JP6701450B2 - Ｄｎａの産生方法及びｄｎａ断片連結用キット - Google Patents

Description

本発明は、２種類以上のＤＮＡ断片を塩基配列が相同である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得る方法、及び当該方法に用いるＤＮＡ断片連結用キットに関する。
本願は、２０１７年７月５日に日本に出願された特願２０１７−１３２０８４号及び２０１７年１２月１日に日本に出願された特願２０１７−２３１７３２に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

複数の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を連結して、直鎖状又は環状の２本鎖ＤＮＡを産生する方法がある。当該方法により、化学合成では合成が困難なより長鎖の２本鎖ＤＮＡを得ることができる。直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を連結する方法としては、主に、Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ法（特許文献１参照。）とＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（特許文献２及び特許文献３参照。）がある。

Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ法は、各２本鎖ＤＮＡ断片の末端１５塩基の相同配列を認識して融合させる機能を備えるＩｎ ｆｕｓｉｏｎ酵素を用いて連結反応を行う方法である。具体的には、まず、ＰＣＲを利用して、連結させる目的の２本鎖ＤＮＡ断片の末端に同一の塩基配列からなる相同領域を付加する。両末端に１５塩基の相同領域を付加した２個の２本鎖ＤＮＡ断片同士をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ酵素と混合してインキュベートすることにより連結させる。

一方で、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法では、まず、第１のＤＮＡ分子の遠位領域と第２のＤＮＡ分子の近位領域をエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で消化して、それぞれの相同領域（相互に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの配列同一性の領域）を１本鎖状態とする。次いで、両者を特異的にアニーリングさせて連結させた後、ギャップやニックを修復することにより、完全な２本鎖ＤＮＡの連結体を得る。例えば、特許文献２には、１．６ｋｂｐと１．４ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼ活性を備えるＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで消化して１本鎖状態とした後、ＲｅｃＡ存在下で連結させた後、ｄＮＴＰとＤＮＡリガーゼを添加してこのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性でギャップを埋めてニックを修復し、３ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡを得たことが記載されている。

その他、ＲｅｃＡを利用して直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を複数連結させる方法として、特許文献４には、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素又は組換え活性をもつ蛋白質の存在下において、複数の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼとインキュベートすることにより、複数の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片が直列に連結した直鎖状２本鎖ＤＮＡを作製する方法が開示されている。当該方法では、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素等を用いることにより、当該直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片内の両末端の結合が抑制され、かつ、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片間の末端同士の結合が促進される。

米国特許第７，５７５，８６０号明細書 米国特許第７，７７６，５３２号明細書 米国特許第８，９６８，９９９号明細書 特開２０１６−０７７１８０号公報

Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ法やＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法では、２個の直鎖状ＤＮＡ断片を連結させることは問題なくできるが、連結させる断片数が多くなるほど、連結効率が低下し、目的の連結体が得られないという問題がある。

本発明は、２種類以上のＤＮＡ断片を塩基配列が相同である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得る方法、及び当該方法に用いるＤＮＡ断片連結用キットを提供することを主たる目的とする。

本発明者らは、鋭意研究した結果、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素とエキソヌクレアーゼを用いることにより、２種類以上のＤＮＡを効率よく連結させられることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係るＤＮＡの産生方法及びＤＮＡ断片連結用キットは、下記［１］〜［２５］である。
［１］ ２種類以上のＤＮＡ断片と、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、を含む反応溶液を調製し、
前記反応溶液中で、前記２種類以上のＤＮＡ断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得る、ＤＮＡの産生方法。
［２］ 前記反応溶液が、さらに、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含む、前記［１］のＤＮＡの産生方法。
［３］ 前記反応溶液が、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、前記［１］又は［２］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［４］ 前記再生酵素がクレアチンキナーゼであり、前記基質がクレアチンリン酸である、前記再生酵素がピルビン酸キナーゼであり、前記基質がホスホエノールピルビン酸である、前記再生酵素がアセテートキナーゼであり、前記基質がアセチルリン酸である、前記再生酵素がポリリン酸キナーゼであり、前記基質がポリリン酸である、又は前記再生酵素がヌクレオシドジフォスフェートキナーゼであり、前記基質がヌクレオシド三リン酸である、前記［３］のＤＮＡの産生方法。
［５］ 前記２種類以上のＤＮＡ断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液は、マグネシウムイオン源濃度が０．５〜１５ｍＭであり、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の濃度が１〜１０００μＭである、前記［１］〜［４］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［６］ 前記２種類以上のＤＮＡ断片を連結させる反応を、２５〜４８℃の温度範囲内で行う、前記［１］〜［５］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［７］ ７個以上のＤＮＡ断片を連結させた直鎖状又は環状のＤＮＡを得る、前記［１］〜［６］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［８］ 前記反応溶液は、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される１種以上を含む、前記［１］〜［７］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［９］ 前記反応溶液は、ポリエチレングリコール、アルカリ金属イオン源、及びジチオスレイトールからなる群より選択される１種以上を含む、前記［１］〜［８］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１０］ 前記ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質がｕｖｓＸであり、前記反応溶液はさらにｕｖｓＹを含む、前記［１］〜［９］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１１］ 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、前記ＤＮＡ断片の末端又はその近傍に存在する、前記［１］〜［１０］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１２］ 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、１０ｂｐ以上５００ｂｐ以下の長さである、前記［１１］のＤＮＡの産生方法。
［１３］ 前記２種類以上のＤＮＡ断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液が、モル濃度が互いに等しい２種類以上のＤＮＡ断片を含有する、前記［１］〜［１２］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１４］ 連結により得られた直鎖状又は環状のＤＮＡ中のギャップ及びニックをギャップリペア酵素群により修復する、前記［１］〜［１３］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１５］ 連結により得られた直鎖状又は環状のＤＮＡを５０〜７０℃で熱処理し、続いて１０℃以下に急冷した後、ギャップリペア酵素群により修復する、前記［１４］のＤＮＡの産生方法。
［１６］ ギャップ及びニックが修復された直鎖状又は環状の２本鎖ＤＮＡを増幅させる、前記［１４］又は［１５］のＤＮＡの産生方法。
［１７］ 連結により得られたＤＮＡが直鎖状であり、当該直鎖状ＤＮＡを直接鋳型として用いてＰＣＲを行う、前記［１］〜［１３］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１８］ 連結により得られたＤＮＡが、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含む環状ＤＮＡであり、当該環状ＤＮＡと、環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群と、岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群と、２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群と、ｄＮＴＰと、を含む反応混合物を形成し、形成された反応混合物を等温条件下でインキュベートすることにより、前記環状ＤＮＡ中のギャップ及びニックの修復、並びに増幅を行う、前記［１］〜［１３］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［１９］ 連結により得られた環状ＤＮＡを、予め５０〜７０℃で熱処理し、続いて１０℃以下に急冷した後に、前記反応混合物を形成させる、前記［１８］のＤＮＡの産生方法。
［２０］ 連結により得られた直鎖状又は環状の環状ＤＮＡを微生物に導入し、当該微生物内で、前記環状ＤＮＡ中のギャップ及びニックが修復された２本鎖ＤＮＡを増幅させる、前記［１］〜［１３］のいずれかのＤＮＡの産生方法。
［２１］ ２種類以上のＤＮＡ断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得るためのキットであって、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、を含むＤＮＡ断片連結用キット。
［２２］さらに、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含む、前記［２１］のＤＮＡ断片連結用キット。
［２３］ さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、前記［２１］又は［２２］のいずれかのＤＮＡ断片連結用キット。
［２４］ さらに、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される１種以上を含む、前記［２１］〜［２３］のいずれかのＤＮＡ断片連結用キット。
［２５］ さらに、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ポリエチレングリコール、ジチオスレイトール、及び緩衝液からなる群より選択される１種以上を含む、前記［２１］〜［２４］のいずれかのＤＮＡ断片連結用キット。

本発明に係るＤＮＡの産生方法により、複数のＤＮＡ断片を効率よく連結して直鎖状又は環状のＤＮＡを得ることができる。
本発明に係るＤＮＡ断片連結用キットにより、より簡便に、前記ＤＮＡの産生方法を実施することができ、ＤＮＡ断片同士を、効率よく連結させることができる。

本発明に係るＤＮＡの産生方法の原理のうち、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士を連結する態様を模式的に示した図である。 実施例１において、７断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２において、５断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例３において、５断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例４において、７断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例５において、５断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例５において、７断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例６において、７断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例７において、７断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例８において、２０〜４９断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例９において、２５断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例１０において、２１断片又は２６断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ａ）と、その後さらにＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ｂ）である。 実施例１１において、２６断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ａ）と、その後さらにＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ｂ）である。 実施例１２において、２６断片又は３６断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ａ）と、その後さらにＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ｂ）である。 実施例１３において、本発明に係る連結法（ＲＡ）とＮＥＢ法により２６断片の連結反応を行った反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ａ）と、その後さらにＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ｂ）である。 実施例１４において、大腸菌ゲノムＤＮＡのＸｂａ I消化物をｏｒｉＣを含む連結用断片と連結して環化した後にＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例１５において、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）とクレアチンリン酸（ＣＰ）からなるＡＴＰ再生系を含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例１６において、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸からなるＡＴＰ再生系を含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例１７において、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）とホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からなるＡＴＰ再生系を含む反応溶液中での３６断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例１８において、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）とポリリン酸（ＰＰ）からなるＡＴＰ再生系を含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例１９において、エキソヌクレアーゼIIIとエキソヌクレアーゼIの両方を含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２０において、３６断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ａ）と、その後さらにＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ｂ）である。 実施例２１において、５０断片又は３６断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ａ）と、その後さらにＲＣＲ増幅した反応混合物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像（ｂ）である。 実施例２１において、５０断片の連結反応後さらにＲＣＲ反応した反応溶液中のＤＮＡを大腸菌に導入し、得られた形質転換体から抽出されたＤＮＡをアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２１において、得られた形質転換体から抽出されたＤＮＡをＲＣＲ増幅して得られた増幅産物の酵素消化物をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２２において、２断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２３において、エキソヌクレアーゼIIIとエキソヌクレアーゼIとエキソヌクレアーゼTを含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２４において、バクテリオフォージＲｅｃＡホモログであるＵｖｓＸを含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２５において、ＵｖｓＸとＵｖｓＹを含む反応溶液中での１０断片の連結反応後の反応溶液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。

＜ＤＮＡの産生方法＞
本発明に係るＤＮＡの産生方法は、互いに塩基配列が相同である領域（以下、単に「相同領域」ということがある。）又は互いに塩基配列が相補である領域（以下、単に「相補領域」ということがある。）を有するＤＮＡ断片同士を、相同領域同士又は相補領域同士において互いに連結させることによって、直鎖状又は環状のＤＮＡを産生する方法である。本発明に係るＤＮＡの産生方法は、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質の存在下で連結反応を行うため、非常に連結効率に優れている。

本発明及び本願明細書において、「塩基配列が相同である」とは「塩基配列が同一である」を意味し、「塩基配列が相補である」とは「塩基配列が互いに相補的である」を意味する。

具体的には、本発明に係るＤＮＡの産生方法は、２種類以上のＤＮＡ断片と、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質（以下、「ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質」ということがある。）と、を含む反応溶液を調製し、前記反応溶液中で、前記２種類以上のＤＮＡ断片を、塩基配列が相同である領域同士又は相補において互いに連結させる。当該方法により、直鎖状又は環状のＤＮＡが得られる。以降において、２個以上のＤＮＡ断片が連結された直鎖状又は環状のＤＮＡを、「連結体」ということがある。

本発明に係るＤＮＡの産生方法においては、連結させるＤＮＡ断片は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であってもよく、１本鎖ＤＮＡ断片であってもよい。すなわち、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士を連結してもよく、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と１本鎖ＤＮＡ断片を連結してもよく、１本鎖ＤＮＡ断片同士を連結してもよい。１種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と１種類以上の１本鎖ＤＮＡ断片を連結することもできる。直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士又は直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と１本鎖ＤＮＡ断片を連結させる場合、両者は相同領域において互いに連結される。１本鎖ＤＮＡ断片同士を連結させる場合、両者は相補領域において互いに連結される。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において連結させるＤＮＡ断片の少なくとも１種類が直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片である場合には、前記反応溶液は、さらに、エキソヌクレアーゼを含む。

図１に本発明に係るＤＮＡの産生方法の原理のうち、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士を連結する態様を模式的に示す。まず、相同領域Ｈを備える直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ａと直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ｂに対して、３’→５’エキソヌクレアーゼ２が作用し、相同領域Ｈを１本鎖にする。この１本鎖となった相同領域Ｈに、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質３が作用し、互いに相補的な相同領域Ｈ同士が結合することによって、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ａと直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ｂは連結する。図１の右図に示すように、３’→５’エキソヌクレアーゼ２によるＤＮＡ鎖の削り込みは、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ａと直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ｂのいずれか一方のみに行われてもよい。例えば、１本鎖状態となった直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ａの相同領域Ｈが、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質３の存在下、２本鎖状態の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片１ｂの相同領域Ｈに作用し、両者が連結する。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士又は直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と１本鎖ＤＮＡ断片を連結させる場合、まず、２本鎖ＤＮＡ断片をエキソヌクレアーゼにより削って相同領域を１本鎖化し、さらに、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質の存在下で連結反応を行う。このため、本発明に係るＤＮＡの産生方法は、非常に連結効率に優れており、従来は困難であった多数の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、一度の反応で連結することができる。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、１本鎖ＤＮＡ断片同士を連結させる場合には、それぞれの１本鎖ＤＮＡ断片上でＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質が速やかにフィラメントを形成することによって、エキソヌクレアーゼによる消化が抑制される。その後、このＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質の作用によって互いに相補的な相同領域Ｈ同士が結合することによって、１本鎖ＤＮＡ断片同士は連結する。

本発明に係るＤＮＡの産生方法で連結させるＤＮＡ断片の数としては、５個（５断片）以上が好ましく、７個（７断片）以上がより好ましく、１０個（１０断片）以上がさらに好ましく、２０個（２０断片）以上であってもよい。本発明に係るＤＮＡの産生方法で連結させるＤＮＡ断片の数の上限は特にないが、例えば、１００断片以下の数を連結させることができる。本発明に係るＤＮＡの産生方法では、反応条件等を最適化することにより、例えば、５０断片程度の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を連結させることもできる。本発明に係るＤＮＡの産生方法において連結させるＤＮＡ断片は、全て別種のＤＮＡ断片同士を連結させることができ、同種のＤＮＡ断片を２断片以上含むように連結させることもできる。

本発明において連結させる２種類以上のＤＮＡ断片は、それぞれ、他のＤＮＡ断片のうちの少なくとも１種類と連結するための相同領域又は相補領域を含む。本発明に係るＤＮＡの産生方法において、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士又は直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と１本鎖ＤＮＡ断片を連結させる場合、まず、エキソヌクレアーゼによって直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片のうちの１本鎖を削って相同領域を１本鎖状態とする。このため、相同領域は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の末端に存在していることが好ましいが、末端の近傍であってもよい。例えば、相同領域の端部のうち直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の末端側の塩基が、当該末端から３００塩基以内にあることが好ましく、１００塩基以内にあることがより好ましく、３０塩基以内にあることがさらに好ましく、１０塩基以内にあることがよりさらに好ましい。一方で、１本鎖ＤＮＡ断片同士を連結させる場合には、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質のフィラメントによってエキソヌクレアーゼによる消化が抑制されているため、相補領域は１本鎖ＤＮＡ断片のいずれに存在していてもよい。

相同領域又は相補領域の塩基配列は、連結させる全てのＤＮＡ断片において同一の塩基配列とすることもできるが、所望の順番に連結させるために、連結させるＤＮＡ断片の種類ごとにそれぞれ異なる塩基配列とすることが好ましい。例えば、２本鎖ＤＮＡ断片Ａと２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと２本鎖ＤＮＡ断片Ｃをこの順に連結させるためには、２本鎖ＤＮＡ断片Ａの下流末端と２本鎖ＤＮＡ断片Ｂの上流末端に相同領域ａを設け、２本鎖ＤＮＡ断片Ｂの下流末端と２本鎖ＤＮＡ断片Ｃの上流末端に相同領域ｂを設けておく。これにより、２本鎖ＤＮＡ断片Ａと２本鎖ＤＮＡ断片Ｂが相同領域ａで連結し、２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと２本鎖ＤＮＡ断片Ｃが相同領域ｂで連結して、２本鎖ＤＮＡ断片Ａと２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと２本鎖ＤＮＡ断片Ｃがこの順番に連結した直鎖状のＤＮＡを得ることができる。この場合に、さらに、２本鎖ＤＮＡ断片Ｃの下流末端と２本鎖ＤＮＡ断片Ａの上流末端に相同領域ｃを設けておくことにより、２本鎖ＤＮＡ断片Ａと２本鎖ＤＮＡ断片Ｂが相同領域ａで連結し、２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと２本鎖ＤＮＡ断片Ｃが相同領域ｂで連結し、２本鎖ＤＮＡ断片Ｃと２本鎖ＤＮＡ断片Ａが相同領域ｃで連結して、２本鎖ＤＮＡ断片Ａと２本鎖ＤＮＡ断片Ｂと２本鎖ＤＮＡ断片Ｃがこの順番に連結した環状のＤＮＡを得ることができる。

相同領域及び相補領域は、連結反応の反応溶液中で、１本鎖同士が特異的にハイブリダイズ可能な程度の塩基配列であればよく、塩基対（ｂｐ）長、ＧＣ率などは、一般的にプローブやプライマーの設計方法を参考に適宜決定することができる。一般的に、非特異的なハイブリダイズを抑制して目的の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片同士を正確に連結するためには、相同領域の塩基対長はある程度の長さが必要であるが、相同領域の塩基対長が長すぎると、連結効率が低下するおそれがある。本発明においては、相同領域又は相補領域の塩基対長としては、１０塩基対（ｂｐ）以上が好ましく、１５ｂｐ以上がより好ましく、２０ｂｐ以上がさらに好ましい。また、当該相同領域又は相補領域の塩基対長としては、５００ｂｐ以下が好ましく、３００ｂｐ以下がより好ましく、２００ｂｐ以下がさらに好ましい。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、互いに連結させるＤＮＡ断片の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の場合には、５０ｂｐ以上が好ましく、１００ｂｐ以上がより好ましく、２００ｂｐ以上がさらに好ましい。１本鎖ＤＮＡ断片の場合には、５０塩基長（ｂａｓｅ）以上が好ましく、１００塩基長以上がより好ましく、２００塩基長以上がさらに好ましい。本発明に係るＤＮＡの産生方法では、３２５ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡ断片も連結させることができる。また、連結させるＤＮＡ断片の長さは、種類ごとに異なっていてもよい。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、互いに連結させる直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、相同領域の全領域又はその一部の領域が、２本の１本鎖ＤＮＡがハイブリダイズしている２本鎖構造であればよい。すなわち、当該直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ギャップやニックのない完全な直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であってもよく、１又は複数の箇所が１本鎖構造である直鎖状ＤＮＡ断片であってもよい。例えば、連結させる直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、平滑末端であってもよく、粘着末端であってもよい。本発明に係るＤＮＡの産生方法により、平滑末端の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と、粘着末端の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を連結させることもできる。

反応溶液内に含ませる各ＤＮＡ断片のモル比は、目的の連結体を構成する各ＤＮＡ断片の分子数の比に揃えることが好ましい。連結反応開始時点における反応系内のＤＮＡ断片の分子数を揃えておくことにより、連結反応をより効率よく行うことができる。例えば、全て別種のＤＮＡ断片同士を連結させる場合には、反応溶液に含ませる各ＤＮＡ断片は、モル濃度が互いに等しいことが好ましい。

反応溶液内に含ませるＤＮＡ断片の総量は特に限定されるものではない。充分量の連結体が得られやすいことから、連結反応の開始時点における反応溶液内に含ませるＤＮＡ断片の総濃度は、０．０１ｎＭ以上が好ましく、０．１ｎＭ以上がより好ましく、０．３ｎＭ以上がさらに好ましい。より連結効率が高く、多断片の連結に適していることから、連結反応の開始時点における反応溶液内に含ませるＤＮＡ断片の総濃度は、１００ｎＭ以下が好ましく、５０ｎＭ以下がより好ましく、２５ｎＭ以下がさらに好ましく、２０ｎＭ以下が特に好ましい。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、連結反応により得られる連結体の大きさとしては、特に限定されるものではない。得られる連結体の大きさとしては、例えば、１０００塩基長以上が好ましく、５０００塩基長以上がより好ましく、１００００塩基長以上がさらに好ましく、２００００塩基長以上がよりさらに好ましい。本発明に係るＤＮＡの産生方法により、３０００００塩基長以上、好ましくは５０００００塩基長以上、より好ましくは２００００００塩基長以上の長さの連結体を得ることもできる。

本発明において用いられるエキソヌクレアーゼは、直鎖状ＤＮＡの３’末端又は５’末端から逐次的に加水分解する酵素である。本発明において用いられるエキソヌクレアーゼとしては、直鎖状ＤＮＡの３’末端又は５’末端から逐次的に加水分解する酵素活性を有するものであれば、その種類や生物学的由来に特に制限はない。例えば、３’末端から逐次的に加水分解する酵素（３’→５’エキソヌクレアーゼ）としては、エキソヌクレアーゼIIIファミリー型のＡＰ（apurinic/apyrimidinic）エンドヌクレアーゼ等の直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、ＤｎａＱスーパーファミリータンパク質等の１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼが挙げられる。エキソヌクレアーゼIIIファミリー型のＡＰエンドヌクレアーゼとしては、例えば、エキソヌクレアーゼIII（大腸菌由来）、ＥｘｏＡ（エキソヌクレアーゼIIIの枯草菌ホモログ）、Ｍｔｈ２１２（エキソヌクレアーゼIIIの古細菌ホモログ）、ＡＰエンドヌクレアーゼ I（エキソヌクレアーゼIIIのヒトホモログ）が挙げられる。ＤｎａＱスーパーファミリータンパク質としては、例えば、エキソヌクレアーゼI （大腸菌由来）、エキソヌクレアーゼＴ（Exo T）（RNase Tとしても知られている）、エキソヌクレアーゼＸ、ＤＮＡポリメラーゼIII イプシロンサブユニット（DNA polymerase III epsilon subunit）、ＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼII、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ５、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼIII（ＲＮａｓｅ Ｄ）、オリゴリボヌクレアーゼ（ＯＲＮ）等が挙げられる。５’末端から逐次的に加水分解する酵素（５’→３’エキソヌクレアーゼ）としては、λエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼVIII、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、及びＲｅｃJエキソヌクレアーゼなどを用いることができる。

本発明において用いられるエキソヌクレアーゼとしては、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の削り込みのプロセッシビティーとＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質存在下での連結効率のバランスが良好である点から、３’→５’エキソヌクレアーゼが好ましい。なかでも、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼがより好ましく、エキソヌクレアーゼIIIファミリー型のＡＰエンドヌクレアーゼがさらに好ましく、エキソヌクレアーゼIIIが特に好ましい。

本発明において反応溶液内に含ませるエキソヌクレアーゼとしては、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの両方であることが好ましい。直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼに１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを組み合わせることにより、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを単独で用いた場合よりもさらに連結効率を改善させることができる。両３’→５’エキソヌクレアーゼを併用することにより連結効率が改善される理由は明らかではない。直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼは３’突出末端を標的とし難い場合が多く、この３’突出末端が１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼにより消化される結果、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとＲｅｃＡによる連結反応が促進されるためと推察される。また、連結させる直鎖状ＤＮＡ断片が、平滑末端や５’突出末端の場合でも、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの併用により連結効率が改善される。これは、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとＲｅｃＡにより形成された連結体中に副次的に形成される３’突端が１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼにより消化される結果、連結効率がより改善されると推察される。本発明において反応溶液内に含ませるエキソヌクレアーゼとしては、特に連結効率に優れることから、エキソヌクレアーゼIIIファミリー型のＡＰエンドヌクレアーゼと１種又は２種以上の１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとの組み合わせであることが好ましく、エキソヌクレアーゼIIIファミリー型のＡＰエンドヌクレアーゼと１種又は２種以上のＤｎａＱスーパーファミリータンパク質との組み合わせであることがより好ましく、エキソヌクレアーゼIIIとエキソヌクレアーゼIとの組み合わせ、又はエキソヌクレアーゼIIIとエキソヌクレアーゼIとエキソヌクレアーゼＴの組み合わせが特に好ましい。

本発明において連結反応を行う反応溶液中におけるエキソヌクレアーゼの濃度としては、連結反応の開始時点において、例えば、１〜１０００ｍＵ／μＬが好ましく、５〜１０００ｍＵ／μＬがより好ましく、５〜５００ｍＵ／μＬがさらに好ましく、１０〜１５０ｍＵ／μＬがよりさらに好ましい。特に、エキソヌクレアーゼが直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの場合には、連結反応の開始時点における反応溶液中の直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの濃度は、例えば、５〜５００ｍＵ／μＬが好ましく、５〜２５０ｍＵ／μＬがより好ましく、５〜１５０ｍＵ／μＬがさらに好ましく、１０〜１５０ｍＵ／μＬがよりさらに好ましい。また、エキソヌクレアーゼが１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの場合には、連結反応の開始時点における反応溶液中の直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの濃度は、１〜１００００ｍＵ／μＬが好ましく、１００〜５０００ｍＵ／μＬがより好ましく、２００〜２０００ｍＵ／μＬがさらに好ましい。直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを併用する場合、連結反応の開始時点における反応溶液中の各エキソヌクレアーゼの濃度は、それぞれ、前記の各エキソヌクレアーゼの好ましい濃度とすることができる。

本発明及び本願明細書において、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質とは、１本鎖状態又は２本鎖状態のＤＮＡ上で重合してフィラメントを形成し、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）等のヌクレオシド三リン酸に対する加水分解活性を有し、相同領域をサーチして相同組換えを行う機能（ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性）をもつ蛋白質を意味する。ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質としては、原核生物ＲｅｃＡホモログ、バクテリオフォージＲｅｃＡホモログ、古細菌ＲｅｃＡホモログ、真核生物ＲｅｃＡホモログ等が挙げられる。原核生物ＲｅｃＡホモログとしては、大腸菌ＲｅｃＡ；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ等のＴｈｅｒｍｕｓ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌等の高度好熱菌に由来するＲｅｃＡ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ等の放射線耐性菌に由来するＲｅｃＡ等が挙げられる。バクテリオフォージＲｅｃＡホモログとしてはＴ４ファージＵｖｓＸ等が挙げられ、古細菌ＲｅｃＡホモログとしてはＲａｄＡ等が挙げられ、真核生物ＲｅｃＡホモログとしてはＲａｄ５１及びそのパラログ、Ｄｃｍ１等が挙げられる。これらのＲｅｃＡホモログのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等のデータベースから入手できる。

本発明において用いられるＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質としては、野生型蛋白質であってもよく、野生型蛋白質に、１〜３０個のアミノ酸を欠失、付加又は置換する変異を導入した、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性を保持する改変体であってもよい。当該改変体としては、野生型蛋白質中の相同領域をサーチする機能を亢進させるアミノ酸置換変異を導入した改変体、野生型蛋白質のＮ末端又はＣ末端に各種タグが付加された改変体、耐熱性を向上させた改変体（国際公開第２０１６／０１３５９２号）等が挙げられる。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換え蛋白質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。野生型のＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質とは、自然界より分離された生物に保持されているＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなる蛋白質を意味する。

本発明において用いられるＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質としては、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性を保持する改変体が好ましい。当該改変体としては、例えば、大腸菌ＲｅｃＡの２０３番目のアミノ酸残基フェニルアラニンをトリプトファンに置換したＦ２０３Ｗ変異体や、各種ＲｅｃＡホモログのうち、大腸菌ＲｅｃＡの２０３番目のフェニルアラニンに相当するフェニルアラニンをトリプトファンに置換した変異体が挙げられる。

本発明において連結反応を行う反応溶液中におけるＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質の量は、特に限定されるものではない。本発明において連結反応を行う反応溶液中におけるＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質の濃度としては、連結反応の開始時点において、例えば、０．０１〜１００μＭが好ましく、０．１〜１００μＭがより好ましく、０．１〜５０μＭがさらに好ましく、０．５〜１０μＭがよりさらに好ましく、１．０〜５．０μＭが特に好ましい。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質がＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性を発揮するためには、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸が必要である。このため、本発明において連結反応を行う反応溶液は、ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオチド三リン酸の少なくとも一方を含む。本発明において連結反応の反応溶液に含有させるヌクレオシド三リン酸としては、ＡＴＰ、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）、ｍ^５ＵＴＰ（５−メチルウリジン三リン酸）からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましく、ＡＴＰを用いることが特に好ましい。本発明において連結反応の反応溶液に含有させるデオキシヌクレオチド三リン酸としては、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、及びｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましく、ｄＡＴＰを用いることが特に好ましい。反応溶液に含まれるヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオチド三リン酸の総量は、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質がＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性を発揮するために充分な量であれば特に限定されるものではない。本発明において連結反応を行う反応溶液中におけるヌクレオシド三リン酸濃度又はデオキシヌクレオチド三リン酸濃度としては、連結反応の開始時点において、例えば、１μＭ以上が好ましく、１０μＭ以上がより好ましく、３０μＭ以上がさらに好ましい。一方で、反応溶液のヌクレオシド三リン酸濃度が高すぎる場合には、多断片の連結効率はかえって低下するおそれがある。このため、連結反応の開始時点における反応溶液のヌクレオシド三リン酸濃度又はデオキシヌクレオチド三リン酸濃度としては、１０００μＭ以下が好ましく、５００μＭ以下がより好ましく、３００μＭ以下がさらに好ましい。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質がＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性を発揮するため、及びエキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼ活性を発揮するためには、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）が必要である。このため、本発明において連結反応を行う反応溶液は、マグネシウムイオン源を含む。マグネシウムイオン源は、反応溶液中にマグネシウムイオンを与える物質である。例えば、酢酸マグネシウム［Ｍｇ（ＯＡｃ）_２］、塩化マグネシウム［ＭｇＣｌ_２］、硫酸マグネシウム［ＭｇＳＯ_４］等のマグネシウム塩が挙げられる。好ましいマグネシウムイオン源は、酢酸マグネシウムである。

本発明において連結反応を行う反応溶液のマグネシウムイオン源濃度は、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質がＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性を発揮でき、かつエキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼ活性を発揮できる濃度であればよく、特に限定されるものではない。連結反応の開始時点における反応溶液のマグネシウムイオン源濃度としては、例えば、０．５ｍＭ以上が好ましく、１ｍＭ以上がより好ましい。一方で、反応溶液のマグネシウムイオン濃度が高すぎる場合には、エキソヌクレアーゼ活性が強くなりすぎ、多断片の連結効率はかえって低下するおそれがある。このため、連結反応の開始時点における反応溶液のマグネシウムイオン源濃度としては、例えば、２０ｍＭ以下が好ましく、１５ｍＭ以下がより好ましく、１２ｍＭ以下がさらに好ましく、１０ｍＭ以下がよりさらに好ましい。

本発明において連結反応を行う反応溶液は、例えば、緩衝液に、ＤＮＡ断片と、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と、エキソヌクレアーゼと、ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオチド三リン酸の少なくとも一方と、マグネシウムイオン源とを添加することにより調製される。当該緩衝液としては、ｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８、において用いるのに適した緩衝液であれば特に制限はない。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、リン酸緩衝液、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＨＣｌ等が挙げられる。好ましい緩衝液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ又はＴｒｉｓ−ＯＡｃである。緩衝液の濃度は、当業者が適宜選択することができ、特に限定されないが、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はＴｒｉｓ−ＯＡｃの場合、例えば、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭの濃度を選択できる。

本発明においてＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質としてＵｖｓＸを用いる場合には、連結反応を行う反応溶液には、さらに、Ｔ４ファージＵｖｓＹを含有させることが好ましい。ＵｖｓＹは、Ｔ４ファージにおける相同組換えのメディエーターである。Ｔ４ファージにおいては、まず、１本鎖ＤＮＡはまずｇｐ３２（１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質）と結合して１本鎖ＤＮＡ−ｇｐ３２複合体が形成される。次いで、当該複合体中のｇｐ３２がｕｖｓＸに置換されるようにして１本鎖ＤＮＡとｕｖｓＸが結合して相同組換えが行われる。ＵｖｓＹは、１本鎖ＤＮＡ−ｇｐ３２の相互作用を不安定化させ、１本鎖ＤＮＡ−ｕｖｓＸの相互作用を安定化させることにより、１本鎖ＤＮＡとｕｖｓＸの結合を促進し、ひいては相同組換え反応を促進する（Bleuit et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, vol.98(15), p.8298-8305）。本発明においても、ＵｖｓＸにＵｖｓＹを併用することにより、連結効率がより促進される。

本発明において連結反応を行う反応溶液には、ＤＮＡ断片と、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と、エキソヌクレアーゼと、ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオチド三リン酸の少なくとも一方と、マグネシウムイオン源との他に、さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素とその基質を含むことが好ましい。反応溶液中でヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸を再生できることにより、多数のＤＮＡ断片をより効率よく連結させることができる。ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸を再生するための再生酵素とその基質との組み合わせとしては、クレアチンキナーゼとクレアチンホスフェートの組み合わせ、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸の組み合わせ、アセテートキナーゼとアセチルリン酸の組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸の組み合わせ、ヌクレオシドジフォスフェートキナーゼとヌクレオシド三リン酸の組み合わせ、が挙げられる。ヌクレオシドジフォスフェートキナーゼの基質（リン酸供給源）となるヌクレオシド三リン酸は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰのいずれであってもよい。その他にも、再生酵素としては、ミオキナーゼが挙げられる。

本発明において連結反応を行う反応溶液中のヌクレオシド三リン酸再生酵素及びその基質の濃度は、当該反応溶液中で連結反応時にヌクレオシド三リン酸の再生が可能になる充分な濃度であれば特に限定されるものではない。例えば、クレアチンキナーゼとクレアチンホスフェートを用いる場合、本発明において連結反応を行う反応溶液に含有させるクレアチンキナーゼの濃度を、好ましくは１〜１０００ｎｇ／μＬ、より好ましくは５〜１０００ｎｇ／μＬ、さらに好ましくは５〜５００ｎｇ／μＬ、よりさらに好ましくは５〜２５０ｎｇ／μＬとし、クレアチンホスフェートの濃度を、好ましくは０．４〜２０ｍＭ、より好ましくは０．４〜１０ｍＭ、さらに好ましくは１〜７ｍＭとすることができる。

多断片を目的の順番で連結させる場合、相同領域又は相補領域の塩基配列は、連結するＤＮＡ断片の組み合わせごとに異なることが好ましい。しかし、同一の温度条件下では、Ｇ（グアニン塩基）とＣ（シトシン塩基）の含有率が高い相同領域は、１本鎖で二次構造を形成しやすい。一方でＡ（アデニン塩基）とＴ（チミン塩基）の含有率が高い相同領域ではハイブリダイゼーションの効率が低くなる。これらの傾向により、連結効率も低くなってしまうおそれがある。１本鎖ＤＮＡの二次構造形成を抑えて特異的ハイブリダイズを促すことにより、ＤＮＡ断片の連結を促進することができる。

そこで、本発明において連結反応を行う反応溶液には、１本鎖ＤＮＡの二次構造形成を抑えて特異的ハイブリダイズを促す物質を添加することが好ましい。当該物質としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）が挙げられる。ＤＭＳＯは、ＧＣに富んだ塩基対の二次構造形成を抑える作用がある。ＴＭＡＣは、特異的ハイブリダイズを促す作用がある。本発明において、連結反応を行う反応溶液に１本鎖ＤＮＡの二次構造形成を抑えて特異的ハイブリダイズを促す物質を含有させる場合、当該物質の濃度は、当該物質によるＤＮＡ断片の連結促進効果が得られる濃度であれば特に限定されるものではない。例えば、当該物質としてＤＭＳＯを用いる場合、本発明において連結反応を行う反応溶液に含有させるＤＭＳＯの濃度としては、５〜３０容量％が好ましく、８〜２５容量％がより好ましく、８〜２０容量％がさらに好ましい。当該物質としてＴＭＡＣを用いる場合、本発明において連結反応を行う反応溶液に含有させるＴＭＡＣの濃度としては、６０〜３００ｍＭが好ましく、１００〜２５０ｍＭがより好ましく、１００〜２００ｍＭがさらに好ましい。

本発明において連結反応を行う反応溶液には、さらに、高分子混み合い効果を有する物質を添加することが好ましい。高分子混み合い効果はＤＮＡ分子同士の相互作用を増強し、ＤＮＡ断片の連結を促進することができる。当該物質としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００〜２００００、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）２００〜２００００、デキストラン４０〜７０、フィコール７０、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。本発明において、連結反応を行う反応溶液に高分子混み合い効果を有する物質を含有させる場合、当該物質の濃度は、当該物質によるＤＮＡ断片の連結促進効果が得られる濃度であれば特に限定されるものではない。例えば、当該物質としてＰＥＧ８０００を用いる場合、本発明において連結反応を行う反応溶液に含有させるＰＥＧ８０００の濃度としては、２〜２０質量％が好ましく、２〜１０質量％がより好ましく、４〜６質量％がさらに好ましい。

本発明において連結反応を行う反応溶液には、さらに、アルカリ金属イオン源を含有させてもよい。アルカリ金属イオン源は、反応溶液中にアルカリ金属イオンを与える物質である。本発明において連結反応を行う反応溶液に含有させるアルカリ金属イオンとしては、ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）又はカリウムイオン（Ｋ^＋）が好ましい。アルカリ金属イオン源としては、例えば、グルタミン酸カリウム［ＫＧｌｕ］、アスパラギン酸カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム［ＫＯＡｃ］、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び酢酸ナトリウムが挙げられる。本発明において連結反応を行う反応溶液に含有させるアルカリ金属イオン源としては、グルタミン酸カリウム又は酢酸カリウムが好ましく、特に多断片の連結効率が改善されることからグルタミン酸カリウムが好ましい。連結反応の開始時点における反応溶液のアルカリ金属イオン源濃度としては、特に限定されるものではなく、例えば、反応溶液中にアルカリ金属イオンを好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは３０〜３００ｍＭの範囲内、さらに好ましくは５０〜１５０ｍＭの範囲内で与える濃度に調整することができる。

本発明において連結反応を行う反応溶液には、さらに、還元剤を含有させてもよい。還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（２−メルカプトエタノール）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、及びグルタチオンが挙げられる。好ましい還元剤はＤＴＴである。還元剤は、反応溶液中に１．０〜１５．０ｍＭ、好ましくは２．０〜１０．０ｍＭ含まれていてもよい。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、連結反応は、緩衝液に、２種類以上のＤＮＡ断片と、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と、ヌクレオシド三リン酸と、マグネシウムイオン源と、必要に応じて、エキソヌクレアーゼと、ヌクレオシド三リン酸再生酵素及びその基質のセット、１本鎖ＤＮＡの二次構造形成を抑えて特異的ハイブリダイズを促す物質、高分子混み合い効果を有する物質、アルカリ金属イオン源、及び還元剤からなる群より選択される１種以上と、を含有させて調製した反応溶液を、当該反応溶液中のＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質及びエキソヌクレアーゼがそれぞれの酵素活性を発揮し得る温度の等温条件下で、所定時間インキュベートすることにより行う。連結反応の反応温度としては、２５〜４８℃の温度範囲内であることが好ましく、２７〜４５℃の温度範囲内であることがより好ましい。特に、相同領域又は相補領域の長さが５０塩基以上の場合には、連結反応の反応温度は、３０〜４５℃の温度範囲内であることが好ましく、３７〜４５℃の温度範囲内であることがより好ましく、４０〜４３℃の温度範囲内であることがさらに好ましい。一方で、相同領域又は相補領域の長さが５０塩基以下の場合には、連結反応の反応温度は、２７〜４３℃の温度範囲内であることが好ましく、２７〜３７の温度範囲内であることがより好ましく、２７〜３３の温度範囲内であることがさらに好ましい。本願明細書において、「等温条件下」とは、反応中に設定した温度に対して±３℃又は±１℃の温度範囲内に保つことを意味する。連結反応の反応時間は、特に限定されるものではなく、例えば、１５分間〜６時間、好ましくは１５分間〜２時間とすることができる。

連結反応により得られた連結体（直鎖状又は環状のＤＮＡ）には、図１に示すように、ギャップやニックが存在する。ギャップは、２本鎖ＤＮＡにおいて１個又は複数個の連続したヌクレオチドが欠けた状態であり、ニックは、２本鎖ＤＮＡにおいて隣り合ったヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合が切断された状態である。そこで、本発明に係るＤＮＡの産生方法においては、連結反応後、得られた連結体中のギャップ及びニックをギャップリペア酵素群とｄＮＴＰにより修復することが好ましい。ギャップ及びニックを修復することにより、連結体を、完全な２本鎖ＤＮＡとすることができる。

具体的には、連結反応後の反応溶液に、ギャップリペア酵素群とｄＮＴＰを添加し、ギャップリペア酵素群が酵素活性を発揮し得る温度の等温条件下で、所定時間インキュベートすることにより、連結体のギャップ及びニックを修復することができる。ギャップリペア酵素群を構成する酵素は、２本鎖ＤＮＡのギャップ及びニックを修復できる酵素群であれば、その種類や生物学的由来に特に制限はない。ギャップリペア酵素群としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素を組合せて使用できる。ＤＮＡリガーゼとして大腸菌由来のＤＮＡリガーゼを用いる場合、その補因子であるＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が反応液中に０．０１〜１．０ｍＭの範囲で含まれる。ギャップリペア酵素群による処理は、例えば、２５〜４０℃で、５〜１２０分間、好ましくは１０〜６０分間、行ってもよい。

ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰの総称である。修復反応の反応開始時点に反応溶液中に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば０．０１〜１ｍＭの範囲であってよく、好ましくは０．０５〜１ｍＭの範囲であってよい。

ギャップ及びニックが修復された連結体（直鎖状又は環状のＤＮＡ）は、さらに増幅することも好ましい。ギャップ及びニックが修復された連結体を増幅する方法としては、特に限定されるものではなく、一般的に直鎖状又は環状のＤＮＡを鋳型として増幅する方法で増幅することができる。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、連結反応後さらにギャップ及びニックの修復反応を行うことにより得られた連結体が直鎖状の場合、当該連結体は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することが好ましい。ＰＣＲは、常法により行うことができる。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、連結反応後さらにギャップ及びニックの修復反応を行うことにより得られた連結体が環状である場合は、当該連結体は、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）により増幅することが好ましい。ＲＣＡは、常法により行うことができる。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において、連結反応により得られた連結体が環状であり、かつＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を含む場合、当該連結体は、複製サイクル反応（ＲＣＲ）増幅法により増幅することが好ましい。連結反応により得られた連結体をそのまま直接、すなわち、ギャップ及びニックの修復反応を行わずに、鋳型としてＲＣＲ増幅を行うことにより、ギャップ及びニックのない完全な２本鎖ＤＮＡの環状の連結体を増幅産物として得ることができる。

複製開始配列としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌に存在する公知の複製開始配列を、ＮＣＢＩ等の公的なデータベースから入手することができる。また、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能なＤＮＡ断片をクローニングし、その塩基配列を解析することによって、複製開始配列を得ることもできる。

ＲＣＲ増幅法は、具体的には、鋳型とする連結反応により得られた環状の連結体と、環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群と、岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群と、２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群と、ｄＮＴＰと、を含む反応混合物を形成し、形成された反応混合物をインキュベートすることにより行うことができる。カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡとは、ＤＮＡ複製反応によって合成された２つの環状ＤＮＡがつながった状態にあるものをいう。

環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群としては、例えばKaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90に記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第一の酵素群として、以下：ＤｎａＡ活性を有する酵素、１種以上の核様体蛋白質、ＤＮＡジャイレース活性を有する酵素又は酵素群、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（single-strand binding protein（ＳＳＢ））、ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、及びＤＮＡポリメラーゼIII活性を有する酵素又は酵素群、からなる群より選択される酵素又は酵素群の１つ以上、又は当該酵素又は酵素群のすべての組み合わせ、を例示することができる。

ＤｎａＡ活性を有する酵素としては、大腸菌のイニシエーター蛋白質であるＤｎａＡと同様のイニシエーター活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤｎａＡを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＡは単量体として、反応混合物中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１〜５００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、５０〜１５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

核様体蛋白質は、核様体に含まれる蛋白質をいう。本発明に用いる１種以上の核様体蛋白質は、大腸菌の核様体蛋白質と同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＩＨＦ、すなわちＩｈｆＡ及び／又はＩｈｆＢの複合体（ヘテロ２量体又はホモ２量体）や、大腸菌由来のＨＵ、すなわちｈｕｐＡ及びｈｕｐＢの複合体を好適に用いることができる。大腸菌由来のＩＨＦはヘテロ／ホモ２量体として反応混合物中、５〜４００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５〜２００ｎＭ、５〜１００ｎＭ、５〜５０ｎＭ、１０〜５０ｎＭ、１０〜４０ｎＭ、１０〜３０ｎＭ、の範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。大腸菌由来のＨＵは反応混合物中、１〜５０ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５〜５０ｎＭ、５〜２５ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤＮＡジャイレース活性を有する酵素又は酵素群としては、大腸菌のＤＮＡジャイレースと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＧｙｒＡ及びＧｙｒＢからなる複合体を好適に用いることができる。大腸菌由来のＧｙｒＡ及びＧｙｒＢからなる複合体はヘテロ４量体として反応混合物中、２０〜５００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０〜４００ｎＭ、２０〜３００ｎＭ、２０〜２００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、１００〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＳＳＢとしては、大腸菌の１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質と同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＳＳＢを好適に用いることができる。大腸菌由来のＳＳＢはホモ４量体として、反応混合物中、２０〜１０００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０〜５００ｎＭ、２０〜３００ｎＭ、２０〜２００ｎＭ、５０〜５００ｎＭ、５０〜４００ｎＭ、５０〜３００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、５０〜１５０ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、１００〜４００ｎＭ、の範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＢと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤｎａＢを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＢはホモ６量体として反応混合物中、５〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５〜１００ｎＭ、５〜５０ｎＭ、５〜３０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＣと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤｎａＣを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＣはホモ６量体として反応混合物中、５〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５〜１００ｎＭ、５〜５０ｎＭ、５〜３０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＧと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤｎａＧを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＧは単量体として、反応混合物中、２０〜１０００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０〜８００ｎＭ、５０〜８００ｎＭ、１００〜８００ｎＭ、２００〜８００ｎＭ、２５０〜８００ｎＭ、２５０〜５００ｎＭ、３００〜５００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤＮＡクランプ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＮと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤｎａＮを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＮはホモ２量体として反応混合物中、１０〜１０００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１０〜８００ｎＭ、１０〜５００ｎＭ、２０〜５００ｎＭ、２０〜２００ｎＭ、３０〜２００ｎＭ、３０〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤＮＡポリメラーゼIII*活性を有する酵素又は酵素群としては、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼIII*複合体と同様の活性を有する酵素又は酵素群であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば大腸菌由来のＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、及びＨｏｌＥのいずれかを含む酵素群、好ましくは大腸菌由来のＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、及びＤｎａＥの複合体を含む酵素群、さらに好ましくは大腸菌由来のＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、及びＨｏｌＥの複合体を含む酵素群を好適に用いることができる。大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼIII*複合体はヘテロ多量体として反応混合物中、２〜５０ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２〜４０ｎＭ、２〜３０ｎＭ、２〜２０ｎＭ、５〜４０ｎＭ、５〜３０ｎＭ、５〜２０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群としては、例えばＤＮＡポリメラーゼI活性を有する酵素、ＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素、及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素からなる群より選択される１つ以上の酵素又は当該酵素の組み合わせを例示することができる。

ＤＮＡポリメラーゼI活性を有する酵素としては、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼIと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼIを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼIは単量体として反応混合物中、１０〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０〜２００ｎＭ、２０〜１５０ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、４０〜１５０ｎＭ、４０〜１００ｎＭ、４０〜８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤＮＡリガーゼと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＤＮＡリガーゼ又はＴ４ファージのＤＮＡリガーゼを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤＮＡリガーゼは単量体として反応混合物中、１０〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１５〜２００ｎＭ、２０〜２００ｎＭ、２０〜１５０ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、２０〜８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素としては、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解する活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＲＮａｓｅＨを好適に用いることができる。大腸菌由来のＲＮａｓｅＨは単量体として反応混合物中、０．２〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは０．２〜２００ｎＭ、０．２〜１００ｎＭ、０．２〜５０ｎＭ、１〜２００ｎＭ、１〜１００ｎＭ、１〜５０ｎＭ、１０〜５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群としては、例えばPeng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575に記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第三の酵素群として、以下：トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、及びＲｅｃＱ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、からなる群より選択される１つ以上の酵素又は当該酵素の組み合わせを例示することができる。

トポイソメラーゼIII活性を有する酵素としては、大腸菌のトポイソメラーゼIIIと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のトポイソメラーゼIIIを好適に用いることができる。大腸菌由来のトポイソメラーゼIIIは単量体として反応混合物中、２０〜５００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０〜４００ｎＭ、２０〜３００ｎＭ、２０〜２００ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、３０〜８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

ＲｅｃＱ型ヘリカーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＲｅｃＱと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、例えば大腸菌由来のＲｅｃＱを好適に用いることができる。大腸菌由来のＲｅｃＱは単量体として反応混合物中、２０〜５００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０〜４００ｎＭ、２０〜３００ｎＭ、２０〜２００ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、３０〜８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

トポイソメラーゼIV活性を有する酵素としては、大腸菌のトポイソメラーゼIVと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えばＰａｒＣとＰａｒＥの複合体である大腸菌由来のトポイソメラーゼIVを好適に用いることができる。大腸菌由来のトポイソメラーゼIVはヘテロ４量体として反応混合物中、０．１〜５０ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは０．１〜４０ｎＭ、０．１〜３０ｎＭ、０．１〜２０ｎＭ、１〜４０ｎＭ、１〜３０ｎＭ、１〜２０ｎＭ、１〜１０ｎＭ、１〜５ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。

前記の第一、第二及び第三の酵素群は、市販されているものを用いてもよいし、微生物等から抽出し、必要に応じて精製したものを用いてもよい。微生物からの酵素の抽出及び精製は、当業者に利用可能な手法を用いて適宜実施することができる。

前記第一、第二及び第三の酵素群として、上記に示す大腸菌由来の酵素以外を用いる場合は、上記大腸菌由来の酵素について特定された濃度範囲に対して、酵素活性単位として相当する濃度範囲で用いることができる。

ＲＣＲ増幅法において反応混合物に含有させるｄＮＴＰは、本発明に係るＤＮＡの産生方法で使用されるものとして挙げられたものと同様のものを用いることができる。

ＲＣＲ増幅法において調製される反応混合物には、必要に応じて、さらにマグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ＡＴＰを含有させる。

ＲＣＲ増幅法において、反応開始時点における反応混合物に含まれるＡＴＰの濃度は、例えば０．１〜３ｍＭの範囲であってよく、好ましくは０．１〜２ｍＭ、０．１〜１．５ｍＭ、０．５〜１．５ｍＭの範囲であってよい。

ＲＣＲ増幅法において反応混合物に含有させるマグネシウムイオン源は、本発明に係るＤＮＡの産生方法で使用されるものとして挙げられたものと同様のものを用いることができる。ＲＣＲ増幅法において、反応開始時点における反応混合物に含まれるマグネシウムイオン源の濃度は、例えば、マグネシウムイオンを５〜５０ｍＭの範囲で与える濃度であってよい。

ＲＣＲ増幅法において反応混合物に含有させるアルカリ金属イオン源は、本発明に係るＤＮＡの産生方法で使用されるものとして挙げられたものと同様のものを用いることができる。ＲＣＲ増幅法において、反応開始時点における反応混合物に含まれるアルカリ金属イオン源の濃度は、例えば、アルカリ金属イオンを１００ｍＭ以上、好ましくは１００〜３００ｍＭの範囲で与える濃度であってよいが、これに限定されない。

ＲＣＲ増幅法において反応混合物に含有させる連結体の量は特に制限はない。例えば、反応開始時点において、連結体を、１０ｎｇ／μＬ以下、５ｎｇ／μＬ以下、１ｎｇ／μＬ以下、０．８ｎｇ／μＬ以下、０．５ｎｇ／μＬ以下、０．３ｎｇ／μＬ以下の濃度で反応混合物中に存在させてもよい。

調製された反応混合物を、所定の温度の等温条件下でインキュベートすることにより、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含む環状ＤＮＡのみが増幅される。ＲＣＲ増幅における反応温度は、ＤＮＡ複製反応が進行することのできるものであれば特に制限はないが、たとえばＤＮＡポリメラーゼの至適温度である２０〜８０℃、２５〜５０℃、又は２５〜４０℃の範囲であることができる。ＲＣＲ増幅における反応時間は、目的とする環状連結体の増幅産物の量に応じて適宜設定することができるが、例えば３０分間〜２４時間とすることができる。

ＲＣＲ増幅は、調製された反応混合物を、３０℃以上でのインキュベーション及び２７℃以下でのインキュベーションを繰り返す温度サイクル下で、インキュベートすることによっても行うことができる。３０℃以上でのインキュベーションは、ｏｒｉＣを含む環状ＤＮＡの複製開始が可能な温度範囲であれば特に限定はなく、例えば、３０〜８０℃、３０〜５０℃、３０〜４０℃、３７℃であってよい。３０℃以上でのインキュベーションは、特に限定されないが、１サイクルあたり１０秒〜１０分間であってもよい。２７℃以下でのインキュベーションは、複製開始が抑制され、ＤＮＡの伸張反応が進行する温度であれば特に限定はなく、例えば、１０〜２７℃、１６〜２５℃、２４℃、であってよい。２７℃以下でのインキュベーションは、特に限定されないが、増幅する環状ＤＮＡの長さに合わせて設定することが好ましく、例えば１サイクルにつき、１０００塩基あたり１〜１０秒間であってもよい。温度サイクルのサイクル数は特に限定されないが、１０〜５０サイクル、２０〜４０サイクル、２５〜３５サイクル、３０サイクルであってもよい。

連結反応により得られた連結体は、ギャップ及びニックの修復反応や、ＲＣＲ増幅の鋳型として供される前に、５０〜７０℃でインキュベートする熱処理、及びその後急冷を行うことが好ましい。熱処理の処理時間は特に限定されるものではなく、例えば、１〜１５分間、好ましくは２〜１０分間とすることができる。急冷の温度は特に限定されるものではなく、例えば、１０℃以下、好ましくは４℃以下にまで冷却する。急冷時の冷却速度としては、５０℃／ｍｉｎ以上が好ましく、７０℃／ｍｉｎ以上がより好ましく、８５℃／ｍｉｎ以上がさらに好ましい。例えば、熱処理後の反応混合物が入った容器を、直接、氷上に静置する又は４℃以下に調節された金属ブロックに接触させることにより、急冷することができる。

連結反応の終了直後の反応溶液中には、非特異的な連結により得られた連結体が含まれている。当該反応溶液を熱処理・急冷することにより、非特異的な連結を解消することができる。このため、熱処理・急冷後の連結体を鋳型としてギャップ及びニックの修復反応やＲＣＲ増幅反応を行うことにより、非特異的な産物産生が抑制され、目的の連結体の完全な２本鎖ＤＮＡを効率よく得ることができる。

本発明に係るＤＮＡの産生方法において連結反応により得られた直鎖状又は環状の連結体の増幅は、連結体を微生物に導入することによって、当該微生物内で当該微生物がもつ酵素等を利用して行うことができる。微生物に導入する連結体は、ギャップ及びニックの修復反応を行う前の連結体であってもよく、修復反応後の連結体であってもよい。ギャップ及びニックをもつ連結体をそのまま微生物に導入した場合でも、ギャップ及びニックのない完全な２本鎖ＤＮＡの状態の連結体を増幅産物として得ることができる。連結体を導入する微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌、古細菌、酵母、糸状菌等が挙げられる。微生物への連結体の導入は、エレクトロポレーション法等の常法により行うことができる。増幅された連結体の微生物からの回収も常法により行うことができる。

＜ＤＮＡ断片連結用キット＞
本発明に係るＤＮＡ断片連結用キットは、２種類以上のＤＮＡ断片を塩基配列が相同である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得るためのキットであって、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質を含む。直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を連結するために用いられる場合には、当該キットはさらにエキソヌクレアーゼを含むことが好ましい。当該キットに備えられているＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質とエキソヌクレアーゼとを、連結する目的の２種類以上のＤＮＡ断片を含む溶液に添加する。これにより、本発明に係るＤＮＡの産生方法をより簡便に行うことができ、目的の連結体を容易に得ることができる。当該キットに含まれるＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質及びエキソヌクレアーゼは、本発明に係るＤＮＡの産生方法で使用されるものをそのまま用いることができる。当該キットに含まれるエキソヌクレアーゼとしては、３’→５’エキソヌクレアーゼが好ましく、少なくとも直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含むことがより好ましく、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼの両方を含むことがさらに好ましい。

本発明に係るＤＮＡ断片連結用キットは、さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素、及びその基質を含むことが好ましい。また、本発明に係るＤＮＡ断片連結用キットは、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ジメチルスルホキシド、塩化テトラメチルアンモニウム、ポリエチレングリコール、ジチオスレイトール、及び緩衝液からなる群より選択される１種以上を含むこともできる。これらは、いずれも、本発明に係るＤＮＡの産生方法で使用されるものをそのまま用いることができる。

本発明に係るＤＮＡ断片連結用キットは、さらに、当該キットを用いて本発明に係るＤＮＡの産生方法を行うためのプロトコールが記載された書面を含むことも好ましい。当該プロトコールは、当該キットを収容した容器の表面に記載されていてもよい。

次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

［実施例１］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のマグネシウムイオン源濃度とＡＴＰ濃度の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、５９１ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であるＤＣＷ１〜ＤＣＷ７（配列番号１〜配列番号７）を用いた。各直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の末端から６０塩基までの領域は相同領域である。すなわち、ＤＣＷ１の５３２番目から５９１番目までの６０塩基はＤＣＷ２との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ２の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。ＤＣＷ２の５３２番目から５９１番目までの６０塩基はＤＣＷ３との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ３の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。ＤＣＷ３の５３２番目から５９１番目までの６０塩基はＤＣＷ４との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ４の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。ＤＣＷ４の５３２番目から５９１番目までの６０塩基はＤＣＷ５との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ５の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。ＤＣＷ６の５３２番目から５９１番目までの６０塩基はＤＣＷ７との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ７の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型（配列番号６１）を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７、１μＭのＲｅｃＡ、４０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭ又は１０ｍＭの酢酸マグネシウム、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、又は１０００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で２時間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２に示す。図中、「５００ｂｐ」は、５００ｂｐから５ｋｂｐまでを５００ｂｐ間隔のバンド（合計１０本）からなるＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を含有する溶液１μＬを泳動したレーンを示す。また、図中、「７ｆｒａｇ」は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ７の７断片全てが連結された連結体のバンドを示す。

酢酸マグネシウムが１ｍＭの反応溶液では、ＡＴＰ濃度が３０μＭの反応溶液ではほとんど連結体が観察されなかったが、ＡＴＰ濃度が１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭの反応溶液では、２断片の連結体から７断片の連結体までの計６種の連結体のバンドが観察された。ＡＴＰ濃度が１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭの反応溶液の結果を比較すると、ＡＴＰ濃度が１００μＭの反応溶液が最も７断片全てが連結した連結体の量が多く、また未連結の断片のバンドが検出されなかった。これに対して、ＡＴＰ濃度が１０００μＭの反応溶液では、７断片の連結体のバンドは非常に薄く、未連結の断片も多く残存していた。一方で、酢酸マグネシウムが１０ｍＭの反応溶液では、ＡＴＰ濃度が３０μＭと１００μＭの反応溶液では、２断片の連結体から７断片の連結体までの計６種の連結体のバンドが観察された。一方でＡＴＰ濃度が３００μＭと１０００μＭの反応溶液では、２断片の連結体から４断片の連結体のバンドまでは確認できたものの、５断片以上の連結体のバンドは確認できず、未連結の断片も多く残存していた。全てのサンプルのうち、７断片連結体の産生量が最も多かったのは、酢酸マグネシウムが１ｍＭ、ＡＴＰが１００μＭの反応溶液であった。これらの結果から、多断片を連結するためには、反応溶液のマグネシウムイオン濃度とＡＴＰ濃度のバランスが重要であること、ＡＴＰ濃度が高すぎるとかえって連結反応が阻害される場合があること、がわかった。

［実施例２］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のＰＥＧ８０００濃度と、ＡＴＰ再生系の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、３１００ｂｐ又は２６５０ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であるＬｔｅｒ１〜Ｌｔｅｒ５（配列番号５４〜配列番号５８）を用いた。各直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の末端から６０塩基までの領域は相同領域である。すなわち、Ｌｔｅｒ１の３０４１番目から３１００番目までの６０塩基はＬｔｅｒ２との連結のための相同領域であり、Ｌｔｅｒ２の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。Ｌｔｅｒ２の３０４１番目から３１００番目までの６０塩基はＬｔｅｒ３との連結のための相同領域であり、Ｌｔｅｒ３の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。Ｌｔｅｒ３の３０４１番目から３１００番目までの６０塩基はＬｔｅｒ４との連結のための相同領域であり、Ｌｔｅｒ４の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。Ｌｔｅｒ４の３０４１番目から３１００番目までの６０塩基はＬｔｅｒ５との連結のための相同領域であり、Ｌｔｅｒ５の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。ＡＴＰ再生酵素としてクレアチンキナーゼを、その基質としてクレアチンリン酸を、それぞれ用いた。

具体的には、まず、各０．０３ｎＭのＬｔｅｒ１〜Ｌｔｅｒ５、１μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、４０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、１５０ｍＭの酢酸カリウム、０質量％、２質量％、５質量％、又は１０質量％のＰＥＧ８０００からなる反応溶液を調製した。これとは別に、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを含まない以外は同様にして反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、３０℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液４μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図３に示す。図中、「５ｆｒａｇ」は、Ｌｔｅｒ１〜Ｌｔｅｒ５の５断片全てが連結された連結体のバンドを示す。クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを含有していない反応溶液では、ＰＥＧ８０００濃度０質量％の反応溶液では２断片連結体と３断片連結体のバンドは確認できたものの、４断片以上の連結体のバンドは確認できなかった。これに対して、ＰＥＧ８０００濃度を高くすると４断片と５断片の連結体のバンドも確認できた。一方で、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを含有させた反応溶液では、ＰＥＧ８０００濃度０質量％の反応溶液では２断片連結体と３断片連結体と４断片連結体のバンドは確認できたものの、５断片の連結体のバンドは確認できなかった。これに対して、ＰＥＧ濃度を高くすると、５断片の連結体のバンドも確認できた。ＰＥＧ８０００濃度０質量％の反応溶液を比較した結果から、ＡＴＰ再生系を含む反応溶液のほうが、より多断片の連結体が得られやすいことがわかった。また、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを含有していない反応溶液と両者を含有している反応溶液のいずれでも、ＰＥＧ無添加の反応溶液よりもＰＥＧを添加した反応溶液のほうが、５断片連結体の産生量が多くなっていた。このことから、ＰＥＧにより連結が促進されることがわかった。全てのサンプルにおいて、未連結の断片が少なく、かつ５断片連結体の量が最も多かったのは、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを含有しており、かつＰＥＧ８０００が５質量％の反応溶液であった。

［実施例３］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のＤＭＳＯ濃度の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ５（配列番号１〜配列番号５）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ５、１μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、４０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭの酢酸カリウム、５質量％のＰＥＧ８０００、及び０容量％、１容量％、３容量％、又は１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、３０℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液２μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図４（ａ）に示す。図中、「ＭＫ３」はＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ５を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応を行った全てのサンプルにおいて、５断片全部が連結した連結体のバンドが確認されたが、ＤＭＳＯ濃度が１０容量％の反応溶液ではその他の反応溶液よりも明らかに５断片連結体の量が多かった。

次いで、ＤＭＳＯ濃度を、０容量％、１０容量％、２０容量％、又は４０容量％とした以外は同様にして反応溶液を調製し、これらの反応溶液を、３０℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液２μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図４（ｂ）に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は図４（ａ）と同じである。この結果、ＤＭＳＯ濃度が１０容量％又は２０容量％の反応溶液では、ＤＭＳＯを添加していない反応溶液よりも５断片全部が連結した連結体の産生量が明らかに増大していたが、ＤＮＳＯ濃度が４０容量％の反応溶液では、連結体のバンドは確認できず、連結が阻害されていた。これらの結果から、ＤＭＳＯを５容量％以上含有させることにより、連結反応が促進されるが、ＤＭＳＯ濃度が高すぎると逆に連結反応が阻害されることがわかった。

［実施例４］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のＴＭＡＣ濃度の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ７（配列番号１〜配列番号７）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７、１μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、４０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、１５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、及び０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、又は１００ｍＭのＴＭＡＣからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、３７℃で２時間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図５（ａ）に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を含有する溶液１μＬを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応を行った全てのサンプルにおいて、７断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。特に、ＴＭＡＣ濃度が１００ｍＭの反応溶液では、その他の反応溶液よりも明らかに７断片連結体の量が多かった。

次いで、ＴＭＡＣの濃度を６０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、又は２５０ｍＭとし、かつグルタミン酸カリウムの濃度を５０ｍＭとした以外は同様にして反応溶液を調製し、これらの反応溶液を、４２℃で２時間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液１．９μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図５（ｂ）に示す。この結果、ＴＭＡＣ濃度が１００ｍＭ〜２００ｍＭの反応溶液では、ＴＭＡＣ濃度が６０ｍＭの反応溶液よりも明らかに７断片連結体の量が多く、連結効率が改善されていた。７断片連結体の量が最も多かったのは、ＴＭＡＣ濃度が１５０ｍＭの反応溶液であった。一方で、ＴＭＡＣ濃度が２５０ｍＭの反応溶液では、７断片連結体の量はＴＭＡＣ濃度が６０ｍＭの反応溶液よりも少なく、また、未連結の断片の残存量が多かった。これらの結果から、ＴＭＡＣを１００〜２００ｍＭ含有させることにより、連結反応が促進できることがわかった。

［実施例５］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のアルカリ金属イオン源の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ７又はＤＣＷ１〜ＤＣＷ５を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ５、１μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、４０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、又は１５０ｍＭの酢酸カリウム、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。また、酢酸カリウムに代えて１５０ｍＭのグルタミン酸カリウムを含有させた以外は同様にして反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、３０℃で２時間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液２μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図６に示す。アルカリ金属イオン源を含有させなかった反応溶液では、５断片全ての連結体のバンドは確認できなかったが、酢酸カリウム又はグルタミン酸カリウムを含有させた反応溶液では、全て、５断片全ての連結体のバンドが確認できた。特に、グルタミン酸カリウムを含有させた反応溶液では、酢酸カリウムを含有させた反応溶液よりも、未連結の断片のバンドが薄かったことから、酢酸カリウムよりもグルタミン酸カリウムのほうが、連結効率を改善する効果がより高いのではないかと推察された。

次いで、連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としてＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を用い、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を配合し、アルカリ金属イオン源としてグルタミン酸カリウムを用い、グルタミン酸カリウムの濃度を５０ｍＭ又は１５０ｍＭとした以外は同様にして反応溶液を調製した。これらの反応溶液を、３７℃、４２℃、又は４５℃で１時間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図７に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を含有する溶液１μＬを泳動したレーンを示す。この結果、反応温度３７℃と４２℃のいずれにおいても、グルタミン酸カリウム濃度が５０ｍＭの反応溶液のほうが１５０ｍＭの反応溶液よりも、連結効率が高く、７断片全ての連結体のバンドが確認できた。これらの結果から、グルタミン酸カリウム濃度が高すぎると、かえって連結反応が阻害される場合があることがわかった。また、４５℃でインキュベートした反応溶液では、グルタミン酸カリウム濃度が５０ｍＭであっても、７断片連結体のバンドは確認できなかった。７断片連結体の量が最も多かったのは、グルタミン酸カリウム濃度が５０ｍＭであって、４２℃でインキュベートした反応溶液であった。

［実施例６］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中の各直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片のモル比の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７、１μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、４０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。また、ＤＣＷ３のみ２ｎＭとなるように含有させた以外は同様にして反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で２時間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図８に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を含有する溶液１μＬを泳動したレーンを示す。また、「Ｅｑｕａｌ」はＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を全て１ｎＭずつ含有させた反応溶液を泳動したレーンを示す。「２−ｆｏｌｄ ｅｘｃｅｓｓ ３ｒｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ」はＤＣＷ１〜７のうち、ＤＣＷ３のみを２ｎＭ、その他は全て１ｎＭずつ含有させた反応溶液を泳動したレーンを示す。この結果、いずれの反応溶液でも７断片の連結体は確認されたが、ＤＣＷ３のみを２倍量（モル）含有させた反応溶液では、７断片の連結体の量が減少し、３断片の連結体と５断片の連結体の量が増大した。これは、過剰なＤＣＷ３により、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３が連結した連結体と、ＤＣＷ３〜ＤＣＷ７が連結した連結体が増加したためと推察される。これらの結果から、連結される各断片のモル比は等量となるように反応溶液を調製することにより、より多断片の連結効率が改善されることがわかった。

［実施例７］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中の３’→５’エキソヌクレアーゼの濃度と反応時間の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７、１μＭの大腸菌ＲｅｃＡの野生型、２０ｍＵ／μＬ、４０ｍＵ／μＬ、８０ｍＵ／μＬ、１２０ｍＵ／μＬ、又は１６０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で１５分間、３０分間、又は６０分間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図９に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ７を含有する溶液１μＬを泳動したレーンを示す。この結果、エキソヌクレアーゼIII濃度が２０ｍＵ／μＬの反応溶液では、インキュベーション時間が６０分間であっても連結体はほとんど形成されていなかった。これに対して、エキソヌクレアーゼIII濃度が４０ｍＵ／μＬの反応溶液では、インキュベーション時間が３０分間では連結体はほとんど形成されていなかったが、インキュベーション時間が６０分間では７断片全部の連結体が形成されていた。また、エキソヌクレアーゼIII濃度が８０〜１６０ｍＵ／μＬの反応溶液では、インキュベーション時間が１５分間でも、７断片全部の連結体が形成されていた。７断片連結体の量が最も多く、多断片の連結効率が最も良好であったのは、エキソヌクレアーゼIII濃度が８０ｍＵ／μＬであり、３０分間インキュベートした反応溶液であった。

［実施例８］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の濃度の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９（配列番号１〜配列番号４９）を用いた。ＤＣＷ１〜ＤＣＷ７と同様に、ＤＣＷ８〜ＤＣＷ４９のそれぞれの末端から６０塩基までの領域は相同領域である。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭ又は各０．５ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片、１μＭの大腸菌ＲｅｃＡの野生型、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０を含有させた反応溶液は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が２０ｎＭ（７．８ｎｇ／μＬ）であった。各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５を含有させた反応溶液は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が２５ｎＭ（９．８ｎｇ／μＬ）であった。各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３０を含有させた反応溶液は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が３０ｎＭ（１１．７ｎｇ／μＬ）であった。各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４０を含有させた反応溶液は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が４０ｎＭ（１５．６ｎｇ／μＬ）であった。各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９を含有させた反応溶液は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が４９ｎＭ（１９．１ｎｇ／μＬ）であった。各０．５ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９を含有させた反応溶液は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が２４．５ｎＭ（９．６ｎｇ／μＬ）であった。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った。反応終了後の反応溶液について次の容量をアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０を用いた反応溶液は１．２５μＬ、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５を用いた反応溶液は１μＬ、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３０を用いた反応溶液は０．８３μＬ、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４０を用いた反応溶液は０．６３μＬ、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９を用いた反応溶液は０．５１μＬ、各０．５ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９を用いた反応溶液は１．０２μＬであった。

染色結果を図１０に示す。それぞれの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を１ｎＭずつ含有させた反応溶液では、含有させた断片数が多くなるほど、すなわち、反応溶液中の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が多くなるほど、多断片の連結体が形成され難くなっていた。また、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９を含有させた反応溶液同士を比較したところ、１ｎＭずつ含有させた反応溶液よりも０．５ｎＭずつ含有させた反応溶液のほうが、より多断片の連結体が得られていた。これらの結果から、反応溶液中の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片の総量が多くなりすぎると連結効率が阻害される恐れがあることが示唆された。

［実施例９］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質の種類の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５（配列番号１〜配列番号２５）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型又はＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５、０．５μＭ、０．７５μＭ、１μＭ、１．２５μＭ、又は１．５μＭの大腸菌ＲｅｃＡの野生型又はＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２０分間インキュベートした。６５℃でのインキュベート終了後、氷上で急冷した反応溶液１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１１に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５を含有する溶液１．５μＬを泳動したレーンを示す。この結果、野生型とＦ２０３Ｗ変異体のいずれであっても、ＲｅｃＡの含有量依存的に多断片の連結体の産生量が多くなっていた。また、野生型のＲｅｃＡを含有させた反応溶液よりも、Ｆ２０３Ｗ変異体を含有させた反応溶液のほうが、多断片の連結体の産生量が多く、連結効率が高かった。

［実施例１０］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをＲＣＲ増幅した。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としては、まず、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０（配列番号１〜配列番号２０）と、ｏｒｉＣ及びｏｒｉＣに対してそれぞれ外向きに挿入された１対のｔｅｒ配列を含むＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）（配列番号５０）のセットを用いた。ｔｅｒ配列は、方向特異的に複製を停止させる機能をもつ蛋白質Ｔｕｓが結合する配列である。ｔｅｒ配列について「ｏｒｉＣに対して外向きに挿入する」とは、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有する蛋白質の組合せの作用により、ｏｒｉＣより外側に向かう方向の複製に対しては複製を許容する一方、ｏｒｉＣに向かって入ってくる方向の複製に対しては複製を許容せず停止する方向でｔｅｒ配列を挿入することを意味する。Ｃｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）は、１２９８ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であり、１番目から６０番目までの６０塩基はＤＣＷ２０との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ２０の５３２番目から５９１番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。また、Ｃｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）の１２３９番目から１２９８番目までの６０塩基はＤＣＷ１との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ１の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。つまり、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）の２１断片が全て連結すると環状ＤＮＡが得られる。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としては、その他に、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５（配列番号１〜配列番号２５）と、ｏｒｉＣを含むＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）（配列番号５１）のセットを用いた。Ｃｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）は、１２９８ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であり、１番目から６０番目までの６０塩基はＤＣＷ２５との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ２５の５３２番目から５９１番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。また、Ｃｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）の１２３９番目から１２９８番目までの６０塩基はＤＣＷ１との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ１の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。つまり、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）の２６断片が全て連結すると環状ＤＮＡが得られる。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として、表１に示す組成の反応用混合物に６０ｎＭのＴｕｓを含む混合液を用いた。Ｔｕｓは、Ｔｕｓの大腸菌発現株から、アフィニティーカラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。

表１中、ＳＳＢは大腸菌由来ＳＳＢ、ＩＨＦは大腸菌由来ＩｈｆＡ及びＩｈｆＢの複合体、ＤｎａＧは大腸菌由来ＤｎａＧ、ＤｎａＮは大腸菌由来ＤｎａＮ、Ｐｏｌ III*は大腸菌由来ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、及びＨｏｌＥからなる複合体であるＤＮＡポリメラーゼIII*複合体、ＤｎａＢは大腸菌由来ＤｎａＢ、ＤｎａＣは大腸菌由来ＤｎａＣ、ＤｎａＡは大腸菌由来ＤｎａＡ、ＲＮａｓｅＨは大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、Ｌｉｇａｓｅは大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ、Ｐｏｌ Iは大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｙｒＡは大腸菌由来ＧｙｒＡ、ＧｙｒＢは大腸菌由来ＧｙｒＢ、Ｔｏｐｏ IVは大腸菌由来ＰａｒＣ及びＰａｒＥの複合体、Ｔｏｐｏ IIIは大腸菌由来トポイソメラーゼIII、ＲｅｃＱは大腸菌由来ＲｅｃＱを表す。

ＳＳＢは、ＳＳＢの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びイオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＩＨＦは、ＩｈｆＡ及びＩｈｆＢの大腸菌共発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＤｎａＧは、ＤｎａＧの大腸菌発現株から、硫安沈殿、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＤｎａＮは、ＤｎａＮの大腸菌発現株から、硫安沈殿及び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
Ｐｏｌ III*は、ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ及びＨｏｌＥの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＤｎａＢ及びＤｎａＣは、ＤｎａＢ及びＤｎａＣの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＤｎａＡは、ＤｎａＡの大腸菌発現株から、硫安沈殿、透析沈殿、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＧｙｒＡ及びＧｙｒＢは、ＧｙｒＡの大腸菌発現株とＧｙｒＢの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
Ｔｏｐｏ IVは、ＰａｒＣの大腸菌発現株とＰａｒＥの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
Ｔｏｐｏ IIIは、Ｔｏｐｏ IIIの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＲｅｃＱは、ＲｅｃＱの大腸菌発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
ＲＮａｓｅＨ、Ｌｉｇａｓｅ、Ｐｏｌ Iは、市販の大腸菌由来の酵素を用いた（タカラバイオ社製）。

具体的には、まず、２．５ｎＭ又は５ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セット、１μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットとしては、前記のＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）を全て等モルずつ含有するセット、又はＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）を全て等モルずつ含有するセットを用いた。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２０分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液について、２．５ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含むものは１μＬ、５ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含むものは０．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１２（ａ）に示す。図中、「１−２０」はＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）を全て等モルずつ含有する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含有する反応溶液を泳動したレーンを示す。「１−２５」はＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）を全て等モルずつ含有する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含有する反応溶液を泳動したレーンを示す。この結果、いずれの反応溶液中にも、様々な大きさの連結体が含まれていることが確認された。

次いで、熱処理・急冷後の反応溶液０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応混合物を調製した。当該反応混合物を、３０℃で１３時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。反応終了後の反応混合物１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１２（ｂ）に示す。図中、「１−２０」と「１−２５」は図１２（ａ）と同じである。この結果、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２０及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２０）のセットを連結させた反応溶液のＲＣＲ増幅物のレーンには、２１断片の環状連結体のスーパーコイルのバンド（図中、「２１ ｆｒａｇ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌ」）が観察された。ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）のセットを連結させた反応溶液のＲＣＲ増幅物のレーンには、２６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンド（図中、「２６ ｆｒａｇ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌ」）が観察された。また、連結反応後の反応溶液（図１２（ａ））では多数のバンドが検出されたのに対して、ＲＣＲ増幅後の反応混合物（図１２（ｂ））では数本のバンドしか検出されなかったことから、環状の連結体のみがＲＣＲ増幅により増幅されたことが確認できた。

［実施例１１］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをＲＣＲ増幅する方法において、ＲＣＲ増幅前の熱処理・急冷の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としては、実施例１０で用いた「ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＣｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）を全て等モルずつ含有する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セット」（２０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セット）を用いた。ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として表１に示す組成の反応用混合物に６０ｎＭのＴｕｓを含む混合液を用いた。

具体的には、まず、２０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セット、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。次いで、この反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、５０℃又は６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。急冷後の反応溶液１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１３（ａ）に示す。図中、「５００ｂｐ ｌａｄｄｅｒ」は実施例１で用いたＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「Ｉｎｐｕｔ」は、２０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含有する溶液１．５μＬを泳動したレーンを示す。また、「−」は連結反応後の熱処理を行わなかった反応溶液を泳動したレーンを示す。「５０℃」は５０℃で２分間インキュベートして熱処理した反応溶液を泳動したレーンを示す。「６５℃」は６５℃で２分間インキュベートして熱処理した反応溶液を泳動したレーンを示す。図１３（ａ）に示す通り、熱処理を行わなかった反応溶液では、泳動されずにスメアーなバンドとなっていたのに対して、熱処理後の反応溶液では、スメアーバンドの大部分が解消されていた。

次いで、熱処理・急冷後の反応溶液０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応混合物を調製した。当該反応混合物を、３０℃で１３時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。対照として、６５℃の熱処理・急冷後の反応溶液０．５μＬを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡからなるＴＥ溶液４．５μＬに添加して増幅前溶液とした。増幅前溶液及び反応終了後の反応混合物１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１３（ｂ）に示す。図中、「ＭＫ３」はＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応により環状連結体が形成された反応溶液をＲＣＲ増幅した反応混合物では、２６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンド（図中、「２５ ｆｒａｇ ｓｃＤＮＡ」）が観察された（図１３（ｂ）中、「−」、「５０℃」、「６５℃」）。増幅前溶液（図１３（ｂ）中、「Ｉｎｐｕｔ」）ではバンドは観察されなかった。熱処理を行わなかった反応混合物（「−」）では、２６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンドよりも泳動距離が長い箇所に２本のブロードのバンドが観察されたが、５０℃で熱処理した反応混合物（「５０℃」）ではこれらのバンドは薄くなっており、６５℃で熱処理した反応混合物（「６５℃」）ではこれらのバンドは検出されなかった。これらの結果から、２６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンドよりも泳動距離が長いバンドは、非特異的な連結により生じた環状連結体の増幅産物であり、ＲＣＲ増幅前に熱処理・急冷を行うことによってこのような非特異的な増幅産物を抑制できることがわかった。

［実施例１２］
２６種類又は３６種類の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをＲＣＲ増幅した。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としては、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５（配列番号１〜配列番号２５）と、ｏｒｉＣを含むＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）（配列番号５２）のセットを用いた。Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）は、１５０９ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であり、１番目から６０番目までの６０塩基はＤＣＷ２５との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ２５の５３２番目から５９１番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。また、Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）の１４５０番目から１５０９番目までの６０塩基はＤＣＷ１との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ１の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。つまり、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）の２６断片が全て連結すると環状ＤＮＡが得られる。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としては、その他に、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５（配列番号１〜配列番号３５）と、ｏｒｉＣ及びｏｒｉＣに対してそれぞれ外向きに挿入された１対のｔｅｒ配列を含むＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）（配列番号５３）のセットを用いた。Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）は、１５０９ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であり、１番目から６０番目までの６０塩基はＤＣＷ３５との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ３５の５３２番目から５９１番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。また、Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）の１４５０番目から１５０９番目までの６０塩基はＤＣＷ１との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ１の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。つまり、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）の３６断片が全て連結すると環状ＤＮＡが得られる。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として表１に示す組成の反応用混合物に６０ｎＭのＴｕｓを含む混合液を用いた。

具体的には、まず、２０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セット、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットとしては、前記のＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）を全て等モルずつ含有するセット、又はＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を全て等モルずつ含有するセットを用いた。次いで、この反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で５分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。急冷後の反応溶液１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１４（ａ）に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、２０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含有する溶液１．５μＬを泳動したレーンを示す。また、「ＤＣＷ１−２５ Ｋｍ−ｏｒｉＣ」は、前記のＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）を全て等モルずつ含有するセットを含有させた反応溶液を泳動したレーンを示す。「ＤＣＷ１−３５ Ｋｍ−ｏｒｉＣ」は、前記のＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を全て等モルずつ含有するセットを含有させた反応溶液を泳動したレーンを示す。図１４（ａ）に示す通り、いずれの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを用いた場合にも、連結反応により多断片の連結体が得られた。

次いで、熱処理・急冷後の反応溶液０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応混合物を調製した。当該反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。続いて、各ＲＣＲ増幅反応物０．５μＬをそれぞれ、表１に示す反応用混合物から酵素群のみを除いたもの（反応バッファー）４．５μＬに希釈した後、３０℃で３０分間再インキュベートを行った。希釈後の再インキュベート処理は、産物中の増幅中間体の複製伸長や分離反応を促し、最終産物であるスーパーコイルＤＮＡの産生量を高める効果がある。対照として、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５を用いて連結反応及び熱処理・急冷後を行った反応溶液０．５μＬを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡからなるＴＥ溶液４．５μＬに添加して増幅前溶液を調製した。増幅前溶液及び再インキュベート終了後の反応混合物２．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１４（ｂ）に示す。この結果、２６断片の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを連結後にＲＣＲ増幅した反応混合物では、２６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンド（図中、「２６断片ｓｃＤＮＡ」）が観察された（図１３（ｂ）中、「ＤＣＷ１−２５ Ｋｍ−ｏｒｉＣ」）。３６断片の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを連結後にＲＣＲ増幅した反応混合物では、３６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンド（図中、「３６断片ｓｃＤＮＡ」）が観察された（図１３（ｂ）中、「ＤＣＷ１−３５ Ｋｍ−ｏｒｉＣ」）。増幅前溶液（図１４（ｂ）中、「Ｉｎｐｕｔ」）ではバンドは観察されなかった。これらの結果から、本発明により、３６断片という多断片の環状連結体を得られること、この環状連結体はＲＣＲ増幅により増幅できること、が確認された。ただし、３６断片の連結反応物のほうが、２６断片の連結反応物よりも、ＲＣＲ増幅による非特異的増幅産物が多かった。

［実施例１３］
Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（特許文献３）を利用して複数の２本鎖ＤＮＡ断片を連結する方法に用いるキット「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリー」（ＮＥＢ社製）が市販されている。当該キットでは、末端に１５〜２０塩基の相同領域がある２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、５’→３’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼを含む当該キットに添付の混合溶液（Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）に添加し、５０℃で１５〜６０分間インキュベートする方法（ＮＥＢ法）により連結する。

ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結反応を行う本発明に係るＤＮＡの産生方法と、ＮＥＢ法との連結効率を比較した。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片としては、実施例１２で用いたＤＣＷ１〜ＤＣＷ２５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ２５）を全て等モルずつ含有するセットを用いた。ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として表１に示す組成の反応用混合物に６０ｎＭのＴｕｓを含む混合液を用いた。

具体的には、まず、本発明に係る方法（ＲＡ法）として、２０ｎＭ又は６０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セット、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯからなる反応溶液を調製した。次いで、この反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で５分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。急冷後の反応溶液１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

また、ＮＥＢ法として、前記キットに添付の２×Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを２倍希釈した溶液に２０ｎＭ又は６０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを混合した反応溶液を調製し、当該反応溶液を、５０℃で６０分間インキュベートして連結反応を行った。連結反応後の反応溶液１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１５（ａ）に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、２０ｎＭの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットを含有する溶液１．５μＬを泳動したレーンを示す。また、「ＲＡ」は、本発明に係る方法（ＲＡ法）で調製された反応溶液を泳動したレーンを示し、「ＮＥＢ」はＮＥＢ法で調製した反応溶液を泳動したレーンを示す。図１５（ａ）に示す通り、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片セットの含有量が２０ｎＭと６０ｎＭのいずれの場合であっても、ＲＡ法で連結反応を行った反応溶液では、かなり多数の断片が連結した連結体が得られた。これに対して、ＮＥＢ法で連結反応を行った反応溶液では、２〜３断片の連結体しか得られなかった。

次いで、各反応溶液０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応混合物を調製した。当該反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。続いて、各ＲＣＲ増幅反応物０．５μＬをそれぞれ、表１に示す反応用混合物から酵素群のみを除いたもの（反応バッファー）４．５μＬに希釈した後、３０℃で３０分間再インキュベートを行った。再インキュベート終了後の反応混合物２．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１５（ｂ）に示す。この結果、本発明に係る方法（ＲＡ法）で連結反応を行った反応溶液をＲＣＲ増幅した反応混合物（図中、「ＲＡ」）には、２６断片が全て連結した環状の連結体の増幅産物のバンドが検出された（図中、「２５ ｆｒａｇ Ｓｕｐｅｒｃｏｉｌ」）。一方で、ＮＥＢ法で連結反応を行った反応溶液をＲＣＲ増幅した反応混合物（図中、「ＮＥＢ」）には、２６断片の環状連結体の増幅産物のバンドは検出されず、ＮＥＢ法では２６断片を連結させることができなかった。また、いずれの反応混合物においても、非特異的なローリングサークル型複製の進行によりコンカテマーとなった産物や、複製後に未分離のまま残った環状ＤＮＡ多量体産物（カテナン）が、アガロースゲル電気泳動の分離限界の位置に検出された（図中、「Ｍｕｌｔｉｍｅｒ」）。

［実施例１４］
長鎖ゲノムの断片同士を連結し、環状連結体を形成し、その後ＲＣＲ増幅で増幅させた。

長鎖ゲノムの断片として、大腸菌株（ＤＧＦ−２９８ＷΔ１００::ｒｅｖΔ２３４::ＳＣ）のゲノムＤＮＡのＸｂａ I消化物（１５断片、ＤＧＦ−２９８／ＸｂａＩ）を用い、このうち、３２５ｋｂｐのゲノム断片（３２５ｋゲノム断片）と２２０ｋｂｐのゲノム断片（２２０ｋゲノム断片）を、それぞれ、ｏｒｉＣを含む連結用断片（Ｃｍ−ｏｒｉＣ断片）と連結させて環状とした。３２５ｋゲノム断片を環化する連結用断片としては、ｏｒｉＣを含み、かつ、上流末端に３２５ｋゲノム断片の下流末端との相同領域があり（すなわち、上流末端の６０塩基が、３２５ｋゲノム断片の下流末端の６０塩基と同一の塩基配列からなり）、下流末端に３２５ｋゲノム断片の上流末端との相同領域がある（すなわち、下流末端の６０塩基が、３２５ｋゲノム断片の上流末端の６０塩基と同一の塩基配列からなる）、１２９８ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片（Ｃｍ−ｏｒｉＣ／３２５ｋ断片、配列番号５９）を用いた。２２０ｋゲノム断片を環化する連結用断片としては、ｏｒｉＣを含み、かつ、上流末端に２２０ｋゲノム断片の下流末端との相同領域があり（すなわち、上流末端の６０塩基が、２２０ｋゲノム断片の下流末端の６０塩基と同一の塩基配列からなり）、下流末端に２２０ｋゲノム断片の上流末端との相同領域がある（すなわち、下流末端の６０塩基が、２２０ｋゲノム断片の上流末端の６０塩基と同一の塩基配列からなる）、１２９８ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片（Ｃｍ−ｏｒｉＣ／２２０ｋ断片、配列番号６０）を用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として表１に示す組成の反応用混合物を用いた。

具体的には、大腸菌ゲノムＤＮＡのＸｂａ I消化物（ＤＧＦ−２９８／ＸｂａＩ、４．８ｎｇ／μＬ）と、連結対象ゲノム断片である３２５ｋゲノム断片との相同領域を持つＣｍ−ｏｒｉＣ／３２５ｋ断片（２４０ｐＭ）を、ＲＡ反応液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＫＯＡｃ、１０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２、１００μＭ ＡＴＰ、５質量％ ＰＥＧ８０００、４０ｍＵ／μＬ エキソヌクレアーゼIII、１μＭ 大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体］（５μＬ）に加え、３０℃で６０分間インキュベートして連結反応を行った。得られたＲＡ産物０．５μＬをＲＣＲ増幅反応液（４．５μＬ）に加え、温度サイクル（３７℃で１分、次いで２４℃で３０分間を１サイクルとし、これを４０サイクル繰り返した）を用いた増幅反応を行った。連結対象ゲノム断片を２２０ｋｂｐとし、Ｃｍ−ｏｒｉＣ／３２５ｋ断片に代えてＣｍ−ｏｒｉＣ／２２０ｋ断片を用いて同様にして連結反応を行った後、ＲＣＲ増幅を行った。対照として、２００ｋｂｐの環状ｏｒｉＣプラスミドについて、同様にＲＣＲ増幅を行った。３２５ｋゲノム断片連結産物のＲＣＲ増幅反応液には、長鎖ＤＮＡ安定化のために５０μＭ ジエチレントリアミン五酢酸を添加した。

反応終了後の反応混合物１μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。染色結果を図１６に示す。図中、「２２０ｋｂ」は連結対象ゲノム断片を２２０ｋｂｐとした反応で得られた増幅産物を泳動したレーンを示す。「３２５ｋｂ」は連結対象ゲノム断片を３２５ｋｂｐとした反応で得られた増幅産物を泳動したレーンを示す。「２００ｋｂ（ＲＣＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、２００ｋｂｐの環状ｏｒｉＣプラスミドをそのまま増幅して得られた産物を泳動したレーンを示す。この結果、連結対象ゲノム断片を２２０ｋｂｐとした反応では、２２０ｋｂｐの環状連結体のスーパーコイルが、連結対象ゲノム断片を３２５ｋｂｐとした反応では、３２５ｋｂｐの環状連結体のスーパーコイルが、それぞれ検出された。これらの結果から、本発明に係るＤＮＡの産生方法により、３２５ｋｂｐもの長鎖の２本鎖ＤＮＡ断片を環化できることが確認された。

［実施例１５］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸からなるＡＴＰ再生経路を含む反応溶液中のクレアチンリン酸濃度の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０（配列番号１〜配列番号１０）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各２ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、及び、０ｍＭ（無添加）、０．１ｍＭ、０．４ｍＭ、１ｍＭ、４ｍＭ、若しくは１０ｍＭのクレアチンリン酸からなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１７に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各２ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応を行ったサンプルのうち、クレアチンリン酸濃度が０．４〜１０ｍＭのサンプルで１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。特に、クレアチンリン酸濃度が１ｍＭ又は４ｍＭのサンプルは、１０断片の連結体の量が多く、中でも４ｍＭのサンプルは、２〜９断片の連結体の量も多く、連結効率に優れていることがわかった。

［実施例１６］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸からなるＡＴＰ再生経路を含む反応溶液中のクレアチンキナーゼ濃度の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０（配列番号１〜配列番号１０）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各２ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０ｎｇ／μＬ（無添加）、５ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、若しくは２００ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１８に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各２ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示し、「Ｂｕｆｆｅｒ」はクレアチンキナーゼ無添加（０ｎｇ／μＬ）のサンプルを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応を行ったサンプルのうち、クレアチンキナーゼを添加した全てのサンプルにおいて、１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。

［実施例１７］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸からなるＡＴＰ再生系の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５（配列番号１〜配列番号３５）とｏｒｉＣ及びｏｒｉＣに対してそれぞれ外向きに挿入された１対のｔｅｒ配列を含むＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）（配列番号５３）のセットを用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２ｍＭのホスホエノールピルビン酸、並びに、１０ｎｇ／μＬ、３２ｎｇ／μＬ、若しくは１００ｎｇ／μＬのピルビン酸キナーゼからなる反応溶液を調製した。また、比較対象として、２ｍＭのホスホエノールピルビン酸に代えて２ｍＭのクレアチンリン酸を、ピルビン酸キナーゼに代えて２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼを混合した以外は同様にして調製した反応溶液と、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを含有しない以外は同様にして調製した反応溶液も得た。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図１９に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。「−ＡＴＰ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」は、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを含有しないサンプルを泳動したレーンを示す。「ＣＰ ２ｍＭ，ＣＫ ２０ｎｇ／μＬ」は、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを含有するサンプルを泳動したレーンを示す。「ＰＥＰ２ｍＭ」は、ホスホエノールピルビン酸と各濃度のピルビン酸キナーゼを含有するサンプルを泳動したレーンを示す。この結果、２ｍＭのホスホエノールピルビン酸と１００ｎｇ／μＬのピルビン酸キナーゼからなるＡＴＰ再生系を含むサンプルでは、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼからなるＡＴＰ再生系を含むサンプルと同様に、多断片が連結した連結体のバンドが確認された。

［実施例１８］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸からなるＡＴＰ再生系の影響を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０（配列番号１〜配列番号１０）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、３’→５’エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼIIIを用いた。

具体的には、まず、各２ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０、１μＭのＲｅｃＡの野生型、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、及び、２０ｎｇ／μＬのポリリン酸キナーゼと、１ｍＭ、４ｍＭ、若しくは１０ｍＭのポリリン酸と、２０ｎｇ／μＬ、６０ｎｇ／μＬ、若しくは１５０ｎｇ／μＬのポリリン酸キナーゼと、からなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２０に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各２ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応を行ったサンプルのうち、６０ｎｇ／μＬのポリリン酸キナーゼと１ｍＭのポリリン酸とを添加したサンプルにおいて、１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。

［実施例１９］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを併用する効果を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０（配列番号１〜配列番号１０）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型を用い、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIを、それぞれ用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０、１μＭのＲｅｃＡの野生型、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０Ｕ／μＬ（無添加）、０．１Ｕ／μＬ、０．３Ｕ／μＬ、若しくは１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼIからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２１に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ１０を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。この結果、連結反応を行った全てのサンプルで１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。また、１０断片全部が連結した連結体の量は、エキソヌクレアーゼIの添加量依存的に多くなっていた。これらの結果から、エキソヌクレアーゼIの添加により、エキソヌクレアーゼIIIとＲｅｃＡによる連結反応が促進されることが判明した。

［実施例２０］
３６種類の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをＲＣＲ増幅した。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５（配列番号１〜配列番号３５）とｏｒｉＣ及びｏｒｉＣに対してそれぞれ外向きに挿入された１対のｔｅｒ配列を含むＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）（配列番号５３）のセットを用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型を用い、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIを、それぞれ用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として表１に示す組成の反応用混合物に６０ｎＭのＴｕｓを含む混合液を用いた。

具体的には、まず、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）、１μＭのＲｅｃＡの野生型、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０Ｕ／μＬ（無添加）、０．３Ｕ／μＬ、若しくは１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼIからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２２（ａ）に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。図２２（ａ）に示す通り、いずれのサンプルでも、多断片の連結体が確認された。また、エキソヌクレアーゼIの添加量が多いサンプルほど、より多数の断片の連結体の量が多かった。

次いで、熱処理・急冷後の反応溶液０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応混合物を調製した。当該反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。続いて、各ＲＣＲ増幅反応物１μＬをそれぞれ、表１に示す反応用混合物から酵素群のみを除いたもの（反応バッファー）４μＬに希釈した後、３０℃で３０分間再インキュベートを行った。再インキュベート終了後の反応混合物２．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２２（ｂ）に示す。この結果、エキソヌクレアーゼIを添加したサンプルでは、３６断片の環状連結体のスーパーコイルのバンド（図中、「３６断片ｓｃＤＮＡ」）が観察された（図１３（ｂ）中、「３６ ｆｒａｇ． Ｓｕｐｅｒｃｏｉｌ」）。一方で、エキソヌクレアーゼIを添加しなかったサンプルでは、このバンドは観察されなかった。この結果から、ＲｅｃＡとエキソヌクレアーゼIIIによる連結反応がエキソヌクレアーゼIの添加により連結効率が促進された結果、３６断片全てが連結した環状連結体が得られたことがわかった。

［実施例２１］
５０種類の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをＲＣＲ増幅した。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９（配列番号１〜配列番号４９）とｏｒｉＣ及びｏｒｉＣに対してそれぞれ外向きに挿入された１対のｔｅｒ配列を含むＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）（配列番号６２）のセットを用いた。Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）は、１５０９ｂｐの直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片であり、１番目から６０番目までの６０塩基はＤＣＷ４９との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ４９の５３２番目から５９１番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。また、Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）の１４５０番目から１５０９番目までの６０塩基はＤＣＷ１との連結のための相同領域であり、ＤＣＷ１の１番目から６０番目までの６０塩基と同一の塩基配列からなる。つまり、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）の５０断片が全て連結すると環状ＤＮＡが得られる。

また、ポジティブコントロールとして、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５（配列番号１〜配列番号３５）とｏｒｉＣ及びｏｒｉＣに対してそれぞれ外向きに挿入された１対のｔｅｒ配列を含むＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）のセットも用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型を用い、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIを、それぞれ用いた。さらに、ＲＣＲ増幅反応液として表１に示す組成の反応用混合物に６０ｎＭのＴｕｓを含む混合液を用いた。

具体的には、まず、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）、１μＭのＲｅｃＡの野生型、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０．３Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼIからなる反応溶液を調製した。また、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）に代えて、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を混合した以外は同様にして調製した反応溶液も準備した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２３（ａ）に示す。図中、「DCW1-35 Km-oriC 20 nM (8.8 ng/mL)」のうち、「Ｉｎｐｕｔ」は、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を含有する溶液１．５μＬを泳動したレーンを示し、「ＲＡ」は、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を含有させた反応溶液を泳動したレーンを示す。「DCW1-49 Km-oriC 30 nM (12.1 ng/mL)」のうち、「Ｉｎｐｕｔ」は、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）を含有する溶液１．５μＬを泳動したレーンを示し、「ＲＡ」は、各０．６ｎＭのＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）を含有させた反応溶液を泳動したレーンを示す。この結果、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を用いたサンプルとＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）を用いたサンプルの両方とも、多断片の連結体が確認された。

次いで、熱処理・急冷後の反応溶液０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応混合物を調製した。当該反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。続いて、各ＲＣＲ増幅反応物１μＬをそれぞれ、表１に示す反応用混合物から酵素群のみを除いたもの（反応バッファー）４μＬに希釈した後、３０℃で３０分間再インキュベートを行った。再インキュベート終了後の反応混合物２．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２３（ｂ）に示す。図中、「ＭＫ３」はＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示す。この結果、実施例２０で確認されたように、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ３５及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）を用いたサンプルでは、３６断片が連結した環状連結体がえられ、この増幅産物が確認された。一方で、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）を用いたサンプルでは、５０断片が連結した環状連結体のバンドが期待される位置に薄いバンドが確認された。

次いで、ＤＣＷ１〜ＤＣＷ４９及びＫｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ４９）を含む反応溶液の連結反応及びその後のＲＣＲ増幅反応後の反応溶液に含まれるＤＮＡ（５０断片が連結した環状連結体の増幅産物）を単離し、そのＤＮＡの塩基配列構造を調べた。

具体的には、ＲＣＲ反応後の溶液１μＬに９μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液）を添加し、得られた希釈液１μＬを大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ、タカラバイオ社製）を含む溶液５０μＬに混合し、得られた混合液に対してエレクトロポレーション法を行い、形質転換を行った。得られた形質転換体のコロニー１２個を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２０ｍＬのＬＢ液体培地で一晩培養し、それぞれの培養液で増殖した大腸菌の細胞内に保持されているプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ抽出液の２６０ｎｍの波長の吸光度を測定してＤＮＡ濃度の算出を行い、算出されたＤＮＡ濃度をもとに、１５ｎｇ分の抽出ＤＮＡを０．５質量％のアガロースからなるゲルを用いて電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

この結果、１２個のコロニーのうち、３個（Ｎｏ．６、８、１０）では、５０断片の連結体の増幅産物（ギャップやニックのない２本鎖環状ＤＮＡ）のバンドが検出された。次いで、この３つのコロニーと、５０断片の連結体の増幅産物のバンドが確認できなかったコロニー（Ｎｏ．１２）について、１５ｎｇ分の抽出ＤＮＡを１質量％のアガロースからなるゲルを用いて電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。染色結果を図２４に示す。図中、「ＭＫ３」はＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「ＲＣＲ」は、ＲＣＲ反応後の溶液を泳動したレーンを示す。また、「ｇｅｎｏｍｅ」は大腸菌のゲノムＤＮＡのバンドを指し、「＊」は５０断片の連結体の増幅産物のバンドを指す。図２４に示すように、Ｎｏ．６、８、１０のコロニーを構成する形質転換体では、大腸菌のゲノムＤＮＡと５０断片の連結体の増幅産物のバンドしか検出されなかった。

次いで、Ｎｏ．６、８、１０のコロニーの形質転換体から得られた、５０断片が連結した環状連結体と想定される標的ＤＮＡの配列構造について調べた。この５０断片の環状連結体は、その塩基配列から、制限酵素ＰｃｉＩで消化すると、１０，８４９ｂｐ、８，１２１ｂｐ、４，７７１ｂｐ、及び３，６９４ｂｐの計４断片が得られ、制限酵素ＮｃｏＩで消化すると、１１，３０８ｂｐ、７，７４１ｂｐ、４，４０７ｂｐ、２，５９９ｂｐ、１，１２３ｂｐ、及び２５７ｂｐの計６断片が得られる。そこで、各形質転換体から得られた環状連結体と想定される標的ＤＮＡをＰｃｉＩ又はＮｃｏＩで消化し、そのバンドパターンを調べた。

具体的には、０．０３ｎｇ／μＬの抽出ＤＮＡ０．５μＬを、ＲＣＲ増幅反応液４．５μＬに添加して反応溶液を調製した。当該反応溶液を、３０℃で１６時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行った。続いて、各ＲＣＲ増幅反応物５μＬをそれぞれ、ＲＣＲ反応バッファー（表１の反応バッファー）２０μＬに希釈した後、３０℃で３０分間再インキュベートを行った。再インキュベート終了後の反応混合物２５μＬを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２質量％のドデシル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍＬのプロネースＫ、１０質量％のグリセロール、０．２質量％のブロモフェノールブルーを含む溶液２５μＬに加えて、３７℃で３０分間インキュベートし、ＲＣＲ反応タンパク質群を分解した。インキュベート後の溶液に等量のＰＣＩ溶液（ＴＥ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、ボルテックスミキサーを用いて激しく混合した後、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。分離後の水層を、ＭＦ（商標）−Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｙｐｅ：０．０５μｍ ＶＭＷＰ、メルク社製）を用いてＴＥバッファーで透析した。透析後のＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、当該ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍの波長の吸光度に基づいて算出した。４０ｎｇの透析後ＤＮＡ、１×のＮＥＢｕｆｆｅｒ３、及び０．１質量％ＢＳＡを含む溶液４．５μＬを調整し、その溶液に１０Ｕ／μＬの制限酵素ＰｃｉＩ（タカラバイオ社製）、１０Ｕ／μＬの制限酵素ＮｃｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）、又は水を０．５μＬ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の反応溶液２．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２５に示す。図中、「ＭＫ３」及び「ＭＫ２」はそれぞれＤＮＡラダーマーカーを泳動したレーンを示し、「ＲＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ」は、ＲＣＲ反応後の溶液を泳動したレーンを示す。「６」、「８」、「１０」は、それぞれ、Ｎｏ．６、８、１０のコロニーの形質転換体の抽出ＤＮＡのＲＣＲ増幅反応物を泳動したレーンを示す。「−」は酵素処理なしのサンプルを泳動したレーンを示す。この結果、Ｎｏ．６、８、１０の形質転換体に含まれている環状ＤＮＡは、ＰｃｉＩとＮｃｏＩの消化物のバンドパターンから、目的の５０断片を連結した環境連結体であることが確認された。

［実施例２２］
相同領域が、３’突出末端又はその近傍に存在するＤＮＡ断片を含む直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを併用する効果を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ｐＵＣ４ＫＳｃｅＩを制限酵素ＰＩ−Ｓｃｅ Iで消化した、末端が３’突出末端である直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片（ｐＵＣ４ＫＳｃｅＩフラグメント）と、この直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片と連結して環状の連結体を構成するように設計した直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片（Ｋｍ−ｏｒｉＣ ＰＩ−ＳｃｅＩ）と、を用いた。ｐＵＣ４ＫＳｃｅＩは、ｐＵＣ４Ｋプラスミドを鋳型に、プライマーペア（ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ（配列番号６３）及びＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣ（配列番号６４））を用いてＰＣＲ増幅した４ｋｂｐの断片と５００ｂｐのＰＩ−ＳｃｅＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ（配列番号６５）を、ＲＡにより連結環状化して調製したプラスミドである。また、Ｋｍ−ｏｒｉＣ ＰＩ−ＳｃｅＩは、Ｋｍ−ｏｒｉＣ（ＤＣＷ３５）断片を鋳型にプライマーペア（ｔｇｃｇｔａａｇｃｇｇｇｇｃａｃａｔｔｔｃａｔｔａｃｃｔｃｔｔｔｃｔｃｃｇｃａｃＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣ（配列番号６６）及びｔａａｔｇｔａｔａｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｔａｔｃｔａｔｇｔｃｇｇｇｔｇｃＴＡＡＣＧＣＧＧＴＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴ（配列番号６７））を用いて増幅したＰＣＲ断片である。

また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体を用い、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIを、それぞれ用いた。

具体的には、まず、各１．２８ｎＭのｐＵＣ４ＫＳｃｅＩフラグメント及びＫｍ−ｏｒｉＣ ＰＩ−ＳｃｅＩ、１．５μＭのＲｅｃＡのＦ２０３Ｗ変異体、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、並びに、０Ｕ／μＬ（無添加）、０．３Ｕ／μＬ、０．６Ｕ／μＬ、若しくは１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼIからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で６０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で５分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２６に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１．２８ｎＭのｐＵＣ４ＫＳｃｅＩフラグメント及びＫｍ−ｏｒｉＣ ＰＩ−ＳｃｅＩを含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。図中、「ｐＵＣ４ＫＳｃｅＩ」がｐＵＣ４ＫＳｃｅＩフラグメントのバンド、「Ｋｍ−ｏｒｉＣ」がＫｍ−ｏｒｉＣ ＰＩ−ＳｃｅＩのバンド、「Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｔ」がｐＵＣ４ＫＳｃｅＩフラグメントとＫｍ−ｏｒｉＣ ＰＩ−ＳｃｅＩが連結した連結体のバンドである。この結果、エキソヌクレアーゼIの添加量が多いサンプルほど、より多量の連結体が得られた。これは、エキソヌクレアーゼIIIは、３’突出末端を標的とし難いが、エキソヌクレアーゼIが３’突出末端を消化してエキソヌクレアーゼIIIが標的としやすい５’突出末端とするために、連結効率が高まるためと考えられる。

［実施例２３］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと２種類の１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとを併用する効果を調べた。

連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３（配列番号３４〜配列番号４３）を用いた。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質として、大腸菌ＲｅｃＡの野生型を用い、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼIIIを、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼTを、それぞれ用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３、１μＭのＲｅｃＡの野生型、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼI、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０Ｕ／μＬ（無添加）、０．０５Ｕ／μＬ、０．１５Ｕ／μＬ、若しくは０．５Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼTからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２７に示す。この結果、連結反応を行った全てのサンプルで１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。また、２〜９断片が連結した連結体の量は、エキソヌクレアーゼTの添加量依存的に少なくなっていた。これらの結果から、エキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼTの添加により、多数の連結断片の連結反応が促進されることが判明した。

［実施例２４］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質と３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質としてバクテリオフォージＲｅｃＡホモログであるＴ４ファージＵｖｓＸを用いた。連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３（配列番号３４〜配列番号４３）を用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３、８、３０、若しくは８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼI、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０μＭ（無添加）、１μＭ、若しくは３μＭのＵｖｓＸ又は１μＭのＲｅｃＡの野生型（対照）からなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２８に示す。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、各１ｎＭのＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３を含有する溶液２μＬを泳動したレーンを示す。この結果、１μＭ又は３μＭのＵｖｓＸと８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIIIとの存在下で連結反応を行ったサンプルでは、１μＭのＲｅｃＡの野生型と８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIIIとの存在下で連結反応を行ったサンプルと同様に、１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。これらの結果から、バクテリオフォージＲｅｃＡホモログであるＵｖｓＸを用いた場合でも、ＲｅｃＡを用いた場合と同様に高い連結効率で連結反応が行えることが確認された。

［実施例２５］
２種類以上の直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を、ＵｖｓＸと３’→５’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、Ｔ４ファージＵｖｓＹを併用する効果を調べた。連結する直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３（配列番号３４〜配列番号４３）を用いた。

具体的には、まず、各１ｎＭのＤＣＷ３４〜ＤＣＷ４３、３μＭのＵｖｓＸ、６０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼI、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１００μＭのＡＴＰ、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、１０容量％のＤＭＳＯ、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、４ｍＭのクレアチンリン酸、及び、０μＭ（無添加）、０．１μＭ、０．３μＭ、若しくは１μＭのＵｖｓＹからなる反応溶液を調製した。次いで、これらの反応溶液を、４２℃で３０分間インキュベートして連結反応を行った後、６５℃で２分間インキュベートして熱処理し、さらにその後氷上で急冷した。熱処理・急冷後の反応溶液のうち１．５μＬをアガロース電気泳動し、分離したバンドをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色した。

染色結果を図２９に示す。この結果、連結反応を行った全てのサンプルで１０断片全部が連結した連結体のバンドが確認された。ＵｖｓＹの添加量依存的に、１０断片全部が連結した連結体の量が多くなり、２〜９断片が連結した連結体の量は少なくなっていた。これらの結果から、ＵｖｓＸとＵｖｓＹを併用することにより、エキソヌクレアーゼIIIとＵｖｓＸによる連結反応が促進されることが判明した。

１ａ，１ｂ…直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片、Ｈ…相同領域、２…３’→５’エキソヌクレアーゼ、３…ＲｅｃＡファミリー組換え酵素蛋白質。

Claims (25)

1. ２種類以上のＤＮＡ断片と、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、を含む反応溶液を調製し、
   前記反応溶液中で、前記２種類以上のＤＮＡ断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得る、ＤＮＡの産生方法。
2. 前記反応溶液が、さらに、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含む、請求項１に記載のＤＮＡの産生方法。
3. 前記反応溶液が、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、請求項１又は２に記載のＤＮＡの産生方法。
4. 前記再生酵素がクレアチンキナーゼであり、前記基質がクレアチンリン酸である、
   前記再生酵素がピルビン酸キナーゼであり、前記基質がホスホエノールピルビン酸である、
   前記再生酵素がアセテートキナーゼであり、前記基質がアセチルリン酸である、
   前記再生酵素がポリリン酸キナーゼであり、前記基質がポリリン酸である、又は
   前記再生酵素がヌクレオシドジフォスフェートキナーゼであり、前記基質がヌクレオシド三リン酸である、請求項３に記載のＤＮＡの産生方法。
5. 前記２種類以上のＤＮＡ断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液は、マグネシウムイオン源濃度が０．５〜１５ｍＭであり、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の濃度が１〜１０００μＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
6. 前記２種類以上のＤＮＡ断片を連結させる反応を、２５〜４８℃の温度範囲内で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
7. ７個以上のＤＮＡ断片を連結させた直鎖状又は環状のＤＮＡを得る、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
8. 前記反応溶液は、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
9. 前記反応溶液は、ポリエチレングリコール、アルカリ金属イオン源、及びジチオスレイトールからなる群より選択される１種以上を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
10. 前記ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質がｕｖｓＸであり、前記反応溶液はさらにｕｖｓＹを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
11. 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、前記ＤＮＡ断片の末端又はその近傍に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
12. 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、１０ｂｐ以上５００ｂｐ以下の長さである、請求項１１に記載のＤＮＡの産生方法。
13. 前記２種類以上のＤＮＡ断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液が、モル濃度が互いに等しい２種類以上のＤＮＡ断片を含有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
14. 連結により得られた直鎖状又は環状のＤＮＡ中のギャップ及びニックをギャップリペア酵素群により修復する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
15. 連結により得られた直鎖状又は環状のＤＮＡを５０〜７０℃で熱処理し、続いて１０℃以下に急冷した後、ギャップリペア酵素群により修復する、請求項１４に記載のＤＮＡの産生方法。
16. ギャップ及びニックが修復された直鎖状又は環状の２本鎖ＤＮＡを増幅させる、請求項１４又は１５に記載のＤＮＡの産生方法。
17. 連結により得られたＤＮＡが直鎖状であり、
    当該直鎖状ＤＮＡを直接鋳型として用いてＰＣＲを行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
18. 連結により得られたＤＮＡが、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含む環状ＤＮＡであり、
    当該環状ＤＮＡと、環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群と、岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群と、２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群と、ｄＮＴＰと、を含む反応混合物を形成し、形成された反応混合物を等温条件下でインキュベートすることにより、前記環状ＤＮＡ中のギャップ及びニックの修復、並びに増幅を行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
19. 連結により得られたＤＮＡを、予め５０〜７０℃で熱処理し、続いて１０℃以下に急冷した後に前記反応混合物を形成させる、請求項１８に記載のＤＮＡの産生方法。
20. 連結により得られた直鎖状又は環状のＤＮＡを微生物に導入し、当該微生物内で、前記ＤＮＡ中のギャップ及びニックが修復された２本鎖ＤＮＡを増幅させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡの産生方法。
21. ２種類以上のＤＮＡ断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のＤＮＡを得るためのキットであって、
    ＲｅｃＡファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状２本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼと、を含むＤＮＡ断片連結用キット。
22. さらに、１本鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含む、請求項２１に記載のＤＮＡ断片連結用キット。
23. さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素、及びその基質を含む、請求項２１又は２２に記載のＤＮＡ断片連結用キット。
24. さらに、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される１種以上を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片連結用キット。
25. さらに、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ポリエチレングリコール、ジチオスレイトール、及び緩衝液からなる群より選択される１種以上を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片連結用キット。