(4) зонда для детекции МусоЬасЮпшп аушт сотр1ех, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 32 и 33;

(5) зонда для детекции допососсик, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 64-68;

(6) зонда для детекции НВУ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 79 и 80;

(7) зонда для детекции ВИЧ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 104 и 105;

(8) зонда для детекции 81арйу1ососсп8 аигеик, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 118 и 119;

(9) зонда для детекции микоплазмы, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 147-149; и (10) зонда для детекции МК.8Л, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 Ш N08: 156 и 157.

(3) Набор настоящего изобретения.

Набор настоящего изобретения содержит химерный олигонуклеотидный праймер и/или зонд, описанные выше в (2). Настоящее изобретение относится к набору, используемому для способа амплификации нуклеиновой кислоты или детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В одном из воплощений набор находится в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся применения ДНКполимеразы и эндонуклеазы в реакции замещения цепи. Также для способа настоящего изобретения предпочтительно использовать набор, содержащий ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи,

- 14 006679 эндонуклеазу и буфер для реакции замещения цепи. С другой стороны, можно выбрать коммерчески доступную ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи и/или эндонуклеазу и использовать согласно инструкциям. Кроме того, набор может содержать реагент для обратнотранскриптазной реакции, который используют, когда в качестве матрицы используют РНК. ДНК-полимеразу можно выбрать из числа ДНК-полимераз, используемых в настоящем изобретении, описанных выше. Эндонуклеазу можно выбрать из числа эндонуклеаз, описанных выше. Буфер для реакции замещения цепи может содержать буфер для реакции, содержащий в качестве буферирующего компонента бицин, трицин, НЕРЕ8, фосфат или трис, и раствор для отжига. Кроме того, набор может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеотидтрифосфата.

Инструкции представляют собой отпечатанный материал, где описывается способ применения набора, например способ получения раствора реагентов для реакции замещения цепи, рекомендуемые условия реакций и т. п. Инструкции включают руководство в форме проспекта или листовки, этикетку, наклеенную на набор, и описание на упаковке, содержащей набор. Инструкции также включают сведения, которые можно получить через электронные среды передачи данных, такие как Интернет.

Набор, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени, может содержать, кроме инструкций и реагентов для реакции амплификации, химерный олигонуклеотидный праймер, подходящий для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, или реагент для детекции амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени (например, зонд). Предпочтительно можно использовать набор, содержащий в качестве компонента реагент для реакции, сконструированный согласно способу стабилизации или длительного хранения реагента для реакции настоящего изобретения. Кроме того, набор настоящего изобретения может содержать нуклеиновую кислоту, служащую в качестве внутреннего стандарта (Ι. С.) для оценки ложноотрицательных показателей. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, примерный набор содержит химерные олигонуклеотидные праймеры с нуклеотидными последовательностями 8ЕО ΙΌ N08: 170 и 171, зонд для детекции МусоЬасЮпиш 1иЬсгси1о515. имеющий нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 172, плазмиду в качестве внутреннего стандарта, содержащую нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 169, и зонд для детекции внутреннего стандарта, имеющий нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 173. Другой пример набора для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса также может содержать внутренний стандарт.

Примеры

Приведенные далее примеры исллюстрируют настоящее изобретение подробнее, но не предназначаются для ограничения его объема.

Ссылочный пример 1.

(1) Величину единицы теплоустойчивой РНКазы Н, используемой в способе настоящего изобретения, можно вычислить следующим образом.

В 1 мл 40-мМ трис-НС1 (рН 7,7), содержащем 1 мМ ЭДТК, растворяют 1 мг поли(гА) или поли(бТ) (оба от АтегкНаш РНагтас1а Вю1ес11) и получают раствор поли(гА) и раствор поли(бТ).

Затем раствор поли(гА) (с конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(бТ) (с конечной концентрации 30 мкг/мл) добавляют к 40-мМ трис-НС1 (рН 7,7), содержащему 4 мМ МдС1₂, 1 мМ ΌΤΤ, 0,003% В8А и 4% глицерина. В смеси проводят реакцию при 37°С в течение 10 мин и затем смесь охлаждают до 4°С и получают раствор поли(гА)-поли(бТ). К 100 мкл раствора поли(гА)-поли(бТ) добавляют 1 мкл соответствующим образом разведенного раствора фермента. В смеси проводят реакцию при 40°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТК для прекращения реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТК, в полученной смеси проводят реакцию при 40°С в течение 10 мин и затем измеряют поглощение. Величину (разницу в поглощении) получают, вычитая поглощение в контроле из поглощения для смеси в случае реакции в отсутствие ЭДТК. Таким образом, на основе разницы в поглощении определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(гА)-поли(бТ) путем ферментативной реакции. Единица=[(разница в поглощении)х(объем реакционной смеси (мл))]/0,0152х(110/100)х(степень разведения)

Ссылочный пример 2. Получение РНКазы Н.

РНКазу Н, используемую согласно настоящему изобретению, получают по способу, описанному в ν0 02/22831. Конкретно, культивируют рекомбинантные клетки ЕксНепсЫа со11 и из клеток получают представляющую интерес РНКазу Н, как описано далее.

(1) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Ругососсик Гигюкик.

Была сконструирована ЕксНепсЫа со11 ДМ 109, трансформированная плазмидой рБИ220, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Ругососсик Гигюкик, обозначена как ЕксНспсЫа со11 1М109/ рБИ220 и депонирована 5 сентября 2000 г. (дата начального депозита) в !п1сгпа11опа1 Ра1сп1 0гдашкт Оерокбагу, №-1бопа1 ΙηκΙίΙυΙο оГ Абуапсеб Ιη6υ8ΐΓία1 8с1епсе апб ТесНпо1оду, ΑΙ8Τ ТкикиЬа Сеп1га1 6, 1-1, Н1дакЫ 1-сНоте, ТкикиЬа-кЫ, ΙΝιπιΕί 305-8566, крап, под инвентарным номером РЕВМ ВР-7654. ЕксНепсЫа со11 ДМ 109, трансформированную рБИ220, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 66,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и

- 15 006679 обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом, получают

61.5 мл горячего супернатанта.

Горячий супернатант загружают в колонку с КЕЗОИКСЕ О (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй). В результате РНКаза НП протекает через колонку с КЕЗОИКСЕ О.

Загружают 60,0 мл фракции РНКазы Н11, протекшей через колонку, в колонку с КЕЗОИКСЕ З (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером А, и элюируют с линейным градиентом №101 от 0 до 500 мМ с использованием системы РРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 150 мМ №С1. Методом ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Аткоп) концентрируют 2,0 мл фракции РНКазы Н11. Загружают 250 мкл концентрата в колонку для гель-фильтрации с супердексом 200 (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную 50-мМ трис-НС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ Ν'®.! и 0,1 мМ ЭДТК, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу Н11 элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 17 кДа. Ферментативную активность препарата, полученного таким образом, измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в препарате наблюдают активность РНКазы Н.

(2) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Ругососсик йопкокйй.

Была сконструирована ЕксйегкЫа сой 1М109, трансформированная плазмидой рРН02З8, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Ругососсик йопкокйл, обозначена как ЕксйепсЫа сой 1М109/ рРН02З8 и депонирована 22 февраля 2001г. (дата начального депозита) в 1п1егпа1юпа1 Ра1еп1 Огдаткт Лерокйагу, №Июпа1 1пк1Щ11е оГ Абгапсеб 1пбик1па1 Зскпсе апб Тесйпо1оду, А1ЗТ Ткикийа Сеп!га1 6, 1-1, Н1дакй1 1-сйоте, Ткикийа-кЫ, 1йагак1 З05-8566, 1арап, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7692. ЕксйегкЫа сой 1М109, трансформированную рРН02З8, инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при З7°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в З4,З мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 80°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом, получают

33.5 мл горячего супернатанта.

Горячий супернатант загружают в колонку с КЕЗОИКСЕ О (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй). В результате РНКаза Н11 протекает через колонку с КЕЗОИКСЕ О.

Диализуют З5,0 мл фракции РНКазы Н11, протекшей через колонку, против 2 л буфера В (50 мМ трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТК) в течение 2 ч. Диализ повторяют еще 2 раза. Загружают З4,5 мл фракции диализованного раствора фермента в колонку с КЕЗОИКСЕ З (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером В, и элюируют линейным градиентом Ν'®.! от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 155 мМ №С1.

Добавляют буфер В к 4,0 мл фракции, чтобы получить концентрацию Ν'®.! 50 мМ. Смесь загружают в колонку с Н1Тгар-гепарином (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 160 мМ №С1.

Методом ультрафильтрации с использованием Сеи1псои-10 (Аткоп) концентрируют 6,9 мл фракции РНКазы Н11. Делят на две порции 250 мкл концентрата и загружают в колонку для гель-фильтрации с суперозой 6 (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную 50-мМ трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТК, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу Н11 элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 24,5 кДа. Такая молекулярная масса соответствует РНКазе Н11 в мономерной форме. Ферментативную активность препарата, полученного таким образом, измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в препарате наблюдают активность РНКазы Н.

(3) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Агсйаеод1ойик Ги1д1бик.

Была сконструирована ЕксйегкЫа сой 1М109, трансформированная плазмидой рАЕИ204, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Агсйаеод1ойик Ги1д1бик, обозначена как ЕксйегкЫа сой 1М109/ рАЕИ204 и депонирована 22 февраля 2001г (дата начального депозита) в 1п1егпа1юпа1 Ра1еи1 ОгдаЫкт Лерокйагу, №Июпа1 1пк1Щ11е оГ Абгапсеб 1пбик1па1 Зскпсе апб Тесйпо1оду, А1ЗТ Ткикийа Сеп1га1 6, 1-1, Н1дакй1 1-сйоте, Ткикийа-кй1, 1йагак1 З05-8566, 1аран, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7691. ЕксйегкЫа сой 1М109, трансформированную рАЕИ204, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при З7°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в З7,1 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 70°С в течение 15 мин. Затем его снова

- 16 006679 центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом, получают 40,3 мл горячего супернатанта.

Горячий супернатант загружают в колонку с ВЕЗОИВСЕ О (АшегкБат РБагтааа Вю1ес11), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (АтегкБат РБагтааа Вю1есБ). В результате РНКаза Н11 протекает через колонку с ВЕЗОИВСЕ О.

Фракцию РНКазы Н11, протекшую через колонку, загружают в колонку с ВЕЗОИВСЕ З (АтегкБат РБагтааа Вю1есБ), уравновешенную буфером А, и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (АтегкБат РБагтааа Вю1есБ). В результате РНКаза Н11 протекает через колонку с ВЕЗОИВСЕ З.

В течение 2 ч диализуют 40,0 мл фракции РНКазы Н11, протекшей через колонку, против 2 л буфера В (50 мМ трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТК), содержащего 50 мМ №С1. Диализ повторяют еще 2 раза. Загружают 40,2 мл диализованного раствора фермента в колонку с Н1Тгар-гепарином (АтегкБат РБагтааа Вю1есБ), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 240 мМ №С1.

Методом ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Ашюоп) концентрируют 7,8 мл фракции РНКазы Н11. Примерно 600 мкл концентрата делят на четыре части и загружают в колонку для гельфильтрации с суперозой 6 (АтегкБат РБагтааа Вю1есБ), уравновешенную 50-мМ трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТК, 250 мкл, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу Н11 элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 30,0 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в мономерной форме. Ферментативную активность препарата, полученного таким образом, измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в препарате наблюдают активность РНКазы Н.

(4) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из ТБегтососсик 1Ботайк.

Была сконструирована ЕксБейсШа сой НМЗ174(ИЕ3), трансформированная плазмидой рТИ204, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из ТБегтососсик БЮгаБк, обозначена как ЕксБейсШа сой НМЗ174(ИЕ3)/рТи204 и депонирована 22 февраля 2001г. (дата начального депозита) в 1п1егпайопа1 Ра1еп1 Ощашкт ИерокБагу, №1йопа1 1п8111и(е о£ Айуапсей 1пйикйта1 Заепсе апй Тесйпо1оду, А1ЗТ ТкикиБа Сепйа1 6, 1-1, НЦакЫ 1-сБоте, ТкикиЬа-кБ1, 1Багак1 305-8566, 1арап, под инвентарным номером РЕВМ ВР-7693. ЕксБепсШа сой НМЗ174(ИЕ3), трансформированную рТИ204, иноку лируют в 10 мл среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение ночи. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, обрабатывают так, как описано выше, и получают горячий супернатант. Ферментативную активность полученного таким образом горячего супернатанта измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в горячем супернатанте наблюдают активность РНКазы Н.

(5) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из ТБегтососсик се1ег.

Была сконструирована ЕксБепсШа сой НМЗ174(ИЕ3), трансформированная плазмидой рТСЕ207, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Тйеттососсик се1ег, обозначена как ЕксБепсШа сой НМЗ174(ИЕ3)/рТСЕ207 и депонирована 22 февраля 2001г. (дата начального депозита) в 1п1етпайопа1 Ра1еп1 Огдашкт ИерокБагу, №йопа1 1пкйШ1е о£ Айуапсей 1пйикйта1 Заепсе апй ТесБпо1оду, А1ЗТ ТкикиБа Сепйа1 6, 1-1, НЦакШ 1-сБоте, ТкикиБа-кШ, 1Багак1 305-8566, 1арап, под инвентарным номером ЕЕВМ ВР-7694. ЕксБепсШа сой НМЗ174(ИЕ3), трансформированную рТСЕ207, культивируют, и полученные клетки очищают, и получают горячий супернатант. Ферментативную активность полученного таким образом горячего супернатанта измеряют так, как описано выше в (4). В результате в горячем супернатанте наблюдают активность РНКазы Н.

Ссылочный пример 3.

Проверяют способ амплификации настоящего изобретения.

(1) Осуществляют ПЦР с использованием праймера для ПЦР 150 выше рИС19 (ЗЕЦ ГО NО: 1) и праймера для ПЦР рИС19 ниже NN (ЗЕЦ ГО NО: 2), а также 100 пг плазмидной ДНК рИС19 в качестве матрицы. Полученный амплифицированный фрагмент очищают с использованием М1сгосоп-100, выравнивают концы с использованием набора для выравнивания ДНК (Такага ЗБнхо) и субклонируют в сайт Н1пй1 плазмиды рИС19. Плазмиду со встроенным амплифицированным фрагментом используют для трансформации ЕксБепсШа сой ДМ109. Трансформант культивируют. Плазмиду со встроенной ДНК рИС19-150 выделяют из клеток в чистом виде с использованием ΟΜΟΗΝ р1акт1й ш1ш кБ (О|адеп). ПЦР осуществляют с использованием в качестве матрицы плазмиды со встроенной ДНК, а также праймеров МСЗ-Е (ЗЕЦ ГО NО: 3) и МСЗ-В (ЗЕЦ ГО NО: 4). Путем очистки реакционной смеси с использованием М1сгосоп-100 (МБйроге) получают ПЦР-амплифицированный фрагмент в 534 п.о. Получают реакционную смесь, содержащую 15 нг фрагмента ПЦР, 30 пмоль праймера МВ2 (ЗЕЦ ГО NО: 5), меченного [у-³²Р] АТР путем фосфорилирования по 5'-концу, и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и также реакционную смесь, содержащую 30 пмоль праймера МВ1 (ЗЕЦ ГО NО: 6). Реакционную смесь денатурируют тепловой обработкой при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С. В каждую реакционную смесь добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ трицинового буфера (рН 8,7), 12,5 мМ хлорида калия, 12,5 мМ сульфата аммония, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетата магния, 0,625 мМ каж

- 17 006679 дого 6ΝΤΡ), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Полученные смеси реагируют при 55°С в течение 15 мин. По завершении реакции к 5 мкл каждой реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для прекращения реакции (95% формамида, 20 мМ ЭДТК, 0,05% бромфенолового синего, 0,5% ксиленцианола). Смеси денатурируют тепловой обработкой при 94°С в течение 3 мин. Каждую реакционную смесь (1,6 мкл) подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевины, регистрируют сигналы с использованием ВАЗ2000 (Еирх) и детектируют продукты, достроенные с праймера МК.1. Результаты показаны на фиг. 1А. Лэддер на фиг. 1А получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М13тр18 (Такага ЗНихо) с использованием праймера МЕ2, меченного [γ-³²Ρ]ΑΤΡ путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: сочетание праймеров МЕ2 и МК1; и полоса 2: МК1.

Как видно на фиг. 1А, детектируется полоса в 448 п.о., достроенная с праймера МК1 к концу матрицы, когда реакцию достраивания осуществляют, добавляя к матрице только праймер МК1. С другой стороны, при добавлении также праймера МР2 кроме вышеуказанной полосы детектируется полоса в 373 п.о., связанная с праймерами МК1 и МЕ2. Таким образом, подтверждается, что достраивание с праймера МК1 с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента как матрицы под действием ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ переключается из-за переключения матрицы на достраивание с использованием цепи, достраиваемой с праймера МЕ2 как матрицы. Кроме того, переключение матрицы наблюдают, когда используют ДНК-полимеразу Кленова в качестве мезофильной ДНК-полимеразы, обладающей в подобных условиях активностью замещения цепи. С другой стороны, переключение матрицы не наблюдают с использованием ДНК-полимеразы ТаКаКа Тад (Такага ЗНихо) или РугоВЕЗТ (Такага ЗНихо), которые не обладают активностью замещения цепи.

(2) Проверяют реакцию переключения матрицы с использованием цепи матричной ДНК с отожженным к ней праймером. Фрагменты ДНК, к которым можно отжигать праймеры МЕ2 и МК1, получают следующим образом. Осуществляют ПЦР с использованием плазмиды рИС19 как матрицы и праймеров МСЗЕ и КУ (Такага ЗНихо) или праймеров М4 (Такага ЗНихо) и МСЗК. Реакционные смеси очищают с использованием Мюгосоп-100 и получают ПЦР-амплифицированные фрагменты МСЗР-КУ (236 п.о.) и М4-МСЗК (271 п.о.). Участок, связанный праймерами М4 и КУ, обычно присутствует в обоих ПЦРамплифицированных фрагментах.

Затем получают матрицу-праймер (2)-1, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами не отожжены друг с другом, и матрицу-праймер (2)-2, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами отожжены друг с другом, как описывается далее.

(2)-1. Реакционную смесь, содержащую 30 нг фрагмента МСЗЕ-КУ, 40 пмоль праймера МЕ2, меченного |/-³²Р|АТР путем фосфорилирования по 5'-концу, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и реакционную смесь, содержащую 30 нг фрагмента М4-МСЗК, 40 пмоль праймера МК1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, по отдельности денатурируют тепловой обработкой при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С. Смешивают вместе по 2,5 мкл каждой реакционной смеси и получают матрицу-праймер.

(2)-2. Реакционную смесь, содержащую 15 нг фрагмента МСЗЕ-КУ, 15 нг фрагмента М4-МСЗК, 20 пмоль праймера МЕ2, меченного |/-³²Р|АТР путем фосфорилирования по 5'-концу, 20 пмоль праймера МК1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, денатурируют тепловой обработкой при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С, и получают матрицу-праймер.

К 5 мкл каждой реакционной смеси матрицы-праймера добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ трицинового буфера (рН 8,7), 12,5 мМ хлорида калия, 12,5 мМ сульфата аммония, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетата магния, 0,625 мМ каждого бЭТР), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Полученные смеси реагируют при 55°С в течение 15 мин. По завершении реакции к 5 мкл каждой реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для прекращения реакции (95% формамида, 20 мМ ЭДТК, 0,05% бромфенолового синего, 0,5% ксиленцианола). Смеси денатурируют тепловой обработкой при 94°С в течение 3 мин. Каждую реакционную смесь (1,6 мкл) подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевины, регистрируют сигналы с использованием ВАЗ2000 (Еирх) и детектируют продукты, достроенные с праймера МЕ2. Результаты показаны на фиг. 1В. Лэддер на фиг. 1В получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М13тр18 с использованием праймера МК1, меченного ^-³²Р]АТР путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: цепи матричной ДНК не отожжены друг с другом; и полоса 2: цепи матричной ДНК отожжены друг с другом.

Как видно на фиг. 1В, только полоса в 161 п.о., достроенная с праймера МР2 к концу матрицы, детектируется в случае матрицы-праймера, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами не отожжены друг с другом. С другой стороны, кроме вышеуказанной полосы, детектируют полосу в 223 п.о., связанную с праймерами МР2 и МК1, в случае матрицы-праймера, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами отожжены друг с другом. Таким образом, подтверждается, что реакция пере

- 18 006679 ключения матрицы происходит, если цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами отожжены друг с другом.

Пример 1.

Проверяют способ детекции настоящего изобретения с использованием в качестве объекта МусоЬайегшт 1нЬегсн1о818. На основе нуклеотидной последовательности генома МусоЬайегшт 1нЬегси1о818, зарегистрированного в ОепеВапк под инвентарным № ЛЫ23456, синтезируют праймеры К-Е-1033-2 (8Е0 ΙΌ N0: 7) и К-Е-1133-2 (8Е0 ГО N0: 8) для амплификации участка с относительно низким содержанием ОС в геноме МусгоЬайепцщ 1иЬегси1о818. Длина участка, ограниченного парой праймеров, включая праймерные части, составляет 105 п.о. Геномную ДНК МусоЬас1епит шЬегси1о818 как матрицу экстрагируют из сухой вакцины БЦЖ (№ррои ВСО 8е1/о) обычным способом. Получают серийные разведения, содержащие от 100 фг до 10 пг геномной ДНК на 1 мкл стерильной воды. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8); 100 мМ ацетата калия; 1% ДМСО; 0,01% В8А; 4 мМ ацетата магния; 500 мкМ каждого из бЭТР; 50 пмоль каждого из праймеров КЕ-1033-2 и К-Е-1133-2, 9,375 Е РНКазы Н11 из РЕи, 4,375 Е РНКазы Н11 из АЕи или 4 Е РНКазы Н из ТК; 2,75 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т; 1 мкл одной из матриц и стерильную воду. Реакционные смеси помещают в термоячейку Рег8оиа1, установленную на 62°С, и инкубируют в течение 60 мин. По завершении реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате подтверждается, что продукт амплификации обнаруживают при использовании каждой РНКазы Н11 и любого количества (100 фг-10 пг) геномной ДНК как матрицы.

Пример 2.

(1) Проверяют способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени с использованием РНК-зонда. В качестве объекта выбирают МусоЬайегшт 1иЬегси1о818. В 50 мкл реакционной смеси добавляют в качестве матрицы 1 нг или 100 пг геномной ДНК БЦЖ, полученной в примере 1. С использованием синтезатора ДНК синтезируют праймеры МТ182Е (8Е0 ГО N0: 162) и МТ182Е (8Е0 ГО N0: 163), а также РНК-зонды для детекции МТ18 (8Е0 ГО N0: 11) и МТ18-2 (8Е0 ГО N0: 12). Каждый зонд имеет флуоресцентные метки 6-ЕАМ (О1еп Еекеагсй) и ТАМЕА (О1еп Еекеагсй) на 5'- и 3'-концах, соответственно. Реакции осуществляют так, как описывается в примере 1, за исключением того, что используют 4 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т и 18,75 Е РНКазы Н11 из РЕи. В каждую реакционную смесь добавляют (конечный объем 50 мкл) 5 пмоль РНК-зонда. Из 50 мкл каждой реакционной смеси 25 мкл используют для реакции IСАN при 58°С. Для реакций IСАN и детекции продуктов амплификации используют 8шаг1 Сус1ег (Такага 811ихо). Результаты показаны на фиг. 2А. На фиг. 2 (А, В и С) продольные оси представляют интенсивность флуоресценции, а горизонтальные оси представляют время. Как видно на фиг. 2А, только с использованием 1 нг или 100 пг матричной ДНК методом анализа с использованием 8таП Сус1ег можно проверить амплифицированные фрагменты, представляющие интерес. Более того, подтверждается, что оба РНКзонда можно предпочтительно использовать для детекции в режиме реального времени.

(2) Проверяют одностадийную систему детекции ΚΤ-IСАN с использованием интеркалятора. В качестве объекта выбирают геном НСУ. РНК как матрицу получают следующим образом. Из 300 мкл сыворотки пациента с гепатитом С после информированного согласия с использованием реагента ТЕ1хо1 (Ь1Ее Тесйио1оду) согласно инструкциям, прилагаемым к реагенту, получают образец РНК и окончательно растворяют в 20 мкл воды для инъекций (0йика Рйагтасеибса1). Образец РНК используют в качестве матрицы для ОТ-ПЦР. Реакцию осуществляют следующим образом. Получают 50 мкл реакционной смеси с использованием 2 мкл образца РНК, 20 пмоль каждого из праймеров 8Р6-НСУ-Е (8Е0 ГО N0: 13) и Т7-НСУ-Е (8Е0 ГО N0: 14) и набора 0пе-81ер ЕNА РСЕ (Такага 81шхо) согласно руководству, прилагемому к набору. Реакционную смесь помещают в термоячейку РегкопаЕ проводят реакцию при 50°С в течение 15 мин и при 94°С в течение 2 мин и смесь подвергают 40 циклам реакций по следующей схеме: 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. По завершении реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в агарозном геле с 2% 8еаР1ас.|ие ОТО и вырезают из геля представляющий интерес продукт амплификации в 350 п.о. ДНК извлекают с использованием ЕА8УТКАР Уег. 2 (Такага 811ихо) согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Синтезируют транскрибированную РНК с использованием извлеченной ДНК как матрицы и набора СотреШАе ЕNА Тгапкспрйоп (Такага 811ихо) согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Используют РНК как матрицу для проверки одностадийной КТПСАК

Добавляют матричную РНК, соответствующую 0,1х10⁵, 1х10⁶ или 1х10⁷ копий. Получают реакционные смеси в конечном объеме 50 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из б№ТР, 50 пмоль каждого из праймеров, представленных 8Е0 ГО N08: 15 и 16, 5 Е РНКазы Н11 из АЕц, 4 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, 20 Е ингибитора РНКазы, 2,5 Е ревертазы ХЬ АМУ (Тайага 81ш/о), 1 мкл транскрибированной РНК, соответствующей заданному числу копий, и 5 мкл 3000-кратного разведения исходного раствора 8 ΥΒΕ Огееп I (нуклеиновая кислота 8 ΥΒΕ Огееп I, Ое1 81ат, Вю\УЫбакег Мо1еси1аг Аррйсабопк) стерильной водой в качестве интеркалятора. Для реакции IСАN при 53°С используют 25 мкл каждой реакционной смеси. Для реакций IСАN и детекции используют систему АВ1 РК18М™ 7700 (АррНеб Вюкукйшк). Результаты показаны на фиг. 2В. Как видно из фиг. 2В, подтвержда

- 19 006679 ется, что нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в режиме реального времени с использованием способа одностадийной ΚΤ-Ιί’ΑΝ.

(3) Проверяют систему детекции Ιί.ΆΝ с использованим интеркалятора. В качестве объекта выбирают геном с111ашуЙ1а. На основе нуклеотидной последовательности плазмиды СЫатуЛа 1гас1ютаР5 (СепеВапк, инвентарный № Х06707) синтезируют праймеры СТ2Р (8Е0 ΙΌ N0: 17) и СТ2И (8Е0 ΙΌ N0: 18). Длина участка, ограниченного парой праймеров, включая праймерные части, составляет 109 п.о. Кроме того, также синтезируют праймеры СТ-РВ19-3 (8Е0 ΙΌ N0: 19) и СТ-ИВ23-2 (8Е0 ΙΌ N0: 20) в качестве праймеров для амплификации сЫатуФа. Длина участка, ограниченного парой праймеров, включая праймерные части, составляет 107 п.о. Получают реакционные смеси в конечном объеме 50 мкл, содержащие, в конечных концентрациях, 32 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из ЙЭТР, 50 пмоль каждого из праймеров СТ2Е и СТ2И или праймеров СТ-ЕВ19-3 и СТ-ЯВ23-2, 35 Е РНКазы Н11 из АГи, 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, 1 мкл образца и стерильную воду. К 22,5 мкл каждой реакционной смеси добавляют в качестве интеркалятора 2,5 мкл 3000-кратного разведения исходного раствора 8УВИ Сгееп I и реакционные смеси подвергают реакции IСΑN при 55°С. Для реакций IСΑN и детекции используют 8таг1 Сус1ег. Результаты показаны на фиг. 2С. Как видно из фиг. 2С, подтверждается, что нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в режиме реального времени с использованием интеркалятора в системе для детекции сЫатуФа.

Как описано выше, подтверждается, что способ настоящего изобретения можно использовать для детекции нуклеиновой кислоты-мишени в режиме реального времени.

Пример 3.

Устойчивость при хранении реагента, используемого для способа настоящего изобретения, проверяют следующим образом.

(1) Получают и хранят при 4 или 30°С в течение примерно 1 месяца раствор-премикс для реакции 1САН содержащий 1,6 мМ каждого из йКТРк, 101 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 317 мМ ацетата калия, 12,7 мМ ацетата магния, 0,03% бычьего сывороточного альбумина, 3,2% диметилсульфоксида, 0,56 Е/мкл РНКазы Н11 из АГи и 0,35 Е/мкл ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т.

К 7,875 мкл раствора-премикса для реакции IСΑN добавляют 16,125 мкл водного раствора, содержащего 50 пмоль каждого из праймеров для детекции МусоЬас1епит 1иЬегси1о515 К-Е-1033 (68) (8Е0 ΙΌ N0: 21) и К-И-1133 (68) (8Е0 ΙΌ N0: 22). Кроме того, к смеси добавляют 1 мкл водного раствора, содержащего геномную ДНК БЦЖ, полученную в примере 1, в концентрации 100 или 10 пг/мкл. Полученные смеси подвергают реакции IСΑN при 64°С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле для подтверждения амплификации. Процедуру повторяют после соответствующего периода хранения (в днях) и устойчивость растворапремикса для реакции IСΑN оценивают, основываясь на продуктах амплификации по К^АН обнаруженных после электрофореза. Результаты показаны на фиг. 3. Фиг. 3 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез, представляющий результаты по устойчивости при хранении раствора-премикса настоящего изобретения. Фиг. 3А показывает результаты при хранении при 4°С. Полоса 1: непосредственно после получения раствора-премикса, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: непосредственно после получения, 10 пг; полоса 3: 9 дней после получения, 100 пг; полоса 4: 9 дней после получения, 10 пг; полоса 5: 18 дней после получения, 100 пг; полоса 6: 18 дней после получения, 10 пг; полоса 7: 28 дней после получения, 100 пг; и полоса 8: 28 дней после получения, 10 пг.

Фиг. 3В показывает результаты при хранении при 30°С. Полоса 1: непосредственно после получения раствора-премикса, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: непосредственно после получения, 10 пг; полоса 3: 6 дней после получения, 100 пг; полоса 4: 6 дней после получения, 100 пг; полоса 5: 10 дней после получения, 100 пг; и полоса 6: 10 дней после получения, 10 пг.

Как видно на фиг. 3, подтверждается, что раствор-премикс можно использовать для устойчивого осуществления реакции IСΑN после хранения при 4°С в течение 28 дней или более после получения. Также подтверждается, что раствор-премикс можно использовать для устойчивого осуществления реакции IСΑN после хранения при 30°С в течение 10 дней или более после получения. Таким образом, подтверждается, что реагент для амплификации с использованием способа IСΑN можно хранить в течение длительного периода времени, когда его получают и хранят в виде раствора-премикса для реакции в условиях, описанных выше.

Кроме того, подобные результаты получают, когда получают растворы-премиксы для К^АН содержащие 3-, 10- или 30-кратное количество РНКазы НИ из АГи и подвергают их испытаниям на хранение в условиях, описанных выше.

Пример 4.

Устойчивость и возможность длительного хранения реагента, используемого для способа настоящего изобретения, проверяют следующим образом.

(1) Проверяют состав раствора-премикса в процессе хранения. Конкретно, получают раствор (Ι), содержащий 142 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 444 мМ ацетата калия, 0,044% бычьего сывороточного альбумина, 4,44% диметилсульфоксида, 0,8 Е/мкл РНКазы НИ из АГи и 0,5 Е/мкл ДНК

- 20 006679 полимеразы ВсаВЕЗТ. Получают премикс [А], премикс [В], премикс [С] и премикс [Ό], добавляя к 5,625 мкл раствора (I) для премикса [А] (без праймера) 1 мкл 100-мМ раствора ацетата магния и 1,25 мкл ЙЫТРк; для премикса [В] (без ЙЫТРк) по 1 мкл каждого из праймеров для детекции МусоЬас1епит 1иЬегси1о515 КЕ-1033 (68) и К-К-1133 (68) (50 пмоль/мкл) и 1 мкл 100-мМ раствора ацетата магния; для премикса [С] (без ацетата магния) 1 мкл каждого из К-Е-1033 (68) и К-К-1133 (68) (50 пмоль/мкл) и 1,25 мкл 10-мМ ЙМТРк; и для премикса [Ό] по 1 мкл каждого из К-Е-1033 (68) и К-К-1133 (68) (50 пмоль/мкл), 1 мкл 100-мМ раствора ацетата магния и 1,25 мкл 10-мМ ЙЫТРк. Растворы-премиксы хранят при 30°С в течение 2 ч. К 7,875 мкл премикса [А] добавляют 1 мкл каждого из К-Е-1033 (68) и К-К-1133 (68) (50 пмоль/мкл); к 8,625 мкл премикса [В] добавляют 1,25 мкл 10-мМ йЫТРк; и к 8,875 мкл премикса [С] добавляют 1 мкл 100-мМ ацетата магния. Затем к премиксу [А], премиксу [В] и премиксу [С] добавляют воду для инъекций или 9,875 мкл премикса [Ό] до объема 24 мкл.К каждой смеси добавляют 1 мкл геномной ДНК БЦЖ в концентрации 100 пг/мкл. Полученные смеси инкубируют при 64°С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения амплификации. В результате подтверждается, что композиции премикса [А], премикса [В] и премикса [С] предпочтительны для стабилизации реагента.

(2) Проверяют изменения при хранении с использованием раствора-премикса, содержащего все компоненты, необходимые для реакции ΚΑΝ, и растворов-премиксов, из которых удален праймер, Мд²⁺ или подобное. Конкретно, получают премикс (I), содержащий 69 мМ НЕРЕЗ-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 215 мМ ацетата калия, 0,022% бычьего сывороточного альбумина, 2,2% диметилсульфоксида, 8,6 мМ ацетата магния, 1,1 мМ каждого из ЙЫТРк, 0,38 Е/мкл РНКазы Н11 из А£и, 0,24 Е/мкл ДНКполимеразы ВсаВЕЗТ, 80 кБк/мкл [а-³²Р]ЙАТР (Атегайат Рйагтааа Вю1ес11) и 5,2 мкл каждого из праймеров для детекции МусоЬааегшт ШЬегсЫокА К-Е-1033 (68) и К-К-1133 (68). Кроме того, получают премикс (ΙΙ), в котором из состава премикса (Ι) изъяты праймеры, и премикс (ΙΙΙ), в котором из состава премикса (Ι) изъят ацетат магния. Из каждого премикса после хранения при 30°С в течение 2, 5 или 20 ч отбирают 3-мкл образцы и замораживают при -20°С. Образцы подвергают электрофорезу в 15% акриламидном геле. Гель работает в течение 1,5 ч, затем его сушат и подвергают авторадиографии. Результаты показаны на фиг. 4. Фиг. 4 представляет собой фигуру, демонстрирующую авторадиографию. Полоса 1: премикс (III), хранившийся в течение 2 ч; полоса 2: премикс (III), хранившийся в течение 5 ч; полоса 3: премикс (ΙΙΙ), хранившийся в течение 20 ч; полоса 4: премикс (ΙΙ), хранившийся в течение 2 ч; полоса 5: премикс (II), хранившийся в течение 5 ч; полоса 6: премикс (II), хранившийся в течение 20 ч; полоса 7: премикс (I), хранившийся в течение 2 ч; полоса 8: премикс (I), хранившийся в течение 5 ч; и полоса 9: премикс (I), хранившийся в течение 20 ч.

Как видно на фиг. 4, подтверждается, что генерация высокомолекулярной ДНК во время хранения, обнаруживаемая для премикса (I), подавляется путем изменения состава до состава премикса (II) или премикса (III), которые соответствуют составу премикса (I) с устранением из него праймеров или ацетата магния. Таким образом, подтверждается, что побочную реакцию химерного олигонуклеотидного праймера можно подавить и реагент можно стабилизировать путем устранения из реакционной смеси химерного олигонуклеотидного праймера, соли магния или ЙЫТРк.

(3) Проверяют норму содержания (концентрацию соли) для хранения в растворе-премиксе, содержащем все компоненты, необходимые для реакции ΚΑΝ, за исключением праймеров. Конкретно, получают и хранят при 30°С раствор-премикс А для реакции ΚΑΝ, раствор-премикс В для реакции ΚΑΝ и раствор-премикс С для реакции ΚΑΝ, содержащие, соответственно, раствор-премикс А - 1,6 мМ каждого из ЙЫТРк, 102 мМ НЕРЕЗ-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 317 мМ ацетата калия, 13 мМ ацетата магния, 3,2% диметилсульфоксида, 0,03% бычьего сывороточного альбумина, 0,556 Е/мкл РНКазы НН из А£и и 0,349 Е/мкл ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ; раствор-премикс В - 1 мМ каждого из ЙЫТРк, 64 мМ НЕРЕЗ-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 200 мМ ацетата калия, 8 мМ ацетата магния, 2% диметилсульфоксида, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 0,35 Е/мкл РНКазы НН из А£и и 0,22 Е/мкл ДНКполимеразы ВсаВЕЗТ; и раствор-премикс С - 0,57 мМ каждого из ЙЫТРк, 36 мМ НЕРЕЗ-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 114 мМ ацетата калия, 4,5 мМ ацетата магния, 1,1% диметилсульфоксида, 0,01% бычьего сывороточного альбумина, 0,2 Е/мкл РНКазы НН из А£и и 0,125 Е/мкл ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ.

Добавляют 50 пмоль каждого из праймеров для детекции МусоЬас1епит шЬегсЫокА К-Е-1033 (68) и К-К-1 133 (68), а также воду для инъекций до объема 24 мкл к 7,875 мкл раствора-премикса А, 12,5 мкл раствора-премикса В или 22 мкл раствора-премикса С. Затем к ним добавляют 1 мкл водного раствора, содержащего геномную ДНК БЦЖ в концентрации 100 или 10 пг/мкл. Полученные смеси подвергают реакции ΚΑΝ при 64°С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения амплификации. Процедуру осуществляют с соответствующими интервалами и устойчивость растворов-премиксов оценивают на основании наличия продуктов ΚΑΝ-амплификации после электрофореза. Результаты показаны на фиг. 5. Фиг. 5 представляет собой фигуру, показывающую картину электрофореза, отражающую устойчивость при хранении растворов-премиксов настоящего изобретения А, В и С. Полоса 1: раствор-премикс А, 13 дней после получения, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: раствор-премикс А, 13 дней после получения, 10 пг; полоса 3: раствор-премикс В, 13 дней после получения, 100 пг; полоса 4: раствор-премикс В, 13 дней

- 21 006679 после получения, 10 пг; полоса 5: раствор-премикс С, 1З дней после получения, 100 пг; полоса 6: раствор-премикс С, 1З дней после получения, 10 пг; полоса 7: раствор-премикс В, 18 дней после получения, 100 пг; полоса 8: раствор-премикс В, 18 дней после получения, 10 пг; полоса 9: раствор-премикс С, 18 дней после получения, 100 пг; и полоса 10: раствор-премикс С, 18 дней после получения, 10 пг.

Как видно из фиг. 5, подтверждается, что растворы-премиксы А и В можно хранить при З0°С в течение примерно 1 и З недель, соответственно. Раствор-премикс С можно использовать для осуществления реакции ΙΟΑΝ в течение 18 дней или более после получения.

Таким образом, подтверждается, что концентрация соли, содержащейся в буфере для реакции, содержащем ферменты, предпочтительно составляет примерно конечную концентрацию соли после реакции. Конкретно, предпочтительные концентрации составляют 1,5 или менее крат от конечной концентрации соли после реакции.

(4) Если раствор, содержащий фермент, необходимо хранить, устойчивость фермента, как правило, повышается за счет повышения концентрации фермента. Проверяют устойчивость премикса в отношении хранения. Премикс для хранения создают таким, чтобы концентрация фермента поддерживалась высокой за счет снижения концентрации соли и добавления соли непосредственно перед реакцией для компенсации ее недостатка для реакции ΙΟΑΝ. Конкретно, получают и хранят при З0°С раствор-премикс для реакции ΙΟΑΝ, содержащий 2,5 мМ каждого из йЭТРк, З2 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 4 мМ ацетата магния, 0,05% бычьего сывороточного альбумина, 0,875 Е/мкл РНКазы Н11 из ΑΓυ и 0,55 Е/мкл ДНК-полимеразы из ВсаВЕ8Т.

К 5 мкл раствора-премикса для реакции ΙΟΑΝ добавляют 19 мкл водного раствора, содержащего 50 пмоль каждого из праймеров для детекции МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515 К-Б-10ЗЗ (68) и К-К-11ЗЗ (68), ЗЗ,64 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 105,22 мМ ацетата калия, 4,21 мМ ацетата магния и 1,З2% диметилсульфоксида. К смеси добавляют 1 мкл водного раствора, содержащего геномную ДНК БЦЖ в концентрации 100 пг/мкл или 10 пг/мкл. Полученные смеси подвергают реакции Ιί'ΆΝ при 64°С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле для подтверждения амплификации.

Процедуру осуществляют с соответствующими интервалами и устойчивость растворов-премиксов настоящего изобретения оценивают на основании наличия продукта ΙΟΑΝ-амплификации после электрофореза. Результаты показаны на фиг. 6. Фиг. 6 представляет собой фигуру, показывающую картину электрофореза, отражающую устойчивость при хранении растворов-премиксов настоящего изобретения А, В и С. Полоса 1: раствор-премикс непосредственно после получения, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: раствор-премикс непосредственно после получения, 10 пг; полоса З: 21 день после получения, 100 пг; полоса 4: 21 день после получения, 10 пг; полоса 5: 25 дней после получения, 100 пг; полоса 6: 25 дней после получения, 10 пг; полоса 7: З2 дня после получения, 100 пг; и полоса 8: З2 дня после получения, 10 пг.

Как видно из фиг. 6, подтверждается, что раствор-премикс можно использовать для устойчивого осуществления реакции ΙΟΑΝ после хранения при З0°С в течение З2 дней или более. Таким образом, подтверждается, что реагент для амплификации с использованием способа Ιί,ΆΝ можно хранить в течение длительного периода времени, когда раствор-премикс для реакции получают и хранят в условиях, описанных выше.

Подобные результаты получают, когда проверку осуществляют так, как описывается выше в (1)-(4), с использованием сочетания ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т и РНКазы Н Т11.

Таким образом, подтверждается, что отношение норм содержания (отношение норма содержания фермента/норма содержания соли) составляет предпочтительно более 1, причем конечную концентрацию фермента (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н) или соли после реакции принимают за 1. Кроме того, подтверждается, что указанное отношение равно предпочтительно 5 или меньшей величине.

Подобные результаты получают, когда проверку осуществляют так, как описывается выше в (1)-(4), увеличивая количество используемой РНКазы Н в З, 10 или З0 раз.

Пример 5.

Проверяют детекцию МусоЬас1егшт аушт сотр1ех с использованием способа настоящего изобретения. Сначала получают положительный контроль для МусоЬас1егшт аушт и МусоЬас1егшт 1п(гасе11и1аге. Получают продукты амплификации в 560 п.о., соответствующие частям последовательностей РНК генов 168 из МусоЬас1ег1ит аушт и МусоЬас1егшт 1п(гасе11и1аге с нуклеотидными последовательностями 8ЕО ΙΌ ΝΟ8: 2З и 24, используя ДНК-полимеразу Ех Тад для реакций достраивания с последующими ПЦР с использованием десяти 74-мерных синтетических праймеров, согласно способу, описанному в В|оТесйп1дие5, 9(З):298-З00 (1990). Продукты амплификации встраивают в вектор рТ7 В1ие Т с использованием набора ΌΝΑ Идайоп Кй усг. 2 (Такага 8йихо). Смеси для дотирования используют для трансформации Е. сой ДМ109 и получают плазмиды как положительный контроль для М. аушт и М. 1п(гасе11и1аге. Синтезируют праймеры Мусо-Б-1, Мусо-Б-2, Мусо-Б-З, Мусо-К-1, Мусо-К-1-2, Мусо-К.^ и Мусо-К.-2Α, имеющие нуклеотдные последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ8: 25-З1. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие в конечных концентрациях З2 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% В8Α, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из йКТРк, 4,4 Е РНКазы НИ из ΑΓυ или 4 Е РНКазы Н из Т11, 4 Е ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т, 10⁵ копий положительного контроля для М. аушт или М. 1п(гасе11и1аге в качестве

- 22 006679 матрицы и 25 пмоль каждого из предшествующего и последующего праймеров. Реакционные смеси помещают в термоячейку, установленную на 55°С, и инкубируют в течение 60 мин. Когда в качестве матрицы используют положительный контроль для М. аушт, с использованием любой РНКазы Н и пары праймеров Мусо-Р-1 и Мусо-В-1; Мусо-Р-1 и Мусо-В-1-2; Мусо-Р-1 и Мусо-В-2А; Мусо-Р-2 и Мусо-В-1; Мусо-Р-2 и Мусо-В-1-2; Мусо-Е-2 и Мусо-В-2А; Мусо-Р-3 и Мусо-В-1; Мусо-Р-3 и Мусо-В-1-2 или Мусо-Р-3 и Мусо-В-2А после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес продукты амплификации в 101, 96, 96, 101, 96, 96, 106, 101 и 101 п.о. Продукт амплификации не наблюдают с использованием пар праймеров Мусо-Р-1 и Мусо-В-21; Мусо-Р-2 и Мусо-В-21 или Мусо-Р-3 и Мусо-В-21.

Когда в качестве матрицы используют положительный контроль для М. т1гасе11и1аге, с использованием любой РНКазы Н и пары праймеров Мусо-Р-1 и Мусо-В-1; Мусо-Р-1 и Мусо-В-1-2; Мусо-Р-1 и Мусо-В-21; Мусо-Р-2 и Мусо-В-1; Мусо-Р-2 и Мусо-В-1-2; Мусо-Р-2 и Мусо-В-21; Мусо-Р-3 и Мусо-В-1; Мусо-Р-3 и Мусо-В-1-2 или Мусо-Р-3 и Мусо-В-21 после электрофореза в агарозном геле наблюдают продукты амплификации, представляющие интерес, в 101, 96, 96, 101, 96, 96, 106, 101 и 101 п.о. Продукт амплификации не наблюдают с использованием пар праймеров Мусо-Р-1 и Мусо-В-2А; Мусо-Р-2 и Мусо-В-2А или Мусо-Р-3 и Мусо-В-2А.

На основании вышеуказанных результатов подтверждается, что М. аушт можно отличить от М. 1п1гасе11и1аге, используя праймер Мусо-В-21 или Мусо-В-2А, которые приводят к результату в матрицеспецифических реакциях. Гибридизацию методом дот-блоттинга с амплифицированными фрагментами осуществляют, как описано далее, с использованием аушт-зонда (БЕО ΙΌ N0: 32) или т1гасе11и1агезонда (БЕО ΙΌ N0: 33), каждый из которых метят по 5'-концу биотином. Коротко, 1 мкл каждой реакционной смеси подвергают денатурации при 98°С в течение 5 мин, быстро охлаждают на льду и наносят каплями на НуЬопй-Ν™ (Атегкйат Рйагтас1а Вю1ес11). После УФ-облучения мембрану помещают в гибридизационный мешочек. Добавляют в него 10 мл раствора для гибридизации (0,5 М динатрийгидро фосфата (рН 7,2), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 7% лаурилсульфата натрия). Осуществляют предварительную гибридизацию при 42°С в течение 30 мин. Денатурируют тепловой обработкой 10 мкл раствора, содержащего аушт-зонд или т1гасе11и1аге-зонд в концентрации 100 нг/мкл, и добавляют в реакционную систему для предварительной гибридизации. После гибридизации при 42°С в течение 60 мин мембрану дважды промывают при комнатной температуре в течение 5 мин в растворе, содержащем 66,6 мМ хлорида натрия, 66,6 мМ гидрата тринатрийцитрата и 0,1% лаурилсульфата натрия. Мембрану инкубируют при 42°С в течение 12 мин в смеси, полученной путем добавления 2 мкл раствора, содержащего конъюгат стрептавидина и пероксидазы из хрена (Р1егсе) в концентрации 5 мг/мл, к 6 мл буфера для промывки (0,3 М хлорида натрия, 17,3 мМ дигидрата дигидрофосфатат натрия, 2,5 мМ ЭДТК и 0,1% лаурилсульфата натрия). Мембрану дважды промывают в буфере для промывки при комнатной температуре, а затем 10 мл 0,1 М нитратного буфера (рН 5,0) при комнатной температуре и вводят во взаимодействие в темноте в течение примерно 10 мин в смеси 5 мл 0,1 М нитратного буфера, 5 мкл 3% пероксида водорода и 250 мкл раствора, содержащего тетраметилбензидин (ТМВ, №саБн Теэдие) в этаноле в коцентрации 2 мг/мл. После появления окраски реакцию прекращают с помощью деионизованной воды.

В результате сигнал для продукта амплификации от положительного контроля в случае М. аушт можно наблюдать только с использованием аушт-зонда, меченного по 5'-концу биотином, и сигнал нельзя наблюдать с использованием 1п1гасе11и1аге-зонда, меченного по 5'-концу биотином. С другой стороны, сигнал для продукта амплификации от положительного контроля в случае М. 1п1гасе11и1аге можно наблюдать только с использованием ийгасе11и1аге-зонда, меченного по 5'-концу биотином, и сигнал нельзя наблюдать с использованием аушт-зонда, меченного по 5'-концу биотином. На основании таких результатов подтверждается, что с использованием указанных зондов М. аушт можно отличить от М. 1п1гасе11и1аге.

Пример 6.

Проверяют детекцию допососсик с использованием способа настоящего изобретения. Согласно способу, описанному в примере 5, получают фрагменты в 560 п.о., амплифицированные из гена СррВ №188епа допоггйоеае, гена плазмиды рГО4 №188епа допоггйоеае и гена цитозинметилтрансферазы ДНК (М^доМШ) №155епа допоггйоеае с нуклеотидными последовательностями БЕО ΙΌ N0Б: 34-37. Подобным способом амплифицируют фрагмент в 490 п.о. из гена цитозинспецифической метилтрансферазы Ν4 №188епа допоггйоеае, используя десять 67-мерных синтетических праймеров. Продукты амплификации встраивают в вектор рТ7 В1ие Т и конструируют положительные контроли А, В, С и Ό.

Синтезируют праймеры ΝΉΙ-5103, ΝΞΙ-5150, СррВ-Р1, СррВ-Р2, СррВ-Р3, СррВ-В1, СррВ-В2, СррВ-В3, рГОВ Р-1, рГОВ Р-2, рГОВ В-1, рГОВ В-2, рГОВ В-3, М^до Р-1, М^до Р-2, М^до Р-3, М^до В-1, М^до В-2, М^до В-3, М^до В-4, цитозин-Р-1, цитозин-Р-2, цитозин-Р-3, цитозин В-1, цитозин-В2, цитозин-В-3, рГОВЮР и рГОВ10В, имеющие нуклеотидные последовательности БЕО ΙΌ N0Б: 38-63 и 164-165. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля В как матрицы и пары праймеров ΝΉΙ-5103 и ΝΉΙ-5150. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 69 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Амплифицированные фрагменты наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием зонда ΝΞΙ

- 23 006679

5130 (3ЕО ГО N0: 64), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Подобным образом осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля А как матрицы, а также пары праймеров СррВ-Е1 и СррВ-К1, СррВ-Е1 и СррВ-К2, СррВ-Е1 и СррВ-К3, СррВ-Е2 и СррВ-К1, СррВ-Е2 и СррВ-К2, СррВ-Е2 и СррВ-К3, СррВ-Е3 и СррВ-К1, СррВ-Е3 и СррВ-К2 или СррВ-Е3 и СррВ-К3. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 60 п.о., представляющие интерес. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием зонда-1 NΕI-СррВ (3Е0 ГО N0: 65), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля А как матрицы, а также пары праймеров рГОВ Е-1 и рГОВ К-1, рГОВ Е-1 и рГОВ К-2, рГОВ Е-1 и рГОВ К-3, рГОВ Е-2 и рГОВ К-1, рГОВ Е-2 и рГОВ К-2 или рГОВ Е-2 и рГОВ К-3. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 91 п.о., представляющие интерес. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием пары праймеров рГОВ10Е и рГОВ10К. После электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 71 п.о., представляющие интерес, с использованием любой РНКазы Н. Амплифицированные фрагменты наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием зонда-2 ДЕЕСррВ (3Е0 ГО N0: 66), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Подобным образом осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля С как матрицы, а также пары праймеров М.Ддо Е-1 и М.Ддо К-1, М.Ддо Е-1 и М.Ддо К-2, М.Ддо Е-1 и М.Ддо К-3, М.Ддо Е-1 и М.Ддо К-4, М.Ддо Е-2 и М.Ддо К-1, М.Ддо Е-2 и М.Ддо К-2, М.Ддо Е-2 и М.Ддо К-3, М.Ддо Е-2 и М.Ддо К-4, М.Ддо Е-3 и М.Ддо К-1, М.Ддо Е-3 и М.Ддо К-2, М.Ддо Е-3 и М.Ддо К-3 или М.Ддо Е-3 и М.Ддо К-4. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 60 п.о., представляющие интерес. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием М^до-зонда (3Е0 ГО N0: 67), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Кроме того, осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля Ό как матрицы, а также пары праймеров цитозин-Е-1 и цитозин-К-1, цитозин-Е-1 и цитозин-К-2, цитозин-Е-1 и цитозин-К-3, цитозин-Е-2 и цитозин-К-1, цитозин-Е-2 и цитозин-К-2, цитозин-Е-2 и цитозин-К-3, цитозин-Е-3 и цитозин-К-1, цитозин-Е-3 и цитозин-К-2 или цитозинЕ-3 и цитозин-К-3. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 70 п.о., представляющие интерес. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием цитозин-зонда (3Е0 ГО N0: 68), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Пример 7.

Проверяют детекцию вируса гепатита В человека (НВУ) с использованием способа настоящего изобретения. Конкретно, части гена белка Х НВУ в 560 п.о., представленные 3Е0 ГО N03: 69 и 70, амплифицируют согласно способу, описанному в примере 5, встраивают в вектор рТ7 В1ие Т и используют в качестве НВУ-положительного контроля 1-Т и НВУ-положительного контроля 1-С. Синтезируют праймеры НВУ-Е-1, НВУ-Е-2, НВУ-Е-3, НВУ-Е-4, НВУ-К-1, НВУ-К-2, НВУ-К-3 и НВУ-К-4, имеющие нуклеотидные последовательности 3Е0 ГО N03: 71-78. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий НВУ-положительного контроля 1-С или НВУположительного контроля 1-Т как матрицы, а также пары праймеров НВУ-Е-1 и НВУ-К-1, НВУ-Е-1 и НВУ-К-2, НВУ-Е-2 и НВУ-К-1 или НВУ-Е-2 и НВУ-К-2. После электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 81, 76, 76 и 71 п.о.

Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий НВУ-положительного контроля 1-Т или 1-С как матрицы, а также пары праймеров НВУ-Е-3 и НВУ-К-3, НВУ-Е-3 и НВУ-К-4, НВУ-Е-4 и НВУ-К-3 или НВУ-Е-4 и НВУ-К-4. После электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 84, 79, 78 и 73 п.о. Амплифицированные фрагменты, полученные с использованием пар праймеров НВУ-Е-1 и НВУ-К-1, НВУ-Е-1 и НВУ-К-2, НВУ-Е-2 и НВУ-К-1 и НВУ-Е-2 и НВУ-К-2, наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием НВУ-зонда 1 (3Е0 ГО N0: 79), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом, амплифицированные фрагменты, полученные с использованием пар праймеров НВУ-Е-3 и НВУ-К-3, НВУ-Е-3 и НВУ-К-4, НВУ-Е-4 и НВУ-К-3 и НВУ-Е-4 и НВУ-К-4, подвергают гибридизации методом дот-блоттинга с использованием НВУ-зонда 2 (3Е0 ГО N0: 80), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Пример 8.

Проверяют детекцию НСV с использованием способа настоящего изобретения. Получают реакционные смеси в конечном объеме 50 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ НЕРЕ3-гидрок

- 24 006679 сидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% диметилсульфоксида, 0,01% В8А, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из άΝΤΡδ, 50 пмоль каждого из праймеров НСУ-А2-8 и НСУ-Л2-Л, НСУ-А4-8 и НСУ-А4-А, НСУ-А4-819 и НСУ-А4-А19, НСУ-Р1 и НСУ-К1 или НСУ-Р2 и НСУ-К2 (8ЕО ΙΌ N08: 8186 и 88-89), 20 Е РНКазы Н11 из АГи или 4 Е РНКазы Н из Τ11, 4 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Х 20 Е ингибитора РНКазы, 1,25 Е ревертазы ХЬ из АМУ и 10⁶ копий транскрипта РНК, описанного в примере 2-(2), в качестве матрицы. Реакционные смеси помещают в термоячейку Еегеопак установленую на 53°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 74, 76, 78, 61 и 61 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованим пар праймеров НСУ-А2-8 и НСУ-А2-А, НСУ-А4-8 и НСУ-А4-А и НСУ-А4-819 и НСУ-А4-А19 с использованием зонда НСУ-С (8ЕО ГО N0: 87), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованим пар праймеров НСУ-Р1 и НСУ-К1 и НСУ-Р2 и НСУ-К2 с использованием зонда НСУГО (8Е0 ГО N0: 92), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Пример 9.

Проверяют применение способа настоящего изобретения в способе одностадийной амплификации ΒΤ-ΙΕΛΝ. В качестве объекта выбирают ВИЧ.

(1) Получение транскрибированной ДНК.

Получают транскрибированную РНК как матрицу. Плазмиду (АТСС 40829), в которую встраивают дад-участок ВИЧ, закупают. Продукт ПЦР-амплификации примерно в 1,4 кб, соответствующий части дад-участка ВИЧ, получают с использованием указанной плазмиды в качестве матрицы, пары праймеров 8Ρ6-ΗΤУ-Ρ (8Е0 ГО Ν0: 93) и ΗΤУ-К (8Е0 ГО Ν0: 94) и ДНК-полимеразы Ех Της. Транскрибированную РНК синтезируют с использованием продукта ПЦР-амплификации как матрицы и СошреШАе КАА Τπιη^πρΙίοη Κίΐ (ΤαΕαπι δΐιιιζο) согласно инструкциям, прилагаемым к набору. РНК используют в качестве РНК-матрицы для проверки одностадийной КΤ-IСАN.

(2) Проверка праймера для детекции ВИЧ с использованием одностадийной КΤ'-IСАN.

Синтезируют праймеры Н1У-Р1, Н1У-Р2, Н1У-Р3, Н1У-Р4, Н1У-К1, Н1У-К2, Н1У-К3, Н1У-К4 и ΗΤУ-К4М, имеющие нуклеотидные последовательности 8Е0 ГО Ν08: 95-103. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие, в конечных концентрациях 32 мМ ΗΕΡΕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 7 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из άΝΤΡδ, 2,2 Е РНКазы Н11 из АГи или 4 Е РНКазы Н из Τ1ί, 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВΕ8Τ, 0,625 Е ревертазы ХЬ из АМУ и 10⁶ копий транскрибированной РНК, а также 25 пмоль каждого из предшествующего и последующего праймеров. Реакционные смеси помещают в термоячейку, установленную на 55°С, и инкубируют в течение 60 мин. После электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 100, 74, 76, 72, 72, 72, 74, 70, 70, 76, 78, 74 и 74 п.о. с использованием любой РНКазы Н и пары праймеров Н1У-Р1 и Н1У-К1, Н1У-Р2 и Н1У-К2, Н1У-Р2 и Н1У-К3, Н1У-Р2 и Н1У-К4, Н1У-Р2 и Н1У-К4М, Н1УР3 и Н1У-К2 , Н1У-Р3 и Н1У-К3, Н1У-Р3 и Н1У-К4, Н1У-Р3 и Н1У-К4М, Н1У-Р4 и Н1У-К2, Н1У-Р4 и ШУКЗ, Н1У-Р4 и Н1У-К4 и Н1У-Р4 и Н1У-К4М. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга с использованием зонда НГУ-А (8ЕО ГО Ν0: 104) или зонда Н1У-В (8ЕО ГО Ν0: 105), каждый из которых мечен по 5'-концу биотином. В результате сигнал, представляющий интерес, наблюдают для продукта амплификации, полученного с использованием пары праймеров Н1У-Р1 и Н1У-К1, в случае зонда ΗΤУ-А, меченного по 5'-концу биотином, и сигналы, представляющие интерес, наблюдают для продуктов амплификации, полученных с использованием пар праймеров Н1У-Р2 и Н1УК2, Н1У-Р2 и Н1У-К3, Н1У-Р2 и Н1У-К4, Н1У-Р2 и Н1У-К4М, Н1У-Р3 и Н1У-К2, Н1У-Р3 и Н1У-К3, Н1УР3 и Н1У-К4, Н1У-Р3 и Н1У-К4М, Н1У-Р4 и Н1У-К2, Н1У-Р4 и Н1У-К3, Н1У-Р4 и Н1У-К4 и Н1У-Р4 и Н1У-К4М, в случае зонда ΗΤУ-В, меченного по 5'-концу биотином.

Пример 10.

Проверяют детекцию 8!арйу1ососси8 аигеих с использованием способа настоящего изобретения. Представляющий интерес участок для амплификации выбирают из гена коагулазы 8!арйу1ососси5 аигеик. Сначала получают продукт амплификации в 221 п.о., осуществляя ПЦР с использованием праймеров сοа-ΡСК-Ρ (8ЕО ГО Ν0: 106) и сοа-ΡСК-К (8ЕО ГО Ν0: 107), генома 8!арйу1ососси8 аигеик в качестве матрицы и ДНК-полимеразы Ех Τηγ|. Положительный контроль для соа-гена получают, встраивая амплифицированный фрагмент в вектор рТ7 В1ие Т.

Синтезируют праймеры соа-Р1, соа-Р2, соа-Р3, соа-Р4, соа-Р5, соа-К1, соа-К2, соа-К3, соа-К4 и соаК5, имеющие нуклеотидные последовательности 8ЕО ГО Ν08: 108-117. Осществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля для соа-гена в качестве матрицы и пары праймеров соа-Р1 и соа-К1, соа-Р1 и соа-К2, соа-Р2 и соа-К1, соа-Р2 и соа-К2, соа-Р3 и соа-К3, соа-Р3 и соа-К4, соа-Р3 и соа-К5, соа-Р4 и соа-К3, соа-Р4 и соа-К4, соа-Р4 и соа-К5, соаР5 и соа-К3, соа-Р5 и соа-К4 или соа-Р5 и соа-К5. В результате после электрофореза в агарозном геле

- 25 006679 наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 59, 69, 75, 85, 95, 101, 98, 89, 95, 92, 107, 113 и 110 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию методом дотблоттинга продуктов амплификации, полученных с использованием пар праймеров соа-Е1 и соа-Д1, соаЕ1 и соа-Д2, соа-Е2 и соа-Д1 и соа-Е2 и соа-Д2, согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда соа-А (8Е0 ΙΌ N0: 118), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом, осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга продуктов амплификации, полученных с использованием пар праймеров соа-ЕЗ и соа-ДЗ, соа-ЕЗ и соа-Д4, соа-ЕЗ и соа-Д5, соа-Е4 и соа-ДЗ, соа-Е4 и соа-Д4, соа-Е4 и соа-Д5, соа-Е5 и соа-ДЗ, соаЕ5 и соа-Д4 и соа-Е5 и соа-Д5, согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда соа-В (8Е0 ΙΌ N0: 119), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Пример 11.

(1) Проверяют детекцию сЫатуФа с использованием способа настоящего изобретения. Позитивный контроль для сЫатуФа получают путем встраивания амплифицированного фрагмента в 560 п.о., соответствующего части гена сЫату&а (8Е0 ΙΌ N0: 120), в вектор рТ7 В1ие Т согласно способу, описанному в примере 5. Синтезируют праймеры СТ-ЕВ19, СТ-ЕВ19-З, СТ-ЕВ-19-З-21, СТ-ЕВ19-З-2З, СТ-ДВ21, СТДВ2З-2 и СТ-ДВ2З-2-24, имеющие нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N08: 121-127. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий хламидийположительного контроля как матрицы и пары праймеров СТ-ЕВ19 и СТ-ДВ21, СТ-ЕВ19 и СТ-ДВ2З-2, СТЕВ19-З и СТ-ДВ21, СТ-ЕВ19-З и СТ-ДВ2З-2, СТ-ЕВ19-З и СТ-ДВ2З-2-24, СТ-ЕВ19-З-21 и СТ-ДВ2З-2, СТ-ЕВ19-З-21 и СТ-ДВ2З-2-24, СТ-ЕВ19-З-2З и СТ-ДВ2З-2 или СТ-ЕВ19-З-2З и СТ-ДВ2З-2-24. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 125, 116, 116, 107, 107, 107, 107, 107 и 107 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием СТ-зонда (8Е0 ΙΌ N0: 128), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес.

(2) Проверяют детекцию сЫатуФа с использованием в качестве мишени другого участка. Позитивный контроль для сЫатуФа 2 получают путем встраивания амплифицированного фрагмента в 560 п.о., соответствующего части критического гена сЫашуФа (8Е0 ΙΌ N0: 129), в вектор рТ7 В1ие Т согласно способу, описанному выше в (1). Синтезируют праймеры СТ-Е1212-20, СТ- Е1212-21, СТ- Е1212-22, СТД1272-20, СТ-Д1272-21, СТ-Д1272-22, СТ-Е1215-4Д-22 и СТ-Д1267-ЗД-18, имеющие нуклеотидные последовательности (8Е0 ΙΌ N08: 1З0-1З5 и 166-167). Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных выше в (1), с использованием 10⁶ копий хламидийположительного контроля 2 как матрицы и пары праймеров СТ-Е1212-20 и СТ-Д1272-20, СТ-Е1212-20 и СТ-Д1272-21, СТ-Е1212-20 и СТ-Д1272-22, СТЕ1212-21 и СТ-Д1272-20, СТ- Е1212-21 и СТ-Д1272-21, СТ- Е1212-21 и СТ-Д1272-22, СТ- Е1212-22 и СТД1272-20, СТ- Е1212-22 и СТ-Д1272-21 или СТ- Е1212-22 и СТ-Д1272-22. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес продукты амплификации в 61 п. о. с использованием любой РНКазы Н во всех случаях. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда СТ12З4 (8Е0 ΙΌ N0: 1З6), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Кроме того, осуществляют реакции IСАN с использованием пары праймеров СТ-Е1215-Д4-22 и СТ-Д1267-ЗД-18. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес продукты амплификации в 5З п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда СТ-12З6 (8Е0 ΙΌ N0: 168), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес.

Пример 12.

Проверяют детекцию Мусор1а§та рпеитошае с использованием способа настоящего изобретения. Положительный контроль А для Мусор1а§та рпеитошае и положительный контроль В для Мусор1а§та рпеитошае получают путем встраивания амплифицированного фрагмента в 560 п.о., соответствующего частям гена-оперона аденозинтрифосфотазы Мусор1а§та рпеитошае (8Е0 ΙΌ N08: 1З7 и 1З8), в вектор рТ7 В1ие Т согласно способу, описанному в примере 5. Синтезируют праймеры Мусо-140, Мусо-140-22, Мусо-706, МРЕ-910, Мусо-190, Мусо-190-22. Мусо-850 и МРД-1016, имеющие нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N08: 1З9-146. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля А для Мусор1а§та рпеитошае как матрицы и пары праймеров Мусо-140 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190-22 или Мусо-140 и Мусо-190-22. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 6З п.о. с использованием любой РНКазы Н во всех случаях. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля А для Мусор1а§та рпеитошае как матрицы и пары праймеров Мусо-706 и Мусо-850 или МРЕ910 и МРД-1016. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 85 и 107 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют

- 26 006679 гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованием пар праймеров Мусо-140 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190-22 и Мусо-140 и Мусо-190-22, согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда Мусо-170 (8ЕО ΙΌ N0: 147), меченого по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованием пары праймеров Мусо-706 и Мусо-850, с использованием зонда Мусо-730 (8Е0 Ш N0: 148), меченого по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигнал, представляющий интерес. Кроме того, осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованием пары праймеров МРЕ-910 и МРВ-1016, с использованием зонда Мусо-952 (8Е0 ГО N0: 149), меченого по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигнал, представляющий интерес.

Пример 13.

Проверяют детекцию устойчивого к метициллину 81ар11у1ососсик аигеик (МВ8А) с использованием способа настоящего изобретения.

Выбирают из МесА-гена участок для ампплификации, представляющий интерес. Положительные контроли А и В для МесА получают путем встраивания амплифицированных фрагментов в 560 п.о., соответствующих частям МесА-гена МесА-А и МесА-В (8Е0 ΙΌ N08: 150 и 151), в вектор рТ7 В1ие Т согласно способу, описанному в примере 5. Синтезируют праймеры МесА-8525, МесА-А611, МесА-81281 и МесА-А1341, имеющие нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N08: 152-155. Осуществляют реакции IСАN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 10⁶ копий положительного контроля А для МесА как матрицы и пары праймеров МесА-8525 и МесА-А611, или 10⁶ копий положительного контроля В для МесА как матрицы и пары праймеров МесА-81281 и МесА-А1341. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 106 и 83 п.о. с использованием любой РНКазы Н.

Реакционную смесь для IСАN (1 мкл), для которой амплифицированный фрагмент получают с использованием пары праймеров МесА-8525 и МесА-А611, наносят каплями на нейлоновую мембрану НуЬопб-Ы и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда МесА-А (8Е0 ΙΌ N0: 156), меченного по 5'-концу биотином. Кроме того, подобным образом амплифицированный фрагмент, полученный с использованием пары праймеров МесА-81281 и МесА-А1341, наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием зонда МесА-В (8Е0 ΙΌ N0: 157), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы при использовании обоих зондов, подтверждающие амплификацию участков, представляющих интерес.

Пример 14.

Проверяют РНКазу Н, которую можно использовать в способе настоящего изобретения.

(1) Синтезируют праймеры рО0№АЫ (22) и р00Н-А[-2 (23), имеющие нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N08: 158 и 159, на основе нуклеотидной последовательности упаковывающего участка в векторе-плазмиде р^0N-АI (Такага 81шхо). Реакционные смеси общим объемом в 25 мкл каждая, содержащие 1 мкл раствора, содержащего 10 фг ДНК р^0N-АI или воды для отрицательного контроля, 100 пмоль каждого из праймеров, 0,5 мМ каждого из бКТРк, 32 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 4,0 мМ ацетата магния, 0,01% бычьего сывороточного альбумина, 1,0% диметилсульфоксида, 2,64 Е ДНК-полимеразы Вса и 8,75, 4,38, 2,19, 1,09, 0,55 или 0,27 Е РНКазы НИ из АТи, 4,69, 2,34, 1,17, 0,59, 0,29, 0,15 или 0,07 Е РНКазы НИ из РТи или 14, 7, 3,5, 1,75, 0,875 или 0,438 Е РНКазы НИ из Р1ю. инкубируют при 64°С в течение 1 ч в термоячейке. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют с использованием электрофореза в 3,0% агарозном геле. В результате наблюдают представляющие интерес продукты амплификации с использованием РНКазы НИ из АТи несмотря на величину единицы. Кроме того, представляющие интерес продукты амплификации наблюдают с использованием 0,59-4,69 Е РНКазы НИ из РТи или 1,75-14 Е РНКазы НИ из Р1о. На основании таких результатов подтверждается, что все теплоустойчивые РНКазы НИ можно предпочтительно использовать в способе настоящего изобретения.

(2) Реакционную смесь общим объемом 50 мкл, содержащую 50 пмоль каждого из праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N08: 160 и 161, синтезированные на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой N0 синтазы (^N08), 1 мкл кДНК, полученной согласно обычному способу из коммерчески доступных мышиных клеток (соответствующей 50 нг РНК), 5 мкл 10 х буфера Ех Тас.| (Такага 81υζο), 1,25 Е ДНК-полимеразы ТаКаВа Ех Тас.| (Такага 8111.1X0) и 0,2 мМ каждого из бНТРк, вводят в реакцию с использованием термоячейки. Программа следующая: 1 цикл - 94°С в течение 2 мин; 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. ПЦР-амплифицированный фрагмент из мышиной кДНК >N08 клонируют в плазмидный вектор рТ7 В1ие Т (№уа§еп), который используют в качестве матрицы для способа настоящего изобретения. Реакционные смеси общим объемом в 25 мкл каждая, содержащие 1 мкл раствора, содержащего 10 фг плазмидной ДНК как матрицы или 1 мл воды для отрицательного контроля, 100 пмоль каждого из праймеров N85 (8Е0 ΙΌ N0: 9) и N86 (8Е0 ΙΌ N0: 10), 0,5 мМ каждого

- 27 006679 из бНТРк, 32 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 4,0 мМ ацетата магния, 0,01% бычьего сывороточного альбумина, 1,0% диметилсульфоксида, 2,64 Е ДНК-полимеразы Вса и 10, 5, 2,5, 1,25, 0,125 Е РНКазы Н11 из МеЙапососсик )аппак1и (М]а), РНКазы Н11 из Тсе или РНКазы Н11 из Т11, инкубируют при 62°С в течение 1 ч в термоячейке. РНКазу Н11 из М|а получают согласно способу, описанному в ЛгисЮге, 8:897-904. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют с использованием электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 7. Фиг. 7 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации, полученных с использованием трех типов РНКазы Н. Фиг. 7 (А, В и С) представляет результаты, полученные с использованием РНКазы Н11 из МеЛапососсик |аппак111, РНКазы Н11 из Тйегтососсик се1ег и РНКазы Н11 из Тйегтососсик 1йогайк, соответственно. Полоса 1: 10 Е РНКазы Н11; полоса 2:10 Е РНКазы Н11, отрицательный контроль; полоса 3: 5 Е РНКазы Н11; полоса 4: 5Е РНКазы Н11, отрицательный контроль; полоса 5: 2,5 Е РНКазы Н11; полоса 6: 2,5Е РНКазы Н11, отрицательный контроль; полоса 7: 1,25 Е РНКазы Н11; полоса 8: 1,25Е РНКазы Н11, отрицательный контроль; полоса 9: 0,25 Е РНКазы Н11; полоса 10: 0,25Е РНКазы Н11, отрицательный контроль; полоса 11: 0,125 Е РНКазы Н11; и полоса 12: 0,125Е РНКазы Н11, отрицательный контроль.

Как видно из фиг. 7, представляющие интерес продукты амплификации наблюдают с использованием 0,125-10 Е РНКазы Н11 из МеЛапососсик )аппак1и, 1-5 Е РНКазы Н11 из Тсе или 0,125-5 Е РНКазы Н11 из Тй. На основании таких результатов подтверждается, что все теплоустойчивые РНКазы Н11 можно предпочтительно использовать в способе настоящего изобретения.

(3) Способ настоящего изобретения также проверяют в условиях реакции, описанных в примере 5, за исключением того, что используют другие тип и количество РНКазы Н. В качестве РНКазы Н используют 1 Е РНКазы Н11 из Тйегтососсик 1йогайк или 8,75 Е Е РНКазы Н11 из Тйегтососсик се1ег. Реакции амплификации осуществляют с использованием 10⁶ копий НВУ-положительного контроля 1-Т как матрицы, а также пары праймеров НВУ-Е-2 и НВУ-К-1, полученных в примере 7. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 76 п.о. с использованием любой РНКазы Н. На основании таких результатов подтверждается, что обе РНКазы Н11 можно предпочтительно использовать согласно настоящему изобретению.

Пример 15.

Проверяют способ детекции настоящего изобретения с использованием реакционной системы, содержащей внутренний стандарт. Сначала получают внутренний стандарт для МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к согласно способу, описанному в примере 5. Продукт амплификации в 169 п.о., имеющий нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 169, получают с использованием ДНК-полимеразы Ех Тад для реакции достраивания с последующей ПНР с использованием четырех 60-мерных синтетических праймеров согласно способу, описанному в ВюТесйтдиек, 9(3):298-300 (1990). Продукт амплификации встраивают в вектор рТ7 В1ие Т с использованием набора ΌΝΑ Ыдайои Кй Уег. 2 (Такага Вю). Смесь для лигирования используют для трансформации Е. сой РМ109. Полученную плазмиду используют в качестве внутреннего стандарта для МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Синтезируют МТ182Е16 и МТ182КААС, имеющие нуклеотидные последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ8: 170 и 171. Длина участка, амплифицированного с использованием пары праймеров, включая праймерные части, составляет 98 п.о.

Реакции осуществляют следующим образом. Получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ НЕРЕ8-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 0,1% пропилендиамина, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из бЭТРк, 25 пмоль каждого из праймеров МТ182Е16 и МТ182КААС, 10³ копий внутреннего стандарта для МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к, 2,2 Е РНКазы Н11 из А Гн или 8 Е РНКазы Н из ТИ, 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, 1 мкл матрицы и стерильную воду. В качестве матрицы используют 0,1 или 10 пг геномной ДНК БЦЖ, которую использовали в примере 1. Реакционные смеси помещают в термоячейку Регкопа1, установленую на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. Образцы, полученные после реакций ΙΕΆΝ, наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда для детекции МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1К МТ18-8-РКОВЕ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 172), меченного по 5'-концу биотином, или зонда для детекции внутреннего стандарта ГЫТЕК-РКОВЕ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 173), меченного по 5'-концу биотином. В результате, когда наносят образцы, полученные после реакций IСΑN без добавления геномной ДНК БЦЖ, с использованием МТI8-8-РКΟΒЕ сигнала не наблюдают, в то время как сигналы наблюдают при использовании ЕЫТЕКРКΟΒЕ. Когда наносят образцы, полученные после реакций IСΑN с добавлением 1 пг геномной ДНК БЦЖ, сигналы наблюдают при использовании как МТI8-8-РКΟΒЕ, так и INТЕК-РКΟΒЕ. Когда наносят образцы, полученные после реакций IСΑN с добавлением 10 пг геномной ДНК БЦЖ, сигналы наблюдают при использовании МТI8-8-РКΟΒЕ, но сигнал не наблюдают при использовании INТЕК-РКΟΒЕ. Такие результаты подтверждают, что сигнал наблюдается с использованием МТI8-8-РКΟΒЕ, если в качестве мишени амплифицируют геномную ДНК БЦЖ, в то время как с использованием INТЕК-РКΟΒЕ сигнал наблюдается, если амплифицируют внутренний стандарт. Таким образом, подтверждается, что по способу настоящего изобретения нуклеиновую кислоту-мишень можно специфически детектировать даже в присутствии внутреннего стандарта.

- 28 006679

Промышленная применимость

Настоящее изобретение относится к способу стабилизации и длительного хранения реагента для реакции в способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, при котором подходящий для специфической амплификации участок в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени амплифицируют реакцией синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, или способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающего стадию детекции фрагмента, амплифицированного из нуклеиновой кислоты-мишени, полученного указанным способом амплификации. Настоящее изобретение также относится к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, который используют для высокочувствительной и специфической детекции или количественного определения микроорганизма (в частности, патогенного микроорганизма), такого как вирус, бактерия, гриб или дрожжи, а также к химерному олигонуклеотидному праймеру и зонду для такого способа.

Список последовательностей

8ЕО Ш N0: 1: олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 выше 150, сконструированный для амплификации части плазмиды рИС19.

8Е0 Ш N0: 2: олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 ниже NN, сконструированный для амплификации части плазмиды рИС19.

8Е0 Ш N0: 3: олигонуклеотидный праймер, названный МС8-Е, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.

8Е0 Ш N0: 4: олигонуклеотидный праймер, названный МС8-Я, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.

8Е0 Ш N0: 5: олигонуклеотидный праймер, названный МЕ2, сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды рИС19.

8Е0 Ш N0: 6: олигонуклеотидный праймер, названный МК1, созданный для амплификации части ДНК плазмиды рИС19.

8Е0 Ш N0: 7: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033-2, сконструированный для амплификации части ДНК МусоЬас1егшт 1нЬегси1о818. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 8: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133-2, сконструированный для амплификации части ДНК МусоЬас1егшт 1нЬегси1о818. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 9: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей Ш08 от мыши. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 10: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей Ш08 от мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 11: олигонуклеотидный зонд, названный МТ18, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности МусоЬас1егшт 1нЬегси1о818.

8Е0 Ш N0: 12: олигонуклеотидный зонд, названный МТ18-2, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности МусоЬас1егшт 1нЬегси1о818.

8Е0 Ш N0: 13: олигонуклеотидный праймер, названный 8Р6-НСУ-Е, сконструированный для амплификации части НСУ.

8Е0 Ш N0: 14: олигонуклеотидный праймер, названный Т7-НСУ-Я, сконструированный для амплификации части НСУ.

8Е0 Ш N0: 15: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А2-8, сконструированный для амплификации части НСУ. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 16: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А2-А, сконструированный для амплификации части НСУ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 17: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2Е, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды СЫашуШа (гасйоптШк . Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 18: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2К, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды СЫатуШа ΐ^асйошаί^8. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 19: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-ЕВ19-3, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды СЫатуШа ί^асйошаΐ^8. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 20: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-КВ23-2, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды СЫатуШа (гасйотаНк. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- 29 006679

ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 21: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033(68), сконструированный для амплификации части ДНК МусоЬасбегшт биЬегси1ок1к. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 22: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133(68), сконструированный для амплификации части ДНК МусоЬасбегшт биЬегси1ок1к. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 23: нуклеотидная последовательность рРНК 16З из МусоЬасбегшт аушт.

ЗЕО ГО ΝΟ: 24: нуклеотидная последовательность рРНК 16З из МусоЬасбегшт шбгасе11и1аге.

ЗЕО ГО ΝΟ: 25: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-Е-1, сконструированный для амплификации части рРНК 16З МусоЬасбегшт. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 26: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-Е-2, сконструированный для амплификации части рРНК 16З МусоЬасбегшт. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 27: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-Е-3, сконструированный для амплификации части рРНК 16З МусоЬасбегшт. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 28: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-К-1, сконструированный для амплификации части рРНК 16З МусоЬасбегшт. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 29: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-К-1-2, сконструированный для амплификации части рРНК 16З МусоЬасбегшт. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 30: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-К-21, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей рРНК 16З из МусоЬасбегшт шбгасе11и1аге. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 31: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-К-2А, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей рРНК 16З из МусоЬасбегшт аушт. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 32: олигонуклеотидный зонд как аушт-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей рРНК 16З из МусоЬасбегшт аушт.

ЗЕО ГО ΝΟ: 33: олигонуклеотидный зонд как тбгасе11и1аге-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей рРНК 16З из МусоЬасбегшт тбгасе11и1аге.

ЗЕО ГО ΝΟ: 34: нуклеотидная последовательность гена СррВ из Че1ккепа допоггНогае.

ЗЕО ГО ΝΟ: 35: нуклеотидная последовательность ДНК плазмиды рГО4 из Че1ккепа допоггНогае.

ЗЕО ГО ΝΟ: 36: нуклеотидная последовательность гена М.ЧдоМШ из Че1ккепа допоггНогае.

ЗЕО ГО ΝΟ: 37: нуклеотидная последовательность цитозинметилтрансферазы из Че1ккепа допоггНогае.

ЗЕО ГО ΝΟ: 38: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΝΉΙ-5103, сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды рГОВ4 из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 39: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΝΉΙ-5150, сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды рГОВ4 из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 40: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЧЫ-СррВ-Е1, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 41: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЧЫ-СррВ-Е2, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 42: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЧЫ-СррВ-Е3, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 43: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЧЕЕС’ррВ-КЕ сконструированный для амплификации части гена СррВ из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 44: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ЧЫ-СррВ-К2, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Че1ккепа допоггНогае. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 45: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NЕI-СррВ-К3, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №бккепа допоггНогае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- 30 006679

8Е0 ΙΌ N0: 46: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ Р-1, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа доиоггйогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 47: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ Р-2, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 48: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ В-1, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 13-15 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 49: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ В-2, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 14-16 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 50: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ В-3, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 15-17 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 51: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до Р-1, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 52: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до Р-2, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 53: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до Р-3, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 54: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до В-1, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 55: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до В-2, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 56: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до В-3, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 57: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М®до В-4, сконструированный для амплификации части гена М.^оМШ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 58: химерный олигонуклеотидный праймер, названный цитозин-Р-1, сконструированный для амплификации части гена метилтрансферазы из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 59: химерный олигонуклеотидный праймер, названный цитозин-Р-2, сконструированный для амплификации части гена метилтрансферазы из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 60: химерный олигонуклеотидный праймер, названный цитозин-Р-3, сконструированный для амплификации части гена метилтрансферазы из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 61: химерный олигонуклеотидный праймер, названный цитозин-В-1, сконструированный для амплификации части гена метилтрансферазы из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 62: химерный олигонуклеотидный праймер, названный цитозин-В-2, сконструированный для амплификации части гена метилтрансферазы из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 63: химерный олигонуклеотидный праймер, названный цитозин-В-3, сконструированный для амплификации части гена метилтрансферазы из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 64: олигонуклеотидный зонд как зонд N^-5130, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть ДНК плазмиды рГОВ4 из №188епа допоггйогае.

8Е0 ΙΌ N0: 65: олигонуклеотидный зонд как зонд-1 NЕI-СррВ, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей СррВ из №188епа допоггйогае.

8Е0 ΙΌ N0: 66: олигонуклеотидный зонд как зонд-2 NЕI-СррВ, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей СррВ из №188епа допоггйогае.

- 31 006679

8Е0 ΙΌ N0: 67: олигонуклеотидный зонд как М^до-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей ген М^доМШ из №188епа допоггйогае.

8Е0 ΙΌ N0: 68: олигонуклеотидный зонд как цитозин-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей ген метилтрансферазы из №188епа допоггйогае.

8Е0 ΙΌ N0: 69: нуклеотидная последовательность белка Х из вируса гепатита В.

8Е0 ΙΌ N0: 70: нуклеотидная последовательность белка Х из вируса гепатита В.

8Е0 ΙΌ N0: 71: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-Е-1, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 72: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-Е-2, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 73: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-Е-3, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 74: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-Е-5, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 75: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-В-1, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 76: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-В-2, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 77: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-В-3, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 78: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НВУ-В-4, сконструированный для амплификации части гена белка Х из вируса гепатита В. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 79: олигонуклеотидный зонд как НВУ-зонд 1, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей белок Х из вируса гепатита В.

8Е0 Ш N0: 80: олигонуклеотидный зонд как НВУ-зонд 2, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей белок Х из вируса гепатита В.

8Е0 ΙΌ N0: 81: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А2-8, сконструированный для амплификации части гена вируса гепатита С. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 82: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А2-А, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 83: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А4-8, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 15-17 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 84: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А4-А, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 85: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А4-819, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 86: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А4-А19, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 87: олигонуклеотидный зонд как зонд НСУ-С, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть вируса гепатита С.

8Е0 Ш N0: 88: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-Е1, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 89: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-К1, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- 32 006679

ЗЕО ГО ΝΟ: 90: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-Е2, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 91: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-К2, сконструированный для амплификации части вируса гепатита С. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 92: олигонуклеотидный зонд как зонд НСУ-Э, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего вирус гепатита С.

ЗЕО ГО ΝΟ: 93: олигонуклеотидный праймер, названный ЗΡ6-ΗIУ-Е, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ.

ЗЕО ГО ΝΟ: 94: олигонуклеотидный праймер, названный ШУ-К, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ.

ЗЕО ГО ΝΟ: 95: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НГУ-Р1, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 96: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НТУ-Е2, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 97: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НТУ-Е3, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 98: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НТУ-Е4, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 99: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ШУ-К1, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 100: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ШУ-К2, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 101: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НТУ-К3, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 102: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НТУ-К4, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 103: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ШУ-К4М, сконструированный для амплификации части последовательности дад из ВИЧ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 104: олигонуклеотидный зонд как зонд НТУ-А, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности дад из ВИЧ.

ЗЕО ГО ΝΟ: 105: олигонуклеотидный зонд как зонд НТУ-В, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности дад из ВИЧ.

ЗЕО ГО ΝΟ: 106: олигонуклеотидный праймер, названный соа-РСК-Е, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1арйу1ососси8 аигеик.

ЗЕО ГО ΝΟ: 107: олигонуклеотидный праймер, названный соа-РСК-К, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1арйу1ососси8 аигеик.

ЗЕО ГО ΝΟ: 108: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-Е1, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1ар11у1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 109: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-Е2, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1ар11у1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 110: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-Е3, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1ар11у1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 111: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-Е4, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1ар11у1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

ЗЕО ГО ΝΟ: 112: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-Е5, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из З1ар11у1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- 33 006679

8Е0 ΙΌ ΝΟ: 11З: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-К1, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ ΝΟ: 114: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-К2, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 115: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-КЗ, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 116: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-К4, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 117: химерный олигонуклеотидный праймер, названный соа-К5, сконструированный для амплификации части гена коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 118: олигонуклеотидный зонд как зонд соа-А, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего ген коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 119: олигонуклеотидный зонд как зонд соа-В, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего ген коагулазы из 81арйу1ососси5 аигеик.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 120: нуклеотидная последовательность критической плазмиды из Сй1атуй1а йасйотайк.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 121: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-БВ19, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а йасйотайк. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 122: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-БВ19-З, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а 1гасйотаЕ5. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12З: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-БВ19-З-21, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а Иасйотайк. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 124: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-БВ19-З-2З, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а Иасйотайк. Нуклеотиды 21-2З являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 125: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-КВ21, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а йасйотайк. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 126: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-КВ2З-2, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а 1гасйотаЙ8. Нуклеотиды 21-2З являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 127: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-КВ2З-2-24, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из Сй1атуй1а Иасйотайк. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 128: олигонуклеотидный зонд как СТ-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть плазмидной ДНК из Сй1атуй1а (гасйотаШ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 129: нуклеотидная последовательность критической плазмиды из Сй1атуШа йасйотайк.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1З0: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-Р1212-20, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из СЫатуФа Иасйотайк. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1З1: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-Р1212-21, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из СЫатуФа Иасйотайк. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1З2: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-Б1212-22, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из СЫатуФа Иасйотайк. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1ЗЗ: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-К1272-20, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из СЫатуФа Иасйотайк. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1З4: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-К1272-21, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из СЫатуФа Иасйотайк. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1З5: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-К1272-22, сконструированный для амплификации части плазмидной ДНК из СЫатуФа Иасйотайк. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

- З4 006679

8Е0 ΙΌ N0: 136: олигонуклеотидный зонд как зонд СТ-1234, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть плазмидной ДНК из СЫашуб1а басйотайк.

8Е0 ΙΌ N0: 137: нуклеотидная последовательность оперона аденозинтрифосфотазы из Мусор1акта рпеитошае.

8Е0 ΙΌ N0: 138: нуклеотидная последовательность оперона аденозинтрифосфотазы из Мусор1акта рпеитошае.

8Е0 ΙΌ N0: 139: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-140, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 140: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-140-22, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 141: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-706, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 142: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-910, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 143: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-190, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 144: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-190-22, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 145: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-850, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 146: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МРВ-1016, сконструированный для амплификации части оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 147: олигонуклеотидный зонд как зонд Мусо-170, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае.

8Е0 ΙΌ N0: 148: олигонуклеотидный зонд как зонд Мусо-730, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае.

8Е0 ΙΌ N0: 149: олигонуклеотидный зонд как зонд Мусо-952, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть оперона аденозинтрифосфатазы из Мусор1акта рпеитошае.

8Е0 ΙΌ N0: 150: нуклеотидная последовательность гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик.

8Е0 ΙΌ N0: 151: нуклеотидная последовательность гена МесА из 81арНу1ососснк аигеик.

8Е0 ΙΌ N0: 152: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МесА-8525, сконструированный для амплификации части гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 153: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МесА-А611, сконструированный для амплификации части гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 Ш N0: 154: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МесА-81281, сконструированный для амплификации части гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 155: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МесА-А1341, сконструированный для амплификации части гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 156: олигонуклеотидный зонд как зонд МесА-А, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик.

8Е0 ΙΌ N0: 157: олигонуклеотидный зонд как зонд МесА-В, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть гена МесА из 81ар11у1ососсик аигеик.

8Е0 ΙΌ N0: 158: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рО0№АЫ(22), сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды рО0№АЕ Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 159: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рО0№АН2(23), сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды рО0№АЕ Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 160: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей >N08 от мыши.

- 35 006679

8Е0 ΙΌ N0: 161: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей (N08 от мыши.

8Е0 ΙΌ N0: 162: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МГО8 2Е, сконструированный для амплификации части последовательности МусоЬас1егшт 1нЬегси1о818. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 16З: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МГО8 2Д, сконструированный для амплификации части последовательности МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515 Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 164: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ 10Е, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа допопйогае. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 165: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рГОВ 10Д, сконструированный для амплификации части гена СррВ из №188епа допоггйогае. Нуклеотиды 15-17 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 166: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-Е1215-4Д-22, сконструированный для амплификации части ДНК критической плазмиды СЫатуФа 1гас1ютай5. Нуклеотиды 1922 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 167: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ-Д1267-ЗД-18, сконструированный для амплификации части ДНК критической плазмиды СЫатуФа 1гас1ютай5. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 168: олигонуклеотидный зонд как зонд СТ-12З6, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть плазмидной ДНК из СЫату&а 1гас1ютай5.

8Е0 ΙΌ N0: 169: нуклеотид, сконструированный как внутренний стандарт для анализа МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818.

8Е0 ΙΌ N0: 170: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МГО82Е16, сконструированный для амплификации части ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818. Нуклеотиды 14-16 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 171: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МГО82ДААС, сконструированный для амплификации части ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ΙΌ N0: 172: олигонуклеотидный зонд, названный МТК-8-РД0ВЕ, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего нуклеотидной последовательности из МусоЬас1егшт 1нЬегсн1о515.

8Е0 ΙΌ N0: 17З: олигонуклеотидный зонд, названный ЕМТЕД-РД0ВЕ, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего нуклеотидной последовательности из МусоЬас1егшт 1нЬегсн1о515.

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ стабилизации реагента для реакции, используемого в способе амплификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающий (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в З'конце или со стороны З'-конца праймера и (b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции при условиях, когда происходит специфический отжиг праймера к нуклеиновой кислоте как матрице, реакции синтеза (приводящего к достройке цепи) и замещения цепи ДНК полимеразой, а также реакция расщепления достроенной цепи РНКазой Н, когда (ί) по меньшей мере один компонент реагента, выбранный из группы, состоящей из магниевой соли, химерного олигонуклеотидного праймера и ферментов (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н), перед реакцией отделяют от других компонентов реагента и (й) концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы), высокая(ие), в то время как концентрация соли в указанном растворе не является высокой, и концентрацию соли в другом растворе реагента регулируют таким образом, что оптимальная концентрация соли для стадии амплификации достигается после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.
2. 2. Способ по п.1, где реагент для реакции состоит из двух растворов реагента: раствора реагента, содержащего химерный олигонуклеотидный праймер, и раствора реагента, содержащего фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н) и магниевую соль.

   - З6 006679
3. 3. Способ по п.1, где концентрация соли в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), равна или меньше оптимальной концентрации соли для стадии амплификации.
4. 4. Способ по п.1, где концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), выше концентрации(ий) фермента(ов) для стадии амплификации.
5. 5. Способ по п.4, где концентрацию(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), регулируют так, что оптимальная концентрация(и) фермента(ов) для стадии амплификации достигается(ются) после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.
6. 6. Набор реагента для реакции, используемого в способе амплификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающем (а) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в З'конце или со стороны З'-конца праймера и (й) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции при условиях, когда происходит специфический отжиг праймера к нуклеиновой кислоте как матрице, реакции синтеза, приводящего к достройке цепи, и замещения цепи ДНК полимеразой, а также реакция расщепления достроенной цепи РНКазой Н, когда (ί) по меньшей мере один компонент реагента, выбранный из группы, состоящей из магниевой соли, химерного олигонуклеотидного праймера и ферментов (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н), перед реакцией отделяют от других компонентов реагента и (ίί) концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы), высокая(ие), в то время как концентрация соли в указанном растворе не является высокой, и концентрацию соли в другом растворе реагента регулируют таким образом, что оптимальная концентрация соли для стадии амплификации достигается после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.
7. 7. Набор по п.6, где реагент для реакции состоит из двух растворов реагентов: раствора реагента, содержащего химерный олигонуклеотидный праймер; и раствора реагента, содержащего фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), и используют магниевую соль.
8. 8. Набор по п.6, где концентрация соли в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), равна или меньше оптимальной концентрации соли для стадии амплификации.
9. 9. Набор по п.6, где концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), выше концентрации(ий) фермента(ов) для стадии амплификации.
10. 10. Набор по п.9, где концентрацию(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), регулируют так, что оптимальная концентрация(и) фермента(ов) для стадии амплификации достигается(ются) после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом.
11. 11. Набор по п.6, который содержит реагент для регулирования концентрации соли в смеси отдельных растворов реагента.