CN114606575A - 组合物及文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组合物及文库构建方法。本发明通过在连接反应体系中引入增强剂，有效提升了连接效率，同时应用于核酸文库构建中，接头二聚体残留低，显著提升了测序有效数据量含量，减少了数据的浪费，一定程度上降低了测序成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子扩增技术领域，具体而言，涉及一种组合物及文库构建方法。
背景技术
连接反应是核酸分子DNA或RNA的两端实现连接，例如平末端连接或粘性末端连接，通常连接反应过程需要连接酶的催化。连接反应广泛运用于分子克隆或检测中，例如在高通量测序文库构建上，通过连接反应将核酸分子与测序接头进行连接。因此，提高连接反应效率，增加文库浓度非常有意义。此外，目前文库构建方法均采用过量的接头序列和目的片段，比例通常在100-400倍不等，过量的接头序列容易引起接头自身连接形成接头二聚体，因此，降低接头自连，提高有效数据量有很大益处。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明意外地发现，连接反应中添加聚蔗糖和DMSO，能够实现以下至少一个效果：提高连接效率，增加文库浓度，接头二聚体含量低、测序数据量高。
本发明具有以下至少一种技术方案：
本发明提供了一种用于核酸连接反应的组合物，包括聚蔗糖和DMSO。
在一些实施方式中，上述组合物还包括丙二醇。
在一些实施方式中，上述的丙二醇选自1,3-丙二醇、1,2-丙二醇中的至少一种。
在一些实施方式中，连接反应体系中丙二醇的体积百分比为1-5％。
在一些实施方式中，连接反应体系中聚蔗糖的体积百分比为5-15％。
在一些实施方式中，聚蔗糖的平均分子量为70000-400000。
在一些实施方式中，聚蔗糖选自Ficoll400或Ficoll70。
在一些实施方式中，连接反应体系中DMSO的体积百分比为2-20％。
在一些实施方式中，上述的组合物用于核酸文库构建的连接反应阶段。
在一些实施方式中，上述的组合物还包括连接酶。
在一些实施方式中，上述连接酶为DNA连接酶。
DNA连接酶选自T3 DNA连接酶，T4 DNA连接酶，T7 DNA连接酶，Taq DNA连接酶，
DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶中的至少一种。
本发明还提供了一种构建核酸文库的试剂盒，包括上述任一项的组合物。
在一些实施方式中，上述试剂盒还包括接头序列、连接反应缓冲液中的至少一种。
本发明还提供了一种核酸连接方法，包括：将上述的组合物与核酸片段混合，在允许连接的条件下进行连接。
本发明还提供了一种构建核酸文库的方法，包括使用上述的组合物、接头序列和连接反应缓冲液进行接头连接反应的步骤。
在接头连接反应前还包括对核酸片段进行末端修复和加A步骤。
在一些实施方式中，上述在接头连接反应后还包括PCR富集步骤。
在一些实施方式中，上述在接头连接反应后PCR富集前，构建核酸文库的方法还包括对纯化步骤。
在一些实施方式中，上述纯化的步骤包括磁珠纯化的步骤。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种用于核酸连接反应的组合物，包括聚蔗糖(Ficoll)和DMSO(二甲基亚砜)。本发明通过在连接反应体系中添加上述组合物，有效提升了连接效率；而接头二聚体含量低，进而提升了测序有效数据量，减少了数据的浪费，一定程度上降低了测序成本。
在一些实施方式中，上述组合物还包括丙二醇。丙二醇的加入可以在一定程度上进一步提高连接效率，提高文库浓度。
在一些实施方式中，上述丙二醇选自1,3-丙二醇、1,2-丙二醇中的至少任意一种。
在一些实施方式中，连接反应体系中丙二醇的体积百分比为1-5％；例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5、4％、4.5％或5％，但不限于此。
在一些实施方式中，连接反应体系中所述聚蔗糖的体积百分比为5-15％；例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，但不限于此。
在一些实施方式中，上述聚蔗糖的平均分子量为70000-400000；例如可以是70000、100000、150000、200000、300000、400000，但不限于此。
在一些实施方式中，上述聚蔗糖例如为Ficoll400或Ficoll70。其中，Ficoll400的平均分子量为400000，Ficoll70的平均分子量为70000。
在一些实施方式中，连接反应体系中所述DMSO的体积百分比为2-20％；例如可以是2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％，但不限于此。
需要说明的是，连接反应体系中含丙二醇、聚蔗糖或DMSO的体积浓度仅仅是溶液形式的添加量，在其他实施方式中，等同换算的摩尔数、质量份数、干粉形式的添加比例均在本发明的保护范围内。
在一些实施方式中，组合物用于核酸文库构建的连接反应阶段。
在一些实施方式中，组合物还包括连接酶。
在一些实施方式中，上述连接酶为DNA连接酶。
DNA连接酶选自T3 DNA连接酶，T4 DNA连接酶，T7 DNA连接酶，Taq DNA连接酶，
DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶中的至少一种。
连接反应体系中连接酶的添加量为0.006-120单位/μL。在其他实施方式中，上述连接酶的添加量可以根据实际连接的需求进行添加。
一种连接反应缓冲液，包括上述任意一些实施方式中定义的组合物和缓冲成分。
一种构建核酸文库的试剂盒，其包括上述任意一些实施方式中的组合物。
在一些实施方式中，上述试剂盒还包括上述的接头序列、连接反应缓冲液中的至少任意一种。
其中，接头序列与测序平台相适应。在一些实施方式中，例如illumina平台，接头序列可以是U型接头或者Y型接头。
在一些实施方式中，接头序列的添加量为1-50μM。
在一些实施方式中，连接反应缓冲液包括缓冲成分、ATP、镁离子等。在一些实施方式中，连接反应缓冲液使用10倍浓度的。在一些实施方式中，ATP的工作浓度为1-10mM。在一些实施方式中，缓冲成分可以是Tris-HCl、PB等，例如其工作浓度可以是10-100mM。在一些实施方式中，镁离子的工作浓度可以是5-20mM。在一些实施方式中，连接反应缓冲液还可以包括DTT，例如其工作浓度可以是5-20mM。
在其他实施方式中，连接反应缓冲液可以是市售的连接反应缓冲液，例如选自Fapon两步法建库试剂盒(货号NK007)中的连接反应缓冲液、Thermo Fisher的建库试剂盒中的连接反应缓冲液以及NEB试剂盒中的连接反应缓冲液。
一种核酸连接方法，包括将以上任一些实施方式的组合物与核酸片段混合，在允许连接的条件下进行连接。
上述允许连接的条件包括连接的温度、连接反应的时间，例如在4-50℃下连接5-20min。
一种构建核酸文库的方法，其包括使用以上任一些实施方式的组合物、接头序列和连接反应缓冲液进行接头连接反应的步骤。
在一些实施方式中，接头连接反应的温度为4-50℃，接头连接反应的时间为5-20min；在一些实施方式中，上述接头连接反应的温度为4-25℃，接头连接反应的时间为15-20min。
接头连接反应的温度和时间取决于连接酶活性的最佳温度。对于T3 DNA连接酶，T4 DNA连接酶，T7 DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，优选地，连接酶活性的最佳温度为4-25℃。
在一些实施方式中，在接头连接反应前还包括对核酸片段进行末端修复和加A步骤。
根据不同的文库构建目的获得待用核酸片段，对基因组片段化是获取核酸片段的形式之一。在一些实施方式中，片段化可以是机械破碎、化学剪切或者酶促法。机械破碎是通过超声波剪切、雾化力、超声处理、流体动力剪切来实现。在一种实施方式中，DNA的特定中值片段长度可以根据制造商的说明书通过超声剪切，例如通过使用仪器通过自适应聚焦声学(AFA)TM来制备。在一些实施方案中，片段化是酶促的。酶促片段化通过核酸内切酶消化DNA来实现。优选地，片段化也可以通过使用本领域技术人员已知的转座酶来进行。当将酶用于断裂反应时，可以通过加热使断裂步骤失活。
在一些实施方式中，在接头连接反应后还包括PCR富集步骤，得到DNA文库。
在一些实施方式中，在接头连接反应后PCR富集前，构建核酸文库的方法还包括对纯化步骤。
在一些实施方式中，纯化的步骤包括磁珠纯化的步骤。例如采用AMPure XP磁珠纯化回收。
以上实施方式，可以取得的有益效果包括：
本发明提供了一种用于核酸连接反应的组合物、试剂盒、核酸连接方法及文库构建方法。本发明通过在连接反应体系中引入聚蔗糖和DMSO作为增强剂，有效提升了连接效率，同时应用于核酸文库构建中，接头二聚体残留低，显著提升了测序有效数据量含量，减少了数据的浪费，一定程度上降低了测序成本。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例以Fapon两步法建库试剂盒(货号NK007)为基础，以人基因组DNA作为建库起始模板进行DNA文库的构建及文库质检，具体实验步骤如下：
(1)超声打断：使用Qubit荧光计对人基因组进行定量，取1μg样本进行超声打断处理，然后用超声破壁清洗器(KQ-50E型超声波清洗器)将样品破碎，打断条件遵循表1进行，本实施例预期得到的目的片段长度为500bp。
超声结束后，取2μl破碎后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果显示破碎DNA的片段大小在300-600bp之间，符合目的片段的大小要求。然后，用AMPure XP磁珠对破碎后的DNA进行纯化，最后用40μl的无核酸酶的水进行溶解。
表1 超声打断参数表。
| 预期片段 | 水深 | 发射功率 | 温度 | 时间 |
| 500bp | 5.5cm | 50W | 8-15℃ | 120s |
| 300bp | 5.5cm | 50W | 8-15℃ | 360s |
| 230bp | 5.5cm | 50W | 8-15℃ | 480s |
(2)末端修复加A：使用Fapon两步法建库试剂盒标准建库流程进行末端修复加A处理，具体反应体系如下表2所示：
表2 末端修复的体系添加量数据表。
| 试剂 | 体积 |
| 超声打断DNA | 1μl(50ng) |
| 末端修复加A缓冲液 | 10μl |
| 末端修复加A酶Mix | 5μl |
| 总计 | 补水至50μl |
反应程序如下：20℃处理30分钟，65℃处理30分钟，保持4℃。
(3)接头连接：按下表3所示的体系进行反应体系的配制，再向连接反应体系中加入不同浓度的增强剂(添加体积为X)。接头连接的反应程序如下：20℃下处理15分钟，保持4℃。
增强剂也可以提前加入到连接反应缓冲液中。本实施例中接头序列采用的是Illumina的Y接头。
表3 接头连接的反应体系添加量数据表。
| 试剂 | 体积 |
| Y接头(15μM) | 1μl |
| 连接反应缓冲液 | 10μl |
| T4 DNA连接酶 | 6μl |
| 增强剂 | Xμl |
| 上一步反应液 | 50μl |
| 总计 | 补水至100μl |
(4)用AMPure XP磁珠进行接头连接产物的纯化回收：向步骤(3)获得的接头连接产物中加入等体积的磁珠，混合后在串磁力架上进行静置纯化，然后用22μl的无核酸酶水进行溶解，得到第一次纯化的连接产物；
(5)PCR扩增：按照表4所示的反应体系进行连接文库的扩增。
表4 PCR扩增体系。
| 试剂 | 体积 |
| 2×HIFI PCR Mix | 25μl |
| 接头连接文库 | 20μl |
| P5+P7扩增引物 | 5μl |
| 总计 | 补水至50μl |
扩增反应程序如下：步骤1：98℃变性30s；步骤2：98℃变性10s；步骤3：65℃退火30s；步骤4：72℃延伸30s；步骤5：重复步骤2-4，6-9次；步骤6：72℃延伸1min；步骤7：4℃保持。
(6)将PCR扩增后的产物进行纯化：扩增后的产物使用AMPure XP磁珠进行纯化，然后用22μl的无核酸酶水进行溶解，得到最终纯化的连接产物。
(7)文库质检：使用Qubit定量检测试剂对扩增完成后的产物进行定量分析，同时在Qsep毛细管电泳分析检测器对上述建库产物进行片段大小分布分析，考察不同大小插入片段占整个连接文库的比例数据。
批次1
实施例2
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400(添加10μl)和6％DMSO(添加6μl)。
实施例3
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll70和6％DMSO。
实施例4
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400、6％DMSO和2％1,3-丙二醇。
对比例1
与实施例1的区别在于：步骤(3)中无增强剂，作为对照组。
对比例2
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％PEG4000。
对比例3
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：6％DMSO。
对比例4
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：2％1,3-丙二醇。
对比例5
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：5％甘油。
对比例6
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的摩尔浓度：1M甜菜碱。
对比例7
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400。
对比例8
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll70。
对比例9
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400和2％1,3-丙二醇。
对比例10
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：6％DMSO和2％1,3-丙二醇。
对比例11
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％PEG4000和6％DMSO。
对比例12
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％PEG4000+2％1,3-丙二醇。
对比例13
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％PEG4000和10％Ficoll400。
实验例1
发明人分别对实施例2-4以及对比例1-13进行了文库浓度的测试。采用实施例1的方法进行建库，使用Qubit dsDNA HS试剂盒定性分析上述对比例和实施例的文库浓度。测试结果参照表5所示。
表5 不同对比例和实施例的文库浓度。
| 组别 | 文库浓度ng/μl |
| 对比例1 | 6.5 |
| 对比例2 | 37.9 |
| 对比例3 | 18.3 |
| 对比例4 | 13.8 |
| 对比例5 | 6.7 |
| 对比例6 | 5.4 |
| 对比例7 | 22.6 |
| 对比例8 | 20.4 |
| 对比例9 | 30.1 |
| 对比例10 | 28.2 |
| 对比例11 | 42 |
| 对比例12 | 38 |
| 对比例13 | 41.5 |
| 实施例2 | 48.3 |
| 实施例3 | 46.5 |
| 实施例4 | 50.3 |
由表5可知，PEG对连接酶具有良好的促进连接效果(参照对比例2及对比例11-13)，Ficoll(聚蔗糖)和DMSO联用的连接效率显著高于二者单用时的连接效果(参照实施例2-4所示)，且连接效率也优于PEG。此外，当1,3-丙二醇与Ficoll(聚蔗糖)和DMSO联用时(参照实施例4所示)，扩增获得的文库浓度最高，即促进连接效果更优。
批次2
发明人进行了第二批次的实验。
实施例5
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400和2％DMSO。
实施例6
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400和10％DMSO。
实施例7
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400和20％DMSO。
实施例8
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400、6％DMSO和1％1,3-丙二醇。
实施例9
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400、6％DMSO和2％1,3-丙二醇。
实施例10
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400、6％DMSO和5％1,3-丙二醇。
对比例14
与实施例1的区别在于：步骤(3)中无增强剂，作为对照组。
对比例15
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％PEG4000。
对比例16
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：5％Ficoll400。
对比例17
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：10％Ficoll400。
对比例18
在实施例1基础上，提供了具体增强剂及其在反应体系中的体积浓度：15％Ficoll400。
实验例2
本实验例针对批次2中各处理组构建的文库进行扩增产物浓度的检测，使用QubitdsDNA HS试剂盒分析了不同浓度下的聚蔗糖、DMSO、1,3-丙二醇对连接文库的促进效果。
表6 不同浓度的聚蔗糖、DMSO、1,3-丙二醇对扩增产物浓度的影响。
| 组别 | 文库浓度 |
| 对比例14 | 4.42 |
| 对比例15 | 40.1 |
| 对比例16 | 13.8 |
| 对比例17 | 19.8 |
| 对比例18 | 20.6 |
| 实施例5 | 47.9 |
| 实施例6 | 51 |
| 实施例7 | 50 |
| 实施例8 | 51.3 |
| 实施例9 | 52.2 |
| 实施例10 | 52.9 |
由表6可知，聚蔗糖在5-15％体积浓度下配合2-20％的DMSO，以及1-5％浓度的1,3-丙二醇，能显著提升连接酶的连接效果且显著优于PEG。
实验例3
现有的连接体系中为了增强连接效率，往往存在有较高的PEG含量(如10％)，会导致接头二聚体在后续磁珠纯化过程中往往不易纯化干净，使得连接文库中存在较高浓度的接头二聚体残留。为此本发明方法进一步测试接头二聚体含量。在Qsep毛细管电泳分析检测器上分析对比例14-15以及实施例2和实施例9产物中接头二聚体含量，本实验例中分析的是100-150bp的片段含量。
表7 不同处理组的产物中接头二聚体含量表。
| 组别 | 接头二聚体含量 |
| 对比例14 | 0.09％ |
| 对比例15 | 0.89％ |
| 实施例2 | 0.06％ |
| 实施例9 | 0.08％ |
由表7可知，PEG虽然有极好的连接增强效率，但PEG会导致接头二聚体含量高，从而影响测序质量和成本(对比例15)；而本发明提供的方案能够获得比PEG更优的增强连接效率，同时接头二聚体含量非常低，具有非常好的应用优势(实施例2和实施例9)。
通过上述实验可以得出：聚蔗糖和DMSO组合为增强剂可以显著提升连接酶的连接效果，并且优于PEG的连接效果。而当1,3-丙二醇与上述组合配合时，可以进一步地提升连接酶的连接效果，且能显著降低接头二聚体的含量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于核酸连接反应的组合物，包括聚蔗糖和DMSO。
2.根据权利要1所述的组合物，其特征在于，还包括丙二醇；
优选地，所述丙二醇选自1,3-丙二醇、1,2-丙二醇中的至少一种；
优选地，连接反应体系中所述丙二醇的体积百分比为1-5％。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，连接反应体系中所述聚蔗糖的体积百分比为5-15％；
优选地，所述聚蔗糖的平均分子量为70000-400000；
优选地，所述聚蔗糖选自Ficoll400或Ficoll70。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，连接反应体系中所述DMSO的体积百分比为2-20％。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括连接酶；
优选地，所述连接酶为DNA连接酶；
优选地，所述DNA连接酶选自T3 DNA连接酶，T4 DNA连接酶，T7 DNA连接酶，Taq DNA连接酶，
连接酶，大肠杆菌DNA连接酶中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于核酸文库构建的连接反应阶段。
7.一种构建核酸文库的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的组合物；
优选地，所述试剂盒还包括接头序列、连接反应缓冲液中的至少一种。
8.一种核酸连接方法，包括：将权利要求1-5任一项所述的组合物与核酸片段混合，在允许连接的条件下进行连接。
9.一种构建核酸文库的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-5任一项所述的组合物、接头序列和连接反应缓冲液进行接头连接反应的步骤。
10.根据权利要求9所述的构建核酸文库的方法，其特征在于，
在接头连接反应前还包括对核酸片段进行末端修复和加A步骤；
优选地，在接头连接反应后还包括PCR富集步骤；
优选地，在接头连接反应后PCR富集前，所述构建核酸文库的方法还包括对纯化步骤；
优选地，所述纯化的步骤包括磁珠纯化的步骤。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024138729A1 (zh) * | 2022-12-30 | 2024-07-04 | 深圳华大生命科学研究院 | Dna连接缓冲液及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN87105787A (zh) * | 1986-08-22 | 1988-05-11 | 塞特斯公司 | 纯化的热稳定性酶以及用其进行扩增、检测和/或克隆核酸顺序的方法 |
| US20120283144A1 (en) * | 2011-05-06 | 2012-11-08 | New England Biolabs, Inc. | Ligation Enhancement |
| CN103930570A (zh) * | 2011-09-16 | 2014-07-16 | 莱克斯奥根有限公司 | 核酸转录方法 |
| CN110408681A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-11-05 | 杭州众测生物科技有限公司 | 增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂 |
| CN111183222A (zh) * | 2017-07-05 | 2020-05-19 | 奥利希罗基因组学有限公司 | Dna的产生方法及dna片段连接用试剂盒 |
-
2020
- 2020-12-03 CN CN202011416103.8A patent/CN114606575A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN87105787A (zh) * | 1986-08-22 | 1988-05-11 | 塞特斯公司 | 纯化的热稳定性酶以及用其进行扩增、检测和/或克隆核酸顺序的方法 |
| US20120283144A1 (en) * | 2011-05-06 | 2012-11-08 | New England Biolabs, Inc. | Ligation Enhancement |
| CN103930570A (zh) * | 2011-09-16 | 2014-07-16 | 莱克斯奥根有限公司 | 核酸转录方法 |
| CN111183222A (zh) * | 2017-07-05 | 2020-05-19 | 奥利希罗基因组学有限公司 | Dna的产生方法及dna片段连接用试剂盒 |
| CN110408681A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-11-05 | 杭州众测生物科技有限公司 | 增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BARBARA H.PHEIFFER，STEVEN B.ZIMMERMAN: "Polymer-stimulated pition: enhanced blunt- or cohesive-end ligation of DNA or deoxyriboofigonucleotides by T4 DNA ligase in polymer solutions", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, 25 November 1983 (1983-11-25), pages 7853 - 7871 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024138729A1 (zh) * | 2022-12-30 | 2024-07-04 | 深圳华大生命科学研究院 | Dna连接缓冲液及其应用 |
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