JPH05505111A - Ｒｎａレプリカーゼのｄｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼ活性を用いる核酸増幅 - Google Patents

Ｒｎａレプリカーゼのｄｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼ活性を用いる核酸増幅

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＮ　ＡレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を用いる核酸増幅 発明の分野 本発明は、核酸セグメントを増幅するためのかつテストサンプル中の核酸被検体 を検出するための方法及びキットに関する。
より特定的には、本発明は、ＱβレブリカーゼのようなＲＮ　Ａ依存性ＲＮＡレ ブリカーゼのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を用いて核酸セグメントを増 幅すること、及び、そのような増幅産物を検出することに関する。
発明の背景 核酸プローブハイブリッド形成法を使用する特異的標的核酸被検体を検出する能 力には多くの用途を有する。それらの用途には、ヒトもしくは他の動物における 感染症もしくは遺伝病もしくは癌の診断、化粧品、食品もしくは水のウィルス性 もしくは微生物性汚染物の同定、及び、ヒトにおける法廷上もしくは実父確定テ スト、及び、植物及び動物における育穫分析及び品種改良のための遺伝子レベル における固体の同定もしくは性質決定、あるいはそれら固体間における識別、が 含まれる。核酸プローブハイブリッド形成法の適用のための基盤は、オリゴヌク レオチドもしくは核酸断片プローブのノ＼イブリッド形成するため、つまり、相 補的な塩基対形成を通しての安定な２本鎖ハイブリッドを形成するため、特に、 特有な配列を有し、特有な種、株、個々の生物もしくは生物から取得された細胞 においてのみ出現する核酸セグメントを用いてそれを形成するための能力である 。
核酸プローブハイブリッド形成アッセイにおける基礎的制限事項の一つは、その アッセイの感度であり、それは、標的分子に対して結合するためのプローブの能 力及び、標的分子に対して結合しかつ検出に有効な期間において検出されること ができる各プローブから産生されるシグナルの強度に依存する。このアッセイに おける既知の検出法は、プローブから産生される、つまり、プローブ中に含まれ る蛍光性部分もしくは放射活性同位体元素から産生されるシグナル、あるいは、 プローブに結合している、アルカリフォスファターゼもしくはペルオキシダーゼ のような酵素、及び、プローブハイブリッド形成後及びハイブリッド形成プロー ブの非ハイブリッド形成プローブからの分離後では、特徴的な呈色産物を産生ず るように特異的な基質と共にインキュベートさせた前記酵素から産生されるシグ ナルに依存する。しかしながら、これらのアッセイの実際的な検出限界は約２０ ０．０００標的分子（１００μｌ中の３フ工ムトモル濃度）であり、これは多く の用途について充分な感度ではない。そのため、核酸プローブハイブリッド形成 アッセイについての検出系の感度を上げることに、多くの努力が費やされている 。
重大な注目を集めている研究の第２の分野は、感度の増大であり、これはつまり 、検出されるべき標的分子の数を増加させることによって行なわれ、つまり、現 在利用可能なシグナル産生及びシグナル検出法を利用することで簡単に検出され るのに　〜充分な量に対する標的核酸のセグメントの増幅によって行なわれる。
サンプル中の標的分子の量を増大させるための従来の方法は、様々な培養法を使 用して、生物に対する栄養物を豊富に含む条件下で生物を標的分子と共に増殖す ることであった。
（Ｌｅｎｎｅ　ｔ　ｔ　ｅ、Ｅ、Ｈｌら（１９８５年）、臨床微生物学便覧、ア メリカ微生物学会編集、ワシントン、Ｄ、Ｃ，。
Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｐ、ら（１９８１年）、一般細菌学の方法マニュアル、アメ リカ微生物学会編集、ワシントン、Ｄ、Ｃ，）。サンプル中の標的分子の数を増 加させることにおける最近の進展は、個々の標的分子から由来することができる レポーター分子の数の標的依存的な増大に焦点を当ててきた。このような「リポ ータ−分子」は、対応する標的分子のセグメントの配列を有していても有してい なくてもよい。これらの最近の進展の一例は、いわゆる「ポリメラーゼ連鎖反応 Ｊ　（ＰＣＲ）を使用する増幅である。ＰＣＲ増幅に関しては、ＰＣＲの基礎的 な記載のために、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、補足版４、セクション ５、ユニット３．１７に最近の方法が引用され、それを本明細書中に参照として 取り込むこととする。
ＰＣＲを記載しである他の引用文献は、Ｅｒ　１　ｉ　ａｈ、Ｈ，Ａ。
（編集）（１９８９年）、ＰＣＲ技術、ストックトン　プレス社；Ｅｒ１ｉｃｈ 、Ｈ，Ａ、ら（１９８８年）　、Ｎａｔｕｒｅ３３１巻、４６１−４６２ページ ；ＭｕｌｌｉｓＳＫ、Ｂ。
及びＦａ　１　ｏｏｎａ、Ｆ、Ａ、　（１９８７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｓ１５５巻、３３５−３５０ページ；３１ｉｋｉ、Ｒ，に 、ら　（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ　３２４巻、１６３−１６６ページ；５ａ ｉｋｉ、Ｒ，に、　ら　（１９８８年）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９巻、４８７ −４９１ベージ：５ａｉｋｉ　、Ｒ，Ｋ、　ら　（１９８５年）　、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３０巻、１３５０−１３５４ベージ：Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許 第４．６８３，１９５号：及び、Ｍｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３， ２０２号、を含む。
ＰＣＲにおいては、２本鎖の標的核酸を温度的に変成させ、更に、標的中の目的 の２本鎖セグメントにフランキングするプライマー対（この２本鎖セグメントの 各層の３°端にハイブリッド形成している一つのプライマー）とハイブリッド形 成させ、その後、このプライマーをＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼにより触媒される伸 長反応において伸長する。核酸のサンプル中の各標的分子についての、かなりの サイクル数（例えば、典型的には２５回）の変成、ハイブリッド形成、及びプラ イマー伸長過程により、標的分子のセグメントと同一の核酸配列（通常は約１０ ０＝２０００塩基対）を有する２本鎖Ｄ　Ｎ　Ａであるリポータ−分子の多くの コピーが作製される。２５サイクルのＰＣＲ増幅において、約１０６より大きい リポータ−セグメントが、サンプル中に当初存在する各標的分子について作製で きる。充分な増幅のためには通常は２時間以上を要する反応を多くの回数行うこ とを必要とするため、このＰＣＲ法は煩雑である。更に、手作業で行う場合には この増幅法はより時間を浪費するものである。
更に、自動装置が必要である場合にはかなり高価なものになる可能性がある。
「転写をベースにした増幅系Ｊ　（ｒＴＡＳＪ）と呼ばれる最近開示された他の 増幅法は、転写のためにプロモーターに操作可能なように連結しているセグメン トからの数多くの転写物を迅速に産生ずることができるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼにより特異的に認識されるプロモーターについてのセグメントを含むプ ライマーを使用する。Ｇｉｎｇｅｒａｓ、Ｔ、Ｒ，らに対するＰＣＴ公開公報第 　ＷＯ８８／１０３１５号を引用文献として挙げる。適切なプライマー及び、− 重鎖の標的分子（例えば、ＲＮＡもしくは、２本鎖ＤＮＡの１本の鎖）とのプラ イマー伸長反応を用い、転写のために、予め選択しである標的分子セグメントに 操作可能なように連結しているプロモーターを有する２本鎖産物を産生きせる。
単一段階で、この産物と、このプロモーターを認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼとの転写により、標的セグメント（即ち、標的分子の、予め選択しであ るセグメント）の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡが１０から１，０００ コピー産生される。リバーストランスクリブターゼと最初の転写段階において作 製されるＲ　Ｎ　Ａコピーとを使用する更に２回のプライマー伸長により、標的 分子の標的セグメントと同一な配列を育するＲＮＡを産生ずるためのＤＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写による追加的な増幅に便利なｃＤＮＡコピ ーが産生される。更に回を重ねたｃＤＮＡ合成及び転写を行うことができる。Ｐ ＣＲと同様にＴＡＳ増幅は、標的分子のセグメントと同一の配列もしくはそれに 対して相補的な配列を有する数多くのリポータ−分子（ＴＡＳの場合ＲＮＡ）を 作製し、かつ、同一のレベルの増幅−を行うのにＰＣＲよりも少ない段階を使用 する一方、ＴＡＳは、ＰＣＲよりも２種類以上の酵素反応、即ち、ＤＮＡ依存性 ＲＮＡポリメラーゼにより触媒化される転写及び逆転写、及び、１若しくは２種 類以上の酵素（ＤＮＡ依存性ＲＮ　Ａポリメラーゼ、及び、プライマー依存性Ｄ ＮＡ伸長に使用されない場合には、リバーストランスクリブターゼ）を必要とす る。更に、ＰＣＲと比較しても時間短縮にならないことが主張されている。
標的核酸被検体の一つのもしくは複数のセグメントの増幅よりもむしろプローブ に結合するラベルの増幅の形態を含む３番目の増幅法は、Ｑβレプリカーゼ酵素 及びそのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を使用することが基礎となってい る。Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ、Ｔ、及びＧ、Ｇ。
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ　（１９７９年）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、４８巻、５２５−５４８ページ；Ｃｈｕ。
Ｂ、らに対するＰＣＴ公開公報　第　ＷＯ８７１０６２７０号及び米国特許第４ ．９５７，８５８号；Ｆｅ１ｘ１Ｇ、及びＨ，５ａｎｏ　（１９７６年）、ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ６３巻、２０１−２０４ベージ；ＫｒａｍｅｒＳＦ、Ｒ， 及びＰ、Ｍ、Ｌｉ　ｚａｒｄｉ　（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ３３９巻、４０ １−４０２ベージ；　Ｋ　ｒ　ａ　ｍ　ｅ　ｒ　ｌ：対する米国特許第４，７８ ６，６００号；Ｌｉｚａｒｄｉ、Ｐ、Ｍ、ら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　６巻〜１１９７−１２０２ページ：及び、５ｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｗ 。
ら（１９７７年）、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１７巻、８７７−９０７ペー ジが、この方法の更に詳しい記載物として引用する。この方法においては、複製 （時には、「複製可能な」と称される）ＲＮＡ分子を、特異的ハイブリッド形成 用プローブ（即ち、サンプル中の標的核酸被検体のセグメント（「標的セグメン ト」）の配列に対して相補的な配列を有する一本鎖の核酸）に共有結合でつない である。このプローブは、組換え復製ＲＮ　Ａ内に組み込まれているか、あるい は、複製ＲＮＡの末端の一つに結合しているセグメントであることができる。ブ ローブー複製可能なＲＮＡ複合体は、サンプル中の標的核酸被検体に対して（プ ローブセグメントにより）／Ｘイブリッド形成し、更に、ハイブリッド形成して いるそのプローブ−ＲＮＡ複合体をその後ハイブリッド形成していない複合体か ら分離し、更に、標的に対してハイブリッド形成している複合体の複製可能なＲ ＮＡをその後（複製可能なＲＮＡ中にプローブセグメントが組込まれていない場 合には、典型的には、プローブセグメントからの分離後）、複製可能なＲＮＡの 自己触媒的な複製を触媒して、ハイブリッド形成している各標的分子について１ ０９までのリポータ−分子（複製可能なＲＮＡ）を産生させるＱβレブリカーゼ とのインキュベーションにより指数関数的に増幅させる。このような増幅は３０ 分以内に完了することができる（Ｌｉｚａｒｄｉら、上掲）。
ある種の構造を有するＲＮＡについてのＱβレプリカーゼの極度な特異性、及び 、自己触媒的複製の触媒化についての配列要件により、プローブに関連する複製 可能なＲＮ　Ａのみが増幅されることが確実である（Ｋｒａｍｅｒ及びＬｉｚａ ｒｄｉ、上掲、１９８９年）。他の利点としては、反応の速度及び操作の簡素化 を含む。しかしながら、欠点として、リポータ−分子としてのＲＮＡの使用を必 要とすることが含まれる。所与の配列のＲＮＡは、製造する費用がより高価であ り、かつ、同一の配列を有するＤＮＡよりも熱安定性ヌクレアーゼに対してより 感受性が高い。更に、複製可能なＲＮＡ中にプローブセグメントが組み込まれて いる場合を除外し、標的セグメントはリポータ−分子により増幅化されない。
発明の要約 本発明は、Ｑβレプリカーゼ、つまり、バクテリオファージＱβのゲノムの複製 を触媒する酵素、のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性（ｒＤＤＲＰＪ　）　 、及び、その機能的等価物（例えば、ＤＤＲＰ活性を有する他のＲＮＡ依存性Ｒ ＮＡレプリカーゼ）の発見に依存する。このＤＤＲＰ活性の発見により、Ｑβレ プリカーゼ及びＤＤＲＰ活性を有する他のレプリカーゼによる増幅のための、Ｄ ＮＡ基質を含む、２゛　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含む 基質の使用を可能にした。
ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性により、結果的にはＲＮＡ　（もしくは、同 一の位置にリボヌクレオチドの類縁体が存在するポリヌクレオチド）の産生を生 じ、このＲＮ　Ａは、任意の基質からＲＮＡＮプレカーゼにより自己触媒的に複 製可能であり、この基質は自己触媒的に複製可能であるＲＮＡの配列を有するセ グメントを含み、かつ、この自己触媒的に複製可能な配列を有するセグメント内 に、２°　−デオキシリボヌクレオチドまたは、２°　−デオキシリボアルキル フオスフォネート、２°−デオキシリボフォスフォロチオエート、２′　−デオ キシ　−リボフォスフォトリエステル、もしくは、２′　−デオキシリボフォス フオロアミデートのようなその類縁体を含む。ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活 性用の基質においては、自己触媒的に複製可能であるＲＮＡのＮプレカーゼによ り触媒される合成用鋳型として働くそのセグメントは、基質全体（従って、その 基質の３′端及び５゛端の両方を含む）、基質の３゛端を含み５゜端を含まない セグメント、基質の５′端を含み３゛端を含まないセグメント、もしくは、基質 中に組み込まれているセグメント（従って、基質の３′端及び５゛端のいずれを も含まないものを含む）を含む。基質は線状であることも、あるいは、閉じた環 状であることもでき、更に、２本鎖の核酸の一部であることもできる。そのセグ メントもしくは基質は、２°　−デオキシリボヌクレオチド（即ち、各々、ＤＮ Ａセグメントもしくは基質）の全体からなることもできる。ＤＤＲＰ活性が操作 可能である基質は、その３°末端にポリーｄＣセグメントを有するポリ−ｄＡも しくはその３′末端にポリーｄＣセグメントを有するＲＮＡ、のようなホモポリ −２′　−デオキシリボヌクレオチドに限定されない。上述のＦｅ　ｉｘ及び５ ａｎｏ　（１９７６年）を参照せよ。
本発明の方法においては、ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性用基賀は「複合」 基質である。「複合」基質は、遊離の３゜端を有さない閉じた環の基質であるか 、あるいは、遊離の３′端を有するが、ＤＤＫＰ活性により触媒される自己触媒 的に複製可能なＲＮＡの合成のための鋳型であるセグメントが３°端を含まない 基質であるか、あるいは、遊離の３°端を含み、更に、ＤＤＲＰ活性により触媒 される自己触媒的に複製可能なＲＮＡの合成のための鋳型であるセグメントが３ °端を含むが、３°端にポリーｄＣ以外のセグメントを有する基質であるか、あ るいは、遊離の３°端を有し、更に、ＤＤＲＰ活性により触媒される自己触媒的 に複製可能なＲＮＡの合成のための鋳型であるセグメントが３°端を含みかつそ の３゛端にポリ−ｄＣを有するが、３゛端におけるそのポリーｄＣ以外に、当該 セグメントのサブセグメントとして少なくとも１種類の２°　−デオキシリボヌ クレオチドもしくはその類縁体を含むが、ホモポリ−２−デオキシリボヌクレオ チドは含まないサブセグメントを有する基質である。ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤ ＲＰ活性により触媒される自己触媒的に複製可能なＲＮＡの合成のための複合基 質中の鋳型であるセグメントは、「複合セグメント」もしくは「複合鋳型コと称 される。本発明の方法においては、この「複合セグメント」は、少なくとも１種 類の２°　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含む。
本明細書中の用語「ポリｄｃＪは、少なくとも２種類のｄＣのセグメントを意味 する。
本明細書中の用語「２°　−デオキシリボヌクレオチド」は、４種類の標準的な ２゛　−デオキシリボヌクレオチドの１種類を意味する。
本明細書中の用語「２°　−デオキシリボヌクレオチド類縁体」は、２°　−デ オキシリボヌクレオチドの類縁体を意味し、その類縁体は、（ｉ）塩基として、 ２°　−デオキシリボヌクレオチド、あるいは、環状炭素もしくはアミノ窒素上 において誘導化された当該塩基を有し、かつ、（！ｉ）対応する標準的なりボヌ クレオチド（ｄＡについてはｒＡＳｄＣについてはｒＣ。
ｄＧについてはｒＧ、ＴについてはＵ）以外のものである。本明細書に記載のＲ ＮＡＮプレカーゼによるＤＤＲＰ活性用鋳型の一部である２°　−デオキシリボ ヌクレオチド類縁体は、鋳型中のＮプレカーゼにより認識され、２°　−デオキ シリボヌクレオチドの塩基に対して相補的な塩基を有するリボヌクレオチドを、 ＤＤＲＰ活性により鋳型から作製される自己触媒的に複製可能なＲＮＡの対応位 置に配置している。
ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性の結果として生じたＲＮＡ　（もしくは、１ 種類以上のりボヌクレオチド順総体を有するポリリボヌクレオチド）は、そのＮ プレカーゼ（もしくは、自己触媒的な複製のための鋳型としてＲＮＡコピーを認 識する他のＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼ）により自己触媒的に複製可能とな る。このように、ＲＮ　ＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型であるセグ メントは、Ｎプレカーゼ、リボヌクレオシド５゛　−三リン酸、及び、おそらく は、ある種のりボヌクレオシド５′　−三リン酸の類縁体の存在下で増幅される が、その理由は、ＤＤＲＰ活性により触媒される合成において作製されるＲＮＡ 　（もしくは、１種類以上のりボヌクレオチド類縁体を有するポリリボヌクレオ チド）が、同一のＮプレカーゼにより自己触媒的に複製されるためである。
そのため、最も一般的な意味において本発明は、バクテリオファージＱβのＲＮ ＡＮブレカーゼのようなＲＮＡＮプレカーゼのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ 活性を使用する複合核酸゛鋳型を増幅するための方法である。本発明はまた、目 的の核酸を作製する、増幅する、検出する、配列決定する、もしくはそうでなけ れば処理することにおける本増幅法の数多くの応用を含む。つまり、この増幅法 を、例えば、核酸プローブとして使用することができる大量のＲＮＡを作製する ために使用することができ、そのＲＮＡをクローニングのためのｃＤＮＡへと変 換し、核酸プローブハイブリッド形成アッセイの一部として検出し、あるいは配 列決定することができる。
本発明の増幅法を、核酸の「標的」セグメント（つまり、予め決定された「標的 」配列を有するセグメント）がサンプル中に存在する場合にのみ、予め決定され た配列を有する、あるいは、それを有するセグメントを含む、自己触媒的に複製 可能であるＲＮＡが、そのサンプルを用いて行われる増幅におけるバックグラウ ンド値以上の検出可能なレベルで産生されるよすることができる。このように、 本発明は、ＱβレプリカーゼのＤＤＲＰ活性、あるいは、ＤＤＲＰ活性を有する 他のＮプレカーゼを用いることを含む、リポータ−核酸分子の標的核酸セグメン ト特異的増幅のための方法を含む。より具体的には、核酸のサンプルに対して、 １種類以上の核酸プローブを添加し、更に、１種類以上の標的セグメントを含む 標的核酸がサンプル中に出現する場合及びそのような場合にのみ、Ｑβレプリカ ーゼのようなＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性の複合基質が出現するようにそ のプローブを含むサンプルを処理する。この複合基質は、つまりは、予め決定さ れた配列（リポータ−配列であるかそれを含む配列）を含みかつＤＤＲＰ活性の 鋳型である複合セグメントであるか、あるいは、それを含む。プローブの各々は 、標的セグメントもしくは標的セグメントの相補体に対してハイブリッド形成し 、かつ、このプローブは、適切な処理においては、標的セグメントがサンプル中 に存在する場合及びそのような場合にのみ、ＤＤＲＰ活性の複合基質である核酸 をプローブを用いて作製することができるというようなセグメントを含む。標的 核酸が存在する場合には、ＤＤＲＰ活性用活性質が出現するように一部サンプル を処理したら、Ｎプレカーゼにより触媒される反応に必要な他に試薬と共に、基 質が有するような活性を有するＲ　Ｎ　ＡＮプレカーゼをサンプルのアリコート へ添加する。標的核酸が存在する場合には、ＤＤＲＰ活性用活性質が作製された ように、リポータ−配列もしくはそれに対して相補的な配列を有するかあるいは 含む自己触媒的に複製可能なＲＮＡを、ＤＤＲＰ活性を用いて作製されるＲＮＡ の自己触媒的な複製と結合されたＤＤＲＰ活性により検出可能なレベルにまで増 幅する。標的核酸が存在しなかった場合には、リポータ−配列を含む、ＤＤＲＰ 活性用活性質は産生されず、かつ、そのＮプレカーゼは、そのようなリポータ− 配列（もしくは、それに対して相補的な配列）を有する自己触媒的に複製された Ｒ　Ｎ　Ａを産生じない。このようなリポータ−配列を有するＲＮＡは、「リポ ータ−」として直接、あるいは、更に処理される場合には、間接的に作用する。
このように、ＲＮＡの産生は、リポータ−分子の増幅を構成し、かつ、この過程 は標的特異的である（つまり、標的依存性である）。
本発明は、核酸を含むサンプル中の標的核酸被検体の存在もしくは不在を検出す るための方法を提供する。本発明のこれらの方法は、ＱβレプリカーゼのＤＤＲ Ｐ活性あるいはＤＤＲＰ活性を有する他のＮプレカーゼを使用しての、リポータ −核酸の、本発明に記載の標的特異的増幅、及び、リポータ−核酸のアッセイを 含む。
核酸被検体を検出することについての本発明に記載の方法により提供される利点 は、他の方法を使用するアッセイと比較して、本発明のこのような方法を使用す るアッセイにおける「偽陽性」の頻度の減少である。この利点は、アッセイ系に 関するＱβ及び他のＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性を使用することでＤＮＡが増幅 可能になること（より正確には、増幅を開始することが可能になる）及び、する にしても同様な方法ではＲＮＡを修飾しない酵素を用いる特定的な方法において ＤＮＡを修飾することができるという事実と関連している。
本発明の、標的依存性増幅法の幾つかの異なる実施態様が提供される。これらの 実施態様は、サンプル中の標的核酸の存在に依存する方法において、核酸のサン プル中に、ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性を用いて増幅可能となる複合核酸 セグメントを提供するために使用される様々な核酸プローブの構造、かつ、それ を処理する方法に依存する。
１つの実施態様においては、予め選択された標的セグメントを含む核酸を含んで いてもよい核酸サンプルに核酸プローブを添加するが、そのプローブは、上述し たように少なくとも１種類の２゛　−デオキシリボヌクレオチドを含むＮプレカ ーゼ増幅可能複合セグメントと、標的セグメントの配列に対して相補的−な配列 を有するアンチ標的（「ブロービング」）セグメントとの両方を含む。もしある とすれば、サンプル中の標的セグメントに対してハイブリッド形成する核酸プロ ーブを、ハイブリッド形成しなかったプローブから分離し、更に、プローブのＮ プレカーゼ増幅可能セグメントと共にＱβレプリカーゼもしくはＤＤＲＰ活性を 提示する他のＮプレカーゼの存在する増幅条件下においてハイブリッド形成した プローブを処理し、結果として、リポータ−核酸分子の標的依存性産生及び増幅 が生じる。
この方法はまた、増幅が起こっているか否かを検出する段階を含む。
他の実施態様においては、先程記載したものに類似して、標的に対してハイブリ ッド形成したプローブの、そのようにはハイブリッド形成したかったものからの 分離は、存在することができる任意の標的に対するプローブのハイブリッド形成 後、ハイブリッド形成しなかった任意のプローブのＮプレカーゼ複製可能セグメ ントを消化するヌクレアーゼの作用に対してサンプルの核酸を供することにより 行われる。ハイブリッド形成している場合にはプローブが消化から保護される本 実施態様においては、発明に記載の標的依存性増幅方法の他の実施態様と同様に 、この増幅方法が標的被検体のアッセイの一部である場合には、増幅された物質 を、当業者に知られている多くの方法の任意のものを使用するためテストする。
他の実施態様においては、標的核酸とのハイブリッド形成後には１種類のプロー ブのアンチ標的セグメントの３°端が他のプローブのアンチ標的セグメントの５ ゛端に近接するというような方法において、標的核酸セグメントが２種類のプロ ーブとハイブリッド形成する。各プローブは、アンチ標的セグメントに共有結合 で結合した、ナノ変異体（ｎａｎｏｖａｒ　１ａｎｔ）Ｄ　Ｎ　Ａの一部もしく は他の増幅可能なりＮ’Ａを含む。あるプローブにおいては、そのアンチ標的セ グメントは５′端にあり、又、他のものにおいては３°端にある。一度ハイブリ ッド形成したら、プローブはアンチ標的セグメントを介して結合することができ る。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼもしくは他の適切なりガーゼをその結合に使用するこ とが好ましい。結合が実行される場合には結合後、あるいは、結合が行われない 場合には、ハイブリッド形成後、近接しているプローブはＱβレプリカーゼもし くはその機能的等個物のＤＤＲＰ活性をよって増幅される。結合・増幅方法が例 えば、核酸プローブハイブリッド形成アッセイ法の一部であり、更に、一度、増 幅が行われてしまっている場合には、増幅される物質は、当業者に知られている 適切な方法により検出される。結合しているアンチ標的セグメントの配列もしく はその配列の相補体を含む増幅されたＲＮＡは、自己触媒的に複製可能な組換え ＲＮＡであり、そのＲＮＡにおいては、結合しているアンチ標的セグメントに対 応するセグメントが自己触媒的に複製可能である他のＲＮＡ内へ挿入される。サ ンプル中に標的セグメントが存在した場合にのみ、結合しているアンチ標的セグ メントの配列もしくはその配列の相補体を含む増幅されたＲＮＡが、この増幅過 程において産生される。
本発明の他の実施態様においてもやはり２種類のプローブを使用する。この実施 態様に記載の使用のための第１プローブは、標的核酸の第１標的セグメントに対 して配列が相補的（もしくは、はぼ相補的）であるアンチ標的セグメントであり かつ鋳型として標的核酸を使用するＤＮＡ合成を開始（ｐｒｉｍｉｎｇ）するの に適する３′端を有する。この実施態様における使用のための第２プローブは、 標的核酸の第２標的セグメントと同一の（もしくは、はぼ同一の）配列を有する セグメント（「標的様」セグメントと命名した）でありかつ鋳型として標的核酸 の相補体を使用するＤＮＡ合成を開始するのに適する３゛端を有する。当該第２ 標的セグメントの３′端ヌクレオチドは、当該ｊｌｆｌ標的セグメントの５°端 ヌクレオチドからの５°に位置する。そのため、第２プローブは、標的核酸に対 してアニールされた第１プローブのプライマー伸長産物においてＤＮＡ合成を開 始することができる。両方のプローブの５゛端は、Ｎプレカーゼで増幅可能であ るか、あるいは、Ｎプレカーゼで増幅可能な核酸の一部であり、それは例えば、 第１プローブの５°端のナノ変異体（＋）ＤＮＡの５゛端、及び、第２プローブ の５゛端の対応するナノ変異体（−）ＤＮＡの５゛端である。増幅方法において は、第１プローブを標的に対してアニールし、更に伸長し、そして、結果として 生じる伸長産物を熱変成により鎖分離させることが好ましく、あるいは、標的が ＲＮＡである場合には、この産物を、リボヌクレアーゼＨ活性を提供する酵素で 処理することにより鎖分離させることができる。５“端に第１プローブを含む伸 長産物の鎖に対してｊｌ！２プローブをアニールし、更に、伸長させる。第２プ ローブの伸長に続きあるいはそれと同時に、Ｑβレプリカーゼもしくは等価物の ＤＤＲＰ活ンプル中に存在し、そのサンプルでこの２重プライマー伸長／増幅方 法を行う場合にのみ、増幅された産物が、（１）第１プローブのアンチ標的セグ メントの相補体、（ｉｉ）第２プローブの標的様セグメント、及び（ｉ　ｉ　ｉ ）標的核酸中の２Ｎ類の標的セグメントの間に出現する、もしあるとすれば（ｉ ）と（ｉ　ｉ）との間のセグメントと同一のセグメント、を含む核酸を含む。こ のように、本発明の核酸プローブＩハイブリッド形成アッセイ法は、これらの２ ．３のセグメントを含む増幅産物のための任意の従来型のアッセイによる２重プ ライマー伸長／増幅過程を随伴することにより提供される。
本発明の他の実施態様においては、便宜のためｒＲＮＡプローブ」と称するが、 リボヌクレオチド全体（そしてそれはＲＮＡプローブである）からなるか、ある いは、その配列内に充分量のりボヌクレオチドを含むプローブを使用して、する としてもより緩慢な速度でＤＮＡでなく　ＲＮＡを分解するりボヌクレアーゼも しくは化学処理での分解を可能にすることができる。
このＲＮＡプローブはアンチ標的セグメントを含み、そのセグメントは標識セグ メントに対して配列が相補的もしくはほぼ相補的であり、その標的セグメントは 標的核酸の３°端に存在するかもしくはそのセグメントであり、そのため、標的 セグメントは鋳型としてのＲＮ　Ａプローブ上でＤＮＡ合成を開始することがで きる。そのＲＮＡプローブは、５端上にレプリカーゼ増幅可能セグメントを含む 。Ｓｔ的核酸の３′端が「遊離」となるように、これはすなわち、その３゛端の ヌクレオチドが３′　−ヒドロキシを有し、かつ、核酸の末端に存在し、更に、 その５゛　−炭素を通して他のヌクレオチドに結合されていることを除いては共 有結合されないように、標的核酸を処理する。
標的セグメントの遊離３°　端は、標的（もしくはその一部分）に対してＲＮＡ プローブをアニーリングする前に、標的核酸を任意の従来技術により処理するこ とによって提供されることが好ましい。プローブ及びこの系における任意の標的 を、リバーストランスクリプターゼ活性を有する酵素のリバーストランスクリブ ターゼ活性により触媒されるプライマー伸長反応において伸長し、更に、この系 におけるＲＮＡをその後、当業者には理解されているように、化学的に分解する か、あるいは、リボヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて分解する。このＲＮ Ａの分解は、やはり行うことができる希釈と結合させる場合には充分広域に及び 、レプリカーゼ増幅可能セグメントを保持しかつそれによってこの方法において その後使用されるべきレプリカーゼによる増幅のための鋳型として操作可能であ るＲＮＡプローブの濃度を、増幅が行われるサンプルのアリコート中に保持され ているこのような任意のプローブの増幅が観察されなくなるに充分な低レベルに まで減少させる。典型的には、このＲＮＡプローブの逆転写後、この溶液（もし くはそのアリコート）を、増幅が行われる溶液のアリコート中の増幅可能セグメ ント保持ＲＮＡの濃度が、この増幅法が適用される核酸のサンプル中に標的セグ メントが存在した場合に存在するＤＤＲＰ活性の複合鋳型の濃度の１／１０００ より小さくなるように、更に望ましくは１／１０．０００より小さくするように 処理する。
統計学的に、増幅可能なセグメントを有するＲＮＡの１分子より少ないものが増 幅が行われるアリコート中に残るようにＲＮＡの分解が希釈と結合されることが より好ましい。標的セグメント伸長及びＲＮＡ分解の後に残存している任意のＤ ＮＡ伸長産物は、レプリカーゼ増幅可能な複合ＤＮＡセグメントを含む。この系 におけるＲ　Ｎ　Ａの分解、及び、ＲＮＡ分解用条件もしくは活性の実買的な除 去後、Ｑβレプリカーゼもしくは機能的等価物のＤＤＲＰ活性を使用して、任意 の標的ＤＮＡに添加されるレプリカーゼ増幅可能セグメントを増幅する。増幅は 、鋳型としてのＲＮＡプローブ上でのＤＮＡ伸長反応を開始することが可能な標 的セグメントが、テストされるサンプル中に存在する場合にのみ起こる。このよ うに、増幅反応の後に、増幅された産物の存在をテストするための任意の従来法 を利用することにより、標的核酸についてアッセイを行う方法も提供される。
ＲＮＡプローブは、リボヌクレオチド全体を含むか、あるいは、充分量のりボヌ クレオチドをその配列内に含み、ＤＮＡでなく　ＲＮＡを分解するりボヌクレア ーゼもしくは化学的処理での分解を可能にするが、このＲＮＡプローブを、３Ｎ 類のプローブを使用する本発明の他の実施態様において使用することができる。
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、もしくはキメラ（即ち、リボヌクレオチドと２゛　−デ オキシリボヌクレオチドとの任意の組み合わせ、又はその類似体の組み合わせ） であることができる東１プローブは、その５゛端に、標的核酸の第１標的セグメ ントの配列に対して相補的であるかもしくはほぼ相補的である配列を宵する第１ アンチ標的セグメントを含む。この第１プローブは、目下記載の第２プローブの 鎖伸長を阻止するのに充分な安定性を以て、それに対応する標的セグメントに対 してバイブ′リッド形成する。また、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、もしくはキメラで あることもできる第２プローブは、標的核酸の第２標的セグメントの配列に対し て相補的であるかあるいはほぼ相補的である配列をその３′端に有する第アンチ ２標的セグメントを含んでおり、かつ、標的核酸に対してアニールされる場合に は、鋳型として標的核酸を使用してＤ　Ｎ　Ａ合成を開始することができる。東 １標的セグメントの３°端は、第２標的セグメントの５°端からの５°　に位置 しており、かつ、少なくとも数塩基、更には約２０００塩基までのギャップによ り第２標的セグメントの５°端から分離されている。第３プローブは、便宜上Ｒ ＮＡプローブと称されるが、Ｎプレカーゼ増幅可能セグメントを含む上述のＲＮ Ａプローブの様に、ＲＮ　Ａを分解する過程を通し、それ自身のＮプレカーゼ増 幅可能セグメントのレプリカーゼ増幅能を除去することに感受的な充分数のりボ ヌクレオチドのみを含む。この第３プローブは、その３°端に標的様セグメント 及びＮプレカーゼ増幅可能セグメントを含む。標的様セグメントは、標的核酸の 第３セグメントと同一もしくはほぼ同一な配列を有し、その配列は、その５“端 に、第１と第２標的セグメントとの間に少なくとも数ヌクレオチドのギャップを 含み（更に、第２標的セグメントと重なり合ってもよい）、かつ、それ自身の５ “端塩基として、第１標的セグメントの３′端の塩基に近接する塩基を有する。
この第３プローブは、標的様セグメントを通して、鋳型として標的核酸を使用し て作製さることが可能でなければならない。本発明に記載されているリポータ− セグメントを標的核酸依存的な方法で増幅するために、サンプルの核酸を一本鎖 にし、更に、第１及び第２プローブをそのサンプルに添加し、それを、プローブ を（もし存在すれば）標的に対してアニールする条件に供し、更に、一端アニー ルされた第２プローブが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片のような 酵素により触媒される、プライマー特異的な鋳型依存性ＤＮＡ伸長反応において 伸長される。この伸長反応において′Ｍ２プローブに添加された伸長物は、標的 核酸中の第１及び第２標的セグメントの間のギャップの配列に対して相補的な配 列を有する。伸長反応後、そのサンプルを処理して伸長産物を層分離させ（例え ば、温度変性）、更にその後、第３プローブをその標的セグメントに対してアニ ールする条件に供するが、その第３プローブは、伸長反応において第２プローブ の３′端に添加されたセグメントの３°端の一部を少なくとも含みかつ第２プロ ーブであった伸長産物のセグメントの少なくとも一部と重複していてもよく、そ して、リバーズトランスクリブターゼ活性及び鋳型としてそれ自身のＮプレカー ゼ増幅可能セグメントを含む策３プローブを使用して、少なくとも伸長された第 ２プローブを更に伸長する。第２プローブの第２伸長に引き続き、ＲＮ　Ａプロ ーブを利用する本発明の実施態様について上述したようにそのサンプルを処理し て、Ｎプレカーゼを添加して増幅を実施する前に、Ｎプレカーゼ増幅可能セグメ ントの濃度を微々たる量にまで低減することにより東３プローブのＮプレカーゼ 増幅可能セグメントを実質的に除去する。このように、溶液を、当業者に理解さ れるように、化学的もしくは酵素的にＲＮＡを分解するための条件に供し、又、 第３プローブの残存するＮプレカーゼ増幅可能セグメントを希釈するために更に 処理することができる。ＲＮＡの分解及びＲＮＡ分解用条件の実質的な除去後、 自己触媒的複製のための鋳型としてＲＮＡプローブのＮプレカーゼ増幅可能セグ メントを認識するＱβレプリカーゼもしくは他のＲＮＡＮプレカーゼをサンプル に添加し、更に、ＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性が、２重に伸長された第２プロー ブの複合Ｎプレカーゼ増幅可能セグメントからの増幅を触媒する条件に、そのサ ンプルを供する。本発明の他の実施態様と同様に、一度ＤＤＲＰ活性によって触 媒された増幅が始まると、当業者に良く知られた適切な方法により、増幅された 物質を検出することができる。
当業者が理解することであるが、標的セグメントは、本発明の方法が適用される サンプル中に、本発明の方法に記載の増幅を起こすのに必要な標的セグメントも しくは複数の標的セグメントの配合物が、標的核酸がサンプル中に存在する場合 にのみ、バックグラウンドから識別可能な量存在するように選択する。
標的核酸が存在しなければ、必要とされる標的セグメントもしくは複数の標的セ グメントの配合物がサンプルに不在となるように、標的セグメントを選択するこ とが好ましい。
本発明は、更に、サンプル中の標的核酸被検体の量の定量化にも関する。定量化 は、第１増幅核酸の検出量、つまり、標的−核酸被検体がサンプル中に存在する 場合にのみ生じる増幅と、第２増幅核酸の検出量、つまり、第１増幅核酸の増幅 に平行して行われ、かつ、内部標準として働きかつ既知の量のサンプル中に存在 する予め選択された核酸のサンプル中の存在により生−じる増幅とを比較するこ とにより行われる。
本発明は更に、核酸のサンプル中の特異的標的核酸被検体の検出のためのテスト キットをも含む。このキットは、本発明に記載の増幅に必要な、リポータ−分子 、ＤＤＲＰ活性を提供するためのＱβレプリカーゼもしくは等価酵素、及び、Ｄ ＤＲＰ活性により触媒される増幅の前のもしくはそれと同時の被検体もしくはプ ローブのプロセッシングに必要な（もしあれば）他の酵素の、１種類以上の核酸 プローブを含む。そのキットは、本発明に記載の増幅において産生されるリポー タ−核酸を検出するための方法、及び、要求されるハイブリッド形成及び自己触 媒的な複製を含む酵素的に触媒される反応を行うことを促進するために、緩衝液 及びヌクレオシド三リン酸のような種々の成分を含んでいても良い。そのキット を用いてアッセイされるべき標的核酸被検体の、本発明に記載の定量化を提供す るために、キットは、内部標準として予め選択された核酸と関連する増幅及びそ のような増幅からの産物の検出に必要な成分を含んでいてもよい。本発明に記載 のキットの様々な成分を、任意の様々な方法でキット中にパッケージすることが でき、そのパッケージ法においては、通常は複数のバイアルもしくは他の容器が 使用され、それは、キットの貯蔵期間中の成分の安定性及び純度を保存するため の必要性、本発明に記載の様々な成分が使用される順序、キットの使用の際の便 利さ、キットの製造における便利さ及び費用、などのような、当業者には理解さ れる因子により決定される。
当業者に知られている様々な方法を、本発明に記載の増幅法により提供されるリ ポータ−分子を検出するために使用することができる。つまり、そのリポータ− 核酸は様々な染料と反応することができ、更に、その染料を肉眼で、あるいは、 分光学的に検出することができる。別の方法としては、検出のためにラベルして あり、かつ、増幅を触媒するＱβレブリカーゼもしくは他のレプリカーセ用の基 質として活性を保ち続けているリボヌクレオシド５′　−三リン酸を増幅反応に おいて利用することができ、更にその後、増幅されたリポータ−内に取り込まれ るラベルからのシグナルを、直接、あるいは、ラベルとシグナル産生分子との結 合後は、間接的に検出することができる。又別の方法においては、増幅の結果生 じるリポータ−核酸を、検出のためラベルしである核酸プローブとハイブリッド 形成させることができ、リポータ−に対してハイブリッド形成したこのようなプ ローブに関連したシグナルを直接もしくは間接的に検出することができる。
本発明の方法及びその方法を実施するための本発明のキットの利点の一つは速度 である。本発明の増幅法は、典型的には、約６０分以内に、サンプル中の各標的 分子に対して１０９より多いリポータ−分子を産生ずることができる。更に、本 発明を実施するための系は、設計が比較的簡単であり、増幅を開始するためにＲ ＮＡの使用を必要とする系に勝るものである。本発明の方法においてこの目的の ために使用されるＤ　Ｎ　Ａは、ＲＮアーゼにより触媒される分解に対して耐性 であり、かつ、それらのＲＮＡカウンターパートよりも多くの合成的選択物（ｏ ｐｔｉｏｎｓ）を提供する。化学的に合成されたＤＮＡは、ＲＮＡよりコスト的 に有利である。本発明は、特に、核酸の混合物中に存在する核酸の稀有な種に基 づく増幅に有効であり、その種の存在及び量の有効な検出法を提供する。
本発明の方法による増幅もしくは検出のための標的核酸被検微吟な核酸：ヒトの 遺伝病の基になる異常を含むゲノム核酸；ヒトの癌遺伝子を含むゲノム核酸：法 廷分析、実父確認テスト、骨髄移植のための適合性テスト、制限断片長多形性を 使用する植物及び動物の性質決定、及び、動物もしくは植物の品種の改良と遺伝 子変換との関連性調査に用いられる核酸、及び、食品、化粧品もしくは水に混在 する生物、あるいは、ある生物の存在が、その生物が出現する環境における環境 条件の診断に役立つという生物の核酸の特性、を含む。
図面の簡単な説明 図１は、ＤＮＡプローブの標的配列（標的セグメント）に対するハイブリッド形 成と、それに続く、ハイブリッド形成しなかったものからのハイブリッド形成し たプローブの分離、及びその後の、標的に対してハイブリッド形成している間の そのプローブの増幅可能セグメントの増幅による、リポータ−分子の標的核酸セ グメント特異的増幅の方法を説明する概略図である。
図に説明されるように、増幅された産物（ＲＮＡ）が検出される。
図２は、図１において記載されている方法においてプローブを使用することがで きる代替形態を説明する概略図である。　−図３は、リポータ−分子の標的核酸 セグメント特異的増幅上についての本発明の他の態様を説明する概略図である。
図３に説明される方法においては、プローブを標的に対してハイブリッド形成さ せ、その後、−氷層３゛　−から−５゛への一重鎖エキソヌクレアーゼ活性を有 する酵素を添加して、標的に対してハイブリッド形成することによって分解から 保護されていない任意のプローブを分解する。最終的には、保護されていて分解 されないプローブが増幅される。この図において説明されるように、増幅された 産物を検出することができる。
図４は、リポータ−分子の標的核酸セグメント特異的増幅についての本発明の他 の態様を説明する概略図である。図４において説明される方法においては、２種 類のプローブを標的の隣接セグメントに対してハイブリッド形成させ、更に、連 結し、その後、結果として生じる連結されたプローブを増幅する。この図おいて 説明されるように、増幅された産物を検出することができる。
図５は、リポータ−分子の標的核酸セグメント特異的増幅についての本発明の他 の態様を説明する概略図である。図５において説明される方法においては、第１ プローブを標的に対してハイブリッド形成させ、鋳型としての標的で鎖伸長を開 始させ、その鎖伸長産物の鎖を分離し、第２プローブを、伸長した第１プローブ に対してハイブリッド形成させ、鋳型としての第１プローブで鎖伸長を開始させ る。第２鎖伸長産物はレブリカーゼ増幅可能セグメントを含み、つまりは、標的 のセグメント配列を有するセグメントを含む。増幅は、第２鎖伸長産物で行われ る。この図おいて説明されるように、増幅された産物を検出することができる。
図６は、リポータ−分子の標的核酸セグメント特異的増幅についての本発明の他 の態様を説明する概略図である。図６において説明される方法においては、ＲＮ Ａプローブを使用し、標的セグメントは標的核酸の３°端に存在する。標的に対 するプローブのハイブリッド形成後、両者を鎖伸長反応において伸長し、その後 、ＲＮ　Ａを消化し、更に、標的の鎖伸長において標的に対して添加されるレプ リカーゼ増幅可能ＤＮＡで増幅を行う。この図おいて説明されるように、増幅さ れた産物を検出することができる。
図７は、リポータ−分子の標的核酸セグメント特異的増幅についての本発明の他 の態様を説明する概略図である。図７において説明される方法においては、Ａ、 Ｂ、及びＣと表示される３種類のプローブを使用する。プローブＡ及びＢはレプ リカーゼ増幅可能セグメントを有さない。プローブＣはＲＮＡであり、レプリカ ーゼ増幅可能セグメントを含む。プローブＡ及びＢは、＆品成の標的セグメント から５°に位置するＡ用の標的セグメントに対してハイブリッド形成する。実際 には「標的様セグメの３′端に近接しかつその３°端からすぐ３゛の標的セグメ ントと同一の配列を有する。プローブＡ及びＢを標的に対してハイブリッド形成 させ、少なくともＢを、Ａの５′端に対して鎖伸長させる。この鎖伸長産物の鎖 を分離し、更に、プローブＣを鎖伸長させたＢに対してハイブリッド形成させ、 更に他の鎖伸長を行い、ＲＮＡを消化し、更に、Ｂの第２鎖伸長において添加さ れたレプリカーゼ増幅可能セグメントで開始するすることにより増幅を行う。こ の図おいて説明されるように、増幅された産物を検出することができる。
図８は、プラスミドｐＮＶ１−３−４の部分的な制限部位及び機能マツプ、及び 、図６に記載したような、本発明の方法において使用されるプローブを含むプラ スミドからの断片の配列を説明する。
図９（ａ）及び図９（ｂ）は、プローブの標的セグメント、及びプローブの標的 セグメントを有さない核酸（ファージΦＸ１７４　ＤＮＡ）を含む核酸（ファー ジＭｌ　３ｍｐ　１９ＤＮＡ）を用いる、本発明に記載の増幅及び検出法の結果 を表すグラフである。
図１０は、プラスミドｐＭＤＶ　Ｘｈｏｌの部分的な制限部位及び機能マツプ、 及び、プラスミドのＨｉｎｄｌｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を説明する。そのＨ ｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、そのセグメントの鎖が、ミディ変異体（ｍｉ ｄｉｖａｒｉａｎｔ）ＤＮＡでありかつＸｈｏ１部位を有する挿入セグメントを 含むセグメントを含む。
図２を含む図において説明されているプローブにおいては、直線はＮプレカーゼ 増幅可能セグメント（配列）の全体もしくは部分を示し；プローブ中の波線はア ンチ標的セグメント（Ｎプレカーゼ増幅可能セグメントの一部であることもでき る）を示し、更に、標的中の波線は標的セグメントを示し、２重線はコネクター 配列を示し；更に、塗りつぶしであるボックスはり　−ポーターセグメントを示 す。用語「セグメント」及び「配列」は、特定の配列を有するセグメントを意味 するために互換的１こ使用されている。
発明の詳細な説明 本発明は、ＱβレプリカーゼのようなＲＮＡＮプレカーゼが、２°　−デオキシ リボヌクレオチドもしくはりボヌクレオチドの代わりのその類縁体を含む複合鋳 型と共にＤＤＲＰ活性を有し、他にも、Ｎプレカーゼにより自己触媒的に複製可 能であるＲＮＡ配列を有するという、意外なかつ予期せぬ発見に依存する。本明 細書中に上述しであるように、本発明は、核酸セグメント増幅、標的核酸検出、 及び他の分野における本発見の数多くの実際的な応用を含む。
つまり、その態様の一つにおいて本発明は複合核酸セグメントを増幅させる方法 を含み、そのセグメントは、２°　−デオキリカーゼにより自己触媒的に複製可 能であるＲＮＡ配列を有し、この方法は、該セグメントを含むサンプルを該Ｎプ レカーゼによる自己触媒的な複製に効果的な条件に供することを含む。
「複合核酸セグメント」は先に定義しである。
ＱβレプリカーゼのようなＲＮＡＮプレカーゼによる自己触媒的な複製に効果的 な条件は、当業者により良く知られているか、あるいは、蘭単に確認できる。こ のような条件は、Ｎプレカーゼが存在する水溶液中において、Ｎプレカーゼが自 己触媒的な複製を触媒するのに活性である、ｐＨ，イオン強度、温度及びＭｇ２ ＋の濃度の条件を提供し、かつ、その上該溶液中に、ＲＮＡＮプレカーゼがこの 方法を触媒することにおいて基質として使用する４種類のりボヌクレオシド５° 　−三リン酸（本明細書中では以下、単に「リボヌクレオシド三リン酸」と称す る）を提供することを含む。このような条件の例；よ、本明細書中の以下におけ る実施例において提供される。「自己触媒的複製」は、当業者には理解されるよ うに、ＲＮＡＩこより触媒される過程であり、その過程においては、基質として ＲＮＡ鋳型を使用し、４種類のりボヌクレオシド三リン酸と共に、鋳型の配列に 対して相補的な配列を有するＲＮＡを作製する。作製されるＲ　Ｎ　Ａは、この 過程の鋳型ともなる。（ビオチン（例えば、Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　（１９８１年）７８巻、６６３３ページをツ照せよ）、イミノビオチ ン、もしくはジゴキンゲニンに結合したウラシルの５−炭素を有するｒＴＴＰも しくはＤＴＰのようなある種のりボヌクレオシド三リン酸は、自己触媒的複製に おし）で、４種類の標準リボヌクレオシド三リン酸共に用いることができる。） 通常、本発明に記載のＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型においては、１ ０ヌクレオチド中１より少なし）ものが２′−デオキシリボヌクレオチド類縁体 もしくはりボヌクレオチド類縁体である。更に、複合鋳型上でＤＤＲＰ活性及び ＤＤＲＰ活性から結果として生じるポリヌクレオチドの自己触媒的複製を行う場 合、通常では、自己触媒的復製の産物中への取り込みのためにＮプレカーゼに用 の、約１０モル％より少な１，１基質が、リボヌクレオシド三リン酸の類縁体で あり、より典型的↓こ番よ、そのような類縁体は、４種類のりボヌクレオシド三 ＩＪン酸の内の唯１種類のみであり、かつ、約１０モル％より少な０その特定の りボヌクレオシド三リン酸が存在する。２°　−デオキシリボヌクレオチド及び リボヌクレオチドのみがＤＤＲＰ活性のための鋳型中に存在し、かつ、リボヌク レオシド三リン酸のみをＤＤＲＰ活性及び自己触媒的複製のための基質として使 用することが好ましい。
先に示したように、Ｍｎ　、Ｃｏ　、もしくはＺｎ＋２のよう＋２＋２ な２価遷移金属イオンもまた、本発明に記載のＤＤＲＰ活性（こよる増幅が行わ れる反応培地において役立つべく存在されてもよい。Ｎプレカーゼ活性に明らか に必要であるこれらのイオン、＋２ 並びにＭｇ　は、任意の塩として提供され、その塩は、所望の金属イオン濃度を 達成させるのにその溶液にお０て充分可溶性であり、かつ、その塩のアニオンが Ｎプレカーゼを失活させない。適切な塩は当業者には知られており、更に、ｌＸ ロゲン化塩（例えば、塩化物、臭化物）、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及びその類 のものを含む。
他の態様においては、本発明は、標的依存的方法への本発明の増幅方法を適用す ることを含む。そのため、発明は、核酸を含むサンプルを処理してリポータ−Ｒ ＮＡを作製する方法を含み、このＲＮＡは、サンプルが予め選択された標的核酸 セグメントを含む場合にのみ、ＲＮＡＮプレカーゼにより自己触媒的に複製可能 となり、この方法は、（ａ）核酸サンプルの第１アリコートを１種類以上の核酸 プローブで処理し、このプローブの各々は、標的セグメントのサブセグメントも しくは標的セグメントのサブセグメントの相補体に対してハイブリッド形成する ことができ、唯し、プローブのうちの少なくとも１種類が標的セグメントのサブ セグメントに対してハイブリッド形成することができ、かつ、（ｉ）この方法に おいて１種類のプローブを使用する場合には、該プローブを、２°　−デオキシ リボヌクレオチドもしくはその類縁体を含みかつリポータ−ＲＮＡ配列もしくは リポータ−ＲＮＡの相補体を有する複合核酸セグメントを作製するために処理し 又は処理可能であり、あるいは、（ｉ　ｉ）この方法において１種類より多いプ ローブを利用する場合には、該プローブを、２゛　−デオキシリボヌクレオチド もしくはその類縁体を含みかつレポータＲＮＡ配列もしくはレポータＲＮＡ相補 体を有する複合もしくは破壊された複合核酸セグメントを作製するために処理す ることができ；　（ｂ）該プローブもしくは複数のプローブを含む該第１アリコ ートを処理して第２アリコートを調製し、この茶２分注中では、（１）唯一のプ ローブの一部としてそれが提供されない場合には、２′　−デオキシリボヌクレ オチドもしくはその類縁体を含みかつリポータ−ＲＮＡ配列もしくはリポータ− ＲＮＡ相補体を有する該複合もしくは破壊された複合核酸セグメントが作製され 、更に、標的セグメントがサンプル中に存在する場合にのみ、それが、段階（ｃ ）の点で重要な量残存し、かつ、（ｉｆ）段階（ｂ）（ｉ）に記載の残存してい る該複合もしくは破壊された複合核酸セグメント以外のものであり、かつ、リポ ータ−ＲＮＡ配列もしくはリポータ−ＲＮＡ相補体を有する任意の核酸セグメン トの量は、段階（Ｃ）の点で重要でない量にまで低減され；かつ（Ｃ）第２アリ コートもしくは該第２アリコートより取りわけた第３アリコートを、該Ｎプレカ ーゼの存在下における自己触媒的複製に有効な条件に供する、ことを含む。
発明の本標的依存性増幅法の数々の異なる実施態様は、本明細書中のどこかに記 載されている。この方法は、レブリカーゼのＤＤＲＰ活性を通してのリポータ− ＲＮＡ　（もしくはその相補体）の産生を必要とする。ＤＤＲＰ活性により作製 されるＲＮＡ（もしくはりボヌクレオチド類縁体を含むＲＮ　Ａ　）は自己触媒 的に複製されるため、ＤＤＫＰ活性のための鋳型である複合セグメントの配列に 相補的な配列を有するＲＮＡか、そのＲＮＡの相補体のいずれかになるように、 「リポータ−ＲＮＡＪを任意に選択することができる。核酸サンプルのアリコー トに適用した増幅方法はある程度は識別できるものであるが、それが標的依存性 であることを保証するためには、この方法において利用される任意のプローブで あり、（ｉ）リポータ−ＲＮＡ　。
の配列もしくはその相補体の配列を有し、かつ、レプリカーゼ用の鋳型であるセ グメントを含み（例えば、このようなセグメントを有するＲ　Ｎ　Ａプローブ） 、（ｉ　１）ＤＤＲＰ活性に依存する増幅が行われるアリコート中に残存し、か つ、（ｉｉｉ）そのアリコートにおける存在が標的セグメントの存在に依存しな い、上記プローブが、その増幅法が行われる以前に有意でないレベル（例えば濃 度）にまで低減され、２°　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を 含みかつリポータ−ＲＮＡの配列（もしくはその相補体）を有する複合セグメン トにおいて行われる増幅方法を与えねばならない。「有意でない（ｉｎｓｉｇｎ ｉｆｉｃａｎｔ）Ｊレベルは、増幅法の持続性及びリポータ−ＲＮＡ及びその相 補体の自己触媒的複製の速度、及び、ＤＤＲＰ活性の鋳型である複合セグメント を使用するＤＲＰ活性を含む、その増幅過程の詳細に依存して変化する。
標的セグメントを有さないことが知られているサンプルでこの過程を行う場合に 、リポータ−ＲＮＡの測定可能量（つまり、バックグラウンド値以上の検出可能 量）が結果として生じなければ、レベルは「有意でない」。もちろん、このレベ ルはゼロであることが好ましい。一般的には、このレベル、及び任意の場合にお ける明らかに「有意でない」レベルは、本明細書中のどこかに記載しであるよう に簡単に達成できる。
「自己触媒的複製に有効な条件」は、ＤＤＲＰ活性により作製されるリポータ− ＲＮＡの実賀的な速度、かつ、そのような活性により始めに提供されるリポータ −ＲＮＡの自己触媒的複製における分解を含む条件が効果を有さないことを必要 とする。
そのため、本発明の標的依存性増幅方法の段階（ｃ）において、リポータ−ＲＮ Ａの問題の分解を生じることがあるレベルでリボヌクレアーゼが存在する場合、 リボヌクレアーゼ阻害剤を使用してこのような分解を遮断しなければならない。
段階（ｂ）において、リポータ−ＲＮＡもしくはその相補物の合成のための鋳型 であるが２°　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含む複合セグ メントでないプローブを分解するために１種類以上のりボヌクレアーゼを使用す る場合、このような阻害剤はこの方法の段階（Ｃ）において使用することができ る。
典型的には、各々がＤＮＡもしくはＲＮＡである１、２もしくは３種類のプロー ブを、各標的セグメントについて、本発明の標的依存性増幅方法において使用す る。ＤＮＡであるかあるいは２゛　−リボヌクレオチドもしくはその類縁体を含 む複合基質である１種類のプローブを使用する場合には、このような基質が作製 される必要はないが、当業者に良くしられる方法によりプローブでサンプルを処 理し、そのため、標的セグメントが存在する場合にのみ、プローブが有意なレベ ル（例えば濃度）で残存する。「有意な」レベルによって、ＤＤＲＰ活性及びこ の方法の段階（Ｃ）における自己触媒的複製を通しての増幅方法の詳細が示され 、観察できる（「バックグラウンド」値以上の検出可能な）リポータ−ＲＮＡの 量を産生ずるレベルを意味する。単一のＲＮＡプローブもしくは１種類より多い プローブを使用する場合には、本明細書中のどこかに、より詳しく記載しである ように、追加的な処理が必要であり、標的セグメントが存在しかつＲＮＡプロー ブ（もしあれば）を有意でないレベルにまで低減される場合にのみ、２′　−デ オキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含む複合セグメントを含みかつＮ プレカーゼのＤＤＲＰ活性の基質である複合セグメントを作製し、かつ、そのセ グメントを有意なレベルで残存させる。
更に別の態様においては、本発明は、標的核酸被検体の存在についてサンプルを アッセイする方法を含み、その方法は、リポータ−核酸（もしくはその相補物） の配列を有する核酸の存在についてのサンプルのアッセイの前に、サンプルでリ ポータ−核酸の、本発明に記載の標的核酸媒介増幅を行うことを含む。
この「リポータ−核酸」は、一般的にはリポータ−ＲＮＡである。
このように、発明は、該標的核酸を含むように考慮されたテストサンプル中にお いて予め選択された標的セグメントを含む標的核酸被検体の存在の検出の方法を 含み、該方法は、核酸の−該サンプルを処理してリポータ−ＲＮ　Ａを作製する ことを含み、そのサンプルが該予め選択された標的セグメントを含む場合にのみ 、そのリポータ−ＲＮＡはＲＮＡＮプレカーゼにより自己触媒的に複製し、かつ 、その方法は、そのように作製される任意のリポータ−ＲＮＡをアッセイするこ とを含み、該処理は、（ａ）核酸のサンプルの第１アリコートをＩＮ類以上の核 酸プローブで処理し、このプローブの各々は、標的セグメントのサブセグメント もしくは標的セグメントのサブセグメントの相補物に対してハイブリッド形成す ることができ、但し、プローブのうちの少なくとも１種類が標的セグメントのサ ブセグメントに対してハイブリッド形成することができ、かつ、（ｉ）この方法 において１種類のプローブを使用する場合には、複合核酸セグメントが２°　− デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含み、かつ、リポータ−ＲＮＡ の配列もしくはリポータ−ＲＮＡの相補物を有し、あるいは、（ｉｉ）この方法 において１種類より多いプローブを利用する場合には、該プローブを、２′　− デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含みかつリポータ−ＲＮＡの配 列もしくはリポータ−ＲＮＡの相補物を有する複合もしくは破壊された複合核酸 セグメントを作製するように処理することができ、（ｂ）該プローブもしくは複 数のプローブを含む該第１アリコートを処理して第２アリコートを調製し、この 第２アリコート中では、（ｉ）唯一のプローブの一部としてそれが提供されない 場合には、２゛　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含みかつリ ポータ−ＲＮＡの配列もしくはリポータ−ＲＮＡの相補物を有する該複合もしく は破壊された複合核酸セグメントが作製され、更に、標的セグメントがサンプル 中に存在する場合にのみ、それが、段階（Ｃ）を考慮した場合有意な量残存し、 かつ、（ｉ　ｉ）段階（ｂ）（ｉ）に記載の残存している該複合もしくは破壊さ れた複合核酸セグメント以外のものであり、かつ、リポータ−ＲＮＡの配列もし くはリポータ−ＲＮＡの相補物を有する任意の核酸セグメントの量は、段階（Ｃ ）を考慮した場合有意でない量にまで低減され；かつ（ｃ）　東２アリコートも しくは該第２アリコートより取りわけた第３アリコートを、該Ｎプレカーゼの存 在下における自己触媒的復製に有効な条件に供する、ことを含む。
任意の数々の方法を、リポータ−ＲＮＡ　（もしくはその相補物）をアッセイす るために使用することができる。もし作製されるのであらば、大量のリポータ− ＲＮＡとその相補物が増幅後に存在する大量の核酸の実質的な画分である状況に おいては、核酸染色用染料を増幅が行われたサンプルのアリコートに単純に添加 することができ、更に、染色物が出現したか否かを観察するためにそのアリコー トを可視化させることができる。標的核酸が存在してリポータ−ＲＮＡの産生を 誘導する場合にのみ染色物が出現しかつ観察される。この単純な染色用技術を適 用することができる状況は、増幅後、染色されたリポータ−ＲＮＡとその相補物 がサンプルのアリコートにおいて可視化でき、かつ、大量のこのような染色され たリポータ−ＲＮＡとその相補物が、増幅後のサンプル中に存在する少なくとも 約２種′類の大量の他の核酸の因子を越える状況を含む。
この増幅方法において形成されるリポータ−ＲＮＡとその相補物の量があまりに 低すぎて標的核酸がサンプル中に存在するか否かを検出するために使用すべき単 純な染色法が不可能である状況において、あるいは、リポータ−以外の分子が増 幅される場合には、サンプルアリコートの核酸を、増幅方法をそのサンプルで行 った後、例えば、電気泳動的にサイズにより分離し、その後染色することができ る。サイズ分離した核酸中のそのサイズの染色された核酸を観察することにより 検出される増幅方法におけるリポータ−ＲＮＡ及びその相補物のサイズの核酸の 産生により、標的核酸が、分析される核酸のサンプル中に存在していたことが示 される。
もう一つの方法として、分析されるサンプル中に標的被検体が存在する場合に増 幅過程中に作製されるリポータ−ＲＮＡとその相補物を、増幅の間にラベルする ことができ、それは例えば、Ｎブレカーゼの基質として使用されるｒＮＴＰ’　 とｒＮＴＰ’　ｓある種の３２Ｐでラベルしたりボヌクレオシド三リン酸もしく はある種のりボヌクレオシド三リン酸類縁体を使用することによるものであり、 これらの物質においては、塩基がラベル化残基で修飾されており（例えば、ビオ チン、イミノビオチン、もしくはジゴキシゲニンのようなラベル化残基に対して リンカ−を介して結合されることによりウラシルの５位の炭素にラベル化されて いるＵＴＰ）　、更にその後、もし作製されるのであれば、ラベル化されたリポ ータ−ＲＮＡ及びその相補物を、当業者において理解されるようなラベルを介し て検出することができる。この検出過程の前に、ラベル化されたリポータ−及び その相補体（もしあれば）を、増幅の過程の間にＲＮＡ中に取り込まれないラベ ル化されたりボヌクレオシド三リン酸から分離する必要があり、それは例えば、 クロマトグラフ的に、リポータ−ＲＮ　Ａとその相補物のラテックスビーズもし くは磁性粒子に対するハイブリッド形成により行われ、それらの物質に対しては 、リポータもしくはその相補物のセグメントの配列に対して相補的な配列を有す る一本鎖の核酸が共有結合する。
リポータ−ＲＮＡとその相補物の産生のための更に別のアッセイ方法は、それら のいずれかについての核酸プローブの！−イブリッド形成アッセイによる。これ らのアッセイにおいては、検出のためにラベル化し、かつ、リポータ−ＲＮＡと その相補物に対してハイブリッド形成をすることが可能な核酸を、当業者に理解 されるように、使用する。
最終的には、標的被検体がアッセイされるサンプル中に存在する場合には、増幅 過程におけるリポータ−ＲＮＡとその相補物の合成により増幅が行われる溶液中 におけるこのような化合物の濃度を監視して増幅が行われたか否かを検出するこ とができる。簡単にその消費量が監視できるこのような化合物の一つはＡＴＰで あり、このような監視を、当業者に理解されるように、例えば、Ｐ、ビラリス（ Ｐ、ｐｙｒａ　Ｉ　ｉｓ）のような甲虫からのルシフェラーゼにより触媒される バイオルミネセンスを測定することにより行うことができる。
発明は、本発明の様々な方法、特には、標的依存性増幅法及び核酸被検体を検出 するための方法を行うためのキットをも含む。
このように、本発明は、リポータ−ＲＮＡの予め選択された標的セグメントを含 む核酸のサンプル中における核酸の存在に依存する増幅のためのキットを含み、 そのリポータ−ＲＮＡはＲＮＡＮプレカーゼにより自己触媒的に複製可能であり 、該キットは、Ｎプレカーゼを保持している容器及び１種類以上のプローブを保 持している容器；リポータ−ＲＮＡが自己触媒的な複製のための鋳型となるＲＮ ＡＮプレカーゼを含む（もしくはこのような溶液から作製された凍結乾燥しであ るＲＮＡＮブレカーゼを保持する）Ｎプレカーゼ溶液を保持する該Ｎプレカーゼ 保持容器；及び、該増幅のために必要とされる核酸プローブ（もしくは凍結乾燥 した型の該プローブ）（「要求プローブ（ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｐｒｏｂｅｓ）Ｊ ）の１種類以上を含むプローブ溶液を保持する、１種類の場合には、該レプリカ ーゼ保持容器、あるいは、１覆類より多い場合には、該レプリカーゼ保持容器の 各々、を共にパッケージングされて含み、但し、キットが含む１種類以上のプロ ーブ保持用容器内に該要求プローブの全てが保持されていることを提供し、該要 求プローブ、あるいは、１種類より多い場合には、該要求プローブの各々が、標 的セグメントのサブセグメントもしくは標的セグメントのサブセグメントの相補 物に対してハイブリッド形成することができ、但し、（ｉ）少なくとも１種類の プローブが、標的セグメントのサブセグメントに対してハイブリッド形成するこ とができ；　（ｉ　ｉ）１種類の要求プローブが存在する場合には、該プローブ は、２°　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁一体を含みかつリポー タＲＮＡもしくはリポータＲＮＡの相補物を有する複合核酸セグメントセグメン トを作製するように処理するかまたは処理することができ；（ｉｉｉ）１種項よ り多い要求プローブが存在する場合には、該プローブを、２゛　−デオキシリボ ヌクレオチドもしくはその類縁体を含みかつリポータＲＮＡもしくはリポータＲ ＮＡの相補物を有する複合もしくは破壊された複合核酸セグメントを作成するよ うに処理できる。
レプリカーゼ保持容器及び１種類以上のプローブ保持容器でパッケージングされ ている本発明のこれらのキットは、追加的に１種類以上の酵素保持容器を含んで おり、その各々は、２′　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含 みかつリポータＲＮＡもしくはリポータＲＮＡの相補物の配列を育する複合もし くは破壊された複合核酸セグメントを作製するために必要なプローブの任意の処 理において使用される１種類以上の溶液を保持する。（この酵素保持容器は凍結 乾燥された携帯の酵素を保持していてもよい。） 本発明のこれらのキットは、予め選択された標的セグメントを含む標的核酸被検 体の存在を、該被検体を含むと考えられるテストサンプル中において検出するた めのテストキットであることができる。このようなテストキットは、追加的に、 テストサンプルのアリコートについてそのキットの成分を用いて行う増幅におい て、該サンプルが該被検体を含む場合に作製されるリポータ−ＲＮＡもしくはそ の相補物を検出するための試薬を含む。このテストキット中では、そのような試 薬は、レプリカーゼ保持容器、プローブ保持容器、及び任意の酵素保持容器と共 にパッケージングされている検出試薬保持容器内に保持されている。テストキッ ト中に含まれることができるこのような試薬は、例えば、核酸を染色するための 染料溶液、検出のためにラベルされておりかつリポータ−ＲＮ　Ａもしくはその 相補物とハイブリッド形成することができる核酸プローブの溶液、もしくは、甲 虫ルンフエラーゼの溶液を含む。（このプローブ及びルンフェラーゼは、例えば 、検出試薬保持容器内における凍結乾燥形態で提供されることもできる。）本発 明は、被検体対するラベル化された親和性分子をも含むことができ、該親和性分 子は、２°　−デオキシリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含みかつそれ自 身の配列として自己触媒的に複製可能なＲＮＡの配列を有する複合核酸セグメン トを含む核酸でラベル化しである。
「自己触媒的複製」及び「自己触媒的に複製可能である」は、当業者に知られて いる用語である。例えば、Ｃｈｕら、ＰＣＴ公開公報　東　Ｗｏ　８７１０６２ ７０号、及び、その中に引用しである引用文献ＨＫｒａｍｅｒら、米国特許　第 ４．７８６．６００号を膠原せよ。自己触媒的に複製可能な鋳型ＲＮＡの濃度が 自己触媒的な復製を触媒化するレプリカーゼの濃度を越えない条件下においては 、この過程は指数関数的なものである。
本発明の目的のためには、用語「コネクター配列」もしくは「コネクターセグメ ント」は、増幅可能なセグメントの全体もしくはその一部ではなくかつアンチ標 的セグメントではないが、むしろプローブ中でこれらのセグメントの２種類を結 合するセグメントである核酸セグメントを意味することを意図する。
本明細書中で用いられている用語「標的核酸」は、本発明に記載の標的依存性増 幅を開始させるための、もしくは、核酸を含みかつ核酸被検体を含むことが疑わ れるサンプル中において検出されるべき、特異的核酸被検体を意味する。標的核 酸は、本発明の処理において本発明のプローブがノ＼イブリッド形成する「標的 セグメント」を含む。
本明細書中に使用されている用語「アンチ標的核酸配列」、「アンチ標的配列」 、「アンチ標的」もしくは「アンチ標的セグメント」は、本発明の処理において プローブをハイブリッド形成させようと意図する核酸セグメント（「標的セグメ ント」）の（塩基の）配列に対して少なくとも部分的に（更に、好ましくは完全 に）相補的である（塩基の）配列を宵する核酸プローブのセグメントを意味する ことを意図する。アンチ標的セグメントとそれらの対応する標的セグメントとの 間のハイブリッド形成が、本発明の方法における標的核酸についての特異性を提 供する。
本発明の方法を行うに当たり、意図された特異性を有するノーイブリッド形成を 実施するためには、一般的に、アンチ標的セグメントが少なくとも６つの、更に 、好ましくは少なくとも１２の、そして、より好ましくは約２０から約３５のヌ クレオチドを有することが必要である。ノーイブリッド形成の特異性に影響を与 える因子は当業者により良く理解されており、かつ、ノーイブリッド形成用セグ メントの長さに加え、／１イブリッド形成が行われる核酸の混合物の複雑度及び ７Ｘイブリツド形成が行われる時の厳格度を含む。所与の複雑度の核酸の混合物 について−は、当業者は、アンチ標的セグメントの長さ、厳格度、及び、必要と される特異性を獲得するための標的セグメントの配列の選択、を操作することが できる。
本明細書中に用いられている用語「プローブ」もしくは「核酸プローブ」は、Ｄ ＮＡ、ＲＮＡ、もしくは、キメラ核酸であり、かつ、アンチ標的セグメントを含 む核酸を意味する。プローブは、自動的な合成器中における場合のように合成的 に作成することができ、あるいは、細胞性もしくはウィルス性置換物質に由来す ることができる。それは１本鎖であることができるが、その相補的な鎖（もしく はそのセグメント）を伴うことができる。プローブは、アンチ標的セグメントを 含まなければならないが、しかしながら、先に示したように、本発明のいくつか の実施態様においては、プローブを、標的核酸のセグメントに対して配列の面で 相補的であるセグメントに対してハイブリッド形成させることを意図して使用す ることができ；このようなプローブのアンチ標的セグメントは「標的様」セグメ ントであり、かつ、そのようなものとして、標的核酸のセグメントと同一もしく はほぼ同一の配列を有する。
本明細書中に用いられている用語「リポータ−分子」もしくは「リポータ−核酸 」は、サンプル中の標的核酸の存在に依存する本発明の増幅方法において産生さ れる核酸を意味することを意図している。「リポータ−ＲＮＡｊは、４種類の標 準的なりボヌクレオチド（リボヌクレオチドにおいて正常に生ずる元素をラベル 化していないもしくは放射性同位体元素（例えば、３２Ｐ）でラベル化しである ）を含むことができ、あるいは、本明細書中のどこかに記載したように、自己触 媒的な複製におけるＲ　Ｎ　ＡＮブレカーゼ用の基質として機能し、かつ、ＲＮ ＡＮブレカーゼによる自己触媒的復製のための鋳型の配列を有するＲＮＡ中に存 在する場合には、Ｎプレカーゼが鋳型を複製することを遮断しない様々なりボヌ クレオチド類縁体を含むことができる。
「リポータ−核酸の増幅」は、（ｉ）２°　−デオキシリボヌクレオチドもしく はその類縁体を含む複合リポータ−セグメントのＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性に よる、完全にＲＮＡであり（あるいは、リボヌクレオチド類縁体（例えば、ウラ シルの５位を介してビオチン残基に結合しているウラジン）を含むことができ、 その５°　−三リン酸はＮプレカーゼのための基質であり、かつ、それはＲＮＡ 内において、Ｎプレカーゼによる自己触媒的な複製のための鋳型としてのＲＮＡ の機能を遮断しな０）、かつ、Ｎプレカーゼによる自己触媒的な複製及びその後 の該自己触媒的に複製可能なリポータ−の自己触媒的な複製ののための鋳型であ る相補的な配列の他のリポータ−への複製、あるいは、（１１）単に、ＲＮＡも しくは記載したようなりボヌクレオチド類縁体を含むＲＮ　Ａである自己触媒的 に複製可能なリポータ−の自己触媒的な複製、のいずれかを意味することができ る。
リポータ−分子の存在もしくは不在、あるいは、産生される量、のいずれかを、 サンプル中の標的被検体の存在（もしくは、それぞれ不在）の標識として使用す ることができる。「リポータ−分子」は「リポータ−配列」を有し、それによっ てリポータ−分子を検出することができ、かつ、それは完全な分子もしくはその セグメントの配列であることができる。
核酸もしくはそのセグメントの「増幅」は、増幅される核酸（もしくはセグメン ト）と同一の配列を有する核酸の多重コピーを作製する過程を意味する。本明細 書中で使用されている用語「セグメント特異的増幅」もしくは「標的特異的増幅 」は、各標的核酸分子（もしくは、より正確には、標的核酸の特有な性質を有す るとして選択された標的セグメント）を使用して多重リポータ−分子を産生させ るレプリカーゼ介在性過程を意味することを意図する。
用語［増幅可能セグメント」、「増幅可能配列」もしくは「増幅可能核酸配列」 は、ＲＮＡＮプレカーゼにより増幅可能もしくは自己触媒的に複製可能な核酸の セグメントもしくは配列を意味することを意図する。そのため、時として「Ｎプ レカーゼ増幅可能な」セグメントもしくは配列が引用されることもある。
核１１！鎖の「セグメント」は、核酸鎖中に存在する場合少なくとも２つのヌク オチド（もしくはヌクレオチド類縁体）の連続的な配列を有する完全な核酸鎖も しくはその任意の部分である。
核酸鎖のセグメントの「サブセグメント」は、核酸鎖中に存在する場合少なくと も２つのヌクオチド（もしくはヌクレオチド類似体）の連続的な配列を有する完 全なセグメントもしくはその任意の部分である。
サンプルの「アリコート」もしくは、より典型的には、水溶液は、全体としての サンプルもしくは溶液の本質的な特性から識別できない本質的な特性（例えば、 組成、構成物の濃度）を　−有するサンプルもしくは溶液の全体もしくは部分で ある。
本発明の基礎となる発見は、２゛　−デオキシリボヌクレオチドもしくはそのア ナログを含むが、ＲＮＡのＮプレカーゼにより触媒される合成のために鋳型とし て機能するＲＮＡＮプレカーゼのための増幅可能な複合配列を有し、相補的であ り、増幅可能でもある配列を有し、かつ、そのために、自己触媒的に複製可能で ある核酸である。このように、意外なことにかつ有利なことに、２“　−デオキ シリボヌクレオチドもしくはその類縁体を含みかつ増幅可能な配列を有する複合 セグメントを、自己触媒的に復製可能なＲＮＡを作製しかつそれにより自己触媒 的な複製の過程を開始させるために使用することができる。
ＲＮ　Ａである核酸に関する本明細書中の引用により、４種類の標準的なりボヌ クレオチド、アデノシン−リン酸（Ａもしくはｒ　Ａ　）　、ウリジン−リン酸 （Ｕ）、グアノシン−リン酸（ＧもしくはｒＧ）及びシチジン−リン酸（Ｃもし くはｒＣ）の１種類以上のみからなる核酸を意味する。さらに限定をを加えない 場合に、「リボヌクレオチド」に関する本明細書中の引用によっては、４種類の 標準的なりボヌクレオチドを意味する。
ＤＮＡである核酸に関する本明細書中の引用により、４種類の標準的な２°−デ オキシリボヌクレオチド、つまり、２°　−デオキシアデノシン−リン酸（Ａも しくはｄＡ）　、２’　−デオキシチミジン−リン酸（Ｔ）　、２°　−デオキ シグアノシンーリン酸（ＧもしくはｄＧ）及び２“　−デオキシシチジン−リン 酸（ＣもしくはｄＣ）の１種類以上のみからなる核酸を意味する。
さらに限定を加えない場合には、「ヌクレオチド」は、２′　−デオキシリボヌ クレオチド、２′　−デオキシリボヌクレオチド類縁体、リボヌクレオチドもし くはりボヌクレオチド類縁体を意味する。さらに限定を加えない場合には、「核 酸」は、２本鎖もしくは１本鎖のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド を意味する。「キメラ」核酸は、ヌクレオチドの幾つかがりボヌクレオチドもし くはりボヌクレオチド類縁体であり、かつ、幾つかが２゛　−デオキシリボヌク レオチドもしくは２°　−デオキシリボヌクレオチド類縁体である一本鎖の核酸 である。
「非類縁体」キメラ核酸は、リボヌクレオチド及び２“　−デオキシリボヌクレ オチドからなるキメラ核酸であり、そのようなものとしていずれのものの類縁体 を含まないものである。「ハイブリッド」核酸は、鎖のうちの一つがＤＮＡであ りもう一方のがＲＮＡもしくはキメラ体であり、あるいは、鎖の一つがＲＮＡで ありもう一方がＤＮＡもしくはキメラ体であり、あるいは、鎖の両方がキメラ体 である、二本鎖、もしくは部分的に二本鎖の核酸である。核酸の５′端の「ヌク レオチド」は、単一の５゛−リン酸を有する必要はなく；それは、例えば、５′ −三リン酸もしくは５°　−ヒドロキシルを有することができる。
同様に、核酸の３”端の「ヌクレオチド」は、３゛　−ヒドロキシルを有する必 要はなく：それは、例えば、３′　−リン酸を有することができる。
本発明に記載のＲＮ　ＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性による増幅のための複合核 酸鋳型中に含まれていてもよい２゛　−デオキシリボヌクレオチド類縁体は上述 しである。このような２°　−デオキシリボヌクレオチド類縁体は「（２′　− デオキシリボヌクレオチド）ホスフェート類似体であり、これにより、対応する ２′　−デオキシリボヌクレオチドのホスフェートが、アルキルホスホネート（ アルキル基が、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、もしくは、ｉ−プロピ ルであることができる）、フォスフをロチオエート、フォスフオトリエステル、 もしくはフォスフをロアミデートのようなホスフェート類縁体で置換されている 類縁体を意味する。このように、本発明に記載のＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ 活性のための複合鋳型中に生じることができる２゛−デオキシリボヌクレオチド は、２′　−デオキシリボアルキルホ力ホネート（Ｂｌａｋｅ他、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　（１９８５年）　２４巻、６１３９ページ、を膠原せよ）、２′ 　−デオキシリボフォスフｆロチオエート（ＦｒｏｅｈｌｅｒＳＴｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎＬｅｔｔ、（１９８６年）　２７巻、５５７５ページ、を；照せよ）、 ２°　−デオキシリボフオスフオトリエステル（Ｂ　Ｉ　ａｃｋｂｕ　ｒ　ｔ　 ｎ他、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。
（ｃ）　（１９６６年）、２３９ページ、を参照せよ）、及び、２°　−デオキ シリボフォスフをロアミデート（Ｚｗｉｅｒｚａｋ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（１ ９７５年）、５０７ページ、を参照せよ）を含む。
「リボヌクレオチド類縁体」は、炭素もしくはアミノ窒素において塩基が誘導化 されているかあるいはホスフェート類縁体でホスフェートが置換されているリボ ヌクレオチドである（（リボヌクレオチド）ホスフェート類縁体）。ＲＮＡＮプ レカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型である複合セグメント中もしくはこのよう な活性に基づくこのような複合セグメントから′作製されるポリヌクレオチド中 のりボヌクレオチド類縁体は、このような、ポリヌクレオチドの複合セグメント 中においてＮプレカーゼにより認識されて、複合セグメントもしくはポリヌクレ オチドから作製される自己触媒的に複製可能なＲＮＡの対応位置に、類縁体のり ボヌクレオチドに対して相補的なりボヌクレオチドである、塩基を有するリボヌ クレオチドを配置する。
リボヌクレオチド類縁体にはｒＴ、及び、５位の炭素においてウラシルが誘導化 されている（例えば、ビオチンにリンカ−を介して）Ｕの他の誘導体、及び、２ °　−デオキシリボヌクレオチドのホスフェート類縁体に対応する様々なホスフ ェート類縁体（先の２°　−デオキシリボヌクレオチドホスフェート類縁体のリ ストを参照せよ）が含まれる。
原子の様々な同位体のパーセント率が変わることにより変化している２°−デオ キシリボヌクレオチド、２′　−デオキシリボヌクレオシド５′　−三リン酸（ 本明細書中では以後単に１２′−デオキシリボヌクレオシド三リン酸と称する） 、リボヌクレオチド、もしくは、リボヌクレオシド三リン酸は、「類縁体」とみ なさない。
用語「増幅可能なプローブ」は、プローブの性質を有しかつ増幅可能なセグメン トを有する核酸を意味することを意図する。
本発明において使用される述語に従い、２種類の一本鎖の標準的な核酸は、その 両者がキメラであるか、あるいはそれらの一方がＲＮＡで他の一方がＤ　Ｎ　Ａ もしくはキメラであるか、あるいはそれらの一方がＤＮＡで他の一方がＲＮＡか キメラであるとしても、両者が同一数のヌクレオチドを有しかつそのヌクレオチ ド上の塩基配列が両者とも同一であるかぎり、「同一な」配列を有することにな る。２種類の核酸配列が「同一」であるか否かを決定する目的で、その原子（リ ボースに結合する窒素原子以外）の一つが誘導化されている塩基を、誘導化され ていない塩基と同一であると見なす。従って、例えば、ＲＮＡとＤＮＡは、それ らが同一数の塩基を有しかつ塩基の配列が両者とも同一である場合には、ＲＮＡ 中の各ウラシルがＤＮＡ中のチミジンに対応して、同一の配列を有することにな る。
増幅に関する用語「サイレント配列」もしくは「サイレントセグメント」は、東 １核酸中においは増幅可能でないが、第１核酸で作製される第２核酸中において は他のセグメントと組合わせて増幅可能セグメントの一部となる核酸セグメント を意味することを意図する。
本明細書中に使用されている用語「Ｑβレプリカーゼもしくは機能的等個物」は 、一定のＲＮＡの自己触媒的複製、並びに、本発明の基礎となる発見に従い、鋳 型ＤＮＡ及びＮプレカーゼにより自己触媒的に複製可能なＲＮ　Ａの配列を有す るキメラ核酸を使用するＲＮＡの合成を触媒するＲＮＡＮプレカーゼを意味する ことを意図する。そのようなＮプレカーゼの例として、Ｇｉｎｇｅｒａｓらに対 する特許公開公報　第　Ｗｏ　８８／１０３１５号、Ｃｈｕらに対するＰＣＴ公 開公報　東ＷＯ８７１０６２７０号、Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ及びＣａｒｍｉｃｈ ａｅｌ　（１９７９年）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、４８巻、５２５−５４８ページ、及び、Ｍｉｙａｋｅら、 （１９７１年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　（ＵＳＡ）　６８巻、２０２２−２０２４ページ、並 びに、これらの出版物において引用しである引用文献を引用として挙げる。本発 明において有効なこのようなＮプレカーゼの例は、バクテリオファージ　ＦＴ、 ｆ２、ＧＡ、ＭＳ２、Ｒ１７，５Ｄ１ＳＰＳＳＴ１ＶＫ、及びＺＲのゲノムによ りコードされているＱβレプリカーゼ、並びに、ブロムモザイクウィルス（ＢＭ Ｖ）のＮプレカーゼのような植物性ＲＮＡウィルスのレブリカーゼを含む。例え ば、バクテリオファージのレブリカーゼの間でも、自己触媒的増幅のための鋳型 の相互互換性が存在する。
当業者は、Ｑβレプリカーゼ及び他のＮプレカーゼにより自己触媒的に増幅可能 な多くの種類のＲＮＡが存在することを理解している。このように、他の種類の ものの間でも、数多くのいわゆるナノ変異体（ｎａｎｏｂａｒｉａｎｔ）ＲＮＡ 及び数多くのいわゆるミディ変異体（ｍｉｄｉｖａｒｉａｎｔ）が存在する。Ｃ ｈｕ他、ＰＣＴ公開公報第　ＷＯ８７１０６２７０号及びその明細書中に引用し である引用文献を参照せよ。ＤＮＡ類、及び、２゛　−デオキシリボヌクレオチ ドもしくはその類縁体を含みかつそれらのＲＮＡの全てに対応する他の核酸セグ メントは、ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性により増幅可能である。本明細書 においては、別な方法で性質決定を行っていない場合には、ｎｖＤＮＡを特異的 ＤＮＡであると見なし、それは、即ち２本鎖ＤＮＡであって、その１本のｊｌ　 （ｎ　ｖ　（＋）　ＤＮＡと称する）が５ｃａｆｆｎｅｒ他、１９７７年、上述 、により教示されるナノ変異体（＋）ＲＮＡ−（ｎ　ｖ　（＋）ＲＮＡ）と同一 であり、かつ、ｎｖ（−）ＤＮＡと称されるもう一方の鎖が完全に相補的な配列 を有する。ｎｖ（＋）ＤＮＡ及びｎｖ（−）ＤＮＡそれぞれの配列についてはＳ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４４及びＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ＋９２８を参照せよ。他の六 ）変異体の例は、実施例３０表１において示される番号を付けた他の鋳型である 。ＱβレプリカーゼのＤＤＲＰ活性の鋳型でありかつ実施例３の表１においてリ ストしである番号を付けた鋳型の任意のものと少なくとも９０％の相同性を有す る任意の他のＤＮＡは、本明細書の意味においては「ナノ変異体ＤＮＡＪである 。同様に、別な方法で性質決定を行っていない場合には、ｍｄｖＤＮＡをＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ：２において示される配列を有する２本ｌｌＤＮＡと称するが、そ の内の１本の鎖をｍｄｖ　（＋）ＤＮＡであると見なし、その理由は、それがミ ディ変異体（＋）ＲＮＡの配列を有するからであり、かつ、相補的配列を有する 他の鎖ｍｄｖ（−）ＤＮＡと称するが、その理由は、対応するミディ変異体（− ）ＲＮＡの配列を冑するためである。ｍｄｖＤＮＡは「組換え」ミディ変異体Ｄ ＮＡであり、その理由は、制限酵素エンドヌクレアーゼを含む様々な酵素でのイ ンビトロ「遺伝子スプライシング」技術を用いて、ＲＮＡセグメント（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２における塩基６６−７５に対応する）を、自然発生的な、もしく は、その酵素による自己触媒的な複製のための天然ＲＮＡ鋳型からＱβレプリカ ーゼによる自己触媒的複製の際にインビトロで生じる、ミディ変異体ＲＮＡ内へ 挿入することにより対応するＲＮＡが作製されたためである。Ｋｒ　ａｍｅ　ｒ 他、米国特許第４．７８６，６００号を参照せよ。ｍｄｖＤＮＡの両方の鎖、及 び、ｍｄｖＤＮＡと同一であるがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２における塩基６６−７ ５に対応する塩基対を有さないＤＮＡの両方の鎖に加え、本明細書の意味におけ る他の「ミディ変異体ＤＮＡＪは、Ｎ１５ｈｉｈｕｒａ他（１９８３年）　Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９３巻、６６９−６７４ページ、により教示されるミディ変 異体−１ＲＮＡの配列を有するＤ　Ｎ　Ａ　。
Ｌｉｚａｒｄｉ他　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５巻、上述為により教示され るミディ変異体−ＩＲＮＡ、Ｋｒａｍｅ　ｒ他（１９７４年）、　Ｊ、　Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、　８９巻、７１９−７３８ページ、により教示されるミディ変異 体−１α、ミディ変異体−１β及びミディ変異体−１７、及び、それらのＤＮＡ の全ての相補体、及び、前述の「ミディ変異体Ｊ　ＤＮＡの任意のものに対して ９０％相同でありかっＱβレプリカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型である任意 のＤＮＡを含む。
口ｎｖプラスミド」は、ｎｖＤＮＡをセグメントとして含むｐＮＶ−１−３−４ のようなプラスミドを意味する。「ナノ変異体プラスミド」は、ナノ変異体ＤＮ Ａをセグメントとして含むプラスミドを意味する。ｒｍｄ　ｖプラスミド」は、 ｍｄｖＤＮＡをセグメントとして含むｐＭＤＶ　ＸｈｏＴのようなプラスミドを 意味する。「ミディ変異体プラスミド」は、ミディ変異体ＤＮＡをセグメントと して含むプラスミドを意味する。
本明細書中に使用されている用語「オリゴヌクレオチドブライマー」は、精製し た制限消化物中に自然に発生するかあるいはＤＮＡ合成器で合成的に産生される かのいずれかのものであって、核酸鋳型路に対して相補的であるプライマー伸長 産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、つまり、２°　−デオキシリボ ヌクレオチドもしくはそのある種の類縁体、及び、当業者には理解されるように 、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の存在下において、かつ、プライマーの 鋳型に対するハイブリッド形成を起こさせかつ酵素をＤＮＡ合成を触媒するため に活性化させるための、適切な温度、ｐＨ及び厳密な条件において、ＤＮＡ合成 を開始することができるプライマーを含む。
このプライマーは、１氷層型で提供されるが、代わりに２本鎖であることもでき る。２本鎖である場合には、そのプライマーを最初に処理して、伸長産物の初期 調製物に対する核酸鎖鋳型に対してハイブリッド形成する以前にその鎖を分離す る。このプライマーは、充分長く、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する酵素の存 在下において伸長産物の合成を開始させるのに充分な安定性を有する鋳型に対し てハイブリッド形成する必要がある。
このプライマーは、やはり、標的セグメント（もしくはその相補物）の３′端に 対して特異的にハイブリッド形成させることにより特異性をも提供することがで きる。プライマーの完全な長さは、温度、厳格度、及び標的配列の複雑度を含む 数々の因子に依存する。オリゴヌクレオチドブライマーは、典型的には、２０− ３５のヌクレオチドを含むが、鋳型とのハイブリッド形−成を意図したセグメン トにおいてはより少ない（約６まで）あるいはより多いヌクレオチドを含むこと ができる。短いブライ７−は、一般的には、鋳型を用いて充分に安定なハイブリ ッド複合対を形成するために低い厳格度（例えば、一定常のｐＨ。
イオン強度及び他の厳格度決定因子における低めの温度）を必要とし、更にその ため、それらがハイブリッド形成しかつ合成を開始するセグメントに関して幾分 特異性が低くなる傾向にある。
Ｎプレカーゼ酵素活性 本発明は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのようなＲＮＡＮプレカーゼを使用す る。本発明は、Ｎプレカーゼの新規の活性、即ちＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼ活性を用いる。この活性は、Ｎプレカーゼに関する口触的に複製可能なＲＮＡ の配列を有する複合体、ＤＮＡ、又はキメラ核酸基質からＲＮＡコピーを生じる 。ＲＮＡＮブレカーゼのための基質と関連して“複合体”の定義は、上記に示さ れている。ＤＤＲＰ活性により提供されるＲＮＡコピーは、同−Ｎプレカーゼ（ 又は口触的複製の鋳型としてＲＮＡを認識する別のＮプレカーゼ）によって口触 的に複製される。例えば、Ｑβレプリカーゼのための基質は、任意の増幅可能な りＮＡ、例えば、ナノ変異体ＤＮＡ、　ミディ変異体ＤＮＡ、　ミニ変異体ＤＮ Ａ、対応する口触的複製可能ＲＮＡに対する名前が指定されていないものを含め た他の変異体、又はその自勉的複製可能突然変異体であり得る。
本発明前、口触的複製可能な相補的配列のＲＮＡを作るための鋳型として複合Ｄ ＮＡ及びキメラ核酸を用いることができるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性 をＲＮＡＮプレカーゼが示すとは、認識されていなかつた。実際、複合配列を伴 うが末端ポリデオキシシチジンを有するＤＮＡはＱβレプリカーゼによる口触的 復製のための鋳型として活性でないと報告されていた（Ｆｅｉｘ、Ｇ、ａｎｄ　 Ｈ，５ａｎｏ　（１９７６）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、６３：２０１〜２０４ ）。
さらに、Ｆｅ１ｘと５ａｎｏ　（上記）は、鋳型に関して狭義に限定される彼ら が観察したＤＤＲＰ活性は、反応媒質中のＭｇ＋２をＭ　ｎ　”’に置換するこ とにより増大しなかったと報告した。しかしながら、本発明の別の態様において 、ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性を介するＤ　Ｎ　Ａ及びキメラ基質の増幅 は、Ｍｇ＋２を明らかに要するけれども、約０．５ｍＭ以上で、一般に約５　ｍ 　Ｍ以下で、好ましくは約１ｍＭでの反応媒質中の二価の遷移金属陽イオン、例 えばＭｎ、Ｃｏ＋２、又はＺｎ＋２の存＋２ 左下で増強されることが、意外にも判明した。
本明細書中で濃度又は量に関して“約”と言及しているのは、分子生物学及び生 化学の業界で当業者が用いる意味を有し、一般に特定濃度又は量＝１０％を意味 する。
鋳型 Ｑβレプリカーゼ及びその他のＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性は、Ｎプレカ ーゼにより口触的複製可能であるＲ　Ｎ　Ａの配列を有する任意の複合ＤＮＡ又 はキメラ核酸セグメントに関して活性である。本発明に関連して、Ｎプレカーゼ により口触的複製可能であるＲＮＡの配列を伴う核酸セグメントを“確認する” その能力においてＮプレカーゼは非常に多才であることが見出された。したがっ て、このような複合ＤＮＡ又はキメラセグメントは、その末端のいずれかと接合 するヌクレオチドを伴わずに、−重鎖形態で遊離し得る。あるいは、このような 複合セグメントは、ヌクレオチドを有する一重鎖であって、ＤＤＲＰ活性によっ て作られるＲ　Ｎ　Ａ中にＮプレカーゼにより複写されず、末端のいずれか又は 両方に付加される。さらに、複合セグメントは二重鎮内の一重鎖の全部又は一部 であるか、あるいはハイブリッド核酸、二重鎖が配列中で正確に相補的でない核 酸、及び一方又は両方の鎖にギャップ（一つ又はそれ以上のヌクレオチド欠失） 又は破断（切断化ホスホジエステル結合、しかしヌクレオチド欠失はない）が存 在し得る核酸を含めた部分的二重鎖核酸である。実際、−緒に共有結合する場合 にはＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型である複合セグメントを構 成する複数のセグメントは、それが核酸鎖上に、複合セグメントにおいて示され ると同じ順で、互いに隣接して（即ちその間に破断のみを有して、ギャップは伴 わない）複数のセグメントがハイブリダイズされるとすれば、−緒に共有結合し ない場合でも、このような複合セグメントとして機能する。このような複数のセ グメントを、本明細書中では“破断複合セグメント”と呼ぶ。破断複合セグメン トの“配列”は、破断複合セグメントのセグメント間の破断を密接させることに より形成される複合セグメントの配列である。破断複合セグメントを構成する複 数（好ましくは２つ）のセグメントのハイブリダイゼーションは十分安定である 必要があるため、複数のセグメントの各々は少なくとも約６個の、一般には少な くとも約１０個の塩基を、複数のセグメントがハイブリダイズする他の　−鎖の セグメントに対する配列と相補的なセグメント中に育さねばならない。破断複合 セグメントの３′　−末端での複数のセグメント、及び破断複合セグメントの５ °　−末端での複数のセグメントは、他の鎖と完全にハイブリダイズされる必要 はない；３゛　−末端の複数のセグメントの５′末端のサブセグメント、及び５ °　−末端の複数のセグメント３゛末端のサブセグメントのみが他の鎖とハイブ リダイズされる必要がある。ＲＮＡＮプレカーゼによる口触的復製のための鋳型 である一部複合セグメント又は破断複合セグメントを有するもの以外の鎖におい て、−次複合セグメント又は破断複合セグメントのセグメントに対する配列が正 確に相補的な二次複合セグメントが存在するならば、二次複合セグメントもＮプ レカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型である。−重鎖であれ、二重鎖、又は部分 的二重鎖であれ、複合セグメントが、ＲＮＡＮプレカーゼにより口触的複製可能 なＲＮＡの配列とともにＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性のた、　めの鋳型としては め込まれ且つ使用可能である核酸は、任意の物理的形態、例えば線状（−重鎖又 は二重鎖）、閉環、超螺旋等である。したがって、ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲ Ｐ活性のための鋳型である複合ＤＮＡ又は複合セグメントは、弛緩又は超螺旋プ ラスミドを含めたプラスミドのセグメントであり得る。
次いで、本発明に関連して、ＲＮＡＮプレカーゼによる増幅のための本発明の鋳 型は、前もって形成された、Ｎプレカーゼにより口触的複製可能なＲＮＡの配列 を有する複合セグメントを包含する一重鎮核酸として、あるいはＮプレカーゼに より口触的複製可能なＲＮＡの配列を有する複合又は破断複合核酸セグメントを 包含する核酸を提供するために試料中で処理されるか又は反応させ得る一つ又は それ以上の核酸として試料に対して提供され得ることが見出された。
本発明は、上記のような、当業界に既に公知の多数のものを含めた、Ｑβレプリ カーゼ又は他のＲＮ　ＡＮプレカーゼに依る口触的複製のための鋳型であるＲ　 Ｎ　Ａを確認するための簡単な、分かりやすい方法を提供する。したがって、当 業者には十分公知の方法を用いて、ＤＮＡ、最も便宜的にはプラスミド、又はク ローニングにより有意量のＤＮＡを便利に製造するのに適したその他のビヒクル が製造されるが、これらはＲＮＡＮプレカーゼにより口触的複製可能であること が公知のＲＮＡの配列を伴うセグメントを包含する。本発明に関連して見出され たように、このセグメントの両層は、Ｎプレカーゼにより増幅され、レブリカー ゼのＤＤＲＰ活性で始まる。このセグメントは次に、当業界に公知の任意の方法 により塩基を欠失し、付加し、又は変えるために、あるいは類似物、及びプラス ミドＤＮＡを本明細書に記載されているような条件下でＮプレカーゼに暴菖され た変化済セグメントと置換するために変えられ、これが、修飾セグメントのＤＮ ＡがＮプレカーゼにより口触的複製可能であるＲＮＡの配列を有する場合には、 増幅を引き起こす。増幅の検出も、本明細書に記載されているようにして実施ｊ ５得る。
例えば、以下の実施例３．４．５及び８は、Ｑβレプリカーゼによる口触的復製 可能性を保持するｎｖ　（＋）ＲＮＡ又はｎｖ（−）ＲＮＡの配列から修飾され た配列を伴うセグメントを示す。例えば、実施例３の表１及び配列一覧に関して 、鋳型６３４は塩基１５及び１６間の５″−ＧＧＡＴの挿入、塩基４５及び４６ 間のＴの挿入、塩基４８のＣからＡへの塩基の変化、並びに塩基４９及び５０間 の２４−塩基セグメントの挿入により、ｎＶ　（＋）ＤＮＡ　（鋳型４４４）と 異なる。同様に、再び実施例３の表１及び配列一覧に関して、鋳型８５１は、塩 基３７及び３８間の４８〜塩基セグメントの挿入によりｎ　Ｖ（＋）ＤＮＡ（鋳 型４４４）と異なる。同様に、ｍ　ｄ　ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａは、例えば本発明に従っ て増幅可能である付加ＤＮＡを提供するためのＸｈｏＩ部位でのＤＮＡ挿入によ り容易に修飾され得る。
標的 精製又は非精製形態で核酸を含有する任意の試料は、試料が標的を含有すると少 なくとも考えられるとすれば、本発明の標的依存工程に対して核酸標的を提供す るために用い得る。
実施例は、メツセンジャーＲＮＡ、−重鎖又は二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ１あるい はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含めたＤＮＡ又はＲＮＡ標的をともに含有する 。さらに、標的核酸セグメントは大型分子の小セグメントであり得るが、しかし 一般的には少なくとも約１０、及びさらに一般的には２０〜５０ヌクレオチド長 である。さらに、標的核酸は複数の標的核酸セグメントを有するが、これらは同 一であっても異なってもよい。
オリゴヌクレオチド 本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はキメラオリゴヌクレオチドの合成的製造方法を 包含する。これに関しては、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅ １３８０Ｂ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　ＵｓｅｒｓＭａｕａｌ、Ｖｅｒ ｓｉｏｎ　１．１１．Ｎｏｅｍｂｅｒ。
１９８５；Ｂｅａｕｃａｇｅ、ｅｔ　ａｌ、（１９８１）。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ、２２：１８５９−１８６２；Ｍａｔｅｕ ｃｃｉ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ ａｃ、１０３：３１８５−４８４６を参照し得る。
オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法、例えばホスホトリエスル及びホスホ ジエステル法、ホスホラミダイト法、又はそれらのいずれかの自動化実施例を用 いて調製し得る。
本発明は、多数のリポータ−分子を生成するためのＱβレプリカーゼ及びその他 のＲＮＡＮプレカーゼのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の使用を指示され る。Ｎプレカーゼのための鋳型であり、標的セグメントに関連する各々のＤＮＡ 又はキメラ核酸セグメントを用いて、１０９より大きいリポータ−分子をこの方 法で生成し得る。
本発明はさらに、ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性の発見に関するいくつかの 応用に向けられる。この発見の利点を利用するよう企てられた５つの異なる方法 の例としては、以下のものが挙げられる。これらの種々の方法は、ＲＮＡＮプレ カーゼのＤＤＲＰ活性のために増幅可能である複合セグメント又は破断複合セグ メントが、Ｎプレカーゼにより口触的複製可能であるＲＮＡの配列を有する複合 セグメントを包含する、予め形成された一重鎖核酸として、あるいはＮプレカー ゼにより口触的複製可能であるＲＮＡの配列を有する複合又は破断複合核酸セグ メントを包含する核酸を提供するために試料中で処理されるか又は反応し得る一 つ又はそれ以上の核酸としてどのように試料に提供され得るかを説明する。
実施例１　ハイブリダイゼーンタン／分離／増幅実施例２　ヌクレアーゼ保護／ 増幅 実施例３　結紮／増幅 実施例４　二重延長／増幅 実施例５　ｃＤＮＡ合成／増幅 以下の項では、これらの方法のいくつかが、用いられて０るプローブの数及び特 徴により一つより多い考え得るフォーマットを有することが説明される。
その最も一般的な意味において、本発明は、少なくとも一つの２゛−デオキシリ ボヌクレオチドを包含する核酸分子の増幅のための方法であって、その増幅は、 一つ又はそれ以上のその工程におけるＲＮＡＮブレカーゼのＤＤＲＰ活性の使用 を包含する。本発明はさらに、一つ又はそれ以上のその工程におけるこのような りＤＫＰ活性によるリポータ−分子の標的核酸セグメント依存性増幅のための方 法を指示される。さらに、これらのリポータ−分子の検出は、核酸を含有する試 料中の標的核酸の存在を示す。リポータ−分子は、試料中の標的核酸セグメント （及び標的核酸）の存在の検出可能性を提供すること以外の用途を有する。これ らのその他の用途としては、プローブ、クローニング中間物質、配列分析のため の基質としての使用、並びに他の分子生物学的又は分子遺伝学的方法が挙げられ る。
本発明はさらに、本方法を実施するためのキットを要する。
これらの方法及びキットは、標的核酸分析対象物の検出のための核酸プローブハ イブリダイゼーション検定に関連して特に有用に適用される。したがって、本発 明はさらに、試料中の核酸分析対象物の存在を検出するための方法、及びその方 法を実施するためのキットを要する。
さらに、本発明の、種々の態様は、相補的配列のＲＮＡの合成を触媒するための 鋳型として、Ｎプレカーゼにより口触的複製可能であるＲＮＡの配列を有する複 合ＤＮＡ又はキメラ核酸をＱβレブリカーゼ又は別のＲＮＡＮプレカーゼが用い 得るという発見の、標的セグメントの増幅、標的核酸分析対象物の検定、及びそ の他の手順（及びそのための関連キット）における適用を要する。このＲＮＡは さらにＮプレカーゼにより口触的複製可能であるため、ＤＮＡ又はハイブリッド 核酸からのＲＮ　Ａの製造工程は、ＮプレカーゼのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼ活性により触媒されるＲＮＡ及びそのＲＮＡ補体の自触的複製を開始する。
本発明のＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性のための基賀は、上記のように、レブリカ ーゼにより口触的複製可能であるＲＮＡの配列を有する複合核酸セグメントでな ければならない。
本発明の種々の多数の実施例の要約を以下に示す。
実施例トハイブリダイゼーン蒼ン／分離／増鴫このフォーマットでは、試料中の 核酸セグメントの増幅方法は、ハイブリダイズ条件下でのプローブと標的核酸を 含有する試料との混合を包含する。遊離の（即ち非ハイブリダイズ化）プローブ を、試料中の核酸とハイブリダイズされるものから分離する。次に、ハイブリダ イズ化プローブを伴う系に増幅条件′を施し、増幅化分子を検出する。このフォ ーマットのためのプローブは、その３°　−又は５゛　−末端でレプリカーゼ増 幅性セグメントと共有結合する抗標的セグメントを有するか、あるいはレプリカ ーゼ増幅性セグメント内に、その一部として埋め込まれる抗標的セグメントを有 する。プローブのリポータ−セグメントは、全しプリカーゼ増幅性セグメントで あるか又はレプリカーゼ増幅性セグメント内に埋め込まれるリポータ−サブセグ メントである。“リポータ−セグメント°は、増幅が起きたか否か（即ち標的核 酸が分析中の試料中に存在するか否か）を検出する際に検定される増幅化物貰の セグメントの配列を宵する。プローブは線状分子であってもよい。あるいは、プ ローブは環状分子でもよいが、この場合、レプリカーゼ増幅性セグメントの一端 は抗標的セグメントに直接（即ち単一ホスホジエステルを介して）接合し、他端 は直接又はコネクターセグメントを介して抗標的セグメントと接合する。
ここで図１を参照すると、本発明の一憇様は、リポータ−分子の標的核酸セグメ ント依存性増幅方法であって、その方法は下記の工程１ａ〜１ｄから成る： ｌａ）その３゛　−又は５゛末端で増幅可能配列、例えばｎｖ（＋）ＤＮＡと共 有結合する抗標的セグメント（配列）を、ハイブリダイゼーシヲン条件下で標的 配列を含有する試料と混合して、標的及び抗標的配列のノ＼イブリダイゼーシッ ンを起こす。
ｌｂ）当業界で公知のいくつかの手段（例えば、カラムクロマトグラフィー）を 用いて、非ハイブリダイズ化プローブ分子から生成されるハイブリッドを分離す る。
ｌｃ）ハイブリッド分子の増幅性セグメントを、例えばＱβレプリカーゼのＤＤ ＲＰ活性により増幅して、複数のＲＮ　Ａコピー、例えばｎｖＲＮＡを産生ずる 。
１ｄ）ｉｃで生成された増幅化物質を、当業界で公知の好適な手段によって検出 する。
ここで図２を参照すると、これは図１の／ｈイブリダイゼーシコン／分離／増幅 フォーマットに用いるための別のプローブ構築物を模式的に説明するものである 。図１の工程では、プローブ分子はいずれかの末端で抗標的配列と直接（例えば 、単一ホスホジエステルを介して）接合する増幅性配列を有する（２ａ。
２ｄ）か、あるいは抗標的セグメントが増幅性セグメント内にあってその一部で ある（２　ｂ、２　ｃ）。コネクター配列を用いてプローブを環化してもよい（ ２Ｃ）。リポータ−セグメントは、増幅性セグメント内に存在する（２ｄ）。任 意のこれらのプローブ構築物は、上記の、そして図１に説明されているハイブリ ダイゼーシジン／分ＩＩ／増幅フォーマットに用い得る。
実施例２−−ヌクレアーゼ保護／増幅 本フォーマットにおいては、プローブはレプリカーゼ増幅性セグメントの３′末 端又は５′末端に隣接する抗標的セグメントを包含する。プローブの抗標的セグ メントを選択し、標的核酸を包含すると考えられる試料の核酸を処理し、標的に 対してハイブリダイズされたプローブを、予め選択されたヌクレアーゼによる消 化から保護する。核酸の試料をブＯ−ブとハイブリダイズし、予め選択されたヌ クレアーゼを付加して、ハイブリダイズできなかったプローブを分解し、次いで ＤＤＲＰ活性のための鋳型としてプローブのレプリカーゼ増幅性セグメントを認 識するＲＮＡＮプレカーゼを付加して、増幅を実施する。その結果生じる増幅（ 標的が存在した場合に）で作られる分子を検出する。好適なヌクレアーゼ活性を 提供する酵素の例としては、大腸菌エンドヌクレアーゼ　ＶＩＩ、Ｔ４　ＤＮＡ ポリメラーゼ、及び大腸１１ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片が挙げら れる。
ここで図３を参照すると、これは、以下の工程３ａ〜３ｄから成る、リポータ− 分子の標的核酸セグメント依存性増幅方法を説明するものである： ３ａ）ヌクレアーゼ保護／増幅フォーマットにおいて、標的核酸配列、及び、そ の３′末端に直接結合するｎｖ（−）ＤＮＡ、ｎｖ　（＋）ＤＮＡ、又は他の増 幅性ＤＮＡを包含するプローブに、標的及び抗標的配列のハイブリダイゼーシタ ンを起こさせる条件を施す。
３ｂ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４　ＤＮＡポリメラ ーゼ、又はその他の好適な酵素の３°　−〜５′−−重鎮ヌクレアーゼ活性を用 いて、工程３ａの生成物質に、非ハイブリダイズ化プローブの３゛末端からのヌ クレアーゼ消化を施す。ハイブリダイゼーションによる標的とのその会合のため にヌクレアーゼ消化から保護された残りのプローブ分子をレプリカーゼを用いて 増幅し、増幅物質（即ち、リポータ−分子）を合成し得る。
３ｃ）工程３ｂにしたがってヌクレアーゼ消化工程を生き残ったプローブの鎖を 、Ｑβレプリカーゼ又は別のレプリカーゼを用いて、且つ鋳型としてプローブの 増幅性セグメントを用い′てこのような酵素のＤＤＲＰ活性によって、増幅する 。
３ｄ）工程３ｃの増幅によって生成された分子を、当業者に公知の好適な手段に より検出する。
実施例３−一結紮（連結）／増幅 本フォーマットにおいては、ハイブリダイズ条件下で、−次非増幅性ブローブ及 び二次非増幅性プローブで試料を処理するが、各プローブは増幅性核酸セグメン トの一部を包含し、その部分は杭機的核酸配列に直接接合される。あるプローブ においては、抗標的配列を、その５′末端で増幅可能セグメントの５゜部に接合 する。他のプローブでは、抗標的配列をその３゛末端で増幅可能セグメントの３ ゛残部に接合する。抗標的配列は、標的に対してハイブリダイズされた場合に、 それらが互いに隣接し、結紮可能であるよ′う選択される。ハイブリダイゼーシ ョン後、−次及び二次プローブをリガーゼ酵素、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ又は 大腸菌ＤＮＡリガーゼを用いた処理により接合して、レプリカーゼ増幅性分子を 生成する。増幅に際しては、増幅化分子を次に検出する。
ここで図４を参照すると、結紮／増幅を包含する、リポータ−分子の標的核酸セ グメント依存性増幅のための方法が模式的に説明されているが、この方法は以下 の工程４ａ〜４ｄから成る。
４ａ）２つの非増幅性プローブＡ及びＢは互いに、抗標的配列の一部分、例えば それぞれ杭機的Ａ及び杭機的Ｂに直接結合する増幅性配列の一部（画部分はとも に増幅性配列である）、例えばｎｖ　及びｎｖＢを含有する。２つのプローブを 、ハイブリダイズ条件下で標的を包含する核酸と混合する。
４ｂ）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、又はその他の酵素を用い て、抗標的配列を介してプローブを結紮して、増幅可能である分子を生成するた めの好適なりガーゼ活性を提供する。
４ｃ）結紮化プローブを、レプリカーゼ（例えばＱβ）を用いて、そのＤＤＲＰ 活性によって、増幅する。
４ｄ）工程４ｃにしたがって生成された増幅化物質を、当業者に公知の好適な手 段により検出する。
このフォーマットのいくつかの修正が用いられる。先ず、プローブとして単一分 子を用い得るが、この場合、５゛　−プローブ（図４のプローブＡ）の５゛　− 末端は直接（例えば、ホスホジエステル結合、又はヌクレオシドを要しない他の 短共有結合により）３°−プローブ（図４のプローブＢ）の３゛−末端に接合さ れる。あるいは、プローブは環状であってもよいし、即ち末端がコネクター配列 により接合されてもよいし、あるいはハイブリダイゼーション後に結紮により環 が形成されてもよい。
次いで、結紮は増幅性セグメントを伴う一重鎮環を生じる。
第二の修正は、結紮工程を削除し、ＤＤＲＰ活性のための鋳型として破断複合セ グメントを用いることである。増幅の能率はこの変化によって低減され、本手順 の一工程が省かれる。
本方法の第三の修正は、杭機的Ａ及び杭機的Ｂが互いに正確には隣接しない配列 に対してハイブリダイズするよう２つのプローブを設計することである。この場 合、ハイブリダイゼーション後の且つ結紮前の付加的ＤＮＡ重合工程は、結紮を 伴わずにＤＤＲＰ活性のための鋳型として用い得る、又は結紮し、次いでＤＤＲ Ｐ活性のための鋳型として用い得る破断複合セグメントを形成するための介在配 列を充填する。この変更フォーマットは、標的（及び杭機的）セグメントの増幅 の他に、標的セグメント間のセグメント（公知でない配列）の増幅の利点を提供 する。
最後に、一方又は両方のプローブは、それ自体で増幅可能である。このような場 合、結紮分子の増幅化物質は、プローブ単独のものとは異なる。この差異は、当 業者に公知の分析の一般的方法を用いて検出し得る。
実施例４−一二重延長／増幅 このフォーマットにおいては、その３′−末端で抗標的配列・と共有的に接合す るレブリカーゼ増幅性配列の一部（５°−末端を含む）から成るプローブを、ハ イブリダイズ条件下で核酸を含有する試料と混合する。その結果生じたハイブリ ッドを、標的が存在する場合は、鋳型として標的を用いるプライマー依存性延長 反応において３°末端からハイブリダイズ化プローブを延長させるためにＤＮＡ ポリメラーゼ又は逆転写酵素を提供する酵素で処理する。延長の生成物質を熱変 性によるのと同様に標的から分離１５、その３°末端で一部ブローブの標的配列 からの５°にある標的の配列の場合と同一の配列と共有的に接合するレプリカー ゼ増幅性配列の一部（５°末端を含む）から成る二次プローブとハイブリダイズ する。二次プローブの増幅性配列の一部は、増幅性配列の補体である増幅性配列 からのものであって、その一部は一次プローブの５゛末端に存在する。二次プロ ーブ中の標的の配列は、延長で付加された延長化−次プーローブの一部分の配列 と相補的である。し、たがって、二次プローブのハイブリダイゼーションは、− 次ブローブの延長化生成物質を用いて生じるが、しかし−次プローブそれ自体に よっては生じない。変性延長化−次プローブは、二次プローブとハイブリダイズ する。その結果生じるハイブリッドを、Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ活性を提供する 酵素によるプライマー延長のための鋳型として用いる。この延長の生成物質をレ プリカーゼで増幅し、増幅化分子を検出する。
本発明のこの、又は任意の他の実施例の、プライマー延長に用い得るＤＮＡポリ メラーゼ活性を提供する酵素の例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■、大腸 ！ｌＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片、鳥類の骨髄芽球症ウィルス逆転 写酵素、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａ ｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ、１ｕｔｅｕｓＤＮＡポリメラーゼ 、Ｔ４　ＤＮＡボリメラー・ゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈ　ｅ　ｒｍｕ　 ！１ｆｌａｖｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｕｕｓｌｅｃｈｅｎｉ　ｆ ｏｒｍｉｓＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ、あるいはその他のＤＮＡポリメラーゼ、逆転 写酵素、又はプライマー開始化鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素 が挙げられる。本発明のこの、又は任意の他の実施例の、プライ７−延長に用い 得る逆転写酵素活性を提供する酵素の例としては、鳥票の骨髄芽球症ウィルス逆 転写酵素、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス逆転写酵素、任意のその他のレ トロウィルスの又はレトロトランスポゾンの逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑ ｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは逆転写酵素活性を有するその他 の酵素が挙げられる。
２つのプローブを、異なる時期に又は同時に付加し得るが、しかし標的からの一 次延長生成物質の鎖分離は一次延長に用いるポリメラーゼを変性する温度での熱 変性を用いる場合には、付加的ポリメラーゼを二次延長のために付加する必要が ある。
ここで図５を参照すると、本実施例は、二重延長／増幅フォーマットを用いるリ ポータ−分子の標的核酸セグメント依存性増幅のための方法に関するものであっ て、本方法は以下の工程５ａ〜５ｆから成る： ５ａ）二重延長／増幅フォーマットに関して記載されているような２つのプロー ブＡ及びＢを用いる。これらのプローブは互いに相補的でない。即ちプローブＡ の延長前には、２つのプローブは、鋳型依存性プライマー開始ＤＮＡ延長反応を 起こさせるのに十分な安定性を有する手法に用いられるハイブリダイズ条件下で 互いに対してハイブリダイズし得ない。プローブＡは、その５′端にｎｖ　（＋ ）ＤＮＡの非増幅性５°部分を包含し得る。次に、プローブＢは、その５“端に ｎＶ　（−）ＤＮＡ（即ち、ナノ変異体ＤＮＡ鎖プローブＡの５′端が一部分で あるナノ変異体ＤＮＡ鎖の配列と相補的な配列を有するナノ変異体Ｄ　Ｎ　Ａ　 １１　）の非増幅性５′部分を包含する。２つのプローブの抗標的配列は特異性 を提供し、鋳型に関するプライマー依存性Ｄ　Ｎ　Ａ合成を起こさせるのに有効 である：したがって、それらは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらに一般的に は２０〜５０ヌクレオチドの長さである。工程５ａでは、プローブＡと核酸の混 合物に、プローブ中の抗標的配列による標的の／％イブリダイゼーションを引き 起こす条件を施す。
５ｂ）標的が存在する場合に生じたハイブリッドをＤＮＡポリメラーゼ又は逆転 写酵素で処理して、工程５ａにしたがってハイブリダイズされるプライマーとし てのプローブＡの３°末端からのプライマー延長により隣接抗標的核酸配列を生 成する。
５ｃ）工程５ｂにしたがって生成された延長プローブ鎖を、熱変性により原標的 から分離する。ここでは工程５ｂにしたがって生成されるような延長配列を有す る原プローブＡを、次にプローブＢでハイブリダイズする。プローブＢの３′− 抗延長化ブローブＡセグメントの配列を提供するために選択される標的核酸のセ グメントによって、プローブＢはプローブＡ中に元来存在する杭機的セグメント に、又はこの“原”抗標的セグメントの３′端からの３°である延長プローブＡ のセグメントに直接接してハイブリダイズし得る。一般に、プローブＢがハイブ リダイズするセグメントは、原抗標的セグメントの３°端の２０００ヌクレオチ ド内であって、通常はもっと接近している。
本方法の実施には、プローブＡの標的セグメントの３°端とプローブＢの５°端 にも存在する標的セグメントの５°端との間の標的のセグメントの配列について の知識を要しないことは、注目すべきである。
５ｄ）次に、増幅性ＤＮＡを、工程５ｃにしたがってプローブＡを延長するため にハイブリダイズされるプライマーとしてのプローブＢからのプライマー延長に より生成する。　′５ｅ）工程５ｄで生成された増幅性分子をレプリカーゼを介 して、そのＤＤＲＰ活性を用いて増幅する。
５ｆ）当業者に公知の好適な手段によって、増幅化物質を検定する。
本工程は、プローブＡ又はプローブＢ１又はその両方として、増幅可能なプロー ブを用いて、修正し得る。この場合、工程５ｅで生じた増幅化物質は、当業者に 公知の好適な手段により、原プローブＡ（及びＢ）のものとは区別し得る。さら に、本方法は、試料中の標的の存在に関する検出可能性を提供する他に、増幅化 物質のその他の使用を包含するために修正し得る。
実施例５−−ｃＤＮＡ合成／増幅 このフォーマットにおいては、その３′末端で杭機的配列と共有的に接合するレ プリカーゼ増幅性配列から成るＲＮＡプローブを、ハイブリダイズ条件下で試料 中の核酸と混合する。次にハイブリダイズ化分子を逆転写酵素で処理する。その 結果生じたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡｇ分、及び非ハイブリダイズ化 ＲＮＡプローブを、次に破壊する。次いで残りのＤＮＡ配列の全部又は一部を、 ＲＮＡプローブのレプリカーゼ増幅性セグメントを増幅するために用い得るレプ リカーゼ酵素を用いて増幅し、その結果生じた増幅化分子を次に検出する。
逆転写酵素の例としては、鳥類の骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素、Ｍｏ１ｏｎｅ ｙネズミ白血病ウイルス逆転写酵素、及びＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ 　ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。非ハイブリダイズ化プローブ、及びＲＮＡ −ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分の破壊は、塩基性条件下で、例えば水酸化ナ トリウムの添加により増強される。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分の 破壊は、大腸菌又は他の種からのＲＮアーゼのような好適な酵素により酵素的に 達成してもよい。遊離プローブは種々のりボヌクレアーゼを用いて消化し得る。
ここで図６を膠原すると、本実施例は、ｃＤＮＡ合成／増幅フォーマットを用い 、以下の工程６ａ〜６ｅから成る、リポータ−分子の標的核酸セグメント依存性 増幅のための方法である。
６ａ）標的核酸配列を、ｎｖ　（＋）ＤＮＡ％ｎｖ　（）ＤＮＡ、又はその３゛ 末端で杭機的核酸配列と共有結合するその他の増幅性ＲＮＡの一部を包含する増 幅性ＲＮＡプローブでハイブリダイズする。標的セグメントの３′端は標的分子 の３′端に存在し、ＲＮＡプローブを伴うハイブリッドにおいては、杭機的セグ メントの５゛端のヌクレオチドと相捕的である。
８ｂ）ハイブリッド分子の鎖を、ＡＭＶ逆転写酵素、又は別の好適な逆転写酵素 の存在下でプライマー延長により引き伸ばす。
６ｃ）非ハイブリダイズ化ＲＮＡプローブ及び鎖延長化ＲＮＡを化学的に、例え ば水酸化ナトリウム処理により、又は酵素的に、例えばＲＮアーゼ処理により消 化する。非ハイブリダイズ化プローブを工程６ｂの前に取り除いてもよい。
６ｄ）処理試料を酸、又は緩衝液（工程Ｃに記載の水酸化ナトリウム処理の場合 ）、あるいはＲＮアーゼ阻害剤（ＲＮアーゼ処理の場合）で中和する。
６ｅ）工程Ｃで生成されたＤＮＡは増幅性セグメントを有し、これらを、ＲＮＡ プローブの増幅性セグメントを口触的複製できるレプリカーゼのＤＤＲＰ活性に より増幅する。
増幅化物質は、当業者に公知の好適な手段により検出し得る。
本フォーマットのいくつかの特定の付加及び修正は、特定の適用に有用である。
例えば、本方法は、３゛末端の末端ヒドロキシルが、工程６ｂに記載されている 延長工程のための標的配列の末端で役立つことが必要である。標的がこの様式で それ自限エンドヌクレアーゼによる限定部位での標的配列の消化が、一つの選択 である。第二の選択は、ハイブリダイゼーシ理ン前のヌクレアーゼによる剪断、 化学的開裂、又は消化による無作為標的３′端を生成することである。第三の選 択は、３°　−〜５′　−エキソヌクレアーゼ活性を提供するための酵素、及び 逆転写酵素活性を提供するための酵素の存在下で工程６ａで形成されるハイブリ ッドを処理することである。エキソヌクレアーゼ活性は、ハイブリダイズ化試料 核酸の張り出し３゛末端を、プローブの杭機的部分を補足する部分に切り取る。
次に、逆転写酵素活性は、ハイブリダイズ化３′　−ヒドロキシル末端からの配 列を延長する。
ここで図７を参照すると、標的配列の末端で必要な３′末端ヒドロキシルの生成 のための第四の方法は、以下の工程７ａ〜７ｄから成るニ アａ）標的核酸を２つのプローブＡ及びＢを用いて、ハイブリダイズした場合に プローブが少なくとも一つの、さらに一般的には少なくとも数個の、約２０００ までのヌクレオチドの介在ギャップにより分離される。プローブＡは、ＤＮＡ、 ＲＮＡ；。
又はキメラ核酸である。プローブＢは、それ又はその延長生成物質がＲＮＡを分 解する条件下での分解に耐性でなければならないので、好ましくはＤＮＡである 。
７ｂ）プローブＡがハイブリダイズするセグメントからの３゜にある標的セグメ ントに対してハイブリダイズされるプローブＢを、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、 Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、大腸ＭＤＮＡポリメラーゼ１１又はそのＫｌｅｎｏ ｗ断片、あるいは延長反応を触媒するための別の好適なポリメラーゼ又は逆転写 酵素の存在下で、プライマー延長により延長する。
７ｃ）延長プローブＢを、当業者に公知の手段、例えば熱変性によって、標的核 酸から分離する。プローブＡによりプローブＢの延長が遮断されて、プローブＢ に限定３′端が提供されることに留意すべきである。
７ｄ）〜７ｈ）次に、分離延長プローブＢを用いて、三番目のプローブであるプ ローブＣとともに用いろ。このプローブＣは、検出され得るリポータ−分子を生 成するための図６のＲＮＡプローブと同様に、延長プローブＢに関して、同一の 機能的特性を有するＲＮＡである。工程７ｄ）〜ｈ）は、それぞれ工程６ａ）〜 ６ｅ）に対応する。
ｃＤＮＡ合成／増幅フォーマットの別の修正は、ＲＮＡプローブを、キメラ分子 のレブリカーゼ触媒化口触的複製性がアルカリ又はＲＮアーゼ処理により破壊さ れるように、デオキシリボヌクレオチド及び少なくとも２つのりボヌクレオチド を包含するキメラ分子に！換することである。″バックグラウンド゛を最小に減 じるのに必要なキメラプローブの完全消化が完全ＲＮＡプローブを用いた場合よ りも困難であるので、同一配列の完全ＲＮＡプローブと比較した場合、このよう な増幅背セグメントを伴うプローブを用いる工程は実質的に効率の低減を伴って 進行するにもかかわらず、２組のりボヌクレオチドを有する２Ｍ１５００は、こ のようなキメラプローブの増幅性セグメントとして用い得るＲＮＡの一例である 。完全ＲＮＡプローブの代わりにキメラプローブを用いる方法の工程はすべて、 本杭に記載されているとおりに実施し得る。
検出方法 増幅化生成物質の検出は、当業者に公知の方法及び物質により実施し得る。この ような検出方法は、ＲＮＡと染料との反応、及び染料−ＲＮＡ複合体の検出を含 む。特に、ＲＮＡ増幅生成物賀が、染料と複合体を形成する他の核酸の有意のパ ックグラウンド中に存在する場合には、染料−ＲＮＡ複合体の形成による増幅生 成物質の検出は、増幅反応の生成物質を検定するために増幅反応が実施された、 そして特徴的なサイズを有するその試料の核酸のサイズにより分離することによ り（電気泳動、クロマトグラフィー等によるのと同様に）達成される。本発明の 増幅反応後に染色により試料中に見出される予測サイズの核酸が増幅反応からの ＲＮＡであるという確証は、配列特異的検出方法、例えば下記のような核酸ブロ ー１フ％イブリダイゼーシ３ン法を用いて得られる。染料としては、”８ｔａｉ ｎＳａｌｌ　”　（Ｄａｈｌｂｅｒｇ、ｅｔ　ａｌ、（１９６９）、Ｊ。
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ　４１．　ｐ　ｐ、１３９−１４７）　、メチレ ンブルー（Ｄｉｎｇｍａｎ　ａｎｄ　Ｐｅａｃｏｃｋ（１９６８）、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｗ、７．　ｐ　ｐ。
６５９−６６８）、及び銀染色（Ｓａｍｍｏｎｓ、ｅｔ　ａｌ。
（１９８１）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｖｏｌ、２゜１）Ｉ）、１３ ５−１４１　；　Ｉ　ｇｌｏ　ｉ　（１９８３）、Ａｎａ　１゜Ｂｉｏｃｈｅｍ 、、Ｖｏｌ、１３４．　ｐ　ｌ）、１８４−１８８）のような色原性染料、並び にエチジウムプロミド（Ｓｈａｒｐ、ｅｔ　ａｔ、（１９７３）、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ。
Ｖｏｌ、１２．ｐｐ、３０５５−３０６３；Ｂａｉ　１ｅｙａｎｄ　Ｄａｖｉｄ ｓｏｎ　（１９７６）、Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、７０．ｐｐ、７５−８５）　、アクリジンオレンジ 、プロピジウムイオダイド、及びエチジウムへテロダイマーを含めたＲＮＡと結 合する蛍原性化合物が挙げられる。
当業者に公知の別の検出方法としては、修飾取り込みリボヌクレオチドの標識か らの直接の信号に基づ（、あるいはこのような標識の存在に依る増幅化生成物質 のその後の反応によって生成される増幅化生成物質の検出前に、非取り込み、修 飾リボヌクレオシド三燐酸塩からの増幅生成物質の増幅化生成物質中への特異的 な修飾化検出可能リボヌクレオチドの取り込みとその後の分離（例えば、クロマ トグラフィー又は電気泳動による）を引き起こすリボヌクレオチド増幅反応中の 修飾リボヌクレオシド三燐酸塩の使用が挙げられる。最も一般的には、修飾化リ ボヌクレオチドを、３２Ｐ又は３５Ｓのような同位元素で放射性標識する。本発 明の増幅に起因してＲＮＡ中に取り込まれるこのような同位元素からのベータ粒 子放射の検出は、当業界で十分公知のシンチレーション計数又はオートラジオグ ラフィーのような方法により実施する。塩基上に発光、蛍光、又は色　−原性部 分を保有するよう修飾されるリボヌクレオシド三燐酸塩を増幅生成物質中に取り 込ませ、次いで当業者に公知の種々の方法及び手段により検出し得る。増幅生成 物質中への修飾リボヌクレオチドの取り込みのためのレブリカーゼにより耐容さ れるリボヌクレオシド三燐酸塩の他の修飾としては、塩基がビオチン（例えば、 ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｕｒｇ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡから市販されている”ビオチン−１１−ＵＴＰ”）、 イミノビオチン、ジゴキシゲニン（例えば、ジゴキンゲニン−１１−ＵＴＰ０こ れはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ。
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡから市販されている）、抗 原、酵素阻害剤等のような°親和性分子°に結合するものが挙げられるが、これ らは、例えば、当業者に理解されるようなビオチンに反応性の酵素標識化アビジ ン又はストレプトアビジン、ジゴキシゲニンのような抗原親和性分子に特異的な 酵素標識化抗体、又は酵素阻害剤親和性分子に反応性の酵素の複合体とのその後 の反応により増幅生成物質に検出可能性を提供する。例えば、増幅生成物質のウ ラシル部分に結合するビオチンと、前記のような検出可能勧賞に、又は検出可能 （例えば呈色）勧賞を生じるために反応する基質との反応を触媒する酵素に抱合 されるアビジン又はストレプトアビジンとの反応は、当業者には公知の検出手段 である。
当業者に公知である本発明の増幅の生成物質の別の検出手段としては、このよう な生成物質を包含すると考えられる核酸の試料と生成物質の全配列又はこのよう な配列の予め選択された部分（”リポータ−”配列又はセグメント）を伴うセグ メントを包含する核酸プローブとのハイブリダイゼーシヨンが挙げられる。増幅 生成物質は、自勉的複製を含めた工程に起因するために、レプリカーゼのＤＤＲ Ｐ活性のための基質であるＤＮＡセグメントの配列を有するＲＮＡ、及びその相 補的配列を宵するＲＮＡを包含する。このような両ＲＮＡに対するプローブは、 特に、２つのうちの１つが他方よりも有意に過多に存在する場合には、同時に用 い得る。核酸プローブを何らかの方法で標識化して、それを検出可能にする。例 えば、それは、それ自体増幅生成物質の標識化と関連して上記のように少なくと も１つの放射能で標識化された又は別の方法で修飾されたヌクレオチドを包含す るか、あるいは信号発生（例えば色原性）反応を触媒し得る酵素で直接（共有的 に、及びプローブの標的とのハイブリダイゼーションに用いる前に）標識化され る。核酸ブローブハイブリダイゼーシタンにより増幅生成物質を検出する方法及 び手段は、当業界で十分公知である。例えば、ビオチンを保有するヌクレオチド をＦｏｒｓｔｅｒ　（１９８５）。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、及びＬａｎｇｅ（１９８１）、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
ＵＳＡに記載されているような核酸中に取り込ませた場合、生成物質は、先ずそ れらをアビジン又はストレプトアノピンと信号発生部分との抱合体と反応させ、 次に信号発生部分を検出することにより検出される。信号発生部分としては、発 光、蛍光又は呈色性（色原性）化合物、反応物質をこのような化合物の１つに変 換する酵素、あるいは他の反応物質及び／又は酵素の存在下で反応して発光、蛍 光、又は呈色性化合物を生じる分析対象物が挙げられる。１アトモルという少量 のリポータ−ＲＮＡが、放射能標識化プローブを用いたそれのための核酸プロー ブハイブリダイゼーション検定で検出可能である。
当業者が理解しているように、本発明の増幅反応で生成されるリポータ−ＲＮＡ の量が絶対量（染料と複合された場合に、他の核酸が存在しない場合でもＲＮＡ が検出可能であるように）で、及び原試料の核酸の量と比較（染料と他の核酸と の間の複合体による“バックグラウンド”が染料とリポータ−ＲＮＡとの複合体 を検出不可能にしないよう）して相当な量である場合、放射能で、又は他の方法 で修飾したりボヌクレオチドの取り込み、又は核酸プローブハイブリダイゼーシ ョン検定法による分析は、増幅化生成物質の検出には必要でない。増幅化物質は 、しばしば、例えばゲル電気泳動で他の核酸からサイズによって分離後に、発光 、蛍光、又は呈色性染料との反応により直接検出可能である。当業者は、一定の 染料、増幅からのＲＮＡ生成生成物一定のサイズ、及びサイズによる核酸の分離 のために用いる一定の方法、他の核酸が存在しない場合の増幅生成物質の最小検 出可能量を決定できる。一般に、公知サイズの５ナノグラムのリポータ−ＲＮＡ を提供するための本発明による増幅は、電気泳動及び染色による整粒後にＲＮＡ を検出するのに十分である。
別の検出方法としては、増幅工程に包含される試薬の１つの集積又は欠失の検出 が挙げられる。例えば、口触的複製中に、ＡＭＰがリポータ−ＲＮＡ分子中に取 り込まれると、リボヌク−レオシト三燐酸ＡＴＰが消費される。ＡＴＰの濃度は 、甲虫の（例えばＰ、ｐｙｒａｌｉｓからの）発光のようなルシフェラーゼで触 媒される生物発光による公知の方法を用いて正確に測定し得る。（−たがって、 本発明による増幅は、このような増幅が生じている溶液からのＡＴＰの欠失を検 出するためのルシフェラーゼに触媒される生物発光を用いて検出し得る。
増幅後の一般的分離方法 口触的複製による増幅で生成され、普通の又は修飾化ヌクレオチドを含有するか 又は染料と結合したＲＮＡの分離は、一般に、当業界に公知の方法及び手段によ って実施する。例えば、増幅化勧賞はフィルター又は粒子と結合し得るし５、非 結合修飾ヌクレオチド又は染料は好適な洗浄条件に依り分離及び除去される。結 合工程は非特異的であって、例えば全核酸を結合するが、しかし非取り込み物質 は結合しない；あるいは、特異的であって、特定の配列又は他の特性を包含する 核酸のみを結合する。特異的結合は、任意の種々の支持物質（例えば、当業界で 理解されるようなマイクロ漬定プレート上の穴の表面、ラテックス、又はアガロ ースビーズ（磁気ビーズを含む）、クロマトグラフィー用樹脂）と結合し、ある 種の核酸と特異的に複合可能な物質により示される。例えば、特異的に結合され る核酸が本発明の増幅に起因するＲＮＡ増幅生成物質である場合、このような特 異的結合物質としては、特異的種類の核酸、例えば二重！ｌＲＮＡ：増幅化生成 物質中の配列と相補的な特異的配列を有するセグメントを包含する核酸：又は前 記のような増幅工程で生成されるＲＮＡ中のビオチンと複合するためのアビジン 又はストレプトアビジンに対する抗体が挙げられる。
リポータ−分子の産生以外の本発明の適用Ｑβレプリカーセ及びその他のＲＮＡ ＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性に起因する生成物質は、ＲＮＡプローブを用い得る 本質的にあらゆる適用に核酸プローブとして用い得る。例えば、プローブ配列が 取り込まれるナノ変異体ＲＮ　Ａは、ＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性を用いてナノ 変異体プローブ配列含有ＲＮＡの同一（又は相補的）配列のナノ変異体ＤＮＡセ グメントＴ・始７　ｉ、Ｔ　、　Ｊｔ−ｉｒ　ンハイブリダイゼーション、ノー ザンハイブリダイゼーション、スロット部ロット及びドツトプロットハイブリダ イゼーション、並びにｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシ３ンを含めた、固体支 持体を包含するいくつかのハイブリダイゼーシヲンフォーマットに用い得る。他 の固体表面上、例えばラテックスビーズ又はパラ磁気粒子上での、並びに溶液中 でのハイブリダイゼーションは、増幅からの分子の有効な用途である。ＲＮＡプ ローブは、上記のように、ＤＮＡからの製造される、又は口触的複製可能な工程 で標識化され、プローブ化されている核酸の試料中に存在し得る標的とハイブリ ダイズするために標識化されずに用い得るし、次に、このようなハイブリダイゼ ーションが生じていた場合には検出前にさらに口触的複製（おそらくは上記のよ うな同時標識化により）させるための条件を施す。
本発明による増幅からの生成勧賞は、遺伝子発現研究にも用い得る。ペプチド又 は蛋白質をコードする配列の上流の翻訳開始部位を含有するカセットの増幅可能 ＤＮＡ配列中への導入、並びに、翻訳系、例えばＸ、１ａｅｖｉｓ卵母細胞系、 又はｉ、ｎ　ｖｉｔｒｏウサギ網赤血球溶解物系と組み合わせて、鋳型としてこ の構築物を用いてＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性により開始される口触的複製によ って作られるＲＮＡの使用により、有意量の問題の蛋白質が産生される。
増幅からの生成物質は、当業者に公知のＲＮＡのシーケンシングのための標準方 法を用いた配列分析のための基質としても用い得る。
本発明によれば、複合増幅可能ＤＮＡを包含する核酸、又はキメラ核酸セグメン トも、例えば、Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ、。
ＰＣＴ出願ＷＯ３７１０６２７０、又は米国特許第４．９５７，８５８号に記載 されているように、親和性分子が特異的に結合する分析対象物を検出する場合に 用いられる抗体、核酸プローブ等を含めた、°親和性分子”を標識するために口 触的複製可能Ｒ，Ｎ　Ａの代わりに用い得る。このような核酸標識は、これらの Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｔ、の文献中に記載されているような親和性分子と共有的又は 非共有的に、接合又は結合する。ある態様において、核酸標識は、増幅性二重鎖 複合ＤＮＡ又は非類似性キメラ核酸から成り、このように、その配列として口触 的複製可能ＲＮＡを有する。好ましくは、標識、及び標識を親和性分子に接合さ せるリンカ−は、プロモーター又はその鎖からのセグメントを包含せず、それに より標識の増幅性セグメントは、標識、又は標識及びリンカ−を二重鎖にするの に必要な任意の処理後に口触的複製可能ＲＮＡに転写される。
本発明によれば、このような転写を要しないのが有益である。増幅可能複合ＤＮ Ａ又はキメラ核酸セグメントを包含　−する本発明の核酸標識を、自勉的複製可 能ＲＮＡ標識に関して実質的にＰＣＴ出願ＷＯ３７１０６２７０、又は米国特許 第４．９５７．８５８号に記載されているように処理して、親和性分子に対する 検出可能性を提供する。ＰＣＴ出願ＷＯ３７１０６２７０、及び米国特許第４， ９５７，８５８号に記載されている、Ｑβレプリカーゼ又は別のＲＮＡＮプレカ ーゼにより口触的複製可能で、核酸分析対象物に対応する杭機的セグメントをも 包含するＲＮＡ親和性分子は、本発明によれば、同一配列のＤＮＡ又はキメラ核 酸と置換され得る。
キット 他の態様において、本発明は、上記の方法によるリポータ−分子の標的核酸セグ メント依存性増幅を実施するためのキット、及び少なくとも１つの核酸が予め選 択された標的配列を含有すると考えられる一つ又はそれ以上の核酸を含有する試 料中の特異的標的核酸分析対象物の検出のための診断キットに関する。
キットは、好ましくは、各成分のための個別の容器を有する多数容器ユニット中 に包装する。本発明に関するキットの例を以下に示す： 実施例１（キット１）　ハイブリダイゼーション／分離／増幅キット ハイブリダイゼーション／分離／増幅キットは、別々の容器中の以下の成分と一 緒に包装される少なくとも２個の容器を包含する： （ａ）複合増幅可能核酸セグメント又はその一部、及び杭機的核酸セグメント（ プローブが増幅性セグメントの一部分のみを有する場合のためのキット３につい ての以下の説明を参照。
このような場合は、少なくとも２つのプローブが存在しなければならない）を有 するオリゴヌクレオチドを包含するノ＼イブリグイゼーシ３ン溶液：及び （ｂ）Ｑβレプリカーゼ又は別のＲＮＡＮプレカーゼを有する増幅緩衝液。これ は成分（ａ）のプローブの増幅性セグメントによるＤＤＲＰ活性を有し、上記の 緩衝液は上記のＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性に適している。
好ましいハイブリダイゼーション液は、以下の物質を包含する：５Ｘ　ＳＳＣ（ ７５０ｍＭ　ＮａＣ１，７５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）、２％硫酸デキストラ ン、４０　ｍ　Ｍ　燐酸ナトリウム、ｐＨ６，５、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ　剪断及び 変性ニシン精子ＤＮＡ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリド ン、及び０．０２％血清アルブミン（ＰｅｎｔａｘＦｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ）。
Ｑβレプリカーゼのための好ましい増幅緩衝液は以下の成分を包含する＋４０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１、及び各々１ｍＭのｒ ＡＴＰ、ｒＧＴＰ。
ＵＴＰ、及びｒＣＴＰ。
ハイブリダイゼーション／分離／増幅キットはさらに、非ハイブリダイズ化プロ ーブからの１１イブリダイズ化プローブの分離を実施するために、緩衝液及びそ の他の成分（例えば、ゲルを含有するカラム）を含む。
実施例２（キット２）　ヌクレアーゼ保護／増幅キットヌクレアーゼ保護／増幅 キットは、別々の容器中の以下の成分と一緒に包装される少なくとも３個の容器 を包含する：（ａ）ヌクレアーゼ保護／増幅法にしたがって使用するための複合 増幅可能核酸セグメント及び上記のその他の特性を有するオリゴヌクレオチドプ ローブを包含するハイブリダイゼーション緩衝液； （ｂ）ヌクレアーゼ保護／増幅法にしたがって、検定において標的とハイブリダ イズしない任意のプローブの分解を触媒するためのエキソヌクレアーゼを含有す るエキソヌクレアーゼ緩衝液；及び （Ｃ）キット１におけると同様の増幅緩衝液。
好ましいハイブリダイゼーション緩衝液及び増幅緩衝液は、キット１の説明中に 上記されている。
好適なエキソヌクレアーゼ緩衝液は以下の成分を包含する＋４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ、ｐＨ７，５、ｌＱｍＭＭｇＳＯ４、及び０．１ｍＭ　ジチオトレイト ール。
実施例３（キット３）　結紮／増幅キット結紮／増幅キットは、別々の容器中の 以下の成分と一緒に包装される少な（とも２個の容器包含する：（ａ）オリゴヌ クレオチドプローブを含有し、そのうちの少なくとも１つがＤ　Ｎ　Ａ又はキメ ラプローブであり、−緒に結紮されるものが複合増幅性セグメントを包含し、そ して本発明の結紮／増幅法にしたがって用いられるプローブに関して上記されて いるその他の特性を有するプローブを有する／＼イブリダイゼーシタン溶液；及 び （ｂ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ又はその他のりガーゼ、及びＱβレプリカーゼ又は他 のＲＮＡＩノブリカーゼ（ＤＤＲＰ活性によ一す、互いに隣接してハイブリダイ ズされる場合に成分（ａ）のプローブ中に生じる増幅性セグメントを増幅可能で ある）を有する増幅緩衝液。上記の緩衝液は、二重鎖ＤＮＡの一重鎮破断のリガ ーゼによる結紮、並びにＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性に適している。
好ましいハイブリダイゼーション液は、キット１の説明中に上記されている。
好ましい結紮／増幅緩衝液は以下の成分を包含する：キット１の増幅緩衝液の全 成分＋１ｍＭ　ＡＴＰ、及び０．０５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン。
キット１の増幅緩衝液は、標的に対してハイブリダイズ化されたプローブが結紮 されない場合に、結紮／増幅緩衝液の代わりに用い得ることに留意すべきである 。
実施例４（キット４）　二重延長／増幅キット　二重延長／増幅キットは、別々 の容器中の以下の成分と一緒に包装される少なくとも３個の容器を包含する： （ａ）ＲＮＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性により増幅可能な複合核酸を産生ずる ために、オリゴヌクレオチドプローブ、及び上記のその他の特性を有するハイブ リダイゼーション溶液：（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供するためのＤＮＡ ポリメラーゼ又は逆転写酵素を含有する延長緩衝液；及び（Ｃ）キット１におけ ると同様の増幅緩衝液。
好ましいハイブリダイゼーション溶液は、キット１の説明中に上記されている。
好ましい延長緩衝液は、以下の成分を包含する＋４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇ５Ｏ０，１ｍＭ　ジチオトレイトール、及び各々４ゝ ０．０４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ０実施例５（キット ５）　ｃＤＮＡ合成／増幅キ、ソトｃＤＮＡ合成／増幅キットは、別々の容器中 の以下の成分と一緒に包装される少なくとも４つの容器を包含する：（ａ）本発 明のｃＤＮＡ合成／増幅法に関して上記されているようなオリゴヌクレオチドプ ローブ（上記の手順５参照）、及び本方法の実施例に用い得るその他のプローブ （上記の手順６参＠）を含有するＲＮＡ−又はキメラ−増幅性セグメントを有す るハイブリダイゼーション溶液： （ｂ）ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ　Ｍ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素、又はその他の逆転写酵素 を含有し、酵素による逆転写の触媒に適した逆転写酵素緩衝液： （Ｃ）プローブ上の標的により用意された逆転写後にＲＮ　Ａ又はキメラプロー ブを分解するための溶液：そして（ｄ）成分（ａ）におけるＲＮＡ又はキメラプ ローブの増幅性セグメントを増幅し得るＮプレカーゼ（例えば、Ｑβレプリカー ゼ）を含有するキット１と同様の増幅緩衝液。
好ましいハイブリダイゼーション溶液及び増幅緩衝液は、キット１の説明に上記 されている。好ましい逆転写酵素緩衝液は、以下の成分を含有する＋３４ｍＭ　 ＴｒｉｓＯＨＣｌ、ｐＨ８、３、５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣｌ　、５ ｍＭジチオトレイトール、並びに各々１．ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。
ＴＴＰ、及びｄＣＴＰ０好ましいＲＮＡ分解溶液はｌＮＮａＯＨである。
実施例６（キット６）　ハイブリダイゼーシタン／増幅キッ　ト ハイブリダイゼーシラン／増幅キットは、上記のハイブリダイゼーン３ン／分離 ／増幅キットと同じであるが、しかし非ハイブリダイズ化プローブからのハイブ リダイズ化プローブの分離のための成分を含まない。
本発明のキットはさらに、本発明にしたがって生成されるＲＮＡの検出、又は他 の用途のための試藁を含む。
本発明のキットにおいて、プローブ、ＲＮＡＮプレカーゼ、他の酵素（プロセッ シングに必要）、及びその他の成分は、水性溶液の成分としてよりも親液性形態 で提供される。したがって、本発明のキットのプローブ保持容器、Ｎプレカーゼ 保持容器、酵素保持容器等は、乾燥、親液性形態で、プローブ、Ｎプレカーゼ、 他の酵素等を保持し得る。
当業者に理解されているように、診断検定、及び本発明に関連して意図されるモ ノのようなその他の試験は、一般に、検定又は試験に使用する試薬が適正に機能 して、試験試料中に分析対象物が存在する場合には分析対象物の存在を示す信号 を発し、“バックグラウンド“信号（一般には分析対象物を含有しないことが公 知の対照試料からの信号）のレベルを提示する（試験試料から得られる信号は、 試験試料が分析対象物を含有したと確実に結論を下す前に過分出なければならな い）ことを保証するために、好適な正又は負の“対照”試料と平行して、試験試 料で実施する。対照試料は、分析対象物の量又は濃度の関数としての信号の測定 値を提供し、それによって試験試料中の分析対象物の量又は濃度を定量し得る。
さらに、試験試料中に存在　′することが公知の“対照”分析対象物は、公知の 濃度（例えば２ベ一タヘモグロビン遺伝子／正常赤血球）での、又はこれもおそ らく公知の濃度で試験試料中に故意に付加された数例においては、試験試料中で の試験中の分析対象物に関する試験に際しての定量のための好適な対照又は基準 を提供するために用い得る。本発明のキット、特に分析対象物のための試験キッ トは、試験試料中の分析対象物の存在を測定するか、又はその量を定量する場合 のキットの使用のための好適な対照を提供するためのプローブ及び試薬を包含し 得る。
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものでは ない。
実施例 実施例１ これは、ＲＮＡＮプレカーゼ、即ちＱβレブリカーゼのＤＤＲＰ活性を用いたＤ ＮＡの増幅の実施例である。増幅化Ｄ　Ｎ　Ａ　ハ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４ ４、即ち５’−ＧＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＣＧＧＧＧ Ｔ　ＴＴＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＣＧＡ　ＡＡＧＴＴＡＧＡＧＡＧＧＡ ＣＡＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＧＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣ−３°で特定される 配列を有するナノ変異体ＤＮＡである。この配列を有するナノ変異体ＤＮＡは、 本発明においては“ｎｖ　（＋）ＤＮＡ”と呼ばれる。ｎｖ（＋）ＤＮＡの配列 と相補的な配列を有するナノ変異体ＤＮＡは、本明細書中ではｎｖ（−）ＤＮＡ と呼ばれる。その−重鎖がｎｖ（＋）ＤＮＡで他方の鎖がｎｖ（−）ＤＮＡであ る９０塩基対二重鎮ＤＮＡは、本明細書中ではｎｖＤＮＡと呼ばれる。ｎｖ（＋ ）ＤＮＡの５０アトモル試料を、以下の工程で増幅した：５０アトモルのｎｖ　 （＋）ＤＮＡを、以下の成分を含有する最終容量１０μｍの混合液中に入れた： １０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５；１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　； 各々１ｍＭのりボヌクレオシド三燐酸ＡＴＰ、ＧＴＰ。
ＵＴＰ、ＣＴＰ　、及び １００μｇ／ｍｌ　Ｑβレプリカーゼ。
混合液を３０℃で６０分間インキュベートし、１０μｍの２倍濃度の反応停止溶 液（２Ｘ反応停止溶液：１００ｍＭＥＤＴＡ、０．２％　ＮａＰＰ、（即ち、ピ ロ燐酸ナトリウ！ ム）、１μｇ　／　ｍ　Ｉ　エチジウムプロミド）を含有するマイクロ滴定穴に 移した。反応混合液に中間波長（３０２ｎｍ）の紫外線を照射し、増幅化生成勧 賞を会合蛍光発光により可視化した。ｎＶ　（＋）ＤＮＡを含有する反応混合液 からの蛍光を、対照試料からｎｖ（ヤ）ＤＮＡ反応混合液と同様の方法で調製し 、ｎｖ　（＋）ＤＮＡを欠くことを除いてはｎｖ　（＋）ＤＮＡを有する試料と 同じである対照反応混合液からの蛍光と比較した。
結果は、ｎｖ　（＋）ＤＮＡ含有試料を用いて調製した反応混合液中に少なくと も１００倍以上の蛍光物質が存在することを示した。この量的差異は、反応混合 液からの蛍光を、同一条件下で分析したニシン精子ＤＮＡの希釈試料を含有する 蛍光基準と比較して、確定した。
実施例２ 実施例１に記載されている増幅反応の生成勧賞をさらに、以下の手順にしたがっ て、８％ポリアクリルアミド、７Ｍ　尿素変性ゲル上での電気泳動により分析し た。７６ｇ／ｌ　アクリルアミド、８ｇ／ｌ　ビス−アクリルアミド、４４０ｇ ／ｌ尿素、５００μ＋　／Ｉ　ＴＥＭＥＤをＩＸＴＢＥ　（ＩＸＴＢＥ：８９ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基、８９　ｍＭ　１１８２．２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ）中で混 合して、３０ｍ１のゲル（厚さ０．４ｍｍ）を調製した。
この溶液３０ｍ１に、１０％過硫酸アンモニウムの５００μｍの新鮮な溶液を添 加した。ゲル重合後、ｎｖ　（＋）ＤＮＡ増幅反応混合液の５μｌ試料（２５ア トモルのｎｖ　（＋）ＤＮＡを含有する）を、ゲル上に載せる前に、２０μｌの ブルージュース（ブルージュース：６００ｍｇ／ｍｌ　尿素、１ｍＭＥＤＴＡ、 ５％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシ アツール）中で２分間９０℃に加熱して、処理した。ゲルを３００ボルトで３０ 分間予行し、試料を載せた後、４００ボルトで１時間実行した。次に、ゲルを０ ．５μｇ　／　ｍ　Ｉのエチジウムプロミドの溶液中で２０分間染色し、３０２ ｎｍの紫外線にゲルを暴露させて生じた蛍光で核酸を可視化した。
結果は、増幅反応の生成物質が、９０塩基ＲＮＡの増幅と一致する位置に単一バ ンドとして移動したことを示した。生成物質はエチジウムプロミドの存在下で蛍 光を発し、リボヌクレオシー三燐酸塩を用いて合成されたため、それはＲＮ　Ａ であったに違いない。増幅前の原ＤＮＡ物質（ゲルに載せたときに溶液中に１μ ｇ未満で存在していたと考えられる）は、この工程では見えなかった。
増幅化物質がＲＮＡの両鏡を含有することを確定するための手順は、以下のとお りであった。上記と同様に、２つの染色ゲルを調製した。各々を、０．５μｇ　 ／　ｍ　ｌのエチジウムプロミドを含有するＱ、１ｘＴＢＥに２０分間浸漬し、 核酸を電気泳動によって、Ｑ、１ｘＴＢＥ中に５０ボルトで１０分間、Ｈｙｂｏ ｎｄ＠フィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃａｔ、Ｎｏ。
ＲＰＮ、２０３Ｎ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ。
１１１ｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）に転移させた。フィルターを０．１ｘＳＳＣ（１ｘ ＳＳＣ：１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）、０． ５％　ＳＤＳ中で６５℃で３０分間洗浄した。次に、フィルターを５　ｘ　Ｓ　 Ｓ　Ｃ。
４０ｍＭ　ＮａＰｏ　、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔの溶液（１ｘＤｅｎｈａｒｄｔの 溶液：各々２００　ｔ、ｔ　ｇ／ｍ　Ｉのフィコール、ポリビニルピロリドン、 及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））　、Ｏｌｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　（７） 剪断及Ｕ　ｆ　性ニシンｍ　子ＤＮＡ、及び１０％　硫酸デキストラン中で６５ ℃で３時間前ハイブリダイズした。３２ＰＯ−キナーゼ化オリゴヌクレオチド　 ＰＭ６１８　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１８の配列（これはｎｖ　（＋）ＤＮＡ の５゛末端の６６塩基の配列と同じである）を育する６６−塩基ＤＮＡプローブ ）、及び３２ＰＯ−キナ−ゼ化オリゴヌクレオチド　ＰＭ６２４　（ＳＥＱ　Ｉ ＤＮ０：６２４の配列（これはｎｖ　（＋）ＤＮＡの３°末端の６６塩基の配列 と相補的である）を有する６６−塩基ＤＮＡプローブ）をそれぞれ、５分間、９ ５℃に加熱し、上記と同様に（但し、ＰＭ６１８に関して用いたフィルターは、 別のプローブに関して予め用いていたが、しかしこのプローブは、０．１ｘＳＳ Ｃ。
０．１％　ＳＤＳで、１００℃で１分間に３回続けてフィルターを暴１して除去 した）ＩＩ製し、洗浄し、前ｌ＼イブリダイズした別々のフィルターにハイブリ ダイゼーションのために添加した。混合液を６５℃で一夜ハイブリダイズした。
次に、フィルターを２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで簡単に濯ぎ、再び同一溶液で 、室温で１５分間、そしてさらに３０分間濯いだ。
フィルターを、０．１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで各々３０分間、２回以上濯ぎ 、２つのＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　ＨｉＰｌｕｓ　増感スクリーンを用いて 、−８０℃でＫｏｄａｋＸ　Ａ　Ｒ，−５フイルムに露出した。
結果は、上記のエチジウム染色により認められた増幅反応の生成物質に対するＰ Ｍ６１８とＰＭ６２４の両方の強力なハイブリダイゼーションを示した。これは 、ｎｖＤＮＡの両方の鎖が作られたことを示しており、これは自勉的複製の最終 要件を満たしている。
ＤＮＡが試料中で増幅されるという事実に対するさらなる支持は以下の手順によ り得られるが、これは増幅前に試料からＲＮＡを排除する。各々１ピコモルのｎ Ｖ　（＋）ＤＮＡ及びｎｖ　（＋）ＲＮＡ　（ｎｖ　（＋）ＤＮＡと同じ配列を 有するナノ変異体ＲＮＡ）を、８０℃で１ｍｌのＬＮ　ＮａＯＨ中で、平行して しかし別々に、インキュベートした。アルカリによる処理の後に等量のＩＮ　Ｈ ＣＩで中和し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ。
ｐＨ７，５を添加して緩衝し、最終濃度を４６０ｍＭとして、鋳型がアルカリ処 理で分解されなかった場合、鋳型が１アトモル／１０μｌで存在するように希釈 する。次いで、増幅及び検出手順を上記と同様に実施した。アルカリ処理して１ ５分後、増幅操作を実施後に見出された蛍光物質の欠如により示されるように、 ｎｖ　（＋）ＤＮＡはもはや増幅可能でなかった。しかしながら、いかなる鋳型 も含有しなかった対照試料の強度と、鋳型としてｎｖ（±）ＤＮＡのみを含有し た試料の強度とを比較した場合、増幅操作後の反応混合液からの蛍光強度は少な くとも１００倍大きいことで示されたように、アルカリ処理の１５又は６０分後 、ｎｖ　（＋）ＤＮＡは増幅可能であった。
アルカリ処理の１８０分後、増幅に関して鋳型として機能するｎｖ　（＋）ＤＮ Ａの能力も破壊された。３７℃で０，２ＮＮａＯＨで１５分のより軽度の処理を 用いて、ｎｖ（＋）ＲＮＡ　（又はｎｖ（−）ＲＮＡ）鋳型の増幅をｎｖ（＋） ＤＮＡ　（又はｎｖ　（−）ＤＮＡ）鋳型の増幅と区別し得る。
試料中に存在するＲＮＡを破壊し、したがって、ＤＮＡを分解せずに、このＲＮ ＡＮプレカーゼのＤＤＲＰ活性のための鋳型として役立つようなりＮＡを含めた 、ＲＮＡＮプレカーゼによる増幅のための鋳型としての口触的複製可能なＲＮＡ を減らすための別の処理は、３７℃で２０分間ヌクレアーゼＲＮアーゼＡ（１０ μｇ／ｍｌ）で処理することである。この後、２００単位のＲＮアシンＲＲＮア ーゼ阻害剤（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ。
Ｗｉ　５ｃｏｎｓ　ｉｎ、ＵＳＡ）を添加して、ヌクレアーゼを中和する。例え ば、この方法で処理したｎｖ　（＋）ＤＮＡ又はｎＶ　（−）ＤＮＡ試料は、Ｑ βレプリカーゼのＤＤＲＰ活性に　−より増幅されるその能力を保持する。
実施例３ 本実施例は、そのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性によるＱβレプリカーゼ での増幅のための別のオリゴヌクレオチド−重鎖及び二重鎖鋳型を説明するため のものである。
実施例１の増幅手順にしたうが、但し、表１に記載された鋳型は表１に記載され た量で使用し、表１に記載された時間及び温度条件下で増幅する。ニシン精子及 び糞ＤＮＡを除いて、量はアトモルである。列挙した鋳型は、プラスミドの一部 であるもの以外は、−重鎖オリゴヌクレオチドである。プラスミド並びにニシン 精子及び糞ＤＮＡ以外の個々の鋳型のヌクレオチド配列は、配列一覧に記載され ている。“ｎｖ　プラスミド”は、プラスミドｐＮＶ−１−３−４である（図８ 及び実施例６参照）；線状化形態では、プラスミドをナノ変異体ＤＮＡのセグメ ントの外側で制限エンドヌクレアーゼで切断する。“説明”は、ｎｖＤＮＡにつ いて記載されているように、一方の鎖に関するものである（あるいはｎｖプラス ミドの場合は両鏡）（実施例１参照）。増幅化物質をマイクロ滴定皿に入れ、実 施例１に記載されているように可視化する。増幅は、“＋”の印で示し、一方増 幅の欠如は、“−°の印で示す。
線種」」 ≦＋＋＋＋＋ｌ　ｌ　ｌ＋十這ぼ：ｊ啄実施例４ 本実施例は、結紮／増幅手順を説明する。１００フェムトモルのオリゴヌクレオ チド　ＰＭ７５４．１００フェムトモルの標的核酸　ＰＭ２１２３、及び５０フ 工ムトモルのオリゴヌクレオチド　ＰＭ２００４（それぞれＰＭ７５４、ＰＭ２ １２３、及びＰＭ２００４に対するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０ｓ７５４゜２１２３及び ２００４に関する配列一覧を参照）を含有する１μｌの２００ｍＭ　ＮａＣ１を ２μｌの１０ｘリガーゼ緩衡液（１０ｘリガーゼ緩衝液：４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ。
１００ｍＭ　ＭｇＣｌ　、１０ｍＭ　ＤＴＴ、５００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳ Ａ）と混合した。混合液を７０℃に設定し、４０分間徐々に冷却して、オリゴヌ クレオチドのハイブリグイゼーシコンを起こさせた。１１μｌの水、各々１０ｍ ＭのｒＮＴＰの２μｌの混合物、及びｌμｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（２単位） を添加し、増幅を３０℃で３０分間進行させた。
全試料を２０μＩの２ｘ停止溶液（実施例１参照）中に移して終止させた。反応 の生成物質を、実施例１に記載されているようにして、可視化した。生成物質は 、マイクロ滴定穴中で明るい蛍光物質に見えた。標的物質　ＰＭ２１２３が反応 から除外される場合は、蛍光は非常に弱く、緩衝液は含有するがＱβレプリカー ゼもプローブも含まない穴で観察されたものと同様であった。
反応生成物質を、以下の手順にしたがって、８％ポリアクリルアミド　７Ｍ　尿 素変性ゲルによる電気泳動にしたがって分析した。７６ｇ／ｌ　アクリルアミド 、４ｇ／ｌ　ビス−アクリルアミド、５００ｇ／Ｉ　尿素を１ｘＴＢＥ中で混合 して、４０ｍ１のゲル（厚さ１．５ｍｍ）を調製した。この溶液５０ｍ１に、２ ５μｍのＴＥＭＥＤ、及び１０％過硫酸アンモニウムの２５０μｌの新鮮な溶液 を添加した。ゲル重合後、増幅反応混合液の５μｌ試料を、２５μｌのブルージ ュース中で１分−間９５℃に加熱して、調製した（実施例２参照）。ゲルを３０ ｍＡで３０分間予行し、試料を載せた後、３０ｍＡで１．５時間実行した。ゲル を、実施例２と同様にして染色し、可視化した。標的　ＰＭ２１２３が反応液中 に存在する場合、約１１８及び１１．０塩基の長さの２つの主バンドと、約８０ 〜数百塩基の長さの少なくとも７つの弱いバンドが観察された。これらのデータ は、リポータ−分子の増幅が、試料中の標的分子の存在、に依っていることを示 す。
標的特異的増幅の確証は、以下の手順にしたがって、プローブ　ＰＭ４０７を用 いた電気泳動的分離物質のハイブリダイゼーションによって実証した。ＰＭ４０ ７の配列に関しては、配列一覧のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０７を膠原されたい。
染色ゲルからの核酸を、電気泳動によって、０．１ｘＴＢＥ中に４５ボルトで２ ０分間、Ｈｙｂｏｎｄ膜フィルターに転移させた。
その結果生じたフィルターを、実施例２に記載されているように、６５℃で１時 間前ハイブリダイズした。　ＰＯ４−キナーゼ化オリゴヌクレオチド　ＰＭ４０ ７を添加し、混合液を６０℃で４時間ハイブリダイズした。フィルターを２　ｘ 　Ｓ　Ｓ　Ｃ。
０．１％ＳＤＳ中で、室温で１分間、そして２ｘＳＳＣ。
０．１％ＳＤＳ中で、６０℃で各々１５分間で５回、濯いだ。
その結果生じたフィルターを、２つのＤｕＰｏｎ　ｔＣｒｏｎｅｘＨｉ　Ｐｌｕ ｓ　ＹＥ　増感スクリーンを用いて、−８０℃でＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイル ムニ菖出した。
ハイブリダイゼーションは、１１８塩基バンドを用いてのみ観察された。
存在する標的核酸に関する異なる実験において、数十〜数百塩基の異なる長さの 、そして種々の長さの間の増幅生成物質の種々の分布を示す生成物質が観察され た。一定の実験において、生成物質のいくつかは、２Ｍ４０７とのハイブリダイ ゼーションにより判断されるように、標的セグメントの配列と相補的な配列を有 するセグメントを含有するが、あるものは含有しないことが判明した。しかしな がら、全実験において、標的　ＰＭ２１２３が存在する場合、少なくともいくつ かの生成物質は標的セグメントの配列と相補的な配列を有するセグメントを包含 した。さらに、ＰＭ２１２３が存在しない実験では、２Ｍ４０７とハイブリダイ ズする反応生成物質は見出されなかった。
実施例５ 本実施例は、標的核酸の隣接セグメントに対してハイブリダイズし、レプリカー ゼにより口触的複製可能であるＴ１．　Ｎ　Ａの配列を有するＤＮＡのセグメン トの一部をともに包含する２つのプローブのハイブリダイゼーション後の、しか し結紮は伴わないＱβレプリカーゼのＤ　Ｄ−ＲＰ活性に媒介される標的依存性 増幅工程を説明する。１００フェムトモルのＰＭ７５４．１００フェムトモルの ＰＭ２１２３、及び５０フ工ムトモルのＰＭ２００４を含有するｌμｌの２００ ｍＭ　ＮａＣ１を２μｌの１０ｘリガーゼ緩衝液と混合した。混合液を７０℃に 設定し、４０分間徐々に冷却して、オリゴヌクレオチドのノ＼イブリダイゼーン ジンを起こさせた。１２μｌの水、及び各々１０ｍＭのｒＮＴＰの２μｌの混合 物を添加し、全混合液を６０分間２５℃に設定した。２μｌのＱβレプリカーゼ （１，２ｍｇ／ｍ１）を添加し、増幅を３０℃で３０分間進行させた。全試料を ２０μｌの２ｘ停止溶液（実施例１参照）中に移して終止させた。反応の生成物 質を、実施例１に記載されているようにして、可視化した。
生成物質は、マイクロ滴定穴中で明るい蛍光物質として見えた。標的分子　ＰＭ ２１２３が反応から除外される場合は、蛍光は非常に弱く、緩衝液は含有するが レプリカーゼもプローブも含まない穴で観察されたものと同様であった。これら のデータは、リポータ−分子の増幅が、試料中の標的分子の存在に依っているが 、しかし標的上で互いに隣接してハイブリダイズされたプローブの結紮は必要で なかったことを示す。反応生成物質を、実施例４に記載されているようにポリア クリルアミド−尿素変性ゲルにより電気泳動にしたがって分析した。反応液中に ＰＭ２１２３が存在する場合、約９０塩基の長さの単−主バンドが観察された。
標的特異的増幅の確証は、実施例４に記載されているように、プローブ　ＰＭ４ ０７による電気泳動的分離物質のハイブリダイゼーシヨンによって実証した。ハ イブリダイゼーシヨンは、ＰＭ２１２３の存在下で生成された９０塩基反応生成 物質の場合にのみ観察された。
実施例６ 本実施例は、ハイブリダイゼーシヨン／分離／増幅手順を説明する。
標的は、ベーターガラクトシダーゼ蛋白賀のアミノ末端の領域をコードする大腸 菌１ａｃＺ遺伝子の１０７ヌクレオチド配列であった。ＩａｃＺ遺伝子の標的領 域は、Ｍ１３ｍｐ１９ファージＤＮＡに含まれる（Ｙａｎ　ｉ　ｓ　ｃｈ−Ｐｅ 　ｒ　ｒｏｎ、　−Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、Ｇｅｎｅ　３３：１０３ −１１９）。関連するファージφＸ１７４からのＤＮＡを、負の対照として用い た。ファージφＸ１７４ＤＮＡは、１ａｃｚ遺伝子を含有しない。
本実施例に用いるプローブをプラスミドｐＮＶ１−３−４から単離するが、これ は図８に説明されている。ｐＮＶｌ−３−４は、プラスミドｐＵＣ１８の誘導体 であって（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ。
（１９８５）、Ｇｅｎｅ　３３：１０３−１１９）、　ｐＵＣ１８のポリリンカ ーの小型Ｐｓｔｌ−Ｋｐｎｌ断片をＴ７ＲＮＡ　ポリメラーゼプロモーター及び ｎｖＤＮＡ（二重鎖）を提供するセグメントに置換することにより、標準法を用 いて構築した。このプロモーター／　ｎ　ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ−含有セグメントの配 列を、図８に示す。ｎ　ｖ　（＋）ＤＮＡの配列が明示されているため、ｎｖＤ ＮＡセグメントは、“ナノ変異体（＋）鎖。
として図に示されている。プラスミドｐＮＶ１−３−４は、Ｐｖｕｌｌ／Ｓｍａ Ｉ制限断片内に、上記の１０７塩基標的部位と相補的な配列を有するセグメント とｎｖＤＮＡセグメントとを有する。
それぞれ制限エンドヌクレアーゼＰｖｕｌｌ及びＳｍａ　ＩでプラスミドｐＮＶ １−３−４を連続消化して、プローブを調製した。約５６μｇのプラスミドＤＮ Ａを、１ｍｌの最終容量で７５分間、Ｓｍａ　Ｉ消化緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ） 中で３７℃で１４０単位のＰｖｕ　Ｉ　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉ　ｓｏ ｎ。
Ｗｉ　５ｃｏｎｓ　ｉｎ、ＵＳＡ）で消化した。反応液を２５℃に冷却し、２０ ０単位のＳｍａｌを添加して、２５℃で５時間消化を継続させた。
約１３μｇ（７ピコモル）の消化Ｄ　Ｎ　Ａを脱燐酸化し、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ） から販売されているＤＮＡ５°末端標識化キツト（カタログ番号第７０２７５７ 号）からの試薬及び条件を用いて、３２Ｐ−ＡＴＰ（３，ＯＯＯＣｉ／ｍｍｏ　 Ｉ）で５°末端を標識化した。３つ、　の標識化断片（２，３７ｋｂ、２１４ｂ ｐ、及び１９４ｂｐ）を１０％ポリアクリルアミド／７Ｍ　尿素ゲル（実施例２ 参照）上に分離した。Ｑ１０　ｎｖＤＮＡセグメントＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ プロモーターセグメント、及び１ａｃＺ遺伝子中に標的と相補的な１０７ｂｐを 含有する２１４ｂｐ断片をゲルから切り出した。ゲル断片を、０．４ｍｌの１０ ０ｍＭ　ＮａＣ１゜０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭＥＤ ＴＡ、ｐＨ８を含有するＬ　Ｉ　Ｄ／Ｘ試験管（Ｌ　Ｉ　Ｄ／Ｘフィルター　注 射器ＡＱＯＲ２５、Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　ｘ。
Ｇａｉｔｈｅｒｗｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）に入れる“圧搾／溶離 °変法により、ゲルからＤＮＡを回収した。
試験管をフィルタープランジャーで密封し、３７℃で一夜混合した。濾液を回収 し、０．４ｍ　ｌの新鮮な緩衝液をフィルター洗浄器に添加し、室温で２時間混 合して、再び濾過した。濾液を混ぜ合わせ、シンチレーション計数によりプロー ブ濃度を測定した。
約２ピコモル（０，３ｍ１）のプローブを１ピコモル（１μｌ）の標的（又はφ Ｘ１７４．負の対照）と混合し、混合物をエタノール沈殿させた。その結果生じ たＤＮＡベレットを０．１ｍｌの２ｘＳＳＣ，Ｑ、１％　ＳＤＳに溶解させた。
プローブ及び標的（又は負の対照）に１００℃で５分間加熱し、その後徐々に５ ０℃に冷却して、９０分間５０℃に温度を保つことにより、ハイブリダイゼーシ ョン条件を施した。
ハイブリダイゼーション後、非ハイブリダイズ化プローブを、１００ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中のＢ　ｉ　 ｏ−Ｇｅ　ＩＡ−５（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ 。
ＵＳＡ）カラム（１ｃｍｘ２８　ａｍ）上でゲル濾過することにより、ファージ ＤＮＡ及びハイブリッド分子（即ち、ブローブー標的ハイブリッド）から分離し た。８０分画（各々５滴）を収集した。ファージＤＮＡ及び非ハイブリダイズ化 プローブの溶離位置を、クロマトグラフィーを別々に実施して確定した。
ファージＤＮＡの溶離位置は、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（ビス−ベンズイミ ド）染料（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａ、ｎａｐｏ ｌｉｓ。
Ｔｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７，５に溶解した０、１５Ｐｇ／ｍｌの染料；　３５４　ｎ　ｍで励起；４５４ ｎｍで放射；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒＬＳ−３蛍光分光光度計を用いる）を用 いて、蛍光光度ＤＮＡ検定により、カラム分画の４０μｍアリコートから確定し た。非ハイブリダイズ化ＤＮＡプローブの溶離位置は、プローブ上の３２Ｐ−標 識、ｙはプローブ内のｎｖＤＮＡセグメントから増幅されたＱβ複製生成物質の 検出により確定した。−ここで図９（ａ）及び９（ｂ）を１＃照、すると、Ｘ軸 はカラムからの分画数を示し２、Ｙ軸は各分画中に存在する放射能の量（ｃｐｍ ）を示す。Ｑβレプリカーゼの存在下で物質を増幅することが示された特定の分 画をプラス（＋）で示し、一方Ｑβ１ノブリカーゼの存在下で物質を増幅するこ とが示されなかった特定の分画をマイナス（−）で示す。図９８は、標的を含有 する断片とのハイブリダイゼーシヨンの結果を説明し、図９ｂは標的を含有し２ ない断片とのハイブリダイゼーシヨンの結果を示す。
Ｍｌ　３ｍｐ　１９中の１ａｃＺ遺伝子に対するプローブのハイブリダイゼーシ ョンは、Ｍ１３ｍｐ１９　ＤＮＡピークにおけるプローブの存在により示され、 放射性標識の検出により、及び次の段に記載されているようにＱβレプリカーゼ により増幅可能なり　Ｎ　Ａの存在によって確定された。
それぞれ、ファージＤＮＡ及びハイブリッド分子からの非ハイブリダイズプロー ブの分離後、φＸ１７４Ｉ）ＮＡ及びＭ１３ｍｐ１９　ＤＮＡ（ハイブリッド分 子を含む）を有する試料を、実施例１に記載の手順にしたがって、増幅のために リボヌクレオシド三燐酸塩及びＱβレプリカーゼと混ぜ合わせたが、但し増幅か らの生成物質は、エチジウムプロミド蛍光を測定するＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ 蛍光分光光度計で測定した（水に溶解（、た０、５μｇ／ｍｌ染料；５３０ｎｍ で励起；６００ｎｍで放射）。
ここで、以下の表２を参照すると、Ｍｌ　３ｍｐ　１９　ファージＤ　Ｎ　Ａで ハイブリダイゼーション後、ハイブリッドＤＮＡピーク分画は１２３０ｃｐｍを 含有し、Ｑβ増幅後に１４８５蛍光単位のＲＮＡを生じたことが分かる。ハイブ リダイゼーション及び検出工程の特異性は、非相同模造標的Ｄ　Ｎ　Ａ　（φＸ １．７４ファージＤＮＡ）　を用ｕｌて！ｉ証り、り。＄Ｘ１７４ＤＮＡとのハ イブリダイゼーション後にＢｉＯＧｅ１Ａ−５カラムから溶離されたハ・ｒブリ ッドを含有し、たと考えられるピークは、放射性標識化プローブのバックグラウ ンドＬノベルのみを含有し、検出可能ＲＮＡはＱβ増幅によって生成されなかっ た。
実施例７ 本実施例は、ｃＤＮＡ合成／増幅手順を説明する。本実施例では、プローブは（ ↓）１１ｎｖＲＮＡであり、−力積的は、（↓）鎖ｎｖＤＮＡの３°末２１ｉ２ １塩基と相補的な２】−塩基（−）鎖Ｄ　Ｎ　Ａ配列である。７５ピコモルのプ ローブを、７０℃で５μｌの１ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭクエ ン酸ナトリウム）に溶解した、それぞれ７５０ピコモル、７５ピコモル、８００ フ工ムトモル、８フ工ムトモル、８０アトモル、８００チボモル、８チポモル、 又は０モルの標的と混合して、標的及びプローブ配列間のハイブリダイゼーショ ンを刺激した。１μｍのこのハイブリダイゼーション液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ８，３，７、５ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１。
０．７５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、１９ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭＭｇｃ１　． １０ｍＭ　ＤＴＴ、各々１ｍＭのｄＮＴＰ及び２，２単位のＡＭＶ逆転写酵素／ μｍの最終濃度を有する反応混合液に希釈し、４２℃で１時間インキュベートし て、原ＲＮＡプローブのｃＤＮＡコピーを合成した。原ＲＮ　Ａプローブは、９ μｌのこの混合液を９０℃で１５分間、１００μｌのＩＮ　ＮａＯＨと混ぜ合わ せて、次に氷上で混合液を冷却することにより、破壊した。１００μｌのＩＮ　 ＨＣＩを添加して、溶液を中和した。４μｍのこのＲＮＡ無含有ｃＤＮＡ溶液を 、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１００ｍＭＮ　ａ　Ｃｌ　−１ ５ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２　、各々１ｍＭの４つのりボヌクレオシド三燐酸（ 即ち、ｒＮＴＰｓ）ＡＴＰ、ＧＴＰ。
ＵＴＰ、及びＣＴＰ、並びにＬＯＯａｇ／ｍｌのＱβレプリカーゼを含有する増 幅混合物に転移させた。混合液を３０℃で６０分間インキュベートした。反応生 成物質は、実施例２に記載されているようなポリアクリルアミドゲル電気泳動後 に可視化した。
Ｑβレブリカーゼ反応液に溶解した２０アトモルより多い又　〜は等量の標的を 含有する試料（これはハイブリダイゼーション工程で８フ工ムトモルの標的を示 す）を、本方法により検出した。ＲＮＡプローブを含有し標的ＤＮＡを含まない ハイブリダイゼーション族は、本方法を用いても検出可能な生成物質信号を発し なかった。
実施例８ 本実施例は、標的として精製サルモネラゲノムＤＮＡを用いた結紮／増幅手順を 説明する。オリゴヌクレオチドＰＭ１０５９　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５９ の配列を有する：ＰＭＩ　０５９を作るためにＰＭ７５４の５°端に付加された デカヌクレオチドに関してＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５４と比較）、及びＰＭ７６ ４　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア６４の配列を有する）を、サルモネラＤＮＡの隣 接配列に対してハイブリダイズして一緒に集めて、標的特異的方法で結紮した。
オリゴヌクレオチドＰＭＩ　Ｏ５９をパラ磁気粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇ ｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｔ、Ｎｏ。
４１００Ｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）にその５′末端で共有結合させた。３０ μｌ　（３０μｇ）のＰＭＩ　Ｏ５９粒子を、磁気濃縮器（ＤＹＮＡＬ、Ｃａ　 ｔ、Ｎｏ、ＭＰＣＥ、Ｏｓ　ｌｏ。
Ｎｏ　ｒｗａ　ｙ）を用いて１分間濃縮し、４８μｌのハイブリダイゼーシヨン 溶液（５ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，１％　ＢＳＡ、２％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００）中に懸濁し、５５℃で１５分間前ハイブリダイズした。
１５分後、１μｌ（１フ工ムトモルを含有する）のＰＭ７６４、及びネズミチフ ス菌（ＡＴＣＣＮｏ、１４０２８）からの２μｌ（３３０ｎｇ又は１１００ａを 含有する）の精製変性（５分間沸騰させた）ＤＮＡをハイブリダイゼーション溶 液に添加した。ハイブリダイゼーションは５５℃で１時間進行した。ハイブリダ イゼーション後、粒子を１分間磁気濃縮し、２ｘＳＳＣ，０，１％Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００で２回洗浄した。各洗浄は、２２０μｍの洗浄液を添加し、手短に かき混ぜて、粒子を再懸濁し、ＰＭＩ　Ｏ５９粒子を１分間磁気濃縮して、洗浄 液を除去することを包含した。二次洗浄液の除去後、粒子を５０μｍの結紮／増 幅緩衝液（結紮／増幅緩衝液：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ。
ｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＭｇＣ１，１０ｍＭ　ジチオトレイトール、１００　ｐ 　Ｉ　／　ｍ　Ｉ　ウシ血清アルブミン、５００ｎＭＡＴＰ、及び各々１ｍＭの ４つのｒ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ｓ　）　、及び５Ｗｅｉｓｅ単位のＴ４　ＤＮＡリガー ゼ中に再懸濁し、３０℃で１時間インキュベートした。次に、５μｌのＱβレプ リカーゼ（１ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を結紮反応に添加し、３０℃で１時間イン キュベートして、結紮物質を増幅した。反応は、５５μｌの２ｘ停止溶液を増幅 反応混合物に添加することにより終結させた。
増幅の生成物質を、実施例２に記載されているように８％変性ポリアクリルアミ ドゲル上で分析した。分離生成物質を０．１ｘＴＢＥ中で４０ボルトで２０分間 、Ｈｙｂｏｎｄ　ナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃａｔ、Ｎｏ、ＲＰ Ｎ。
２０３Ｎ）に電気泳動で転移させた。３０２ｎｍの紫外線下でフィルターを可視 化して、染色物質の転移を確証した。
５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。
Ｃａｔ、Ｎｏ、４０００７１．Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。
Ｃａ　１　ｉ　ｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて２５４　ｎｍで、フィルターを １２００μｓの紫外線に暴露することにより、フィルター上のＲＮＡ物質をフィ ルターに架橋結合した。次に、２０ｍ１のハイブリダイゼーション溶液Ｂ　（５ ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，１０％硫酸デキストラン、１００μｇ　／　ｍ　１変性ニシン 精子ＤＮＡ、４０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ４、及び５ＸＤｅｎｈａｒｄｔの溶 液）中で、６５℃で１時間、フィルターを前ハイブリダイズした。このハイブリ ダイゼーションのためのプローブは、ＳＥＱ　ＩＤた。オリゴヌクレオチド　Ｐ Ｍ４０７は、オリゴヌクレオチドＰＭＩ　Ｏ５９中に存在するサルモネラ配列に 対応する。このプローブによるハイブリダイゼーシヨンは、ＰＭ１０５９が単独 では増幅性ではないため、増幅化結紮生成物質の存在を示す。
プローブ　ＰＭ４０７を、１０μｍの容量中で３７℃で１時間、３２ＰＯ４でキ ナーゼ標識した。９０℃で３分間、キナーゼを熱不活性化後、全標識反応混合液 をハイブリダイゼーション溶液及びフィルターに添加した。ハイブリダイゼーシ ョンは６０℃で４時間道行した。フィルターを、室温で洗浄液（２ｘＳＳＣ。
０６１％５ＤＳ）を用いて簡単に、その後６０℃で洗浄液を用いて１５分間洗浄 した。次に、フィルターを２つのＤｕＰｏｎｔＣｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎ ｇ　Ｐｌｕｓ増感スクリーンを用いて一８０℃で１６時間、Ｋ　ｏ　ｄ　ａ　ｋ ＸＡＲ−５フイルムに露出した。
結果は、ＰＭ４０７が、約１２０ｂｐの大きさのＲＮＡ生成生成物対してハイブ リダイズしたことを示す。サルモネラ標的核酸を含有しなかった結紮／増幅反応 に平行して、プローブを用いた増幅化生成物質のハイブリダイゼーションは観察 されなかった。これは、標的特異的結紮／増幅が起きたことを示す。
実施例９ これは、ミディ変異体ＤＮＡ増幅の実施例である。本実施例に用いる鋳型　ｐＭ ＤＶ　Ｘｈｏｒは、組換えミディ変異体ＤＮＡ（Ｍｉｌｌｓ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　 ａｌ、（１９７８）Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　ｌ　。　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 、７５：５３３４−５３３８）の配列を有するセグメントを含有する二重鎖プラ スミド　ｐＳＰ６４　（Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、、ｅｔａｌ、（１９８４）　Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２ニア０３５−７０５６）である（図１０）、ｐＭ ＤＶ　Ｘｈｏ　１の２７４ｂｐ　Ｈ４ｎｄｌＩＩ−Ｐｓｔｌの配列は、５ＥＱＩ Ｄ　ＮＯ：１で示される。この断片は、ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ：１の配列の塩基対 ３５〜塩基対２６６（両端を含む）であり、゛ミディ変異体配列の６６〜７５位 置、及びＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１の１００〜１０９位置に存在するＸｈｏＩ部位 を含む１０個の塩基対ＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧの挿入によって修飾されるミディ変 異体ＲＮＡ　（Ｑβレプリカーゼにより口触的複製化され得る）の配列を有する ｍｖＤＮＡセグメント（”ミディ変異体１ＤＮＡ）を含む。それぞれＰｓｔ　Ｔ 又はＳｍａ　Ｉによる制限エンドヌクレアーゼ消化は、図１０に示される部位で プラスミドｐＭＤＶ　Ｘｈｏｌを切断する。基質を、ＩＮ　ＮａＯＨ中で８０℃ で１５分間前パイプリダイズし、等量のＨＣＩを添加して中和し、その後、レブ リカーゼ反応中にそれらを入れて、ＲＮＡ鋳型による汚染の可能性を除去した。
対照実験として、各塩基処理Ｄ　Ｎ　Ａ鋳型の試料にも、５単位のＲＱＬ　ＲＮ アーゼ無含有ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を３７℃で６０分間添加して、ＤＮアーゼ処理を施し た。
ミディ変異体ＤＮＡ含有ＤＮＡは、以下の成分を含有する２５μｍの反応容器中 の１フ工ムトモルの鋳型の添加によりＱβレプリカーゼによるＤＮＡ依存性ＲＮ Ａ重合のための鋳型として役立った： １００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５；１５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２ 　； 各々１ｍＭのりボヌクレオシド三燐酸ＡＴＰ、ＧＴＰ。
ＵＴＰ、ＣＴＰ　。
２０μｇ／ｍｌ　Ｑβレプリカーゼ。
５マイクロキユリー（６，２５ピコモル）のα−３２Ｐ　−ＣＴＰ　（ＤｕＰｏ ｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔ ｏｎ、ＭＡ）の添加後、混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。増幅は 、ＧＦＦフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ。
Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）上に反応液の一部をスポツティングし、 水冷１０％トリクロロ酢酸／１％ピロ燐酸ナトリウム中にフィルターを浸漬させ て合成ＲＮＡを沈殿させることにより、モニタリングした。フィルターを水冷５ ％トリクロロ酢酸で４回洗浄して、次に液体シンチレーシタンによって計数した 。
結果（表３）は、増幅がミディ変異体ＤＮＡ配列の存在に依存することを示す。
さらに、暴露された標準３”末端を有する分子（Ｓｍａ　ｒ−消化物質）、又は 他のＤＮＡ配列内に埋め込まれた標１！３゛末端を有する分子（Ｆ’ｓｔ　Ｉ− 消化物質）はともに、増幅可能鋳型として役立つことを示す。さらに、主に超螺 旋化される非消化プラスミドも有効な基質を作る。
表３ ミディ変異体配列のＤＮＡ依存性増幅 実施例１０ 本実施例は、ＱβレプリカーゼのＤＤＲＰ活性による増幅のためのキメラＤＮＡ −ＲＮＡ鋳型の使用を指示する。
実施例１の増幅及び検出手順にしたがったが、但し、５゛末端の３塩基及び３′ 末端の６塩基がリボヌクレオチドであることを除いてナノ変異体玉鎖ＤＮＡ　（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４４４）と同じ配列を有する１０．１、又は０．１チポモ ルのキメラ鋳型　ＰＭ１０７０　（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：１０７０）を３０℃で６ ０分間増幅させた。増幅は、１チポモル又はそれ以上の鋳型を用いて再現可能的 に、そして０．１チポモルの鋳型を用いて実施したいくつかの実験において観察 された。鋳型が　−存在しない場合には、増幅は観察されなかった。
塩基３８．３９．６８、及び６９がリボヌクレオチドであり、ＮＡ ５’　−ＡＴＡＡＧＣＧＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＣＣ−３“がｎｖ　（ ＋）ＤＮＡの３′末端に接合することを除いて、ナノ変異体玉鎖ＤＮＡ配列と同 じ配列を有する二次キメラ鋳型ＰＭ１５００（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５００） も増幅した。
実施例１の増幅手順にしたがったが、但し、１０チポモルの鋳型　ＰＭ１５００ を、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１３ｍＭ　ＭｇＣｌ　、 各々１ｍＭのｒＮＴＰ。
及び１００μｇ／ｍ　ＩのＱβレプリカーゼ中で３０’Ｃで６０分間増幅した。
増幅化物質をマイクロ滴定皿に入れ、実施例１と同様に可視化した。１ｏチポモ ルのＰＭＩ　５００は増幅したが、一方鋳型の非存在下での可視的増幅が認めら れなかった。
実施例１１ 本実施例は、ｎｖ　（＋）ＤＮＡ及びｎｖ−キメラ鋳型の増幅の感受性を説明す る。“キメラ°鋳型は、その配列中に側路ヌクレオチド及び２゛−デオキシリボ ヌクレオチドをともに有するものである。
変動量のｎｖ　（＋）ＤＮＡ　（ＰＭ４４４）及びｎｖ−キメラ（ＰＭＩ　Ｏ７ ０）を、１０μｌ容量の７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，６，１０ｍＭ　 ＭｇＣｌ　、５ｍＭ　ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、各々１ｍＭのｒＮＴＰ、 及び１００μｇ／ｍｌのＱβレプリカーゼ中で、３０℃で３Ｑ分間又は６０分間 増幅した。反応は、等容量の２Ｘ停止溶液を添加して停止させた。反応媒賀を放 射線照射し、実施例１と同様に可視化した。各条件下で増幅された各鋳型の最小 量を、表４に示す。
表４ 実施例１２ 本実施例は、ｍｄｖＤＮＡ鋳型の増幅の感受性を説明する。
変動量のｍｄｖＤＮＡ　（ｐＭＤＶ　Ｘｈｏ　Ｔのゲル精製Ｐｓｔ　Ｉ／Ｓｍａ 　ｒ断片１図１０）を、実施例９に記載されているのと同様に塩基処理し、増幅 し、検出したが、但し、増幅は３０℃で実施した。結果を表５に示す。
表５ 実施例１３ 本実施例は、塩化マンガンの存在下でのＤＮＡ及びキメラ鋳型の増幅の感受性を 説明する。
変動量のｎｖ　（＋）ＤＮＡ　（ＰＭ４４４）及びｎｖ−キメラ（ＰＭＩ　Ｏ７ ０）を、１０μｌ容量の７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ、ｐＥ（７，６，１０ｍＭ 　ＭｇＣｌ　、１ｍＭＭｎＣｌ　、５ｍＭ　ＤＴＴ、各々１ｍＭのｒＮＴＰ、及 び１００μｇ／ｍｌのＱβレプリカーゼ中で、３０’Ｃｔ”３０分間又は６０分 間増幅した。反応は、実施例１１に記載されているようにして停止させ、可視化 させた。反応生成勧賞を、実施例２に記載されているのと同様にして、ポリアク リルアミド−尿素変性ゲルによる電気泳動によって分析した。Ｍ　ｎ　ＣＩ　２ の存在下では、鋳型の非存在下での増幅は反応の３０分又は６０分後に起きる。
しかしながら、反応は覆々の大きさの核酸生成物置の混合物を生じるが、我々は これを“新規の　ｄｅｎｏｖｏ”合成と呼ぶ（Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ。
（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．８９−９１参照）。本物の鋳型が存在し 、増幅される場合、９ｏ塩基生成物賀として移動する生成物質は、ｄｅ　ｎｏｖ ｏ合成のバックグラウンド上に見える。鋳型特異的増幅の確証は、実施例２に記 載されているように、電気泳動で分離された物質とプローブＰＭ６２４とのハイ ブリダイゼーションにより実証した。ノｈイブリダイゼーシコンは、鋳型が存在 し、増幅された場合にのみ観察された。
ハイブリダイゼーシヨンは、ｄｅ　ｎｏｖｏ合成により生成された物質を用いて は起きなかった。
各条件下で一貫して増幅された各鋳型の最小量を、表６に示す。
表６ 反応混合液中に０　、　５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃ］　２を用いても、同様の結果 が得られた。反応混合液中に２　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２を用いると、−貫し て観察可能であった標的の最小検出量は、１ｍＭＭ　ｎ　Ｃｌ　を用いた場合と 同じであったが、しかし増幅による９０塩基標的セグメント含有生成物質の量は 低かった。
０　、２５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃ＋　２の場合は、９０塩基標的セグメント含有 増幅生成物質の生成の感受性又は速度に及ぼす影響は、Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２を用い ない場合の生成の感受性及び速度と比較して、はとんど又は全く認められなかっ た。
実施例１４ 本実施例は、塩化コバルトの存在下でのｎｖ　（＋）ＤＮＡ鋳型の増幅の感受性 を説明する。
変動量のｎ　ｖ　（＋）　ＤＮＡ　（ＰＭ４４４）を、１０μｍ容量の７０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，６、ｌＱｍＭＭｇＣｌ　、１ｍＭ　ＣｏＣｌ２、 各々１ｍＭのｒＮＴＰ、及び１００μｇ　／　ｍ　ｌのＱβレプリカーゼ中で、 ３０℃で３０分間増幅した。反応は、実施例１１に記載されているようにして停 止させ、可視化させた。反応生成物質を、実施例２に記載されているのと同様に して、ポリアクリルアミド−尿素変性ゲルによる電気泳動によって分析した。Ｃ ｏ　ＣＩ　２の存在下では、鋳型の非存在下での増幅は反応の３０分以内に起き て、ｄｅｎｏｖｏ合成により種々の大きさの核酸生成物質の混合物を生じる。本 物の鋳型が存在し、増幅される場合、約９０塩基に相当する位置に移動する一つ 又はそれ以上の顕著な生成物質が、ｄｅ　ｎｏｖｏ合成のバックグラウンド上に 観察される。鋳型特異的増幅の確証は、実施例２に記載されているように、電気 泳動で分離された物質とプローブＰＭ６２４とのノ＼イブｉノダイゼーションに より実証した。ノ＼イブリダイゼーシジンは、少なくとも１チポモルの鋳型が存 在した場合にのみ観察された。）Ｓイブリダイゼーションは、ｄｅ　ｎｏｖｏ合 成により生成された物質を用いては起きなかった。
本明細書は、かなり特殊な例を含めて本発明を説明してきたが、本発明の精神を 逸脱しない限りにおいて多数の変更及び修正がなされることは当業者には理解さ れている。このような修正及び変更は本明細書中の説明及び請求の範囲として本 発明に包含される。
配列表 （１）全般的資料 い）出願人：Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（冒）表題：ＲＮＡＮブ レカーゼのＤＮＡ依存正ＲＮＡポリメラーゼ活性による核酸増幅 （ｉ　ｉ　ｉ）配列数＝２６ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４４４に関する資料（１）配列特性 （Ａ）長さ：９０塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４４４配列図（３）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：５５ ０１．：関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：８８塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ○＝５５０配列図ＧＧＧＴＣＡＡＣ （４）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７８に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、７８塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７８配列図（５）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８５ ＋、：関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ＝６７塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８５配列図（６）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４９ に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ二８７塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖　−重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４９配列図ＴＣＡＡＣＣＣ （７）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９２８に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ・９０塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ：　９２８配列図ＧＧＡＴＴｒＣＣＣＣ （８）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０３に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ＝１２９塩基 （Ｂ）種類　Ｄ　Ｎ　Ａ （Ｃ）鎖・−重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０３配列図ＡＡＴＣＡＴＣＴＣ （９）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０１に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さニア０塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：６０１配列図（１０）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・６３ ４に関する資料（１）配列特性 （Ａ）長さ＝１１９塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：６３４配列図（１１）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５ １１ｍ関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１３８塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５１配列図（１２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５ ４１：関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、６１塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・７５４配列図ＧＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡＣ ＣＡＧＧ　ＡＴ入入ＣＣＧＧＧＴ　Ｔ！ＴＣＴＣＡＡＴＡ（１３）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ＋７６４１：Ｈすル資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さニア７塩基 （Ｂ）種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ （Ｃ）ｍｌニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア６４配列図（１４）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０ １６に関する資料　−（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、６１塩基 （Ｂ）種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ （Ｃ）鎖、−重鎖 （ｘｉ）ｊＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０１６配列図ＧＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡ ＣＣＡＧＧ　ＡＴＪ’ＪｉＣＧＧＧＧＴ　ＴｒＴＣＴＣλＧＧＴＣＡＡＣＴＧＡ ＡＣＧ　ＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴ　Ｔ（１５）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２１９に関 する資料（１）配列特性 （Ａ）長さ・５７塩基 （Ｂ）Ｎ類：　ＤＮＡ （Ｃ）ａｌｌニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２２１９配列図（１６）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア ５６に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ＝４８塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎮 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７５６配列図（１７）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２ ０５８に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：４８塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖・−重鎮 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０５８配列図ＧＧＣＧＡＣＡＡＣＡ　ＴＣＡＡ ＴＧＧＣＧＣＴｒＡＴＡＡＡＧＣＴ　ＣｋＧＧＧＣＧＴＴＣＡＧＴＴＧ入ＣＣ （１８）ＳＥＱ　ｒｐ　ＮＯ：６１８１こ関する資料（１）配列特性 （Ａ）長さ　６６塩基 （Ｂ）種類　ＤＮＡ （Ｃ）鎖　−重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１８配列図（１９）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２ ４に関する資料（ｉ）配列特性 （八）長さ　６６塩基 （Ｂ）種類：　ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ○＝６２４配列図（２０）ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ・４０ ７（こ関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ・２４塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎮 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０７配列図ＡＴＡＡＧＣにＣＣＡ　ＴＴＧＡＴ ＧＴＴＧＴ　ＣＧＣＣ−（２１）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２００４に関する資料（ ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、５７塩基 （Ｂ）ＩＩ類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２００４配列図（２２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２１２３に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：４８塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）ＩＩ・−重鎮 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２１２３配列図ＴＧＧＴＴＡＧＧＣＣＧＴＡＴＧ ＣＣＧＴＡ　ＣＡＡＡＧＧＣにＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧ　ＧＣＧＣＴＴＡＴ（ ２３）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１に関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２７４塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖：二重鎖 （ｉｘ）特徴 （Ｄ）配列は、長さ２７４ｂｐと考えられる、プラスミドｐＭＤＶ　Ｘｈｏｌの Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲ１断片の配　−列である。両端を含む塩基３５〜２６ ６の間のセグメントの両鏡は、配列中に示されるように、Ｑβ−レブリカーゼ増 幅性である。塩基７及び５１の”Ｎ’　ｓ”は、別々にＧか又は塩基なしである 。塩基２６０及び２６１の“ＮＮ”は、ＧＧ、Ｃ又は塩基なしである。塩基２６ ２のＫがＴであるかＧであるかは分（２５）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１０５９に関 すＡ沓餌入ＡＧＣＴＴＮにＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＡ　ＴＡＣＣＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＧＧ入Ａ（２４）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２に関 する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ＝２３２塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖：二重鎖 （ｉｘ）特徴 （Ｄ）配列は、長さ２３２ｂｐと考えられる（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：ｌに記載され ているＤＮＡ断片の塩基対３５〜２６６）、ミディ変異体ＤＮＡの配列である。
塩基１７の“Ｎ”は、Ｇか又は塩基なしである。塩基２２６及び２２７の“ＮＮ ”は、ＧＧＳＣ又は塩基なしである。塩基２２８のＫがＴであるかＧであるかは 分からない。
（ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１配列図（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ　７１塩基 （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５９配列図（２６）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ０７０１．：関する資料（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：９０塩基 （Ｂ）橿原　ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ （Ｃ）鎖ニー重鎖 （ｉｘ）特徴 （Ｄ）５°一端の３つのヌクレオチド、及び３°一端の６つのヌクレオチドはり ボヌクレオチドである。
（ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０７０配列図ＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣ （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：９０塩基 （Ｂ）種ｈ：ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ （Ｃ）鎖・−重鎖 （ｉｘ）特徴 （Ｄ）位置３８．３９．６８、及び６９のヌクレオチドはりボヌクレオチドであ る。
（ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１５００配列図ＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣ 図１ （輻されたＲＮＡ シグナル □８　レブリカーゼ増幅可能セグメント〜〜〜〜へ＝アンチ漂的セグメント □８　筆１３セグメント ■　＝　リポータ−セグメント 図２ 図３ シグナル 図４ シグナル 図５　＼ 図７ 図６ ＤｒａＩ工　２７６２ 図９ フラツジぢン 図１０ ｍｄｖ−Ｘｈｏｌ配列を含むプラスミド＋（ｉ＋１ｄｌｌ！からＥｃｏＲＩまで のＤＮＡ配列ＧＧＧＡＣにＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＧＧＧＡＧ ＴｒＣＧＡＣＣＧＴＣ，ＡＣＧＡＧ　ｑユニｘｄ■冨１八Ｇ　ＴＣＡＣＧ８２０ ０．１．コＯ，，，，０，，４０，，，，，，、，５０，、、、、、、，６０， 、、、、、、，７０，、、、、、、，８０ＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＴｒＣＧＣＣＣ ＴＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＧＴＧＣＧＴ１１９１９、９０．、、、、、．１００．、、、、、．１１０． 、、、、、．１２０．、、、、、．１１０．、、、、、、、ｉ４゜ＴＴＣＧＧＴ ＧＡＣＧＣＡＣＧＡにＡＡＣＣＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴにＧ ＣＣＣＣＴＴＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣ ＧＡＡＧＧＧＧｑｇヒＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣ、、、−、，２１０，、、、、 、，２２０，、、、、、，２］０．、　、、、、．２４０ミディ変八体及び挿入 配列を列挙した。
要　約 本発明は、ＱβレプリカーゼのようなＲＮＡＮブレカーゼが、２′−デオキシリ ボヌクレオチドを包含し、Ｎプレカーゼにより口触的複製可能なＲＮＡの配列を 有する、ＤＮＡセグメント及びＤＮＡ　：　ＲＮＡキメラセグメントを含めた核 酸セグメント、、！：　トモｔ：、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポ＋））　ラ−−ｔ’　 （”ＤＤＲＰ’″）活性を有するという発見に基づいてそれらを実施するための 方法及びキットを包含する。このＤＤＲＰ活性の発見は、ＲＮＡＮプレカーゼに より口触的複製可能なＲＮＡの配列を有するＤＮＡセグメントを伴う核酸がＮプ レカーゼのための基質として提供される核酸増幅のための本発明の方法を提供す る。Ｎブレカーゼは、ＤＮＡセグメントからのＲＮＡの合成を触媒し、次いでＮ プレカーゼは自勉的に複製する。本発明は、核酸ブローブハイプリダイゼーンヨ ン検定の場合と同様に、核酸分析対象物を検出する場合の増幅方法の使用を包含 する。本発明のこのような検定は、自勉的に複製されて多量の容易に検出可能な リポータ−分子を提供する口触的複製可能ＲＮＡのＲＮＡＮブレカーゼのＤＤＲ Ｐ活性により触媒されるセグメントからの生成により増幅可能なりＮＡ上セグメ ント生成するために含宵するか又はプロセッシングされる一つ又はそれ以上の核 酸プローブで核酸分析対象物がハイブリダイズされるものを含む。
国際調査報告

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. １．２′−デオキシリボヌクレオチド、又は２′−デオキシリボヌクレオチドと リボヌクレオチドの両方を包含し、ＲＮＡレプリカーゼにより自触的複製可能な ＲＮＡの配列を有する複合核酸セグメントの増幅方法であって、上記セグメント を含有する試料に上記レプリカーゼによる自触的複製に有効な条件を施すことを 包含する方法。
  2. ２．上記複合セグメントがＤＮＡセグメントである請求項１記載の方法。
  3. ３．上記複合セグメントがＤＮＡのセグメントである請求項２記載の方法。
  4. ４．上記複合セグメントが一重鎖核酸のセグメントである請求項１記載の方法。
  5. ５．上記複合セグメントが一重鎖核酸のセグメントである請求項２記載の方法。
  6. ６．上記複合セグメントが一重鎖ＤＮＡのセグメントである請求項３記載の方法 。
  7. ７．上記複合セグメントが二重鎖又は部分的二重鎖の核酸の鎖のセグメントであ る請求項１記載の方法。
  8. ８．上記複合セグメントが二重鎖又は部分的二重鎖の核酸の鎖のセグメントであ る請求項２記載の方法。
  9. ９．上記複合セグメントが二重鎖又は部分的二重鎖の核酸のＤＮＡ鎖のセグメン トである請求項３記載の方法。
  10. １０．二重鎖又は部分的二重鎖の核酸の両鎖がＤＮＡである請求項９記載の方法 。
  11. １１．レプリカーゼがＱβレプリカーゼである請求項１〜１０のいずれかに記載 の方法。
  12. １２．レプリカーゼによる自触的複製に有効な条件が、増輻が生じる溶液中に、 約０．５ｍＭより高い濃度でＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、及びＺｎ＋２から成る群から 選択されるイオンを有することを包含する請求項１〜１０のいずれかに記載の方 法。
  13. １３．自触的複製に有効な条件が、増幅が生じる溶液中に、約０．５ｍＭ〜約５ ｍＭの濃度でＭｎ＋２及びＣｏ＋２から成る群がら選択されるイオンが存在する ことを包含する請求項１２記載の方法。
  14. １４．試料が予め選択された標的核酸セグメントを包含する場合のみＲＮＡレプ リカーゼにより自触的複製可能である、リポータ−ＲＮＡを作製するための核酸 を包含する試料の処理方法であって、（ａ）プローブの少なくとも１つが標的セ グメントのサブセグメントに対してハイブリダイズ可能であるとすれは、その各 々は標的セグメントのサブセグメント又は標的セグメントのサブセグメントの補 体に対してハイブリダイズでき、（ｉ）本方法に１つのプローブを用いる場合、 上記プローブは２′−デオキシリボヌクレオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ又 はリポータ−ＲＮＡの補体の配列を有する複合核酸セグメントを作るためにプロ セッシングされるか又はプロセッシングされ得るし、あるいは（ｉｉ）１つ以上 のプローブを本発明に用いる場合は、上記プローブは、２′−デオキシリボヌク レオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ又はリポータ−ＲＮＡの補体の配列を有す る複合又は破断複合核酸セグメントを作るためにプロセッシングされ得る、一つ 又はそれ以上の核酸プローブで核酸の試料の一次アリコートを処理し；（ｂ）（ ｉ）一重鎖プローブの一部として提供されない場合には、２′−デオキシリボヌ クレオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ又はその補体の配列を有する上記複合又 は破断複合核酸セグメントが作られ、標的セグメントが試料中に存在する場合の み工程（ｃ）に関して十分な量で残留し、（ｉｉ）工程（ｂ）（ｉ）にしたがっ て残留する上記複合又は破断複合核酸セグメント以外で、リポーターＲＮＡ又は その補体の配列を有する任意の核酸セグメントの量が工程（ｃ）に関して非有意 の量に低減される、二次アリコートを調製するために上記の単数又は複数のプロ ーブを含有する上記一次アリコートをプロセッシングし；そして（ｃ）二次アリ コート、又は上記二次アリコートから得られた三次アリコートに上記レプリカー ゼの存在下での目触的複製に有効な条件を施すことを包含する方法。
  15. １５．全プローブがリボヌクレオチド又は２′−デオキシリボヌクレオチドから 成る請求項１４記載の方法。
  16. １６．一重鎖プローブを用いる請求項１５記載の方法。
  17. １７．プローブがＤＮＡであり、工程（ｂ）のプロセッシングが標的セグメント に対してハイブリダイズされないプローブのエキソヌクレアーゼ消化を包含する 請求項１６記載の方法。
  18. １８．プローブの抗標的セグメントに隣接し、その５′端から５′方向に伸び、 ジリボヌクレオチドを包含するＲＮＡレプリカーゼにより触媒されるリポータ− ＲＮＡ又はその補体の合成のための鋳型であり、ＲＮＡレプリカーゼにより触媒 されるリポータ−ＲＮＡ又はその帆他意の合成のための鋳型として負活性にさせ る塩基による処理又はリボヌクレアーゼによる消化によって上記ジリボヌクレオ チドのリボヌクレオチド間を切断し得る増幅性セグメントをプローブが包含し； そして工程（ｂ）のプロセッシングが、（ｉ）必要により、標的核酸を処理して 、標的セグメントを、鋳型としてプローブを用いて鎖延長のプライマーとして有 効なプローブに対してハイブリダイズさせ；（ｉｉ）鋳型としてプローブを用い て標的セグメントの延長生成物質を合成し、それにより上記延長生成物質の少な くとも一部がプローブの増幅性セグメントの配列と相補的な配列を有する複合Ｄ ＮＡセグメントを包含し、上記合成が活性を提供する酸素の逆転写酵素活性によ り触媒され；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の合成後に、塩基又はリボヌクレアーゼで 試料のアリコートを処理して、プローブの増幅性セグメントをＲＮＡレプリカー ゼにより職倍されるリポータ−ＲＮＡ又はその補体の合成のための鋳型として不 活性にさせ；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の処理後、しかし工程（ｉｉｉ）の処理を 施されたアリコートに上記レプリカーゼの存在下での自触的複製に有効な条件を 施す前に、塩基を中和するか又は工程（ｉｉｉ）の処理に用いたりボヌクレアー ゼを不活性化することから成る請求項１６記載の方法。
  19. １９．プローブがＲＮＡであり、プローブの増幅性セグメントの切断が塩基を用 いた処理による請求項１８記載の方法。
  20. ２０．標的の延長生成物質の合成を触媒する逆転写酸素活性を提供する酵素が、 ＡＭＶ逆転写酵素及びＭＭＬＶ逆転写酸素から成る群から選択される請求項１９ 記載の方法。
  21. ２１．レプリカーゼがＱβレプリカーゼである請求項１４〜２０記載の方法。
  22. ２２．レプリカーゼによる自触的複製に有効な条件が増幅が生じる溶液中に約０ ．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度でＭｎ＋２及びＣｏ＋２から成る群から選択されるイ オンを有することを包含する請求項２１記載の方法。
  23. ２３．２つのプローブを用い、標的セグメントが２つのサブセグメントから成り 、この各々に対してプローブの１つがハイブリダイズする請求項１５記載の方法 。
  24. ２４．標的セグメントの２つのサブセグメントがギャップによって分離され、工 程（ｂ）のプロセッシングが、延長し、プライマー延長反応において２つのサブ セグメント間の標的セグメントのギャップを鋳型として用いて、プローブの１つ が標的に対してハイブリダイズして延長プローブを形成し、この延長がＤＮＡセ グメントであって、その３′末端が、上記延長プローブ及びその他の非延長プロ ーブが標的セグメントに対してハイブリダイズされる場合は、上記非延長プロー ブの５′末端に隣接する請求項２３記載の方法。
  25. ２５．標的セグメントの２つのサブセグメントが互いに隣接する請求項２３記載 の方法。
  26. ２６．工程（ｂ）のプロセッシングがさらに、標的セグメントに対してハイブリ ダイズされた上記延長プローブを標的セグメントに対してハイブリダイズされた 上記非延長プローブに結紮することを包含する請求項２４記載の方法。
  27. ２７．工程（ｂ）のプロセッシングがハイブリダイズされた２つのプローブを標 的セグメントに結紮することを包含する請求項２５記載の方法。
  28. ２８．プライマー延長反応後に、標的セグメントに対してハイブリダイズされた ２つのプローブが破断複合セグメントとして残留する請求項２４記載の方法。
  29. ２９．標的セグメントに対してハイブリダイズされた２つのプローブが破断複合 セグメントとして残留する請求項２５記載の方法。
  30. ３０．結紮で作られた複合セグメントがナノ変異体ＤＮＡ又はミディ変異体ＤＮ Ａの配列を有し、この配列中に延長プローブの抗標的セグメントの配列から成る 配列、延長プローブの延長、及び非延長プローブの抗標的セグメントが挿入され る請求項２６記載の方法。
  31. ３１．結紮で作られた複合セグメントがナノ変異体ＤＮＡ又はミディ変異体ＤＮ Ａの配列を有し、この配列中に２つのプローブの抗標的セグメントの配列から成 る配列が挿入される請求項２７記載の方法。
  32. ３２．破断複合セグメントがナノ変異体ＤＮＡ又はミディ変異体ＤＮＡの配列を 有し、この配列中に延長プローブの抗標的セグメントの配列から成る配列、延長 プローブの延長、及び非延長プローブの抗標的セグメントが、延長プローブ及び 非延長プローブが標的セグメントに対してハイブリダイズされる場合に、挿入さ れる請求項２８記載の方法。
  33. ３３．破断複合セグメントがナノ変異体ＤＮＡ又はミディ変異体ＤＮＡの配列を 有し、この配列中に２つのプローブの抗標的セグメントに隣接する配列から成る 配列が、標的セグメントに対してハイブリダイズされる場合に、挿入される請求 項２９記載の方法。
  34. ３４．レプリカーゼがＱβレプリカーゼである請求項２３〜３３のいずれかに記 載の方法。
  35. ３５．両プローブがＤＮＡである請求項３４記載の方法。
  36. ３６．レプリカーゼによる自触的複製に有効な条件が増幅が生じる溶液中に約０ ．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度でＭｎ＋２及びＣｏ＋２から成る群から選択されるイ オンを有することを包含する請求項３５記載の方法。
  37. ３７．２つのプローブを用い、工程（ｂ）のプロセッシングにおいて、一次プロ ーブが標的核酸に対してハイブリダイズされ、一次プライマー延長反応で延長さ れて、二次プローブのハイブリダイゼーションのための鋳型を提供し、標的から の延長一次プローブの鎖分離及び延長一次プローブに対する二次プローブのハイ ブリダイゼーション後、二次プローブが二次プライマー延長反応で延長されて２ ′−デオキシリボヌクレオチドを包含する複合セグメントを提供する請求項１５ 記載の方法。
  38. ３８．両プローブがＤＮＡであり、複合セグメントがＤＮＡである請求項３７記 載の方法。
  39. ３９．複合セグメントがナノ変異体ＤＮＡ又はミディ変異体ＤＮＡであって、こ のＤＮＡ中に（ｉ）３′端に、一次プローブの抗標的セグメントの配列と相補的 な配列；（ｉｉ）５′端に、二次プローブの３′端の標的様セグメントの配列； 及び（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）に記載された配列間に、一次プローブの標的 セグメントと鎖延長化一次プローブのセグメントと配列が相補的なセグメントと の間の標的核酸の配列（これに対して二次プローブの標的様セグメントがハイブ リダイズする）から成る配列を有するセグメントが挿入される請求項３７又は３ ８記載の方法。
  40. ４０．レプリカーゼがＱβレプリカーゼである請求項３９記載の方法。
  41. ４１．レプリカーゼによる自触的複製に有効な条件が増幅が生じる溶液中に約０ ．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度でＭｎ＋２及びＣｏ＋２から成る群から選択されるイ オンを有することを包含する請求項４０記載の方法。
  42. ４２．（ａ）３つのプローブ：即ち、（ｉ）標的様セグメント及び増幅性セグメ ントを包含する一次プローブであって、上記増幅性セグメントが隣接し、上記標 的様セグメントの５′端から５′方向に延長し、ＲＮＡレプリカーゼにより触媒 されるリポータ−ＲＮＡ又はその補体の合成のための鋳型であり、ジリボヌクレ オチドを包含し、塩基による処理又はリボヌクレアーゼによる消化により上記ジ リボヌクレオチドのリボヌクレオチド間で切断されて、ＲＮＡレプリカーゼによ り触媒されるリポータ−ＲＮＡ又はその補体の合成のための鋳型として不活性に され得る一次プローブ；（ｂ）一次抗標的セグメントを包含する二次プローブで あって、それにより上記二次プローブが一次標的セグメントに対してハイブリダ イズ可能である二次プローブ；及び（ｃ）その３′端に二次抗標的セグメントを 包含する三次プローブであって、それにより上記三次プローブが二次標的セグメ ントに対してハイブリダイズ可能であって、そのようにハイブリダイズされる場 合に、鋳型として標的核酸を用いるプライマー延長反応を用意し、上記二次標的 セグメントの５′末端が上記一次標的セグメントの３′端から３′方向に少なく とも８ヌクレオチドに位置する三次プローブを用い；工程（ｂ）のプロセッシン グが、（ｉ）二次及び三次プローブを標的に対してハイブリダイズし、延長化三 次プローブの３′端のヌクレオチドがハイブリダイズ化二次プローブの５′端の ヌクレオチドに隣接するまで一次プライマー延長反応において三次プローブを延 長し；（ｉｉ）延長化三次プローブを標的から鎖分離し；（ｉｉｉ）延長化三次 プローブの３′端の少なくとも８ヌクレオチドのセグメントと配列が相補的であ るか又はほぼ相補的であるその標的様セグメントにより延長化三次プローブの３ ′端に対して、一次プローブをハイプリダイズし；（ｉｖ）さらに鋳型として一 次プローブの増幅性セグメントを用いて二次プライマー延長反応における鎖延長 化三次プローブを延長し、それにより上記鎖延長化三次プローブの少なくとも一 部のさらなる延長が一次プローブの上記増幅性セグメントの配列と相補的な配列 を有する複合ＤＮＡ配列を包含し；（ｖ）二次プライマー延長反応後、このよう な反応を実施した試料のアリコートを塩基又はリボヌクレアーゼで処理して一次 プローブの上記増幅性セグメントをＲＮＡレプリカーゼによるリポータ−ＲＮＡ 又はその補体の合成のための鋳型として不活性にし；（ｖｉ）工程（ｖ）の処理 後ではあるが工程（ｖ）の処理を施されたアリコートに上記レプリカーゼの存在 下で自触的複製に有効な条件を施す前に、塩基を中和するか又はリボヌクレアー ゼを不活性化することから成る請求項１５記載の方法。
  43. ４３．一次プローブの標的様セグメントが少なくとも１２ヌクレオチド長であっ て、一次延長反応で作られた延長化三次プローブの３′端の同一長のセグメント の配列と相補的な配列を有し、二次標的セグメントの５′端と一次標的セグメン トの３′端の間の標的核酸中に少なくとも１２個のヌクレオチドが存在する請求 項４２記載の方法。
  44. ４４．一次プローブがＲＮＡプローブであり、複合ＤＮＡの合成後の一次プロー ブの分解が塩基を用いた処理によるものである請求項４３記載の方法。
  45. ４５．一次プローブがＲＮＡプローブであり、複合ＤＮＡの合成後の一次プロー ブの分解がリボヌクレアーゼを用いた処理によるものである請求項４３記載の方 法。
  46. ４６．レプリカーゼがＱβレプリカーゼである請求項４２〜４５のいずれかに記 載の方法。
  47. ４７．レプリカーゼによる自触的複製に有効な条件が増幅が生じる溶液中に約０ ．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度でＭｎ＋２及びＣｏ＋２かり成る群から選択されるイ オンを有することを包含する請求項４６記載の方法。
  48. ４８．上記標的核酸を含有すると考えられる試験試料中に予め選択された標的セ グメントを包含する標的核酸分析対象物の存在の検出方法であって、核酸の上記 試料を処理して試料が上記の予め選択された標的セグメントを包含する場合のみ ＲＮＡレプリカーゼにより自触的複製可能なリポータ−ＲＮＡを作り、そのよう に作られた任意のリポータ−ＲＮＡに関して検定することを包含し、上記処理が （ａ）プローブの少なくとも１つが標的セグメントのサブセグメントに対してハ イプリダイズ可能であるとすれは、その各々は標的セグメントのサブセグメント 又は標的セグメントのサブセグメントの補体に対してハイブリダイズでき、（ｉ ）本方法に１つのプローブを用いる場合、上記プローブは２′−デオキシリボヌ クレオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ又はリポータ−ＲＮＡの補体の配列を有 する複合核酸セグメントを作るためにプロセッシングされるか又はプロセッシン グされ得るし、あるいは（ｉｉ）１つ以上のプローブを本発明に用いる場合は、 上記プローブは、２′−デオキシリボヌクレオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ 又はリポーターＲＮＡの補体の配列を有する複合又は破断複合核酸セグメントを 作るためにプロセッシングされ得る一つ又はそれ以上の核酸プローブで核酸の試 料の一次アリコートを処理し；（ｂ）（ｉ）一重鎖プローブの一部として提供さ れない場合には、２′−デオキシリボヌクレオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ 又はそのの補体の配列を有する上記複合又は破断複合核酸セグメントが作られ、 標的セグメントが試料中に存在する場合のみ工程（ｃ）に関して十分な量で残留 し、（ｉｉ）工程（ｂ）（ｉ）にしたがって残留する上記複合又は破断複合核酸 セグメント以外で、リポータ−ＲＮＡ又はその補体の配列を有する任意の核酸セ グメントの量が工程（ｃ）に関して非有意の量に低減される、二次アリコートを 調製するために上記の単数又は複数のプローブを含有する上記一次アリコートを プロセッシングし；そして（ｃ）二次アリコート、又は上記二次アリコートから 得られた三次アリコートに上記レプリカーゼの存在下での自触的複製に有効な条 件を施すことを包含する方法。
  49. ４９．全プローブがリボヌクレオチド又は２′−デオキシリボヌクレオチドから 成る請求項４８記載の方法。
  50. ５０．レプリカーゼがＱβレプリカーゼである請求項４９記載の方法。
  51. ５１．リポータ−ＲＮＡに関する検定が、もしあればリポータ−ＲＮＡを提供す るための自触的複製が生じる溶液のアリコートのＲＮＡを染色することを包含す る方法によるものである請求項４９記載の方法。
  52. ５２．リポータ−ＲＮＡに関する検定が、もしあれはリポータ−ＲＮＡを提供す るための自触的複製が生じる溶液のアリコートのＲＮＡを整粒することにより分 離し、リポータ−ＲＮＡのサイズを有する染色ＲＮＡが上記アリコート中に生じ たか否かを測定することを包含する方法によるものである請求項５１記載の方法 。
  53. ５３．リポータ−ＲＮＡに関する検定が、以下の：（ｉ）放射性標識化リボヌク レオシド三燐酸塩又はリボヌクレオシド三燐酸塩類似体を含有することによりリ ポーターＲＮＡを標識するが、この場合塩基は自触的複製の少なくとも一部の間 に基質として標識部分を伴って誘導化され、（ｉｉ）もしあれはリポータ−ＲＮ Ａを提供するための自触的複製が生じる溶液のアリコートを用いて、ＲＮＡに取 り込まれなかった放射性標識化リボヌクレオシド三燐酸塩及びリボヌクレオシド 三燐酸塩類似体を任意の標識化リポータ−ＲＮＡから分離し；そして（ｉｉｉ） 標識化リポータ−ＲＮＡが工程（ｉｉ）により提供されるか否かを調べる工程か ら成る方法によるものである請求項４９記載の方法。
  54. ５４．標識化が、３２Ｐで標識される放射性標識化リボヌクレオシド三燐酸塩を 用いる請求項５３記載の方法。
  55. ５５．標識化が、ビオチン、イミノビオチン、又はジゴキシゲニンを用いて炭素 −５でウラシルが誘導化されるウリジン三燐酸塩を用いる請求項５３記載の方法 。
  56. ５６．リポータ−ＲＮＡに関する検定が、レプリカーゼの存在下での自触的複製 に有効な条件を施された溶液のアリコート中のリポータ−ＲＮＡの存在に関する 核酸プローブハイプリダイゼーション検定を包含する方法による請求項４９記載 の方法。
  57. ５７．リポータ−ＲＮＡに関する検定が、レプリカーゼの存在下での自触的複製 に有効な条件を施された溶液のアリコート中でＡＴＰが自触的複製により欠失さ れるか否かを生物発光により測定することを包含する方法による請求項４９記載 の方法。
  58. ５８．ＲＮＡレプリカーゼにより自触的複製可能であるリポータ−ＲＮＡの予選 択標的セグメントを包含する核酸の核酸試料中の存在に依る増幅用キットであっ て、上記キットが、一緒に包装されるレプリカーゼ保持容器、及び一つ又はそれ 以上のプローブ保持容器を包含し；上記レプリカーゼ保持容器が、リポータ−Ｒ ＮＡが自触的複製のための鋳型であるためのＲＮＡレプリカーゼを保持し；必要 なプローブの全てがキットが包含する一つ又はそれ以上のプローブ保持容器内に 保持されるとすれば、上記プローブ保持容器が、一つより多い場合には各々の上 記プローブ保持容器が上記増幅に必要な一つ又はそれ以上の核酸プローブを保持 し；（ｉ）少なくとも一つのプローブが標的セグメントのサブセグメントに対し てハイブリダイズ可能であり；（ｉｉ）必要なプローブが一つである場合には上 記プローブは２′−デオキシリボヌクレオチドを包含し、リポーターＲＮＡ又は リポータ−ＲＮＡの補体の配列を有する複合核酸セグメントを作るためにプロセ ッシングされるか又はされ得る；（ｉｉｉ）必要なプローブが一つより多い場合 には上記のプローブは２′−デオキシリボヌクレオチドを包含し、リポーターＲ ＮＡ又はリポータ−ＲＮＡの補体の配列を有する複合又は破断複合核酸セグメン トを作るためにプロセッシングされ得るとすれは、上記の必要なプローブ、一つ より多い場合には各々の上記の必要なプローブが標的セグメントのサブセグメン ト又は標的セグメントのサブセグメントの補体に対してハイブリダイズ可能であ るキット。
  59. ５９．必要なプローブが全て、リボヌクレオチド又は２′−デオキシリボヌクレ オチドから成る請求項５８記載のキット。
  60. ６０．必要なプローブを全て保持する一つのプローブ保持容器を包含する請求項 ５９記載のキット。
  61. ６１．さらに、レプリカーゼ保持容器及び一つ又はそれ以上のプローブ保持容器 と一緒に包装される一つ又はそれ以上の酵素保持容器を包含し、その各々が２′ −デオキシリボヌクレオチドを包含し、リポータ−ＲＮＡ又はリポータ−ＲＮＡ の補体の配列を有する複合又は破断複合核酸セグメントを作るために必要なプロ ーブの任意のプロセッシングに用いられる一つ又はそれ以上の酸素を保持するキ ット。
  62. ６２．標的核酸分析対象物の存在を検出するための試験キットであり、上記分析 対象物を含有すると考えられる試験試料中に予選択標的セグメントを包含し、上 記試料が上記分析対象物を包含する場合に試験試料のアリコートとともにキット の成分を用いる場合に生じる増幅で生成されたリポータ−ＲＮＡ又はその補体を 検出可能にするための試薬をさらに包含する請求項５８〜６１記載のキット。
  63. ６３．リボヌクレオチド又は２′−デオキシリボヌクレオチドから成り、２′− デオキシリボヌクレオチドを包含し、その配列として自触的複製可能ＲＮＡの配 列を有する複合核酸で標識される分析対象物のための親和性分子。
  64. ６４．複合核酸がＤＮＡである請求項６３記載の親和性分子。
  65. ６５．分析対象物が抗原であり、親和性分子が分析対象物と反応性の抗体である か、又は分析対象物が少なくとも約１０ヌクレオチドの標的セグメントを包含す る核酸であり、親和性分子が標的セグメントの配列と相補的な配列を有する一重 鎖核酸である請求項６３又は６４記載の親和性分子。
  66. ６６．複合核酸の配列がＱβレプリカーゼにより自触的複製可能なＲＮＡの配列 である請求項６５記載の親和性分子。
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0648281A4 (en) * 1991-09-10 1997-06-04 Jack D Love TARGETED AMPLIFICATION OF DNA AND RNA AND SIGNAL AMPLIFICATION.
AU6027794A (en) * 1993-01-15 1994-08-15 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Diagnostic assays and kits for rna using rna binary probes and an rna-directed rna ligase
EP0682716A4 (en) * 1993-01-15 1999-10-27 New York Health Res Inst RNA ASSAYS USING BINARY RNA PROBES AND A RIBOZYME-LIGASE.
US5876924A (en) * 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US6593086B2 (en) 1996-05-20 2003-07-15 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Nucleic acid amplification methods
USRE38442E1 (en) * 1994-06-22 2004-02-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
FR2723591B1 (fr) * 1994-08-10 1996-09-20 Cis Bio Int Methode d'amplification et/ou de detection d'une sequence d'acide nucleique, reactif de detection et ses applications.
US5753787A (en) * 1995-04-10 1998-05-19 Yale University Nucleic acids encoding ancylostoma secreted protein
US5837466A (en) * 1996-12-16 1998-11-17 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples
US6001570A (en) * 1997-02-18 1999-12-14 Invitro Diagnostics, Inc. Compositions, methods, kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules
US6108582A (en) * 1998-07-02 2000-08-22 Intermedics Inc. Cardiac pacemaker lead with extendable/retractable fixation
WO2001059162A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Bayer Corporation METHOD FOR NUCLEIC ACID DETECTION VIA Qβ REPLICASE
US6562575B1 (en) 2000-06-26 2003-05-13 Epicentre Technologies Corporation Analyte-specific assays based on formation of a replicase substrate
US6949340B2 (en) 2001-03-28 2005-09-27 Creative Mines Llc Optical phase modulator
GB0111275D0 (en) * 2001-05-09 2001-06-27 Secr Defence Analytical method and kit
US10539561B1 (en) * 2001-08-30 2020-01-21 Customarray, Inc. Enzyme-amplified redox microarray detection process
DE10143106C1 (de) * 2001-09-03 2002-10-10 Artus Ges Fuer Molekularbiolog Vermehrung von Ribonukleinsäuren
US20120077196A9 (en) * 2001-09-03 2012-03-29 Guido Krupp Universal method for selective amplification of mRNAs
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
US7238477B2 (en) * 2001-09-24 2007-07-03 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering
US6852492B2 (en) 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
US7476501B2 (en) * 2002-03-26 2009-01-13 Intel Corporation Methods and device for DNA sequencing using surface enhanced raman scattering (SERS)
US20040110208A1 (en) * 2002-03-26 2004-06-10 Selena Chan Methods and device for DNA sequencing using surface enhanced Raman scattering (SERS)
US20030215816A1 (en) * 2002-05-20 2003-11-20 Narayan Sundararajan Method for sequencing nucleic acids by observing the uptake of nucleotides modified with bulky groups
DE10224200C1 (de) * 2002-05-31 2003-08-21 Artus Ges Fuer Molekularbiolog Vermehrung von Ribonukleinsäuren
DE10240868A1 (de) * 2002-09-04 2004-03-18 Artus Gesellschaft für molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung mbH Verbesserte Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren
GB0230238D0 (en) * 2002-12-28 2003-02-05 Fu Guoliang Combined exponential and linear amplification
US7718421B2 (en) 2003-02-05 2010-05-18 Iquum, Inc. Sample processing
WO2004092197A2 (en) * 2003-04-07 2004-10-28 The Regents Of The University Of California Amyloid-specific peptides and uses thereof
US20060199194A1 (en) * 2003-11-10 2006-09-07 Q-Rna, Inc. Methods of detection using immuno-Q-Amp technology
US20050214805A1 (en) * 2003-11-10 2005-09-29 Q-Rna, Inc. Methods of detection employing immuno-Q-Amp technology
GB0517005D0 (en) * 2005-08-19 2005-09-28 Enigma Diagnostics Ltd Analytical method and kit
US20070065834A1 (en) * 2005-09-19 2007-03-22 Hillis William D Method and sequences for determinate nucleic acid hybridization
US20080003564A1 (en) * 2006-02-14 2008-01-03 Iquum, Inc. Sample processing
WO2012038448A1 (en) * 2010-09-21 2012-03-29 Riboxx Gmbh Method for synthesizing rna using dna template
JP5951755B2 (ja) * 2011-05-04 2016-07-13 エイチティージー モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ｑＮＰＡ）法および定量的ヌクレアーゼプロテクション配列決定（ｑＮＰＳ）法の改善

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4786600A (en) * 1984-05-25 1988-11-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autocatalytic replication of recombinant RNA
CA1339981C (en) * 1984-05-25 1998-08-04 Fred R. Kramer Replicatable hybridizable recombinant rna probes and methods of using same
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
ES8706823A1 (es) 1985-03-28 1987-06-16 Cetus Corp Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra
IL86724A (en) * 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1339991C (en) 1988-09-08 1998-08-11 The Trustees Of Columbia University Replicative rna-based amplification/detection system
WO1990002819A1 (en) * 1988-09-08 1990-03-22 The Salk Institute For Biological Studies Replicative rna-based amplification detection systems
ZA899593B (en) * 1988-12-16 1990-09-26 Siska Diagnostics Inc Self-sustained,sequence replication system
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
US5480784A (en) * 1989-07-11 1996-01-02 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification methods
CA2040503A1 (en) * 1990-04-25 1991-10-26 James E. Stefano Selective amplification system using q beta replicase

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