KR20190017793A - 환상 dna의 증폭 방법 - Google Patents

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    • C12Y306/04012—DNA helicase (3.6.4.12)

Abstract

무세포계에 있어서, 환상 DNA, 특히 장쇄 환상 DNA를 간편 또한 지수적으로 증폭시킬 수 있는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 가지는 환상 DNA를, 이하의 효소군： (1) 환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군； (2) 오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군； 및 (3) 2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군 및, 완충액, NTP, dNTP, 마그네슘 이온원, 및 알칼리 금속 이온원을 포함하는 반응액과 혼합하여 생성한 반응 혼합물을 반응시키는 것을 포함하는, 환상 DNA의 증폭 방법을 제공한다.

Description

환상 DNA의 증폭 방법
본 발명은, 환상(環狀) DNA의 증폭 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 무세포계(無細胞系)에 있어서 환상 DNA를 지수적으로 증폭시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
바이오 테크놀러지 발전의 기반이 된 DNA 클로닝(cloning) 기술은, DNA 단편(斷片)의 잘라 붙이기에 의해 조제(調製)한 환상 DNA를 대장균 등의 세포 내에서 플라스미드(plasmid)로서 증폭 시키는 방법이다. 세포를 사용한 DNA 클로닝 기술을 이용하여 환상 DNA를 증폭하는 경우, 세포 배양 및 증폭 산물의 추출·정제(精製) 등의 번잡한 순서가 필요하다. 또한, 세포를 이용한 DNA 클로닝을 실시하기 위해서는 유전자 재조합 생물을 작출(作出)할 필요가 있기 때문에, 실험할 수 있는 환경에 제한이 있다.
시험관 내에서 DNA를 증폭하는 방법으로서는, 폴리머라아제(polymerase) 연쇄 반응(PCR)이 일반적으로 이용되고 있다. 그러나, PCR에 의한 시험관 내 DNA 증폭법에서는, 환상 DNA를 그대로 증폭시킬 수 없다. 환상 DNA의 시험관 내 증폭법으로서는, 롤링 써클 증폭법(RCA) 등이 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3). 그러나, 롤링 써클 증폭법으로 환상 DNA를 증폭하기 위해서는, 표적 DNA에 특이적인 프라이머를 그때 마다 설계할 필요가 있다. 또한, 롤링 써클 증폭법에 의한 직접적인 증폭 산물은 직쇄형(直鎖型) DNA이며, 얻어진 증폭 산물을 환상화(環狀化)하기 위해서는, 재조합 효소와 인큐베이션하는 등의 새로운 환상화 공정이 필요하다. 대장균의 미니 염색체(oriC 환상 DNA)를 복제한 후, 이것을 분리하여, 단량체의 환상 복제 산물을 얻는 방법도 보고되고 있다(비특허문헌 2~5). 그러나, 이들 문헌에서 사용되고 있는 반응 조건에 있어서는, 환상 DNA 분자로서의 복제 효율은, 가한 주형(鑄型) DNA의 15－40% 정도에 머무르는 것이며, 증폭량으로서는 배(倍)에도 도달하지 않는 것이 실험적으로 나타나고 있다(비특허문헌 3~6). 또한, 이들 문헌에 있어서 주형으로서 사용되고 있는 환상 DNA의 사이즈는 10kbp 미만에 머무른다.
이와 같이, 종래의 시험관 내 DNA 증폭법으로 환상 DNA를 증폭하기 위해서는, 프라이머의 주형 DNA에의 결합이 필요하고, 증폭 산물은 직쇄형 DNA이고, 또한, 증폭 가능한 DNA 사이즈는 수kbp에 머무르는 것이었다. 또한, 대장균 미니 염색체 복제계를 이용하여 환상의 증폭 산물을 산생(産生)하고자 한 경우에는, 주형 환상 DNA는 배(倍) 조차도 증폭되지 않는다는 문제가 있었다.
특허문헌 1 : 일본 특허공개 특개2005－229950 특허문헌 2 : 일본 특허공개 특개2008－161182 특허문헌 3 : 일본 특허공표 특표2012－501173
비특허문헌 1 : Fakruddin M et al., J Pharm Bioallied Sci. 2013, 5: 245-252 비특허문헌 2 : Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575 비특허문헌 3 : Hiasa H & Marians KJ. J Biol Chem. 1994, 269: 32655-32659 비특허문헌 4 : Funnell B et al., J Biol Chem. 1986, 261: 5616-5624 비특허문헌 5 : Hiasa H et al., J Biol Chem. 1994, 269: 2093-2099 비특허문헌 6 : Hiasa H & Marians KJ. J Biol Chem. 1994, 269: 26959-26968
본 발명은, 무세포계에 있어서, 환상 DNA, 특히 장쇄(長鎖) 환상 DNA를 간편 또한 지수적으로 증폭시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 연구를 거듭한 결과, 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 가지는 환상 DNA를, 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트(fragment) 연결 반응을 촉매하여, 카테난(catenane)을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원(源)； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액과 혼합하여 생성한 반응 혼합물을 반응시킴으로써, 「복제의 개시(DNA2 중쇄 개렬(重鎖 開裂)·신장(伸長)(복제 포크(fork) 진행)·복제된 자매 DNA의 분리(Decatenation)」의 사이클이 반복되어, 지수적으로 환상 DNA를 증폭시킬 수 있는 것을 발견했다.
즉, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 이하의 양태의 발명을 포함한다.
[1] 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
(1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액과의 반응 혼합물을 형성하는 공정,
여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는； 및
(2) 공정 (1)에서 형성된 반응 혼합물을 등온(等溫) 조건 하에서 보온(保溫)하는 공정；
을 포함하는, 상기 방법.
[2] 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
(1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액과의 반응 혼합물을 형성하는 공정,
여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는； 및
(2) 공정 (1)에서 형성된 반응 혼합물을, 30℃ 이상에서의 인큐베이션 및 27℃ 이하에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클 하에서, 인큐베이트하는 공정；
을 포함하는, 상기 방법.
[3] 반응액이, 단백질의 비특이(非特異) 흡착 억제제, 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 반응액이, 직쇄상(直鎖狀) DNA 특이적 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및/또는 RecG형 헬리카아제(helicase)를 더 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[5] 반응액이, 암모늄염을 더 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[6] 제1의 효소군이, DnaA 활성을 가지는 효소, 1종 이상의 핵양체(核樣體) 단백질, DNA 자이레이스(gyrase) 활성을 가지는 효소 또는 효소군, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소, DNA 헬리카아제 로더(loader) 활성을 가지는 효소, DNA 프라이마제(primase) 활성을 가지는 효소, DNA 클램프(clamp) 활성을 가지는 효소, 및 DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군의 조합을 포함하고,
제2의 효소군이, DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소 및 DNA 리가아제(ligase) 활성을 가지는 효소의 조합을 포함하고,
제3의 효소군이, 토포이소머라아제(topoisomerase) III 활성을 가지는 효소 및/또는 토포이소머라아제 IV 활성을 가지는 효소를 포함하는,
상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[7] 제2의 효소군이 RNaseH 활성을 가지는 효소를 더 포함하는, 상기 [6]에 기재된 방법.
[8] 제3의 효소군이 RecQ형 헬리카아제 활성을 가지는 효소를 더 포함하는, 상기 [6]에 기재된 방법.
[9] 제1의 효소군에 있어서,
1종 이상의 핵양체 단백질이 IHF 또는 HU이고,
DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군이, GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체이고,
DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소가 DnaB 헬리카아제이고,
DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소가 DnaC 헬리카아제 로더이고,
DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소가 DnaG 프라이마제이고,
DNA 클램프 활성을 가지는 효소가 DnaN 클램프이고,
DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군이, DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, 및 HolE 중 어느 하나를 포함하는 효소 또는 효소군인, 상기 [6]에 기재된 방법.
[10] 공정 (2)에 있어서의 등온 조건이, 25℃~50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도인, 상기 [1]에 기재된 방법.
[11] 반응액이, RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[12] 반응액이, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[13] 반응액이, DNA의 안정화 인자를 더 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[14] 공정 (1)이
(1－1) 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액을 프리인큐베이션하는 공정；
(1－2) 해당 반응액과 주형이 되는 환상 DNA와의 반응 혼합물을 형성하는 공정； 및
을 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[15] 공정 (2)을, 유중수적형(油中水滴型) 에멀젼 내에서 실시하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[16] 공정 (2)에 이어서
(3) 반응 후(後)처리를 실시하는 공정；을 더 포함하고, 여기서, 해당 반응 후처리는,
(i) 제1부터 제3의 효소군을 포함하지 않는 반응액으로 5배 이상으로 희석한 후, 재보온하는 처리；
(ii) 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제에 의한 처리； 및/또는
(iii) 갭 리페어(gap repair) 효소에 의한 처리；인,
상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[17] 환상 DNA의 증폭용 조성물로서,
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는, 상기 조성물.
[18] 단백질의 비특이 흡착 억제제, 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[19] 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 RecG형 헬리카아제를 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[20] RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[21] 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[22] DNA의 안정화 인자를 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[23] 환상 DNA의 증폭용 키트(kit)로서,
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
의 조합을 포함하는, 상기 키트.
[24] 단백질의 비특이 흡착 억제제, 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제와의 조합을 더 포함하는, 상기 [23]에 기재된 키트.
[25] 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 RecG형 헬리카아제와의 조합을 더 포함하는, 상기 [23]에 기재된 키트.
[26] RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 상기 [23]에 기재된 키트.
[27] 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 상기 [23]에 기재된 키트.
[28] DNA의 안정화 인자를 더 포함하는, 상기 [23]에 기재된 키트.
[29] 갭 리페어 효소를 더 포함하는, 상기 [23]에 기재된 키트.
[30] 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액과, 주형이 되는 환상 DNA와의 반응 혼합물을 형성하는 공정을 포함하고,
여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는, 복제 사이클을 반복하여, 지수적으로 환상 DNA를 증폭하는 방법.
[31] 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
(1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액과의 반응 혼합물을 형성하는 공정,
여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는； 및
(2) 공정 (1)에서 형성된 반응 혼합물을 소정의 온도 범위에서 보온하는 공정；
을 포함하는, 상기 방법.
[32] 환상 DNA의 증폭용 키트로서,
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
의 조합,
및, 상기의 조합을 포함하는 반응액과 주형이 되는 환상 DNA와의 반응 혼합물에 있어서 복제 사이클을 반복함으로써 환상 DNA를 지수적으로 증폭 시키는 방법을 실시하기 위한 지시가 기재된 설명서를 포함하는,
상기 키트.
[33] 반응액에 tRNA를 더 포함하는, 상기 [1], [2], [30] 및 [31] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[34] 반응액에 tRNA를 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[35] 반응액에 tRNA를 더 포함하는, 상기 [23] 또는 [32]에 기재된 키트.
[36] 반응액에, 100mM 이상의 알칼리 금속 이온원을 더 포함하는, 상기 [1], [2], [30] 및 [31] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[37] 반응액에, 100mM 이상의 알칼리 금속 이온원을 더 포함하는, 상기 [17]에 기재된 조성물.
[38] 반응액에, 100mM 이상의 알칼리 금속 이온원을 더 포함하는, 상기 [23] 또는 [32]에 기재된 키트.
[39] 환상 DNA가, 적어도 10배로 증폭되는, 상기 [1], [2], [30] 및 [31] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
본 발명에 의해, 대장균 세포나 플라스미드 벡터를 이용하는 일 없이, 환상 DNA, 특히 장쇄 환상 DNA를 간편 또한 지수적으로 증폭시킬 수 있는 방법이 제공된다. 본 발명에 의하면, 환상 DNA를 증폭 시키는데 프라이머는 불필요하고, 200kb를 초과하는 장쇄 환상 DNA의 증폭도 가능하다. 그리고, 본 발명의 방법에 의하면, 주형 환상 DNA는 겨우 1분자로부터이어도 환상 DNA의 증폭이 가능하다. 또한, 본 발명에 의해 얻어지는 증폭 산물은, 원래의 주형과 동일한 환상 구조인대로의 카피(copy)이다. 또한, 복수의 DNA 단편을 연결한 후, 그대로 해당 반응계에 가하면, 연결에 의해 환상화된 DNA만을 특이적으로 증폭 시켜 조제할 수도 있다.
[도 1] 도 1은, 본 발명에 의한 복제 사이클의 모델을 나타낸다.
[도 2] 도 2는, Gibson Assembly법을 이용한 시험관 내 연결에 의해 환상화된 DNA의 구조를 나타낸다.
[도 3] 도 3은, 9.6kb의 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우의 반응 시간 마다의 증폭 산물을 아가로오스 전기영동하고, SYBR Green에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
[도 4] 도 4는, 200kb 및 80kb의 장쇄 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우의 증폭 산물을 아가로오스 전기영동하고, SYBR Green에 의해 검출한 결과를 나타낸다. 도 4a는, 200kb의 장쇄 환상 DNA(15pM, 20ng)를 주형으로서 사용한 경우의, 반응 시간 마다의 증폭 산물의 결과를 나타낸다. 도 4b는 80kb(15pM, 8ng) 및 200kb(5pM, 6.7ng)의 장쇄 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우의 반응 3시간 후의 증폭 산물의 결과를 나타낸다.
[도 5] 도 5는, Gibson Assembly법을 이용한 시험관 내 연결에 의해 환상화된 DNA를 주형으로서 사용한 경우의 증폭 산물을 아가로오스 전기영동하고, SYBR Green에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
[도 6] 도 6은, 미량(1분자 레벨)의 9.6kb의 환상 DNA를 주형으로서 사용한 증폭 실험의 결과를 나타낸다. 도 6a는, 9.6kb의 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우의 증폭 산물을 아가로오스 전기영동하고, SYBR Green에 의해 검출한 결과를 나타낸다. 도 6b는, 증폭 산물의 DNA량을 PicoGreen법 혹은 대장균 형질전환법에 의해 정량하고, 그 증폭 정도를 나타낸 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 7] 도 7은, 9.6kb의 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우의 증폭 시간에 대한 증폭한 환상 DNA 분자수를 나타내는 그래프이다.
[도 8] 도 8은, 혼합물로부터의 단일의 환상 DNA 클론의 증폭 시험 결과를 나타내는 도면이다. 도 8a는, 환상 DNA의 혼합물의 희석에 대한 모식도이다. 도 8b는, 환상 DNA의 혼합물을 희석하여 증폭 시킨 경우의 증폭 산물을 아가로오스 전기영동하고, SYBR Green에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
[도 9] 도 9는, 환상 DNA의 계대 증폭 시험 결과를 나타내는 도면이다. 도 9a는, 실험 순서에 대한 모식도이다. 도 9b는, 증폭 반응 후의 DNA 산물을 새로운 반응액으로 희석하고, 재차 증폭을 유도한다는 계대(繼代) 증폭을 10회 반복한 경우의 결과를 나타낸다. 증폭 산물은 아가로오스 전기영동 및 SYBR Green에 의해 검출했다.
[도 10] 도 10은, 80kb의 환상 DNA를 주형으로서 사용하고, RecG 및 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 첨가한 경우의, 증폭 산물을 아가로오스 전기영동하고, SYBR Green에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
[도 11] 도 11은, 실시예 7의 조건 A의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 12] 도 12는, 실시예 7의 조건 B의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 13] 도 13은, 실시예 7의 조건 C(GTP, CTP 및 UTP량의 검토)의 결과를 나타내는 그래프, 및 겔 전기영동의 사진이다.
[도 14] 도 14는, 실시예 7의 조건 D(IHF량의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 15] 도 15는, 실시예 7의 조건 E(Topo IV량의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 16] 도 16은, 실시예 7의 조건 F(DNA 자이레이스량의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 17] 도 17은, 실시예 7의 조건 G(DNA 폴리머라아제 III* 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 18] 도 18은, 실시예 7의 조건 H(알칼리 금속 이온원량의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 19] 도 19는, 실시예 7의 조건 I(단백질의 비특이 흡착 억제제 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제의 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 20] 도 20은, 실시예 7의 조건 J(DnaA 활성을 가지는 효소의 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 21] 도 21은, 실시예 7의 조건 K(DNA 리가아제 활성을 가지는 효소의 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 22] 도 22는, 실시예 7의 조건 L(SSB량의 검토)의 결과를 나타내는 그래프, 및 겔 전기영동의 사진이다.
[도 23] 도 23은, 실시예 7의 조건 M(DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소의 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 24] 도 24는, 실시예 7의 조건 N(DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소 및 DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소의 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 25] 도 25는, 실시예 7의 조건 O(RNaseH 활성을 가지는 효소의 양의 검토)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 26] 도 26은, 실시예 7의 조건 P의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 27] 도 27은, 실시예 7의 조건 Q(제3의 효소군의 효소의 조성 및 양의 검토)의 결과를 나타내는, 겔 전기영동의 사진 및 그래프이다.
[도 28] 도 28은, 실시예 7의 조건 R의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 29] 도 29는, 실시예 7의 조건 S의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 30] 도 30은, 알칼리 금속 이온원의 첨가의 효과를 검토한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 31] 도 31은, 프리인큐베이션에 의한 증폭 반응의 효율화를 검토한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 32] 도 32는, RecG 및 RecJ를 첨가한 경우의 증폭 산물을 검출한 결과를 나타내는, 겔 전기영동의 사진이다.
[도 33] 도 33은, RecBCD 및 exo I를 첨가한 경우의 증폭 산물을 검출한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 34] 도 34는, 증폭 반응 후에, RecBCD 및 exo I로 처리한 경우의 증폭 산물을 검출한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 35] 도 35는, 증폭 반응 후에, 갭 리페어 효소로 처리한 경우의 증폭 산물을 검출한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 36] 도 36은, 장쇄 환상 DNA의 안정화 인자(因子)를 사용한 경우의 증폭 반응의 효율을 검토한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 37] 도 37은, 유중수적형 에멀젼 내에서의 환상 DNA의 증폭 반응을 검토한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
[도 38] 도 38은, 온도 사이클을 수반하는 환상 DNA의 증폭 반응에 있어서의 증폭 산물을 검출한 결과를 나타내는 겔 전기영동의 사진이다.
이하에 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 것으로 한다.
＜환상 DNA＞
주형으로서 사용되는 환상 DNA는, 2중쇄(重鎖)인 것이 바람직하다. 주형으로서 사용되는 환상 DNA는, DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는 것이면, 특별히 제한은 되지 않으며, 미생물의 환상 염색체 등의 천연의 환상 DNA, 천연의 환상 DNA를 효소 처리 등에 의해 절단한 것 등에 다른 DNA 단편을 연결하고, 그것을 환상화한 환상 DNA, 모두 인공적으로 합성한 환상 DNA 등을 예시할 수 있다. DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))(이하, 간단히 「복제개시서열」이라고 하는 경우가 있다)로서는, 예를 들어 대장균, 고초균(枯草菌) 등의 세균에 존재하는 공지의 복제개시서열을, NCBI(http://www. Ncbi. Nlm. Nih.gov/) 등의 공적인 데이타 베이스로부터 입수할 수 있다. 또한, DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 DNA 단편을 클로닝하고, 그 염기 서열을 해석함으로써, 복제개시서열을 얻을 수도 있다.
본 발명에 있어서 주형으로서 사용되는 환상 DNA는, 원래 복제개시서열을 포함하는 환상 DNA이어도 되고, 원래는 복제개시서열을 포함하지 않는 환상 DNA에 복제개시서열을 도입한 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 주형으로서 사용되는 환상 DNA는, 목적에 따라, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린 등의 약제 내성 마커 유전자 서열을 포함하는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 주형으로서 사용되는 환상 DNA는, 정제된 것이어도 되지만, 환상 DNA를 포함하는 균체 추출물 등의 현탁액의 형태이어도 된다. 또한, 1종류의 환상 DNA를 주형으로서 사용해도 되지만, 예를 들어 DNA 라이브러리와 같은 복수 종류의 환상 DNA의 혼합물을 1개의 시험관 내에서 주형으로서 사용해도 된다.
본 발명에 있어서 주형으로서 사용되는 환상 DNA의 길이에 제한은 없지만, 예를 들어 1kb(1000염기 길이) 이상, 5kb(5000염기 길이) 이상, 8kb(8,000염기 길이) 이상, 10kb(10,000염기 길이) 이상, 50kb(50,000염기 길이) 이상, 100kb(100,000염기 길이) 이상, 200kb(200,000염기 길이) 이상, 500kb(500,000염기 길이) 이상, 1000kb(1,000,000염기 길이) 이상, 또는 2000kb(2,000,000염기 길이) 이상의 길이로 할 수 있다.
＜제1, 제2 및 제3의 효소군＞
1. 제1의 효소군
본 명세서에 있어서 제1의 효소군이란, 환상 DNA의 복제를 촉매하는 효소군을 의미한다.
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군으로서는, 예를 들어 Kaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90에 기재된 효소군을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 제1의 효소군으로서, 이하：DnaA 활성을 가지는 효소, 1종 이상의 핵양체 단백질, DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소, DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소, DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소, DNA 클램프 활성을 가지는 효소, 및 DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소 또는 효소군의 하나 이상, 또는 해당 효소 또는 효소군의 모든 조합을 예시할 수 있다.
DnaA 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 이니시에이터(initiator) 단백질인 DnaA와 동일한 이니시에이터 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DnaA를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaA는 단량체로서 반응액 중, 1nM~10μM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 1nM~~5μM, 1nM~3μM, 1nM~1.5μM, 1nM~1.0μM, 1nM~500nM, 50nM~200nM, 50nM~150nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
핵양체 단백질은, 핵양체에 포함되는 단백질을 말한다. 본 발명에 사용되는 1종 이상의 핵양체 단백질은, 대장균의 핵양체 단백질과 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 IHF, 즉 IhfA 및/또는 IhfB의 복합체(헤테로 2량체(二量體) 또는 호모 2량체)나, 대장균 유래의 HU, 즉 hupA 및 hupB의 복합체를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 IHF는 헤테로/호모 2량체로서 반응액 중, 5nM~400nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5nM~200nM, 5nM~100nM, 5nM~50nM, 10nM~50nM, 10nM~40nM, 10nM~30nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다. 대장균 유래의 HU는 반응액 중, 1nM~50nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5nM~50nM, 5nM~25nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군으로서는, 대장균의 DNA 자이레이스와 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체는 헤테로 4량체(4量體)로서 반응액 중, 20nM~500nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20nM~400nM, 20nM~300nM, 20nM~200nM, 50nM~200nM, 100nM~200nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB))로서는, 대장균의 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 SSB를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 SSB는 호모 4량체로서, 반응액 중, 20nM~1000nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20nM~500nM, 20nM~300nM, 20nM~200nM, 50nM~500nM, 50nM~400nM, 50nM~300nM, 50nM~200nM, 50nM~150nM, 100nM~500nM, 100nM~400nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 DnaB와 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DnaB를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaB는 호모 6량체로서 반응액 중, 5nM~200nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5nM~100nM, 5nM~50nM, 5nM~30nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 DnaC와 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DnaC를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaC는 호모 6량체로서 반응액 중, 5nM~200nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 5nM~100nM, 5nM~50nM, 5nM~30nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 DnaG와 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DnaG를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaG는 단량체로서, 반응액 중, 20nM~1000nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20nM~800nM, 50nM~800nM, 100nM~800nM, 200nM~800nM, 250nM~800nM, 250nM~500nM, 300nM~500nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 클램프 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 DnaN와 동일한 활성을 가지는 효소이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DnaN를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DnaN는 호모 2량체로서 반응액 중, 10nM~1000nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 10nM~800nM, 10nM~500nM, 20nM~500nM, 20nM~200nM, 30nM~200nM, 30nM~100nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군으로서는, 대장균의 DNA 폴리머라아제 III* 복합체와 동일한 활성을 가지는 효소 또는 효소군이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, 및 HolE 중 어느 하나를 포함하는 효소군, 바람직하게는 대장균 유래의 DnaX, HolA, HolB, 및 DnaE의 복합체를 포함하는 효소군, 더욱 바람직하게는 대장균 유래의 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, 및 HolE의 복합체를 포함하는 효소군을 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DNA 폴리머라아제 III* 복합체는 헤테로 다량체로서 반응액 중, 2nM~50nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 2nM~40nM, 2nM~30nM, 2nM~20nM, 5nM~40nM, 5nM~30nM, 5nM~20nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
2. 제2의 효소군
본 명세서에 있어서 제2의 효소군이란, 오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 효소군을 의미한다.
본 발명에 있어서, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA란, DNA 복제 반응에 의해 합성된 2개의 환상 DNA가 연결된 상태에 있는 것을 말한다.
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군으로서는, 예를 들어 DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소, DNA 리가아제 활성을 가지는 효소, 및 RNaseH 활성을 가지는 효소, 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 효소 또는 해당 효소의 조합을 예시할 수 있다.
DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 DNA 폴리머라아제 I와 동일한 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DNA 폴리머라아제 I를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DNA 폴리머라아제 I는 단량체로서 반응액 중, 10nM~200nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20nM~200nM, 20nM~150nM, 20nM~100nM, 40nM~150nM, 40nM~100nM, 40nM~80nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 리가아제 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 DNA 리가아제와 동일한 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 DNA 리가아제 또는 T4 파지(phage)의 DNA 리가아제를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 DNA 리가아제는 단량체로서 반응액 중, 10nM~200nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 15nM~200nM, 20nM~200nM, 20nM~150nM, 20nM~100nM, 20nM~80nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
RNaseH 활성을 가지는 효소로서는, RNA:DNA 하이브리드의 RNA쇄(鎖)를 분해하는 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 RNaseH를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 RNaseH는 단량체로서 반응액 중, 0.2nM~200nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 0.2nM~200nM, 0.2nM~100nM, 0.2nM~50nM, 1nM~200nM, 1nM~100nM, 1nM~50nM, 10nM~50nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
3. 제3의 효소군
본 명세서에 있어서 제3의 효소군이란, 2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 효소군을 의미한다.
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군으로서는, 예를 들어 Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575에 기재된 효소군을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 제3의 효소군으로서, 이하：토포이소머라아제 IV 활성을 가지는 효소, 토포이소머라아제 III 활성을 가지는 효소, 및 RecQ형 헬리카아제 활성을 가지는 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 효소 또는 해당 효소의 조합을 예시할 수 있다.
토포이소머라아제 III 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 토포이소머라아제 III와 동일한 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 토포이소머라아제 III를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 토포이소머라아제 III는 단량체로서 반응액 중, 20nM~500nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20nM~400nM, 20nM~300nM, 20nM~200nM, 20nM~100nM, 30~80nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
RecQ형 헬리카아제 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 RecQ와 동일한 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 대장균 유래의 RecQ를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 RecQ는 단량체로서 반응액 중, 20nM~500nM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 20nM~400nM, 20nM~300nM, 20nM~200nM, 20nM~100nM, 30~80nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
토포이소머라아제 IV 활성을 가지는 효소로서는, 대장균의 토포이소머라아제 IV와 동일한 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 ParC와 ParE의 복합체인 대장균 유래의 토포이소머라아제 IV를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 토포이소머라아제 IV는 헤테로 4량체로서 반응액 중, 0.1nM~50nMM의 범위에서 포함되어 있어도 되고, 바람직하게는 0.1nM~40nM, 0.1nM~30nM, 0.1nM~20nM, 1nM~40nM, 1nM~30nM, 1nM~20nM, 1nM~10nM, 1nM~5nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
상기의 제1, 제2 및 제3의 효소군은, 시판되고 있는 것을 사용해도 되고, 미생물 등으로부터 추출하고, 필요에 따라 정제한 것을 사용해도 된다. 미생물로부터의 효소의 추출 및 정제는, 당업자에게 이용 가능한 방법을 사용하여 적절히 실시할 수 있다.
상기 제1, 제2 및 제3의 효소군으로서, 상기에 나타내는 대장균 유래의 효소 이외를 사용하는 경우는, 상기 대장균 유래의 효소에 관하여 특정된 농도 범위에 대하여, 효소 활성 단위로서 상당하는 농도 범위에서 사용할 수 있다.
상기 효소의 무세포 단백질 발현계를 포함하는 반응액을, 그대로 주형이 되는 환상 DNA와 혼합하고, 환상 DNA의 증폭을 위한 반응 혼합액을 형성해도 된다. 무세포 단백질 발현계는, 상기 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA를 포함하는 총RNA(total RNA), mRNA, 또는 inVitro 전사 산물 등을 주형 RNA로 하는 무세포 번역계이어도 되고, 각 효소를 코드하는 유전자 또는 각 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 등을 주형 DNA로 하는 무세포 전사 번역계이어도 된다.
＜환상 DNA의 증폭 방법＞
본 발명은, 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
(1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액과의 반응 혼합물을 형성하는 공정을 포함하고,
여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는, 상기 방법에 관한 것이다.
다른 양태에 있어서, 본 발명의 방법은, 상기 공정 (1)의 전에, 반응액을 프리인큐베이션(pre-incubation)하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 즉, 본 발명의 방법은, 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
(1－1) 이하：
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는 반응액을 프리인큐베이션하는 공정； 및
(1－2) 해당 반응액과 주형이 되는 환상 DNA와의 반응 혼합물을 형성하는 공정,
여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는；
을 포함하는, 상기 방법이어도 된다. 프리인큐베이션은, 예를 들면,0~40℃, 10~40℃, 15~37℃, 또는 16~30℃의 범위에서, 5~60분간, 5~45분간, 5~30분간, 15~60분간, 15~45분간, 15~30분간의 사이 보온함으로써 실시해도 된다. 프리인큐베이션은, 반응액의 온도가 상기의 온도 범위 내로 유지되면 프리인큐베이션 중에 약간 변동되어도 된다.
이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, 본 발명은 도 1에 나타내는 바와 같이 복제 사이클을 반복하여, 환상 DNA를 지수적으로 증폭한다. 본 발명에서는, 상술한 환상 DNA를 주형으로서 사용하고, 그것을 적어도 10배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 또는 10000배로 증폭시킬 수 있다.
반응액과 혼합하는 환상 DNA에 관해서는, 상기 ＜환상 DNA＞의 항목에 기재한 바와 같다. 1반응 당 사용되는 주형 DNA의 양에 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 반응 개시(開始) 시에 10ng/μl 이하, 5ng/μl 이하, 1ng/μl 이하, 0.8ng/μl 이하, 0.5ng/μl 이하, 0.3ng/μl 이하의 농도로 반응액 중에 존재시켜도 된다. 또한, 반응 개시 시에, 1 반응 당 1분자의 환상 DNA를 주형으로서 존재시켜 증폭에 사용할 수도 있다.
반응액에 포함되는 완충액은, pH7~9, 바람직하게는 pH8에서 사용하는데 적합한 완충액이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Tris-HCl, Tris-OAc, Hepes-KOH, 인산 완충액, MOPS-NaOH, Tricine-HCl 등을 들 수 있다. 바람직한 완충액은 Tris-HCl 또는 Tris-OAc이다. 완충액의 농도는, 당업자가 적절히 선택할 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, Tris-HCl 또는 Tris-OAc의 경우, 예를 들면 10mM~100mM, 10mM~50mM, 20mM의 농도를 선택할 수 있다.
ATP는, 아데노신3인산을 의미한다. 반응 개시 시에 반응액 중에 포함되는 ATP의 농도는, 예를 들면 0.1mM~3mM의 범위이어도 되고, 바람직하게는 0.1mM~2mM, 0.1mM~1.5mM, 0.5mM~1.5mM의 범위이어도 된다.
GTP, CTP 및 UTP는, 각각 구아노신3인산, 시티딘3인산, 및 우리딘3인산을 의미한다. 반응 개시 시에 반응액 중에 포함되는 GTP, CTP 및 UTP의 농도는, 각각 독립하여, 예를 들면 0.1mM~3.0mM의 범위이어도 되고, 바람직하게는 0.5mM~3.0mM, 0.5mM~2.0mM의 범위이어도 된다.
dNTP는, 데옥시아데노신3인산(dATP), 데옥시구아노신3인산(dGTP), 데옥시시티딘3인산(dCTP), 및 데옥시티미딘3인산(dTTP)의 총칭이다. 반응 개시 시에 반응액 중에 포함되는 dNTP의 농도는, 예를 들면 0.01~1mM의 범위이어도 되고, 바람직하게는 0.05mM~1mM, 0.1mM~1mM의 범위이어도 된다.
마그네슘 이온원은, 반응액 중에 마그네슘 이온(Mg2＋)을 부여하는 물질이다. 예를 들면, Mg(OAc)2, MgCl2, 및 MgSO4 등을 들 수 있다. 바람직한 마그네슘 이온원은 Mg(OAc)2이다. 반응 개시 시에 반응액 중에 포함되는 마그네슘 이온원의 농도는, 예를 들면, 반응액 중에 마그네슘 이온을 5~50mM의 범위에서 부여되는 농도이어도 된다.
알칼리 금속 이온원은, 반응액 중에 알칼리 금속 이온을 부여하는 물질이다.알칼리 금속 이온으로서는, 예를 들면 나트륨 이온(Na＋), 칼륨 이온(K＋)을 들 수 있다. 알칼리 금속 이온원의 예로서, 글루타민산칼륨, 아스파라긴산칼륨, 염화칼륨, 아세트산칼륨, 글루타민산나트륨, 아스파라긴산나트륨, 염화나트륨, 및 아세트산나트륨을 들 수 있다. 바람직한 알칼리 금속 이온원은 글루타민산칼륨 또는 아세트산칼륨이다. 반응 개시 시에 반응액 중에 포함되는 알칼리 금속 이온원의 농도는, 반응액 중에 알칼리 금속 이온을 100mM 이상, 바람직하게는 100mM~300mM의 범위에서 부여하는 농도이어도 되지만, 이에 한정되지 않는다. 선행하는 출원과의 균형에 있어서는, 상기의 알칼리 금속 이온원의 농도로부터 150mM가 제외되어도 된다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 단백질의 비특이 흡착 억제제 또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 포함하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응액은 단백질의 비특이 흡착 억제제 및 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 포함하고 있어도 된다. 단백질의 비특이 흡착 억제제 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제가 반응액 중에 존재함으로써, 반응 효율이 향상된다. 단백질의 비특이 흡착 억제제 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제가, 단백질끼리 및/또는 단백질과 환상 DNA의 비특이 흡착이나, 단백질 및 환상 DNA의 용기 표면에의 부착을 억제함으로써 반응 효율이 향상된다고 생각된다.
단백질의 비특이 흡착 억제제란, 본 발명의 방법에 있어서의 증폭 반응과는 무관계한 단백질이다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들면, 소혈청 알부민(BSA), 리소자임, 젤라틴, 헤파린, 및 카세인 등을 들 수 있다. 단백질의 비특이 흡착 억제제는 반응액 중, 0.02~2.0mg/ml의 범위, 바람직하게는 0.1~2.0mg/ml, 0.2~2.0mg/ml, 0.5~2.0mg/ml의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
핵산의 비특이 흡착 억제제란, 본 발명의 방법에 있어서의 증폭 반응과는 무관계한 핵산 분자 또는 핵산 유사 인자이다. 그와 같은 핵산 분자 또는 핵산 유사 인자로서는, 예를 들면, tRNA(트랜스퍼 RNA), rRNA(리보솜 RNA), mRNA(메신저 RNA), 글리코겐, 헤파린, 올리고 DNA, poly(I-C)(폴리이노신-폴리시티딘), poly(dI-dC)(폴리데옥시이노신-폴리데옥시시티딘), poly(A)(폴리아데닌), 및 poly(dA)(폴리데옥시아데닌) 등을 들 수 있다. 핵산의 비특이 흡착 억제제는 반응액 중, 1~500ng/μl의 범위, 바람직하게는 10~500ng/μl, 10~200ng/μl, 10~100ng/μl의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다. 선행하는 출원과의 균형에 있어서는, 핵산의 비특이 흡착 억제제로서 tRNA를 선택하는 경우, tRNA의 농도로부터 50ng/μl가 제외되어도 된다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 DNA의 안정화 인자를 더 포함하고 있어도 된다. DNA의 안정화 인자가 반응액 중에 존재함으로써, DNA의 절단이 억제되어, 주형 DNA 및 증폭 산물을 보호할 수 있다고 생각된다. DNA의 안정화 인자의 첨가에 의해, 목적 산물의 수율 향상으로 이어진다. 특히, 주형 DNA가 장쇄 환상 DNA인 경우는, 주형 DNA 및 증폭 산물이 분해되기 쉽기 때문에, DNA의 안정화 인자의 첨가는 유익하다. DNA의 안정화 인자는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 글루코오스, 스크로오스, 디메틸설폭시드(DMSO), 소혈청 알부민(BSA), 글리콜에테르디아민4아세트산(EGTA), 바소크프로인 디설폰산2나트륨(BDA), 페닐실라민, 타이론(Tiron, 1,2-디하이드록시벤젠-3,5-설포네이트), 디에틸렌트리아민5아세트산(DTPA), 에틸렌 디아민4아세트산(EDTA), 및 Dps 단백질(대장균 유래), 메탈로티오네인 단백질(사람 유래)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이어도 된다. 이 중에서, DTPA, Tiron, BDA, Dps 단백질 및 BSA는, 환상 DNA 증폭 반응을 효율화 작용도 가지므로, 특히 바람직하다. DTPA 또는 Tiron는 반응액 중, 0.01mM~0.3mM, 바람직하게는 0.05~0.15mM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만 이에 한정되지 않는다. BDA는, 반응액 중, 0.01~0.5mM, 바람직하게는 0.05~0.3mM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만 이에 한정되지 않는다. Dps 단백질은 반응액 중, 0.3~3.0μM, 바람직하게는 0.3~1.5μM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만 이에 한정되지 않는다. BSA는 반응액 중, 0.02~2.0mg/ml의 범위, 바람직하게는 0.1~2.0mg/ml, 0.2~2.0mg/ml, 0.5~2.0mg/ml의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 또는 RecG형 헬리카아제를 더 포함하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 RecG형 헬리카아제를 더 포함하고 있어도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 RecG형 헬리카아제가 반응액 중에 존재함으로써, 증폭 반응 중에 이중쇄 절단 등에 의해 발생되는 직쇄상 DNA의 양을 저감 하고, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 RecG형 헬리카아제 또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응액은 RecG형 헬리카아제 및 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하고 있어도 된다. RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제가 반응액 중에 존재함으로써, 증폭 반응 중에 발생되는 저분자의 부차적인 증폭 산물의 양을 저감하고, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하고 있어도 된다. 바람직하게는, 반응액은 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하고 있어도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제가 반응액 중에 존재함으로써, 증폭 반응 중에 이중쇄 절단 등에 의해 발생되는 직쇄상 DNA의 양을 저감하고, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소이다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 직쇄상 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 활성을 가지는 것이면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, RecBCD, λ엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제VIII, T5엑소뉴클레아제, T7엑소뉴클레아제, 및 Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase (epicentre) 등을 사용할 수 있다. 바람직한 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 RecBCD이다. 직쇄상 DNA 엑소뉴클레아제는 반응액 중, 0.001~1.0U/μL, 바람직하게는 0.005U~1.0U/μL, 0.01~1.0U/μL, 0.05~1.0U/μL, 또는 0.1~1.0U/μL의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다. 직쇄상 DNA 엑소뉴클레아제에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에 있어서, 직쇄상 DNA의 1nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다.
RecG형 헬리카아제는, 신장(伸張) 반응의 종결 시에 복제 포크(folk)끼리가 충돌할 수 있는 부차적인 DNA 구조를 해소하는 헬리케이스(helicase)이라고 생각되고 있는 효소이다. RecG형 헬리카아제는, 대장균 유래의 RecG와 동일한 활성을 가지는 것이면, 그 생물학적 유래에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 대장균 유래의 RecG를 적합하게 사용할 수 있다. 대장균 유래의 RecG는 단량체로서 반응액 중, 100nM~800nM의 범위, 바람직하게는 100nM~500nM, 100nM~400nM, 100nM~300nM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다. RecG형 헬리카아제는, 상기 대장균 유래의 RecG에 관하여 특정된 농도 범위에 효소 활성 단위로서 상당하는 농도 범위에서 사용할 수 있다.
단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 단일 가닥 DNA의 5' 말단 혹은 3' 말단의 뉴클레오티드를 순차적으로 가수분해하는 효소이다. 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는, 단일 가닥 DNA의 5' 말단 또는 3' 말단의 뉴클레오티드를 순차적으로 가수분해하는 활성을 가지는 것이면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면 엑소뉴클레아제 I(exo I), RecJ, 엑소뉴클레아제 T 등을 사용할 수 있다. 바람직한 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 exo I이다. 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제는 반응액 중, 0.1~1.0U/μL의 범위, 바람직하게는 0.15~1.0U/μL, 0.2~1.0U/μL, 또는 0.2~0.5U/μL의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다. exo I에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에 있어서, 단일 가닥 DNA의 10nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다. RecJ에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에 있어서, 단일 가닥 DNA의 0.05nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 암모늄염을 더 포함하고 있어도 된다.암모늄염의 예로서는, 황산암모늄, 염화암모늄, 및 아세트산암모늄을 들 수 있다.특히 바람직한 암모늄염은 황산암모늄 또는 아세트산암모늄이다. 암모늄염은 반응액 중, 0.1mM~100mM의 범위, 바람직하게는 0.1mM~50mM, 1mM~50mM, 1mM~20mM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
제2의 효소군의 하나로서, DNA 리가아제 활성을 가지는 효소로서 대장균 유래의 DNA 리가아제를 사용하는 경우, 그 보인자(補因子)인 NAD(니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드)가 반응액 중에 포함된다. NAD는 반응액 중, 0.01mM~1.0mM의 범위, 바람직하게는 0.1mM~1.0mM, 0.1mM~0.5mM의 범위에서 포함되어 있어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 환원제를 더 포함하고 있어도 된다. 바람직한 환원제의 예로서는, DTT, β－메캅토에탄올(2－메캅토에탄올), 트리스(2－카복시에틸)포스핀(TCEP) 및 글루타티온을 들 수 있다. 바람직한 환원제는 DTT이다. 환원제는, 반응액 중에 1.0mM~15.0mM의 농도로, 바람직하게는 2.0mM~10.0mM, 4.0mM~8.0mM의 농도로 포함되어 있어도 된다.
본 발명의 방법에 사용되는 반응액은 또한, ATP를 재생하기 위한 효소 및 기질을 포함하고 있어도 된다. ATP 재생계의 효소와 기질의 조합으로서는, 크레아틴키나아제와 크레아틴포스페이트, 및 피르빈산키나아제와 포스포에놀피루브산을 들 수 있다. ATP 재생계의 효소로서는 미오키나아제를 들 수 있다. 바람직한 ATP 재생계의 효소와 기질의 조합은 크레아틴키나아제 및 크레아틴포스페이트이다.
반응액 중에 포함되는 제1, 제2, 및 제3의 효소군에 관해서는, 상기 ＜제1, 제2 및 제3의 효소군＞의 항목에 기재한 바와 같다.
어느 양태(態樣)에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 제1의 효소군은, DnaA 활성을 가지는 효소, 1종 이상의 핵양체 단백질, DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소, DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소, DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소, DNA 클램프 활성을 가지는 효소, 및 DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군의 조합을 포함하고 있어도 된다. 여기에 있어서, 1종 이상의 핵양체 단백질은 IHF 또는 HU이어도 되고, DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군은, GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체이어도 되고, DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소는 DnaB 헬리카아제이어도 되고, DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소는 DnaC 헬리카아제 로더이어도 되고, DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소는 DnaG 프라이마제이어도 되고, DNA 클램프 활성을 가지는 효소는 DnaN 클램프이어도 되고, 그리고, DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군은, DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, 및 HolE 중 어느 하나를 포함하는 효소 또는 효소군이어도 된다
다른 양태에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 제2의 효소군은, DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소 및 DNA 리가아제 활성을 가지는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다. 혹은, 제2의 효소군은, DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소, DNA 리가아제 활성을 가지는 효소, 및 RNaseH 활성을 가지는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 제3의 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 가지는 효소 및/또는 토포이소머라아제 IV 활성을 가지는 효소를 포함하고 있어도 된다. 혹은, 제3의 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 가지는 효소 및 RecQ형 헬리카아제 활성을 가지는 효소의 조합을 포함하고 있어도 된다. 혹은 또한, 제3의 효소군은, 토포이소머라아제 III 활성을 가지는 효소, RecQ형 헬리카아제 활성을 가지는 효소, 및 토포이소머라아제 IV 활성을 가지는 효소의 조합이어도 된다.
본 발명의 방법은, 공정 (2)으로서, 상기 반응 혼합물을 소정의 온도 범위에서 보온하는 공정을 더 포함해도 된다. 소정의 온도 범위는, DNA 복제 반응이 진행할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 DNA 폴리머라아제의 지적온도(至適溫度)인 20℃~80℃, 25℃~50℃, 또는 25℃~40℃의 범위일 수 있다. 소정의 온도 범위 내에서의 보온은, 반응 중에 그 소정의 온도 범위 내의 온도 변화 또는 온도 변동을 허용한다. 바람직한 양태에 있어서, 상기 공정 (2)는, 상기 반응 혼합물을 등온(等溫)조건 하에서 보온하는 공정이어도 된다. 등온 조건으로서는, DNA 복제 반응이 진행할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 DNA 폴리머라아제의 지적온도인 20℃~80℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 25℃~50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 25℃~40℃의 범위에 포함되는 일정한 온도로 할 수 있고, 30℃ 정도로 할 수 있다. 본 명세서에 있어서 「등온 조건 하에서 보온하는」, 「등온에서 반응시키는」의 용어는, 반응 중에 설정한 온도에 대하여 ±7℃, ±5℃, ±3℃, 또는 ±1℃의 온도 범위 내에 유지하는 것을 의미한다. 보온 시간은, 목적으로 하는 환상 DNA의 증폭 산물의 양에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들어 1~24시간으로 할 수 있다.
혹은, 본 발명의 방법은, 공정 (2)로서, 상기 반응 혼합물을, 30℃ 이상에서의 인큐베이션 및 27℃ 이하에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클 하에서, 인큐베이트하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 30℃ 이상에서의 인큐베이션은, oriC를 포함하는 환상 DNA의 복제 개시가 가능한 온도 범위이면 특별히 한정은 없고, 예를 들면, 30~80℃, 30~50℃, 30~40℃, 37℃이어도 된다. 30℃ 이상에서의 인큐베이션은, 특별히 한정되지 않지만, 1사이클 당 10초~10분간이어도 된다. 27℃ 이하에서의 인큐베이션은, 복제 개시가 억제되고, DNA의 신장 반응이 진행하는 온도이면 특별히 한정은 없고, 예를 들면, 10~27℃, 16~25℃, 24℃이어도 된다. 27℃ 이하에서의 인큐베이션은, 특별히 한정되지 않지만, 증폭되는 환상 DNA의 길이에 맞추어 설정하는 것이 바람직하고, 예를 들면 1사이클에 대해, 1000염기 당 1~10초간이어도 된다. 온도 사이클의 사이클수는 특별히 한정되지 않지만, 10~50사이클, 20~40사이클, 25~35사이클, 30사이클이어도 된다.
어느 양태에 있어서, 공정 (2)는, 유중수적형 에멀젼 내에서 실시해도 된다.유중수적형 에멀젼은, 공정 (1)에서 형성된 반응 혼합물에 미네랄 오일 및 계면활성제를 첨가하여 혼합함으로써 조제할 수 있다. 미네랄 오일 및 계면활성제의 종류 및 양은, 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은, 공정 (2) 후에, 제1부터 제3의 효소군을 포함하지 않는 반응액으로 5배 이상으로 희석한 후, 재보온하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다.효소군의 희석에 의해 새로운 복제 개시가 억제되는 한편으로, 진행 도중의 복제 신장, 카테난 형성, 분리 반응은 잔류 효소의 효과로 계속하여 진행한다. 또한, 반응 중에 닉(nick) 등이 들어와 발생된 부생성물도, 이 과정에서 잔류 라이게이스 등의 효과에 의해 수복(修復) 가능하다. 따라서, 증폭 중간체나 부생성물로부터의 최종 산물로의 이행이 특이적으로 유도되어, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA의 수율 향상을 기대할 수 있다.
본 발명의 방법은, 공정 (2) 후에, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 처리하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로 처리함으로써, 증폭 반응 중에 발생된 부산물인 직쇄상 DNA를 분해하여 제거할 수 있다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제의 종류 및 사용하는 양은, 상술한 바와 같이 하여도 된다. 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제에 의한 처리는, 예를 들면, 25℃~40℃에서, 30분간~3시간 실시해도 된다.
본 발명의 방법은, 공정 (2) 후에, 갭 리페어(gap repair) 효소로 처리하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 갭 리페어 효소는, 2중 가닥 DNA에 있어서 1개 또는 복수가 연속한 뉴클레오티드가 결여된 상태인 갭, 또는 2중 가닥 DNA에 있어서 이웃한 뉴클레오티드 간의 인산 디에스테르 결합이 절단된 상태의 닉을 수복하고, 완전한 2중 가닥 슈퍼 코일 DNA로 하는 효소군이다. 갭 리페어 효소로 처리함으로써, 증폭 반응 중에 부산물로서 발생되어 있던 갭 또는 닉이 들어온 DNA를 수복하고, 목적하는 슈퍼 코일 산물의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
갭 리페어 효소는, 2중 가닥 DNA의 갭 또는 닉을 수복할 수 있는 효소군이면, 그 종류나 생물학적 유래에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 엑소뉴클레아제 III, DNA 폴리머라아제 I, DNA 리가아제, DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군의 조합을 사용할 수 있다. 엑소뉴클레아제 III 활성을 가지는 효소는 5~100mU/μL의 농도로 사용해도 되지만, 이에 한정되지 않는다. 엑소뉴클레아제 III에 대한 효소 활성 단위(U)는, 37℃, 30분의 반응에 있어서, 2중 가닥 DNA의 1nmol의 데옥시리보 뉴클레오티드를 산가용성으로 하는데 필요한 효소량을 1U로 한 단위이다. DNA 폴리머라아제 I, DNA 리가아제, DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군은, 각각 전술한 제1 또는 제2의 효소군에서 정한 농도로 사용해도 되지만, 이에 한정되지 않는다. 갭 리페어 효소에 의한 처리는, 예를 들면, 25~40℃에서, 5~120분간, 바람직하게는 10~60분간, 실시해도 된다.
본 발명의 방법은, 공정 (2) 후에, 목적에 따라, 환상 DNA의 증폭 산물을 정제하는 공정을 포함해도 된다. 환상 DNA의 정제는, 당업자에게 이용 가능한 방법을 사용하여 적절히 실시할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 증폭한 환상 DNA는, 반응 후의 반응 혼합물을 그대로, 혹은 적절히 정제한 것을, 형질전환 등의 그 후의 목적에 이용할 수 있다.
＜환상 DNA의 증폭용 조성물 및 키트＞
본 발명은, 환상 DNA의 증폭용 조성물로서,
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
을 포함하는, 상기 조성물에도 관한 것이다.
본 발명의 조성물은, 단백질의 비특이 흡착 억제제, 핵산의 비특이 흡착 억제제, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제, RecG형 헬리카아제, 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제, 암모늄염, NAD, 환원제, DNA의 안정화 인자, 및, ATP 재생계의 효소 및 기질의 조합으로부터 선택되는 1이상의 성분을 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 조성물에 포함되는 성분에 관한 구체적인 성분 및 농도에 관해서는, 상기 ＜환상 DNA＞, ＜제1, 제2, 제3의 효소군＞, ＜환상 DNA의 증폭 방법＞의 항목에 있어서대해 기재한 바와 같다.
또한, 본 발명은, 환상 DNA의 증폭용 키트로서,
환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
완충액；
ATP；
GTP, CTP 및 UTP；
dNTP；
마그네슘 이온원； 및
알칼리 금속 이온원；
의 조합을 포함하는, 상기 키트에도 관한 것이다.
본 발명의 키트는, 상기의 구성품을 1개의 키트에 모두 포함하는 것이어도 되고, 또한, 본 발명의 방법에 이용할 목적을 위한 키트이면, 상기의 구성품의 일부를 포함하지 않는 것이어도 된다. 상기의 구성품의 일부를 포함하지 않는 키트인 경우, 실시자가, 증폭 시에 필요한 성분을, 해당 키트에 추가하여, 본원발명의 증폭 방법을 실시할 수 있다.
본 발명의 키트는, 단백질의 비특이 흡착 억제제, 핵산의 비특이 흡착 억제제, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제, RecG형 헬리카아제, 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제, 암모늄염, NAD, 환원제, DNA의 안정화 인자, 및, ATP 재생계의 효소 및 기질의 조합으로부터 선택되는 1이상의 성분을 포함하는 추가의 구성품을 더 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 키트는 증폭 반응 후의 처리를 위해서, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제, 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제, 및 갭 리페어 효소로부터 선택되는 1이상의 성분을 포함하는 추가의 구성품을 더 포함하고 있어도 된다. 추가의 구성품은, 1개의 키트로서 본 발명의 키트에 포함되어 있어도 되고, 또는 본 발명의 키트과 함께 사용하는 것을 전제로 한 다른 키트로서 제공되어도 된다.
본 발명의 키트에 포함되는 각 구성품에 관한 구체적인 성분 및 농도에 관해서는, 상기 ＜환상 DNA＞, ＜제1, 제2, 제3의 효소군＞, ＜환상 DNA의 증폭 방법＞의 항목에 있어서 기재한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 상기 구성품의 혼합물을 1개로 포장한 것을 포함하는 것이어도 되지만, 상기 구성품을 개별적으로, 혹은 여러 종류씩 모아서 혼합한 것을 별개로 포장한 것을 포함하는 것이어도 된다
본 발명의 키트는 또한, 본 발명의 환상 DNA의 증폭 방법을 실시하기 위한 지시가 기재된 설명서를 포함하는 것이어도 된다. 해당 설명서에는, 상기 ＜환상 DNA＞, ＜제1, 제2, 제3의 효소군＞, ＜환상 DNA의 증폭 방법＞의 항목에서 기재한 사항이 설명으로서 기재되어 있어도 된다.
실시예
이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 또한, 본 발명은, 하기 실시예에 기재된 범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1：환상 DNA의 증폭
＜재료와 방법＞
표 1에 나타내는 조성의 반응액에 주형 DNA를 첨가하여 얼음 위에서 혼합한 후, 30℃의 인큐베이터에서 1시간, 2시간, 또는 3시간 보온했다. 1반응 당의 총용량은 10마이크로리터가 되도록 했다. 30℃에 있어서의 반응 후, 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동(0.5%　1ХTAE, 150V, 100분간, 14℃)한 후, SYBR Green(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 DNA를 검출했다.
[표 1]
Figure pct00001
표 중, SSB는 대장균 유래 SSB, IHF는 대장균 유래 IhfA 및 IhfB의 복합체, DnaG는 대장균 유래 DnaG, DnaN는 대장균 유래 DnaN, PolIII*는 대장균 유래 DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, 및 HolE의 것으로 이루어지는 복합체인 DNA 폴리머라아제 III* 복합체, DnaB는 대장균 유래 DnaB, DnaC는 대장균 유래 DnaC, DnaA는 대장균 유래 RNaseH, Ligase는 대장균 유래 DNA 리가아제, PolI는 대장균 유래 DNA 폴리머라아제 I, GyrA는 대장균 유래 GyrA, GyrB는 대장균 유래 GyrB, Topo IV는 대장균 유래 ParC 및 ParE의 복합체, Topo III는 대장균 유래 토포이소머라아제 III, RecQ는 대장균 유래 RecQ를 나타낸다.
SSB는, SSB의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄(硫安) 침전 및 이온교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
IHF는, IhfA 및 IhfB의 대장균 공발현주(共發現株)로부터, 황산암모늄 침전 및 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
DnaG는, DnaG의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 음이온교환 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
DnaN는, DnaN의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전 및 음이온교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
PolIII*는, DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ 및 HolE의 대장균 공발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
DnaB, DnaC는, DnaB 및 DnaC의 대장균 공발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
DnaA는, DnaA의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 투석 침전, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
GyrA, GyrB는, GyrA의 대장균 발현주와 GyrB의 대장균 발현주의 혼합물로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
Topo IV는, ParC의 대장균 발현주와 ParE의 대장균 발현주의 혼합물로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
Topo III는, Topo III의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전 및 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
RecQ는, RecQ의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피, 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
RNaseH, Ligase, PolI는 시판의 대장균 유래의 효소를 사용했다(다카라바이오 주식회사).
주형 DNA로서는, 9.6kb의 환상 DNA(복제개시서열 oriC를 가지는 환상 DNA, 카나마이신 내성(Km)), 80kb의 장쇄 환상 DNA(복제개시서열 oriC를 가지는 환상 DNA, 카나마이신 내성(Km)), 200kb의 장쇄 환상 DNA(복제개시서열 oriC를 가지는 환상 DNA, 카나마이신 내성(Km)), 또는 시험관 내 연결에 의해 환상화된 DNA를 사용했다.
9.6kb의 환상 DNA 및 80kb, 200kb의 장쇄 환상 DNA는, 대장균 세포 내 재조합 반응에 의해 조제했다. 구체적으로는, λ 파지의 재조합 단백질군을 발현하고 있는 대장균을 사용하고, 세포 내 재조합 반응에 의해, 카나마이신 내성 카세트(cassette)와 대장균 염색체 중 oriC를 포함하는 영역을 포함하는, 원하는 길이의 환상 DNA를 조제했다.
시험관 내 연결에 의한 환상화 DNA의 조제 방법을, 도 2에 나타낸다. 구체적으로는, 복제개시서열 oriC와 카나마이신 내성(Km)을 가지는 것의 PCR 단편(2.3kb)에, dnaA 유전자 및 dnaN 유전자 서열을 가지는 PCR 단편(이하, dnaA－dnaN 단편이라고 기재한다)(2.6kb)를, Gibson assembly법에 의해 반응시킴으로써 연결했다. 2개의 PCR 단편은 양단(兩端)에 부가한 20염기의 상동 서열(H1, H2이라고 기재한다)를 통하여 연결하여, 환상 구조가 된다. 반응은, Gibson Assembly Master Mix(NEB사)에 상기 2종류의 PCR 단편을 혼합하고, 50℃에서 15분간 반응시킴으로써 실시했다. 반응 후, 반응 용액 0.1마이크로리터분(반응 용액의 10배 희석 용액 1마이크로리터분)을 주형 DNA로서, 10마이크로리터의 증폭 반응계(표 1의 조성)에 직접 첨가하여, 30℃에서 1시간 반응시켰다.
＜결과 1＞ 9.6kb의 환상 DNA(0.08ng, 환상 분자수로 하여 약 107개)를 주형으로서 사용한 경우
SYBR Green에 의한 증폭 산물의 검출 결과를 도 3에 나타낸다.
부차적 산물(반응 중간 산물)도 볼 수 있지만, 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA 증폭 산물(검정 틀로 나타낸다)을 확인할 수 있었다.
반응 후의 용액을 그대로 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하고, 카나마이신 함유 한천 배지에서 배양하여, 콜로니수를 계측함으로써, 환상 DNA의 증폭량을 구한 결과를 표 2에 나타낸다. 대조(對照)로서는, 보온 시간 0시간의 반응 용액을 사용했다.
[표 2]
Figure pct00002
본 발명의 방법에 의해, 9.6kb의 환상 DNA를 환상 DNA로서 대략 6,000배로 증폭시킬 수 있었다.
＜결과 2＞　80kb 및 200kb의 장쇄 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우
SYBR Green에 의한 증폭 산물의 검출 결과를 도 4에 나타낸다.
슈퍼 코일 구조의 환상 DNA 증폭 산물(검은 틀 또는 화살표로 나타낸다)을 확인할 수 있었다.
본 발명의 방법에 의해, 80kb 또는 200kb이라고 하는 장대한 환상 DNA를 주형으로서 사용한 경우이라도, 양호하게 증폭 산물을 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다.
＜결과 3＞　시험관 내 연결에 의해 환상화된 DNA를 주형으로서 사용한 경우
SYBR Green에 의한 증폭 산물의 검출 결과를 도 5에 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해, 시험관 내 연결에 의해 환상화된 DNA를 주형으로서 사용한 경우이라도, 양호하게 증폭 산물을 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다.
반응 후의 용액을 그대로 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하고, 카나마이신 함유 한천 배지에서 배양하여, 콜로니수를 계측함으로써, 환상 DNA의 증폭량을 구한 결과를 표 3에 나타낸다. 대조로서, 증폭 반응을 실시하지 않았던 샘플을 사용했다.
[표 3]
Figure pct00003
Gibson Assembly법을 사용하여 환상화한 DNA가, 본 발명의 방법에 의해, 환상 분자로서 대략 2,000배로 증폭된 것을 알 수 있었다.
실시예 2：소수의 주형 분자로부터의 환상 DNA의 증폭
실시예 1에 기재된 9.6kb의 환상 DNA를 사용하여, 실시예 1과 동일하게 증폭 반응을 실시했다.
(2－1) 증폭 효율의 검토
증폭 반응액(실시예 1, 표 1) 10μl에, 9.6kb의 환상 DNA를 환상 분자로서 1~1000분자 포함되도록 첨가하고, 30℃에서 3시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 반응물에 관하여, 0.5% 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, SybrGreen(다카라바이오 주식회사)로 염색하여, 증폭 DNA를 검출했다(도 6 a). 또한, 증폭 산물의 총DNA량을, PicoGreen 검출 키트(ThermoFisher사)에 의해 정량했다(도 6b：PicoGreen법). 환상 DNA 분자로서의 증폭량을, 증폭 산물을 직접, 대장균으로 형질전환하고, 카나마이신 내성 콜로니수를 구함으로써 정량했다(도 6b：형질전환법). 정량 결과로부터, 초기 DNA량에 대한 증폭 정도를 구하고(증폭), 그래프에 나타냈다.
상기의 결과로부터, 주형 DNA로서 1분자의 환상 DNA를, 겨우 3시간의 등온 반응으로 약 1011분자로까지, 증폭 가능하다는 것이 분명해졌다(약 1,000억배의 증폭).
(2－2) 배가 시간의 검토
증폭 반응액(실시예 1, 표 1) 80μl에, 상기의 환상 DNA를 첨가하고, 30℃에서 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 환상 DNA는 반응액 1μl 당 105분자가 되도록 첨가했다. 경시적으로 샘플링하고, 샘플을 직접, 대장균으로 형질전환하고, 카나마이신 내성 콜로니수를 구함으로써 증폭된 환상 DNA 분자수를 정량했다(도 7).
상기의 결과로부터, 9.6kb의 환상 DNA 분자의 배가 시간은 약 5분인 것이 확인되었다.
실시예 3：혼합물로부터 단일의 환상 DNA 클론의 증폭
실시예 1에 기재된 9.6kb의 환상 DNA 및 12.0kb의 환상 DNA(복제개시서열 oriC를 가지는 환상 DNA, 카나마이신 내성(Km))의 혼합물로부터 단일의 환상 DNA 클론의 증폭을 실시했다.
12.0kb의 환상 DNA는, 대장균 세포 내 재조합 반응에 의해 조제했다. 구체적으로는, λ 파지의 재조합 단백질군을 발현하고 있는 대장균을 사용하고, 세포 내 재조합 반응에 의해, oriC와 카나마이신 내성 유전자로 이루어지는 카세트와 대장균 염색체의 일부의 영역을 포함하는, 원하는 길이의 환상 DNA를 조제했다.
증폭 반응액(실시예 1, 표 1) 10μl에, 상기 2종의 환상 DNA의 혼합물을 반응액 중에 각 15분자 혹은 각 1.5분자가 되도록 희석하여 첨가하고, 30℃에서 6시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 반응물에 관하여, 0.5% 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, SybrGreen(다카라바이오 주식회사)으로 염색하여, 증폭 DNA를 검출했다(도 8).
그 결과, 환상 DNA가 1.5분자로까지 희석된 반응액에서는, 각 반응 샘플 모두에, 어느 한쪽의 클론만이 증폭되었다. 이는, 주형 DNA가 혼합물이어도, 그것을 반응액 중에 1분자 레벨로까지 희석함으로써, 단일의 환상 DNA 클론의 증폭이 가능한 것을 나타낸다.
실시예 4：계대(繼代) 증폭
lacZ 환상 DNA를 사용하여, 환상 DNA의 계대 증폭에 관하여 시험했다.
lacZ 환상 DNA(9.0kb)는, oriC를 포함하는 2중 가닥 DNA 단편(1.0kb), 카나마이신 내성 유전자(Km)를 포함하는 2중 가닥 DNA 단편(4.6kb) 및 lacZ(β－갈락토시다아제) 유전자를 포함하는 2중 가닥 DNA 단편(3.4kb)을 연결시킴으로써 조제했다. 증폭 반응액(실시예 1, 표 1) 10μl에, lacZ 환상 DNA를 1,000분자 포함되도록 첨가하고, 30℃에서 3시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시하고, 이것을 1계대로 했다. 전(前)의 계대수에서의 증폭 반응물을 105배 희석하고, 이것을 1μl, 새로운 증폭 반응액에 첨가하여 동일하게 반응시킴으로써 다음의 계대 증폭으로 했다. 이 계대 증폭을 10회까지 반복했다. 계대 마다의 증폭 산물에 관하여, 0.5% 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, SybrGreen(다카라바이오 주식회사)로 염색하여, 검출했다(도 9). 또한, 그 증폭 산물의 일부를 대장균 형질전환하고, 카나마이신 내성 콜로니수부터 DNA 증폭 정도를 정량, 이 값에 의해, 몇 세대 지수 증폭을 반복했는지를 산출하여 총세대수라로서 나타냈다.
그 결과, 10회의 계대 후도 환상 DNA의 증폭이 효율적으로 진행되고 있는 것이 알았다. 실시예 2(도 7)의 결과가 나타내는 바와 같이, 환상 DNA가 어느 정도 증폭되면, 기질이나 효소의 고갈에 의해, 증폭 속도는 한계점 도달이 된다. 한편, 본 실시예의 결과는, 증폭 반응물의 일부를 새로운 반응액으로 계대함으로써, 환상 DNA의 지수 증폭을 반영구적으로 반복하는 것이 가능한 것을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 방법은, 환상 DNA의 증폭을, 세포의 계대 증식과 같이 실시하는 것이 가능한 방법이다.
실시예 5：증폭 반응에 있어서의 복제 에러 발생율
실시예 4에 있어서의 주형의 환상 DNA에는 lacZ 유전자가 포함되어 있기 때문에, 이 환상 유전자로 형질전환한 대장균을 X-gal 플레이트 위에서 배양하면, lacZ 유전자가 정상적으로 발현된 콜로니(lacZ+)는 X-gal를 분해할 수 있기 때문에 청색을 나타내고, 복제 에러에 의한 변이 도입으로 lacZ 유전자가 정상적으로 기능하지 않게 된 콜로니(lacZ－)는 X-gal를 분해할 수 없기 때문에 백색을 나타낸다.즉, 이 환상 유전자로 형질전환한 대장균이 X-gal 플레이트 위에서 나타내는 색에 의해, 증폭된 환상 DNA에 있어서의 복제 에러를 판정할 수 있다.
각 계대 샘플의 증폭 반응물을 직접 대장균으로 형질전환하고, X-gal 플레이트 위에서 배양하여, lacZ -출현율을 구했다. 이 lacZ -출현율과 실시예 4에서 구한 총세대수로부터, Barnes의 방법(Barnes WM Gene. 1992, 112, 29-35)에 따라, 복제 사이클 1세대 당의 에러 발생율을 산출했다. 결과를 이하의 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00004
상기의 결과는, 복제 에러는 1억 염기에 대하여 1개소(箇所) 정도(염기 당 평균 1.4×10-8 에러)인 것을 나타낸다. 이는, 세포 내(미스매치(mismatch) 수복계를 갖지 않는 주)의 변이율과 동일한 정도이며, Taq 폴리머라아제의 약 1만배의 정확성이다.
실시예 6：엑소뉴클레아제 및 RecG의 추가
실시예 1에 기재된 80kb의 환상 DNA를 사용하고, 증폭 반응액에 RecG형 헬리카아제 및 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 첨가하여 증폭 반응을 실시하는 경우의 효과를 검토했다.
80kb의 환상 DNA는, 실시예 1에 나타낸 바와 같이 조제했다.
RecG형 헬리카아제로서, RecG를 사용했다. RecG는, RecG의 대장균 발현주로부터, 황산암모늄 침전, 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공정으로 정제하여, 조제했다.
직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로서, 시판되는 엑소뉴클레아제인 Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase (epicentre)를 사용했다. 유닛(unit)수는, 제조원(製造元)의 기재에 따랐다.
실시예 1의 표 1에 나타내는 반응 조성에, 80kb의 환상 DNA를 0.8pg/μl 또는 8pg/μl, RecG를 0nM, 100nM, 300nM, 또는 1000nM, 및 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 0 U/μL 또는 0.2U/μL가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을, 30℃에서 24시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 반응물에 관하여, 0.5% 아가로스 겔 전기영동(1×TAE 버퍼, 150V, 100분)을 실시하고, SybrGreen(다카라바이오 주식회사)으로 염색하여, 증폭 DNA를 검출했다.
그 결과, RecG 및 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제의 첨가에 의해, DNA의 절단 등에 의한 부산물인 직쇄상 DNA의 생성이 저감되어, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA 증폭 산물의 생성량의 향상이 관찰되었다(도 10).
실시예 7：각종 조건 검토
반응액의 각 성분에 관하여 조건 검토를 실시한 결과를 나타낸다.
1. 방법
주형이 되는 환상 DNA로서, 8.0kb의 환상 DNA를 사용했다. 8.0kb의 환상 DNA는, M13mp18 플라스미드 벡터에 oriC 단편을 삽입하여 작성했다.
조건 A~R에 관해서는, 표 5에 나타내는 증폭 반응액에 8.0kb의 환상 DNA를 종농도(終濃度) 8.0ng/μl 또는 0.8ng/μl가 되도록 첨가하고, 30℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액에[α－32P] dATP를 첨가하여 두고, DNA 복제 반응 후, 주형 DNA에 취입된 dNTP량을 액체 신틸레이션 카운터로 계측했다. DNTP 취입량은 25μl반응액 당(當)의 값을 산출했다. 종농도 8.0ng/μl의 환상 DNA를 주형으로 하여, 100% 복제 반응이 진행된 경우(1 라운드의 복제), 600pmol의 dNTP가 취입된다. 반응액의 일부는 아가로스 겔 전기영동 후, BAS 이메징 플레이트로 32P 취입 산물을 검출하고, 목적하는 슈퍼 코일 구조 산생(産生)을 확인했다.
조건 S에 관해서는, 표 5에 나타내는 증폭 반응액에 8.0kb의 환상 DNA를 종농도 8.0ng/μl 또는 0.8ng/μl가 되도록 첨가하고, 30℃에서 2시간 반응시켰다. 반응물에 관해서, 0.5% 아가로스 겔 전기영동(1ХTAE 버퍼, 150V, 100분)을 실시하고, SybrGreen(다카라바이오 주식회사)로 염색하여, 증폭 DNA를 검출했다.
[표 5-1]
Figure pct00005
[표 5-2]
Figure pct00006
[표 5-3]
Figure pct00007
2. 결과
(1) 조건 A
제1, 제2 및 제3의 효소군을 첨가하여 반응시킴으로써, 수(數) 라운드의 복제 사이클의 반복이 유도되는 것을 발견했다. 그러나, 복제 사이클을 거칠 때 마다 반응의 기질 단백질이 부족해지기 때문에, 복제 사이클은 4라운드까지에서 정체되는 것이 판명되었다(도 11).
(2) 조건 B
반응 개시의 주형 DNA량을 줄임으로써 복제 사이클수를 향상시킬 수 있을지에 관하여 검토했다. 반응 개시 시의 주형 DNA량에 관하여, 8ng/μl 및 0.8ng/μl에서 검토했다.
그 결과, 반응 개시 시의 주형 DNA량이 8ng/μl인 경우는 복제 반응을 볼 수 있었지만, 주형 DNA량을 0.8ng/μl로 감소시키면, 복제 효율이 현저하게 저해되어, DNA의 증폭이 관찰되지 않았다(도 12). 이는, 복제 사이클수를 향상시키기 위해서는, 단지 주형 DNA량을 감소시키면 되는 것이 아니라, 반응 조성의 각종 성분의 양을 포함하는 조건 검토가 필요한 것을 나타내고 있다.
(3) 조건 C
반응 조성에 있어서의 GTP, CTP 및 UTP의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 GTP, CTP 및 UTP의 농도에 관하여, 0.2mM, 0.5mM, 1.0mM 및 2.0mM를 검토했다.
결과를 도 13에 나타낸다.
(4) 조건 D
반응 조성에 있어서의 IHF의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 IHF의 농도에 관하여, 0nM, 10nM, 20nM, 40nM, 100nM, 및 200nM를 검토했다.
결과를 도 14에 나타낸다.
(5) 조건 E
반응 조성에 있어서의 Topo IV의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 Topo IV의 농도에 관하여, 0nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nM, 및 20nM를 검토했다.
결과를 도 15에 나타낸다.
(6) 조건 F
반응 조성에 있어서의 DNA 자이레이스의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 GyrA-GyrB 복합체의 농도에 관하여, 0nM, 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 및 200nM를 검토했다.
결과를 도 16에 나타낸다.
(7) 조건 G
반응 조성에 있어서의 DNA 폴리머라아제 III*의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 Pol III*의 농도에 관하여, 0nM, 1nM, 2nM, 5nM, 및 10nM를 검토했다.
결과를 도 17에 나타낸다.
(8) 조건 H
반응 조성에 있어서의 알칼리 금속 이온원의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 글루타민산칼륨의 농도에 관하여, 50mM 및 150mM를 검토했다.
결과를 도 18에 나타낸다.
(9) 조건 I
반응 조성에 있어서의 단백질의 비특이 흡착 억제제 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제의 양을 검토했다. 반응 조성에 tRNA를 포함하지 않고 0.1mg/ml　BSA를 포함하는 조건, 20ng/μl　tRNA 및 0.1mg/ml　BSA를 포함하는 조건, tRNA를 포함하지 않고 BSA를 0.5mg/ml 포함하는 조건을 검토했다.
결과를 도 19에 나타낸다.
(10) 조건 J
반응 조성에 있어서의 DnaA 활성을 가지는 효소의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 DnaA의 농도에 관하여, 0nM, 5nM, 10nM, 20nM, 40nM, 100nM, 및 200nM를 검토했다.
결과를 도 20에 나타낸다.
(11) 조건 K
반응 조성에 있어서의 DNA 리가아제 활성을 가지는 효소의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 리가아제의 농도에 관하여, 0nM, 2nM, 5nM, 10nM, 20nM, 및 50nM를 검토했다.
결과를 도 21에 나타낸다.
(12) 조건 L
반응 조성에 있어서의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 SSB의 농도에 관하여, 0nM, 10nM, 20nM, 50nM, 100nM, 200nM, 및 500nM를 검토했다.
결과를 도 22에 나타낸다.
(13) 조건 M
반응 조성에 있어서의 DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 Pol I의 농도에 관하여, 0nM, 2nM, 5nM, 10nM, 20nM, 및 50nM를 검토했다.
결과를 도 23에 나타낸다.
(14) 조건 N
반응 조성에 있어서의 DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소 및 DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 DnaB-DnaC 복합체의 농도에 관하여, 0nM, 5nM, 10nM, 20nM, 및 40nM를 검토했다.
결과를 도 24에 나타낸다.
(15) 조건 O
반응 조성에 있어서의 RNaseH 활성을 가지는 효소의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 RNaseH의 농도에 관하여, 1nM, 3nM, 및 10nM를 검토했다.
결과를 도 25에 나타낸다.
(16) 조건 P
조건 P에 관하여, 반응 개시 시의 주형 DNA량을, 8ng/μl, 0.8ng/μl, 및 0.27ng/μl로 하여 증폭 반응을 검토했다.
결과를 도 26에 나타낸다. 조건 P에서는, 주형 DNA의 양이 0.8ng/μl인 경우도 효율적으로 증폭시킬 수 있었다. 또한, 주형 DNA의 양을 0.27ng/μl로 줄였을 경우도 효율적으로 증폭시킬 수 있었다. DNA 합성량으로서는, 100배를 초과하여 증폭하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
(17) 조건 Q
반응 조성에 있어서의, 제3의 효소군의 효소의 조성 및 양에 관하여 검토했다. 제3의 효소군으로서 Topo IV, Topo III, 및 RecQ를 사용했다. 각 효소에 관하여 검토한 농도는 도 27에 나타내는 바와 같다.
결과를 도 27에 나타낸다.
(18) 조건 R
조건 R에 관하여, DNA 자이레이스의 양을 검토했다. 반응 개시 시의 GyrA-GyrB 복합체의 농도에 관하여, 0nM, 10nM, 25nM, 50nM, 및 150nM를 검토했다.
결과를 도 28에 나타낸다.
(19) 조건 S
조건 S로서, tRNA, NAD, 황산암모늄(AS), IHF, SSB, TopoIV의 농도를 변경하여 환상 DNA의 증폭을 검토했다. 각 성분에 관하여 검토한 농도는 도 29에 나타내는 바와 같다.
결과를 도 29에 나타낸다.
실시예 8：버퍼 조성의 개량
표 1에 나타내는 반응 버퍼의 조성에 관하여, 조건 검토를 더 실시했다.
구체적으로는, 실시예 1에 기재된 200kb 환상 DNA를 0.5pM 사용하고, 반응 버퍼의 조성으로 변경을 가한 이외는, 실시예 1과 동일하게 증폭 반응을 실시했다.
(1) 디티오트레이톨(DTT)의 양의 개량
DTT에 관하여, 실시예 1에서는 8mM의 농도로 하고 있었는데, 4mM로 변경하여 증폭 반응을 실시했다. 그 결과, DTT의 양을 반감시켜도 환상 DNA의 증폭 반응이 진행된 것을 확인했다.
(2) 알칼리 금속 이온원의 검토
표 1의 반응 버퍼의 조성에 관하여, DTT를 4mM로 변경하는 것과 동시에, 알칼리 금속 이온원을 포함하지 않는 반응 버퍼, 및, 알칼리 금속 이온원으로서 글루타민산칼륨 대신에 150mM 아세트산칼륨을 포함하는 반응 버퍼를 사용하여, 환상 DNA의 증폭 반응을 실시했다.
결과를 도 30에 나타낸다. 장쇄 환상 DNA를 0.5pM 이하의 저농도로부터 증폭하는 경우에는, 저분자의 부생성물이 증폭되어, 목적하는 증폭 산물인 슈퍼 코일의 산생을 확인할 수 없게 된다는 문제가 발생된다. 그러나, 글루타민산칼륨이나 아세트산칼륨이라고 하는 알칼리 금속 이온원을 반응 버퍼에 포함함으로써, 장쇄 환상 DNA를 0.5pM의 저농도로부터 증폭하는 경우이라도 양호하게 목적 산물인 슈퍼 코일의 증폭을 확인할 수 있었다.
이후의 실험에는, 이하에 나타내는 조성의 반응 버퍼를 사용했다.
[표 6]
Figure pct00008
(3) 완충제의 검토
표 6의 버퍼의 조성에 관하여, 20mM Tris-HCL (pH 8.0)를 20mM Tris-OAc (pH 8.0)로 변경하여 환상 DNA의 증폭 반응을 실시했다. 그 결과, 20mM Tris-OAc (pH 8.0)를 사용한 경우도, 20mM Tris-HCL (pH 8.0)를 사용한 경우와 동일한 증폭 산물이 관찰되었다.
(4) 디티오트레이톨(DTT)의 대체물의 검토
표 6의 버퍼 조성에 관하여, 4mM DTT를, 4mM 2－메캅토에탄올(2-Me) 또는 4mM 트리스(2－카복시에틸) 포스핀(TCEP)으로 변경하여 환상 DNA의 증폭 반응을 실시했다. 그 결과, 2-Me 및 TCEP 중 어느 하나를 사용한 경우도, DTT를 사용한 경우와 동일한 증폭 산물이 관찰되었다.
(5) 황산암모늄의 대체물의 검토
표 6의 버퍼 조성에 관하여, 10mM 황산암모늄을, 10mM 아세트산암모늄으로 변경하여 환상 DNA의 증폭 반응을 실시했다. 그 결과, 아세트산암모늄을 사용한 경우도, 황산암모늄을 사용한 경우와 동일한 증폭 산물이 관찰되었다.
실시예 9：반응액의 프리인큐베이션에 의한 증폭 효율화
증폭 반응 전에 프리인큐베이션을 실시하는 경우의 효과를 검토했다.
주형 DNA로서 실시예 1에 기재된 200kb 환상 DNA를 사용했다. 표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액을 얼음 위에서 조제했다. 0℃, 16℃, 또는 30℃에서, 각각 0, 5, 15 또는 30분간 프리인큐베이션을 실시했다. 그 후, 반응액에 주형 DNA를 종농도가 0.05pM가 되도록 첨가하고, 30℃의 인큐베이터에서 3시간 보온했다. 반응 후, 반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 31에 나타낸다. 16℃ 또는 30℃에서 프리인큐베이션을 실시한 경우, 목적 산물인 슈퍼 코일의 산생이 증가되었던 것이 확인되었다. 증폭 반응 전의 프리인큐베이션은, 장쇄 환상 DNA의 저농도로부터의 증폭의 경우이라도, 목적하는 증폭 산물인 슈퍼 코일의 산생이 많아진다는 점에서 유효하다.
실시예 10：RecG 및 RecJ의 추가
증폭 반응액에 RecG형 헬리카아제 및 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 첨가하여 증폭 반응을 실시하는 경우의 효과를 검토했다.
주형 DNA로서 실시예 1에 기재된 200kb 환상 DNA를 사용했다.
RecG형 헬리카아제로서, RecG를 사용했다. RecG는 실시예 6과 동일하게 조정한 것을 사용했다.
단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로서 RecJ를 사용했다. RecJ는 NEB사로부터 입수했다.
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액에, 200kb 환상 DNA를 0.5pM(67pg/μl), RecG를 0nM 또는 100nM, RecJ를 0U/μL 또는 0.5U/μL가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을 30℃에서 3시간 또는 25시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 반응 후, 반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 32에 나타낸다. RecG 및 RecJ의 첨가에 의해, 저분자의 부차적인 증폭 산물의 정제가 저감되어, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA 증폭 산물의 생성량의 향상이 관찰되었다. 증폭 반응에 있어서의 RecG형 헬리카아제 및 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제의 첨가는, 특히, 장쇄 환상 DNA를 저농도로부터 증폭하는 경우에 저분자의 부생성물이 증폭된다는 문제를 해소하는 수단으로서 유효하다.
실시예 11：RecBCD 및 exo I의 추가
증폭 반응액에 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 첨가하여 증폭 반응을 실시하는 경우의 효과를 검토했다.
주형 DNA로서 실시예 1에 기재된 200kb 환상 DNA를 사용했다.
직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로서 RecBCD를 사용했다. RecBCD는 NEB사로부터 입수했다.
단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로서 exo I를 사용했다. exo I는, NEB사로부터 입수했다.
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액에, 200kb 환상 DNA를 0.5pM(67pg/μl), RecBCD를 0, 1.5, 5.0, 15.0, 또는 50.0mU/μL, exo I를 200mU/μL가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을 30℃에서 20시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 반응 후, 반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 33에 나타낸다. RecBCD 및 exo I의 첨가에 의해, DNA의 절단 등에 의한 부산물인 직쇄상 DNA의 생성이 저감되고, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA 증폭 산물의 생성량의 향상이 관찰되었다. 증폭 반응에 있어서의 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제의 첨가는, 특히, 장쇄 환상 DNA를 저농도로부터 증폭하는 경우에 직쇄상 DNA의 부생성물이 증폭된다는 문제를 해소하는 수단으로서 유효하다.
실시예 12：반응 후처리-희석 재보온에 의한 최종 산물 증가와 재보온 시의 RecBCD 및 exoI에 의한 직쇄상 DNA의 제거
증폭 반응 후에 희석 재보온 처리를 실시함으로써, 부생성물의 제거가 가능한지 아닌지를 검토했다. 또한, 증폭 반응 후에 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제로 처리함으로써, 부생성물의 제거가 가능하지 아닌지를 검토했다.
주형 DNA로서 실시예 1에 기재된 200kb 환상 DNA를 사용했다.
직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로서 RecBCD, 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제로서 exo I를 사용했다. RecBCD 및 exo I는 실시예 10과 동일하게 입수했다.
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액에, 200kb 환상 DNA를 0.5pM(67pg/μl)가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을 30℃에서 23시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다.
증폭 반응 후의 반응액을, 표 6으로부터 크레아틴키나아제와 소혈청 알부민을 제외한 조성의 반응 버퍼로 1/5로 희석하고, (i) 그대로 30℃에서 1시간 재보온, (ii) RecBCD를 200mU/μL 첨가하여 30℃에서 1시간 재보온, 또는 (iii) RecBCD를 200mU/μL 및 exo I를 200mU/μL 첨가하여 30℃에서 1시간 재보온했다. 반응 산물을, 희석 재보온 전의 산물과 함께, 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 34에 나타낸다. 증폭 반응 후의 반응액을 희석 재보온하는 것만에 의해서도 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA를 검출할 수 있었다. 또한, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제 존재 하에 있어서, 부산물인 직쇄상 DNA를 제거할 수 있었다.
희석 재보온 처리는, 산물 중의 증폭 중간체의 복제 신장이나 분리 반응을 촉진하고, 최종 산물인 슈퍼 코일 DNA의 산생량을 높이는 수단으로서 유효하다. 또한, 재보온 시에 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제에 의해 처리를 맡기는 것은, 특히, 장쇄 환상 DNA를 저농도로부터 증폭하는 경우에 부생성물로서 발생되는 직쇄상 DNA를 제거할 수 있는 수단으로서 유효하다.
실시예 13：반응 후처리-갭 리페어(GR) 효소에 의한 단일 가닥 갭의 수복
증폭 반응 후에, 갭 리페어(GR) 효소로 처리함으로써, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA의 검출이 가능하지 아닌지를 검토했다.
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액에, 15kb 환상 DNA를 0.5pM(5pg/μl)가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을 30℃에서 20시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 주형 DNA로서 사용한 15kb의 환상 DNA는, 대장균 게놈상의 15kb 영역과 oriC 단편(0.4kb)을 연결 환상화하고, 대장균을 사용하여 클론화 후, 정제한 것을 사용했다.
증폭 반응 후 산물에 관하여, 20ml의 10mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 2시간 투석을 실시하고, 그 중 0.5μl를, GR효소를 포함하는 반응 버퍼 5μl에 첨가하고, 30℃에서 20분간 또는 60분간 인큐베이트 했다. GR효소로서는, Exo III, DNA 폴리머라아제 I, 리가아제 및 자이레이스의 조합을 사용하고, 각각 20mU/μL, 50nM, 50nM, 50nM의 농도로 첨가했다. 반응 버퍼는 표 6에 나타내는 조성의 것을 사용했다.
GR효소에 의한 처리의 포지티브 컨트롤(positive control)로서, 닉이 들어가 있는 DNA인 PhiX174 RFII(NEB사)를 사용하여 갭 리페어 반응을 실시했다. 갭 리페어가 적절히 이루어지면, 닉이 수복되어, 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA를 검출할 수 있다.
반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 35에 나타낸다. 본 실험에서는, 15kb의 환상 DNA에 지적(至適)한 증폭 시간(3시간 정도)을 웃도는 장시간 반응 때문에, 슈퍼 코일 산물은 거의 관찰할 수 없게 되어 있다. 이 산물을 GR효소로 처리함으로써, 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA를 검출할 수 있었다. 이는, 증폭 반응 후의 부산물로부터, 갭 리페어에 의해 목적하는 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA를 얻을 수 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 14：장쇄 환상 DNA의 안정화 인자 및 그것을 이용한 증폭 반응 효율화
(1) 장쇄 DNA의 안정화 인자의 검토
장쇄 환상 DNA를 표 6으로부터 크레아틴키나아제와 소혈청 알부민을 제외한 조성의 반응 버퍼로, 37℃에서 인큐베이트하면, DNA 손상이 유도되어, 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA가 감소되는 모습이 관찰되었다. 장쇄 환상 DNA의 안정화에 기여하는 시약에 관하여 검토했다.
검토의 결과, 글루코오스, 스크로오스, 디메틸설폭시드(DMSO), 소혈청 알부민(BSA), 글리콜에테르디아민4아세트산(EGTA), 바소크프로인디설폰산2나트륨(BDA), 페닐실라민, 타이론(Tiron, 1,2-디하이드록시벤젠-3,5-설포네이트), 디에틸렌트리아민5아세트산(DTPA), 에틸렌디아민4아세트산(EDTA), Dps 단백질(대장균 유래), 메탈로티오네인 단백질(사람 유래)이 반응 버퍼에서의 보온 시에 있어서의 DNA의 안정화에 효과를 나타내는 것이 분명해졌다.
(2) DNA 안정화 인자에 의한 환상 DNA 증폭 반응 효율화
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액에, 200kb 환상 DNA를 0.5pM(67pg/μl), DTPA 혹은 Tiron를 0.05, 0.1또는 0.3mM, BDA를 0.1, 0.3 또는 1mM, Dps를 0.3, 1 또는 3μM가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을 30℃에서 20시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다. 증폭 후의 반응액을, 실시예 11과 동일하게, 30℃에서 1시간, 희석 재보온한 후, 반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 36에 나타낸다. (1)에서 발견한 DNA 안정화 인자 중, DTPA, Tiron, BDA, Dps 단백질 및 BSA를 첨가한 증폭 반응물에 있어서는, 슈퍼 코일 구조의 환상 DNA의 산생량(産生量)이 향상되어 있어, 환상 DNA 증폭 반응을 효율화하는 작용을 가지는 것이 분명해졌다.
실시예 15：에멀젼을 이용한 장쇄 환상 DNA의 증폭 반응
유중수적형 에멀젼 내에서의 환상 DNA의 증폭 반응을 검토했다.
주형 DNA로서 실시예 1에 기재된 200kb 환상 DNA를 사용했다.
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액에, 200kb 환상 DNA를 0.5pM(67pg/μl)가 되도록 첨가한 증폭 반응액(5μl)을 조제했다. 이 증폭 반응액에, 계면활성제(2% ABIL EM90 및 0.05% Triton-X100)를 포함하는 미네랄 오일 100μl를 첨가하여, 볼텍스(Vortex)에 60초 걸쳐 혼합했다. 이 혼합물을 30℃에서 3시간 또는 18시간 시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다(에멀젼). 또한, 비교를 위해, 상기의 증폭 반응액을 그대로 30℃에서 3시간 또는 18시간 보온함으로써 증폭 반응을 실시했다(벌크). 반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 37에 나타낸다. 벌크의 계(系)에서는, 저분자의 부산물의 생성을 볼 수 있는 것과 동시에, 반응 시간이 길어지면 목적하는 슈퍼 코일 구조의 DNA가 관찰되지 않게 되었다. 에멀젼의 계에서는, 저분자의 부산물의 생성이 억제되는 것과 동시에, 반응 시간에 따라 목적하는 슈퍼 코일 구조의 DNA의 산생이 향상되었다.
실시예 16：온도 사이클에 의한 증폭 효율화
환상 DNA의 증폭 반응에 있어서는, 저분자일수록 복제가 빨리 완료되므로, 부생성물로서 저분자의 환상 DNA가 생성되어 버리면, 부생성물쪽이 빨리 증폭되어 버린다. 장쇄 DNA를 증폭할 때에는, 이 현상에 의해 부생성물의 증폭이 우위가 되어, 목적 산물인 장쇄 DNA의 증폭을 볼 수 없게 되는 것이 문제이었다. 장쇄 DNA를 효율적으로 증폭하기 위해서는, 저분자 DNA의 과잉 증폭을 억제할 필요가 있다.
여기서, 발명자들은 oriC를 포함하는 환상 DNA의 복제 개시에는 30℃ 이상의 온도가 지적(至適)인 한편, 신장·분리 반응에 관해서는 보다 저온에서도 진행되는 점에 주목했다. 환상 DNA의 증폭 반응에 있어서 온도 사이클을 매김함으로써, 복제 개시의 사이클을 갖추어, 저분자 DNA의 과잉 증폭을 억제하는 것을 시도했다.
표 6에 나타내는 조성의 반응 버퍼 및 표 1에 나타내는 조성의 효소군을 포함하는 반응액을 실시예 8에 따라 30℃, 30분간 프리인큐베이트한 후, 200kb 환상 DNA(실시예 1)를 0.5pM(67pg/μl)가 되도록 첨가한 증폭 반응액(10μl)을 조제했다.이 증폭 반응액에 관하여, 37℃, 5분간→16℃ 또는 24℃, 30분간의 온도 사이클을 30사이클 실시했다(2-Step 사이클). 또한, 비교를 위한 시료로서, 상기의 증폭 반응액을 30℃, 21시간 보온했다. 반응 산물을 실시예 1과 동일하게 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 DNA를 검출했다.
결과를 도 38에 나타낸다. 2-Step 사이클로 반응시킨 경우, 저분자의 부생성물의 산생이 억제되는 것과 동시에, 목적하는 슈퍼 코일 구조의 DNA의 산생량이 증대되었다.
산업상의 이용 가능성
본 발명에 의해, 대장균 세포나 플라스미드 벡터를 이용하는 일 없이, 환상 DNA, 특히 장쇄 환상 DNA를 간편 또한 지수적으로 증폭시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (29)

  1. 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
    (1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하：
    환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
    오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
    2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
    완충액；
    ATP；
    GTP, CTP 및 UTP；
    dNTP；
    마그네슘 이온원； 및
    알칼리 금속 이온원；
    을 포함하는 반응액과의 반응 혼합물을 형성하는 공정,
    여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는； 및
    (2) 공정 (1)에서 형성된 반응 혼합물을 등온(等溫) 조건 하에서 보온(保溫)하는 공정；
    을 포함하는, 상기 방법.
  2. 환상 DNA의 증폭 방법으로서, 이하의 공정：
    (1) 주형이 되는 환상 DNA와, 이하：
    환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
    오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
    2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
    완충액；
    ATP；
    GTP, CTP 및 UTP；
    dNTP；
    마그네슘 이온원； 및
    알칼리 금속 이온원；
    을 포함하는 반응액과의 반응 혼합물을 형성하는 공정,
    여기서 해당 환상 DNA는 DnaA 활성을 가지는 효소와 결합 가능한 복제개시서열(origin of chromosome(oriC))을 포함하는； 및
    (2) 공정 (1)에서 형성된 반응 혼합물을, 30℃ 이상에서의 인큐베이션 및 27℃ 이하에서의 인큐베이션을 반복하는 온도 사이클 하에서, 인큐베이트하는 공정；
    을 포함하는, 상기 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    반응액이, 단백질의 비특이(非特異) 흡착 억제제, 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    반응액이, 직쇄상(直鎖狀) DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 RecG형 헬리카아제를 더 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    반응액이, 암모늄염을 더 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    제1의 효소군이, DnaA 활성을 가지는 효소, 1종 이상의 핵양체(核樣體) 단백질, DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein(SSB)), DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소, DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소, DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소, DNA 클램프 활성을 가지는 효소, 및 DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군의 조합을 포함하고,
    제2의 효소군이, DNA 폴리머라아제 I 활성을 가지는 효소 및 DNA 리가아제 활성을 가지는 효소의 조합을 포함하고,
    제3의 효소군이, 토포이소머라아제 III 활성을 가지는 효소 및/또는 토포이소머라아제 IV 활성을 가지는 효소를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    제2의 효소군이 RNaseH 활성을 가지는 효소를 더 포함하는, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서,
    제3의 효소군이 RecQ형 헬리카아제 활성을 가지는 효소를 더 포함하는, 방법.
  9. 청구항 6에 있어서,
    제1의 효소군에 있어서,
    1종 이상의 핵양체 단백질이 IHF 또는 HU이고,
    DNA 자이레이스 활성을 가지는 효소 또는 효소군이, GyrA 및 GyrB로 이루어지는 복합체이고,
    DnaB형 헬리카아제 활성을 가지는 효소가 DnaB 헬리카아제이고,
    DNA 헬리카아제 로더 활성을 가지는 효소가 DnaC 헬리카아제 로더이고,
    DNA 프라이마제 활성을 가지는 효소가 DnaG 프라이마제이고,
    DNA 클램프 활성을 가지는 효소가 DnaN 클램프이고,
    DNA 폴리머라아제 III* 활성을 가지는 효소 또는 효소군이, DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, 및 HolE 중 어느 하나를 포함하는 효소 또는 효소군인, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    공정 (2)에 있어서의 등온 조건이, 25℃~50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도인, 방법.
  11. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    반응액이, RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    반응액이, 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 방법.
  13. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    반응액이, DNA의 안정화 인자를 더 포함하는, 방법.
  14. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    공정 (1)이
    (1－1) 이하：
    환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
    오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
    2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
    완충액；
    ATP；
    GTP, CTP 및 UTP；
    dNTP；
    마그네슘 이온원； 및
    알칼리 금속 이온원；
    을 포함하는 반응액을 프리인큐베이션하는 공정；
    (1－2) 해당 반응액과 주형이 되는 환상 DNA와의 반응 혼합물을 형성하는 공정； 및
    을 포함하는, 방법.
  15. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    공정 (2)을, 유중수적형(油中水滴型) 에멀젼 내에서 실시하는, 방법.
  16. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    공정 (2)에 이어서
    (3) 반응 후(後)처리를 실시하는 공정；을 더 포함하고, 여기서, 해당 반응 후처리는,
    (i) 제1부터 제3의 효소군을 포함하지 않는 반응액으로 5배 이상으로 희석한 후, 재보온하는 처리；
    (ii) 직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제에 의한 처리； 및/또는
    (iii) 갭 리페어(gap repair) 효소에 의한 처리；인,
    방법.
  17. 환상 DNA의 증폭용 조성물로서,
    환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
    오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
    2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
    완충액；
    ATP；
    GTP, CTP 및 UTP；
    dNTP；
    마그네슘 이온원； 및
    알칼리 금속 이온원；
    을 포함하는, 상기 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서,
    단백질의 비특이 흡착 억제제, 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제를 더 포함하는, 조성물.
  19. 청구항 17에 있어서,
    직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 RecG형 헬리카아제를 더 포함하는, 조성물.
  20. 청구항 17에 있어서,
    RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 조성물.
  21. 청구항 17에 있어서,
    직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 조성물.
  22. 청구항 17에 있어서,
    DNA의 안정화 인자를 더 포함하는, 조성물.
  23. 환상 DNA의 증폭용 키트(kit)로서,
    환상 DNA의 복제를 촉매하는 제1의 효소군；
    오카자키 프래그먼트 연결 반응을 촉매하여, 카테난을 형성하는 2개의 자매 환상 DNA를 합성하는 제2의 효소군；
    2개의 자매 환상 DNA의 분리 반응을 촉매하는 제3의 효소군；
    완충액；
    ATP；
    GTP, CTP 및 UTP；
    dNTP；
    마그네슘 이온원； 및
    알칼리 금속 이온원；
    의 조합을 포함하는, 상기 키트.
  24. 청구항 23에 있어서,
    단백질의 비특이 흡착 억제제, 및/또는 핵산의 비특이 흡착 억제제와의 조합을 더 포함하는, 키트.
  25. 청구항 23에 있어서,
    직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 RecG형 헬리카아제와의 조합을 더 포함하는, 키트.
  26. 청구항 23에 있어서,
    RecG형 헬리카아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 키트.
  27. 청구항 23에 있어서,
    직쇄상 DNA 특이적 엑소뉴클레아제 및/또는 단일 가닥 DNA 특이적 엑소뉴클레아제를 더 포함하는, 키트.
  28. 청구항 23에 있어서,
    DNA의 안정화 인자를 더 포함하는, 키트.
  29. 청구항 23에 있어서,
    갭 리페어 효소를 더 포함하는, 키트.
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