CN109689872B - 一种dna末端修复与加a的方法 - Google Patents
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Abstract
一种DNA末端修复与加A的方法,该方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’‑5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP。所述方法能够在同一个反应体系中实现DNA末端修复与加A反应,简化酶反应和纯化步骤,提高起始DNA转化成可连接接头DNA的效率,降低对起始DNA总量的要求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,尤其涉及文库构建技术领域,特别涉及一种DNA末端修复与加A的方法和一种DNA打断、末端修复与加A的方法,以及基于此的文库构建方法。
背景技术
随着新一代测序技术的蓬勃发展,高通量测序技术被广泛应用于生物、医药等行业,推动着生物分子机制研究和生物技术的发展。基于高通量测序技术的文库构建方法也在不断改进和优化,以满足不同样品量、不同物种和不同测序目的的要求。一般而言,高通量测序技术的文库构建的核心步骤包括:将基因组DNA片段化,酶反应修复DNA损伤,在DNA双末端连接测序接头,扩增连有接头的目的DNA,得到用于测序的文库。
现有的文库构建方法包括多个步骤,尤其是DNA打断、末端修复和加A在多个不同的步骤中完成,因此步骤繁琐、效率较低并且对起始量样本量的要求较高。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法,缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率成为高通量测序技术拓展应用领域的一大关键点。
此外,现有的文库构建方法,具体到DNA打断步骤也存在一些问题。常用的DNA打断方法是物理打断法和酶打断法。物理打断法以常用的Covaris打断仪为例。Covaris打断仪的工作原理是,利用声波打断DNA,整个过程需要将DNA置于低温水浴环境中,通过调整声波强度、时长和改变DNA接触的表面介质得到不同大小的DNA片段。这种方法的缺点有:第一,预冷打断仪耗时较长,一般至少需要30分钟;第二,不利于全自动化建库流水线的开发;第三,DNA起始量要求高(至少100ng),不利于微量建库的开发。酶打断法以NEB公司的打断试剂盒为例。该试剂盒使用两种DNA内切酶的混合液,通过非限制性DNA内切酶在双链DNA上产生缺口,另一种DNA内切酶把缺口的对应链切开从而实现片段化。虽然酶打断法也能有效地片段化基因组DNA,但是在低起始量时打断片段集中度差,且非限制性DNA内切酶有碱基偏好性,影响测序数据覆盖度的均一性。
发明内容
本发明提供一种DNA末端修复与加A的方法,该方法能够在同一个反应体系中实现DNA末端修复与加A反应,简化酶反应和纯化步骤,提高起始DNA转化成可连接接头DNA的效率,降低对起始DNA总量的要求。进一步,本发明提供一种DNA打断-末端修复-加A方法,该方法能够在同一个反应体系中实现DNA打断、末端修复与加A反应,更进一步简化酶反应和纯化步骤。本发明还提供一种DNA末端修复与加A的反应体系和试剂盒。
根据本发明的第一方面,本发明提供一种DNA末端修复与加A的方法,该方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP。
根据本发明的第二方面,本发明提供一种基于DNA末端修复与加A的文库构建方法,该方法包括如下步骤:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP;在上述反应体系中,直接加入接头和连接反应混合液,使上一步产生的3’A突出的双链DNA与上述接头连接。
根据本发明的第三方面,本发明提供一种DNA打断-末端修复-加A方法,该方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用非限制性DNA内切酶在DNA上形成切口或缺口,同时利用DNA聚合酶进行缺口平移或链置换并进行末端修复;在过量dATP存在下,利用DNA聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP。
根据本发明的第四方面,本发明提供一种DNA打断-末端修复-加A方法,该方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用打断酶随机打断DNA片段,同时利用DNA聚合酶进行末端修复;在过量dATP存在下,利用DNA聚合酶进行末端加dATP反应。
根据本发明的第五方面,本发明提供一种基于DNA打断-末端修复-加A的文库构建方法,该方法包括如下步骤:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用非限制性DNA内切酶在DNA上形成切口或缺口,同时利用DNA聚合酶进行缺口平移或链置换并进行末端修复;在过量dATP存在下,利用DNA聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP;在上述反应体系中,直接加入接头和连接反应混合液,使上一步产生的双链DNA与上述接头连接。
根据本发明的第六方面,本发明提供一种基于DNA打断-末端修复-加A的文库构建方法,该方法包括如下步骤:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用打断酶随机打断DNA片段,同时利用DNA聚合酶进行末端修复;在过量dATP存在下,利用DNA聚合酶进行末端加dATP反应;在上述反应体系中,直接加入接头和连接反应混合液,使上一步产生的双链DNA与上述接头连接。
根据本发明的第七方面,本发明提供一种DNA末端修复与加A的反应体系,该体系按照每50μL的体系中含有,物理打断DNA 1-100ng,T4 DNA聚合酶1.2-10U,Klenow大片段0-2U,T4多聚核苷酸激酶4-16U,Taq聚合酶1-4U,每种dNTP各0.02-0.2mM,额外的dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM;或者,该体系按照每50μL的体系中含有,血浆游离DNA或酶切打断DNA 1-100ng,T4 DNA聚合酶0-3U,Klenow大片段0-2U,T4多聚核苷酸激酶4-10U,Taq聚合酶1-2U,每种dNTP各0.02-0.2mM,额外的dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-10mM,条件是T4 DNA聚合酶和Klenow大片段的含量不同时为0。
根据本发明的第八方面,本发明提供一种DNA末端修复与加A的反应试剂盒,该试剂盒按照T4 DNA聚合酶1.2-10U,Klenow大片段0-2U,T4多聚核苷酸激酶4-16U,Taq聚合酶1-4U,每种dNTP各1-10nmol,额外的dATP 20-50nmol,以及Mg离子400-750nmol,形成用于稀释成50μL反应体系的试剂盒单位;或者,该试剂盒按照T4 DNA聚合酶0-3U,Klenow大片段0-2U,T4多聚核苷酸激酶4-10U,Taq聚合酶1-2U,每种dNTP各1-10nmol,额外的dATP 20-50nmol,以及Mg离子400-500nmol,条件是T4 DNA聚合酶和Klenow大片段的含量不同时为0,形成用于稀释成50μL反应体系的试剂盒单位。
根据本发明的第九方面,本发明提供一种DNA打断-末端修复-加A的反应体系,该体系按照每30μL的体系中含有,基因组DNA 5-100ng,NEB打断酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM;或者,该体系按照每30μL的体系中含有,基因组DNA 5-100ng,非限制性DNA内切酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM。
根据本发明的第十方面,本发明提供一种DNA打断-末端修复-加A的反应试剂盒,该试剂盒按照基因组DNA 5-100ng,NEB打断酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM,形成用于稀释成30μL反应体系的试剂盒单位;或者,该试剂盒按照基因组DNA 5-100ng,非限制性DNA内切酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM,形成用于稀释成30μL反应体系的试剂盒单位。
需要说明的是,本发明的试剂盒按照上述定义,并不意味着本发明的试剂盒局限于用于稀释成50μL或30μL反应体系的试剂盒,而是根据上述定义来确定本发明的试剂盒中各种组分的比例关系和浓度。本领域的技术人员可以根据上述用于稀释成50μL或30μL反应体系的试剂盒单位中各种组分的比例关系和浓度来平行地放大或者缩小试剂盒的容量大小,只要各种组分的比例关系和浓度与上述定义一致即可认为是本发明的试剂盒。上述试剂盒单位是人为定义的,本领域的技术人员可以理解,平行地放大或者缩小的试剂盒的容量均可以称为一个试剂盒单位。
附图说明
图1为本发明一个实施方案的基于BGISEQ-500/1000测序平台的末端修复-加A-加接头反应法(即图中“一管法”)的建库流程示意图;其中,1:起始DNA;2:末端修复和加A在同一反应体系中进行;3.1:采用PCR策略时,DNA两端加上鼓泡型接头(不含U碱基);3.2:采用PCR-free(无需PCR)策略时,DNA两端加上含U碱基的鼓泡型接头,同时进行USER处理,USER处理的加上接头的DNA 5’末端为磷酸基团,便于后续单链环化;4:纯化反应体系,去除接头污染;5:对于PCR建库策略,连接产物进行PCR扩增;对于PCR-free建库策略,连接产物直接用于单链环化;6:纯化PCR反应体系,去除引物二聚体污染;7:将PCR产物用于单链环化。
图2为本发明另一个实施方案的基于Illumina测序平台的末端修复-加A-加接头反应法的建库流程示意图;其中,1:起始DNA;2:末端修复和加A在同一反应体系中进行;3.1:采用PCR策略时,DNA两端加上不含标签序列的Y型接头;3.2:采用PCR-free策略时,DNA两端加上含标签序列的Y型接头;4:纯化反应体系,去除接头污染;对于PCR-free建库策略,纯化的连接产物经Q-PCR定量后可直接用于上机;5:对于PCR建库策略,连接产物进行PCR扩增;6:纯化PCR反应体系,去除引物二聚体污染,纯化的PCR产物经Q-PCR定量后可直接用于上机。
图3为本发明另一个实施方案的基于CG(Complete Genomics)测序平台的打断-末端修复-加A一步法的文库构建流程示意图;其中,1:非限制性DNA内切酶或打断酶与DNA聚合酶共同作用,使DNA片段化(即打断)并完成末端修复,并在3’末端加上腺苷酸脱氧核糖核酸(dATP);2:DNA片段连接鼓泡接头;3:对于PCR策略,PCR扩增加好鼓泡接头的DNA片段;4:对于PCR-free策略,USER酶切处理DNA片段;5:环化单链DNA产生构建的文库最终产物。
图4为本发明另一个实施方案的基于Illumina测序平台的打断-末端修复-加A一步法的文库构建流程示意图;其中,1:非限制性DNA内切酶或打断酶与DNA聚合酶共同作用,使DNA片段化(即打断)并完成末端修复,并在3’末端加上腺苷酸脱氧核糖核酸(dATP);2:DNA片段连接Y接头;3:PCR扩增加好接头的产物。
图5示出了本发明一个实施例的8例人血浆样品的PCR产物电泳图,PCR产物的片段大小在250bp左右,符合BGISEQ-500/1000测序平台的上机要求。
图6示出了本发明一个实施例的PCR-Free文库DNA纳米球电泳结果,样品大部分都在胶孔里,无法电泳出来,符合DNA纳米球在聚丙烯酰胺凝胶电泳时无法跑出胶孔的特点。
图7示出了本发明一个实施例的1例基因组样品的测序深度分布图,测序深度符合泊松分布,测序深度集中在30x左右,符合人基因组重测序的数据需求。
图8示出了本发明一个实施例的1例基因组样品的GC含量累积比例,虽然高GC含量的片段的覆盖度有所下降,但覆盖率接近1,说明大部分高GC含量的片段可以被检测到,所有不同GC含量的片段均一化后的覆盖度基本保持水平。
图9示出了本发明一个实施例的8例酶打断基因组样品的PCR产物电泳图,PCR产物的片段大小在250bp左右,符合BGISEQ-500/1000测序平台的上机要求。
图10示出了本发明一个实施例的2例酶打断基因组样品的PCR产物的bio-analysis 2100结果,PCR产物的片段大小在250bp左右。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
在本发明的一个技术方案中,提出了一种DNA末端修复与加A的方法,该方法能够实现DNA末端修复与加A在同一个反应体系(一管)中完成,并且可以直接在反应管中加入接头和连接反应混合液,进而实现一管式加接头。
根据本发明的一个技术方案,上述DNA末端修复与加A的方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP。
本发明的DNA末端修复与加A的方法得到的末端修复补平和加A的DNA产物可以应用于多种应用场景之中,最常见的应用是用于文库构建。采用本发明的DNA末端修复与加A反应法,能够实现低起始量打断样本或血浆游离DNA的快速建库,缩短文库制备的时间,降低文库制备的成本,提高文库的可用数据产出,并且不仅可应用到BGISEQ平台,也可推广到Illumina或其他利用3’T突出接头做为建库接头的测序平台。本发明中,3’T突出接头可以是鼓泡型接头、Y型接头、颈环型接头或其它任何3’T突出接头。
在本发明的另一个技术方案中,提出了一种DNA打断-末端修复-加A方法,该方法能够实现DNA打断、末端修复与加A在同一个反应体系(一管)中完成,并且可以直接在反应管中加入接头和连接反应混合液,进而实现一管式加接头。
下面将以不同的平台为例,并结合附图,详细说明本发明的技术方案。需要说明的是,以下涉及到的平台仅是示例性的,本发明并不局限于这些平台,而是可以应用于更广泛的平台上。并且本发明的技术方案也不局限于以下参考附图所说明的技术方案的细节上。
请参考图1,根据本发明的第一个实施方案,以BGISEQ-500/1000测序平台的文库构建为示例,本方案的文库构建过程具体步骤如下:
1、模板DNA的准备:用制备好的模板DNA进行建库反应,模板DNA包括但不限于血浆游离DNA、ChIP DNA、FFPE DNA、超声打断或酶切打断纯化好的基因组DNA或RNA反转录得到的cDNA(如图1中编号1所示)。
2、DNA末端修复与加A反应:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平,例如利用聚合酶的5’-3’聚合活性将5’突出末端补平和/或聚合酶的3’-5’外切活性将3’突出末端切平,利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基;在过量dATP存在下,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP(如图1中编号2所示)。
由机体自身酶切产生的游离DNA片段或被物理或化学方法人为打断的基因组DNA片段末端的完整性会受到不同程度的破环,形成5’突出末端、3’突出末端、5’羟基、3’磷酸基团等构型,不利于后续与接头发生连接反应。末端修复反应主要利用聚合酶(如T4 DNA聚合酶、Klenow大片段等)在dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate,脱氧核糖核苷三磷酸)存在时的5’-3’聚合活性将5’突出末端补平,3’-5’外切酶活性将3’突出末端切平;利用多聚核苷酸激酶(如T4多聚核苷酸激酶等)的5’羟基激酶活性将5’羟基转变成5’磷酸基团,多聚核苷酸激酶的3’磷酸酯酶活性将3’磷酸基团转变成3’羟基。3’末端加A反应则是在反应体系中存在dATP时,利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶(如去除了3’-5’外切活性的Klenow大片段(又称“Klenow片段(3′→5′exo-)”)、不具有3’-5’校正活性的Taq DNA聚合酶等),在双链DNA3’末端加上dATP,以利于双链DNA后续与3’T突出构型的接头序列进行A-T连接。
基于上述原理,末端修复和加A反应在同一反应体系中进行需要具备的成分有聚合酶、多聚核苷酸激酶、无3’-5’外切活性的聚合酶、dNTP(其中dATP需多于dTTP、dCTP、dGTP)、兼容三种酶的反应缓冲液。
在本发明的一个优选的实施例中,从酶量、反应缓冲液成分、反应温度、反应时间多个方面进行了系统地优化,得到了一系列适合不同起始量和不同来源模板DNA的末端修复与加A的反应试剂配方和建库条件。如此,加入优化的酶反应混合液,通过控制反应温度,使双链DNA末端修复反应和3’末端加A反应在一个反应体系中有序地进行。
具体来讲,对于物理打断DNA,每50μL的体系中含有,物理打断DNA 1-100ng,T4DNA聚合酶1.2-10U,Klenow大片段0-2U,T4多聚核苷酸激酶4-16U,Taq聚合酶1-4U,每种dNTP各0.02-0.2mM,额外的dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM;优选地,反应条件为15-37℃反应10-30min,然后65-75℃反应10-30min。
对于血浆游离DNA或酶切打断DNA,每50μL的体系中含有,血浆游离DNA或酶切打断DNA 1-100ng,T4 DNA聚合酶0-3U,Klenow大片段0-2U,T4多聚核苷酸激酶4-10U,Taq聚合酶1-2U,每种dNTP各0.02-0.2mM,额外的dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-10mM,条件是T4 DNA聚合酶和Klenow大片段的含量不同时为0;优选地,反应条件为15-37℃反应10-30min,然后65-75℃反应10-30min。
需要说明的是,额外的dATP 0.4-1mM,是指除了每种dNTP(包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP)各0.02-0.2mM以外,还含有多余的dATP 0.4-1mM。也就是说,dATP的总量为0.42-1.2mM。
还需要说明的是,本发明以50μL的体系为例进行说明,并不表明本发明的方法仅适合于50μL的体系,本领域的技术人员能够理解,以本发明的50μL的体系为基准,维持各种组分的含量不变,进行体系的平行放大或者缩小均能够实现本发明,本发明权利要求的技术方案也包括这里所说明的平行放大或者缩小的体系。
在本发明的另一个更加优选的实施例中,从酶量、反应缓冲液成分、反应温度、反应时间多个方面进行了系统地优化,得到了一系列适合不同起始量和不同来源模板DNA的末端修复与加A的反应试剂配方和建库条件(如表1所示)。
表1 50μL反应体系下不同模板DNA的末端修复-加A的反应优化参数
需要说明:在表1中,对于酶切打断和血浆游离DNA情况,T4 DNA聚合酶与Klenow大片段的含量不同时为0。
在本发明的又一个更加优选的实施例中,从酶量、反应缓冲液成分、反应温度、反应时间多个方面进行了系统地优化,得到了一系列适合不同起始量的DNA打断、末端修复、加A的反应试剂配方和建库条件(如表2所示)。
表2 30μL反应体系下不同模板DNA的打断、末端修复、加A的反应优化参数
需要说明:在表2中,具有3’-5’外切活性的聚合酶与具有链置换活性的聚合酶的含量不同时为0;NEB打断酶和非限制性DNA内切酶不同时为0;具有3’-5’外切活性的聚合酶例如T4 DNA聚合酶或DNA聚合酶I;具有链置换活性的聚合酶例如Klenow大片段;不具有3’-5’外切活性的聚合酶例如rTaq酶。
3、加接头:在步骤2的反应液中直接加入接头和连接反应混合液,使上一步3’A突出的双链DNA与接头连接。针对不同测序平台,可以加入不同平台的接头。
接头是一段特殊设计的脱氧核糖核酸序列,通过连接等方法固定在DNA片段两端后,在测序时能被识别并作为测序的起始位点,供仪器读取其后的序列信息。由于不同平台的文库结构不同,其使用的接头结构也有差异。在此步骤使用不同接头,即可满足不同测序平台对于文库的需求。
针对BGISEQ平台,当采用PCR建库策略时,加入不含U的鼓泡型接头(如图1中编号3.1所示);当采用PCR-free建库策略时,加入含U的鼓泡型接头,同时加USER酶进行消化反应,使连接上接头的DNA 5’端经USER酶切后产生5’磷酸基团(如图1中编号3.2所示)。
4、纯化接头连接产物:纯化末端修复-加A-加接头的反应体系,去除接头污染(如图1中编号4所示)。
5、PCR扩增或单链环化:对于PCR建库策略,加入与目的接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增,得到大量的DNA产物,由于其中一条引物5’末端有磷酸化修饰,扩增得到的双链DNA其中一条的5’端有磷酸基团;然而,对于PCR-free建库策略,纯化的连接产物直接用于单链环化反应,DNA的两条链都可以形成环化产物(如图1中编号5所示)。
6、纯化PCR反应体系:对于PCR建库策略,纯化PCR反应体系,去除引物二聚体污染(如图1中编号6所示)。
7、单链环化:对于PCR建库策略,纯化的PCR扩增产物DNA的其中一条链可以发生单链环化反应(如图1中编号7所示)。
单链环化反应利用热变性将双链DNA变成单链脱氧核酸,并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸(可称为介导桥序列)与变性后的单链脱氧核酸杂交和连接反应,使目的单链核酸环化。反应完的单链环化体系可直接用于后续的滚环复制,形成测序上机模板产物DNB(DNA Nanoball,核酸纳米球),用于测序反应。
请参考图2,根据本发明的第二个实施方案,以Illumina测序平台的文库构建为示例,说明其技术方案。
如图2所示,其与图1所示的BGISEQ-500/1000测序平台的文库构建方法的差别在于:在步骤3的加接头过程中,当采用PCR建库策略时,加入不含标签序列的Y型接头(如图2中编号3.1所示);当采用PCR-free建库策略时,加入含标签序列的Y型接头(如图2中编号3.2所示)。此外,图2所示的方法中,不需要最后的单链环化,可以将纯化后的产物直接用于上机测序。
本发明的建库方法将经典建库方法的步骤2至4从原来的3步酶反应、3步纯化反应,简化为2步酶反应、1步纯化反应,大大缩短建库时间,节省纯化步骤的建库成本,提升高通量建库技术应用到医学临床检测项目(如无创产前检测、游离肿瘤DNA基因检测等)的实效。
请参考图3和图4,根据本发明的第三个实施方案,基于打断-末端修复-加A一步法的文库构建方法的具体步骤如下:
1、采用非限制性DNA内切酶(例如DnaseI、Vvn或ColE7等)在DNA上形成切口或缺口,同时使用DNA聚合酶进行缺口平移或链置换并进行末端修复,以及在DNA的3’末端加上一个A碱基(图3和图4中编号1所示)。
非限制性DNA内切酶是一类没有特异性识别位点的DNA内切酶,可以随机地(或有偏好性地)在DNA双链上产生切口或缺口。DNA聚合酶可以识别切口或者缺口,进行缺口平移或者链置换,双链分别沿着5’-3’方向延伸,当双链上的缺口平移至相近或相同的位点时,DNA从此处断开,从而达到将DNA片段化的目的。与此同时,聚合酶的聚合和外切酶活性,可以将DNA 3’末端补齐,5’末端切平,从而使DNA的末端得到修复。一步酶反应可以同时完成打断、末端修复和加A三个过程,节省建库时间,节约建库成本。
2、在DNA片段两端加上接头,针对不同测序平台可以加入不同平台的接头。针对于CG平台,可使用带U碱基或者不带U碱基的鼓泡接头(图3中编号2所示);针对于Illumina平台,可使用Y型接头。
如图3所示,针对CG平台,以下步骤分为两个方面:PCR扩增或USER酶处理;以及单链环化。
3、PCR扩增:针对PCR策略,使用不带U的鼓泡接头的连接产物,加入与目的接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增(图3中编号3所示):通过高温使DNA双链分离,再降温将引物结合至对应单链上后,进行延伸,从而得到大量的DNA产物。
4、USER酶处理:针对PCR-free策略,使用带U的鼓泡接头的连接产物,利用与U作用的酶(例如:USER,或者UDG/APE酶等)处理接头,使接头产生能够连接的末端(图3中编号4所示)。
5、利用热变性将PCR扩增或USER酶处理得到DNA产物变成单链脱氧核酸,并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸(可称为介导片段)与变性后的单链脱氧核酸杂交和连接反应,使目的单链核酸环化,再用外切酶消化掉介导片段和未环化的目的单链核酸,得到带接头的单链环状核酸产物(图3中编号5所示)。该产物经过滚环复制后形成测序上机模板产物DNB(DNA Nanoball,核酸纳米球),用于后续的测序反应。
如图4所示,针对Illumina平台:以连接产物为模版,加入与目的接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增(图4中编号3所示)。通过高温使DNA双链分离,引物结合至对应单链上后,进行延伸,从而得到大量的DNA产物,该产物经过桥式PCR后即可用于测序。
相较现有的文库制备方法,本发明的上述方法可将酶打断和DNA末端修复、加A碱基一步完成。此外,在采用带U碱基的鼓泡接头的情况下,可实现基于酶切打断法文库构建的PCR-free策略。具体地,上述实施方案将非限制性DNA内切酶与DNA聚合酶巧妙地结合在一起,在非限制性DNA内切酶在双链DNA上形成切口时,利用DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性进行缺口平移或者链置换,快速将DNA修复成完整的双链DNA片段,由此消除了非限制性DNA内切酶碱基偏好性的影响。而且此反应不需要特殊设备的支持,温控简单,完全能够满足自动化生产的需求。同时由于减少了操作和纯化步骤,可以减少DNA量的损失,从而满足低起始量文库构建的需求。此外,使用PCR-free方法,不仅可以降低对温控设备的要求,而且可以降低由DNA聚合酶所引起的碱基偏向性和扩增错误率,提高测序质量。
请参考图3和图4,本发明还提供第四个实施方案,该实施方案与第三个实施方案的差别仅在于:以打断酶(如NEB Next dsDNA fragmentase)代替非限制性DNA内切酶。
使用打断酶随机打断DNA片段,得到具有5’-P,3’-OH突出末端的DNA小片段。同时,体系中的DNA聚合酶的聚合和外切酶活性,可以将DNA 3’-末端补齐,5’-末端切平,随后提高反应温度,使用Taq酶等DNA聚合酶在5’-末端添加A碱基。至此,在一步酶反应中,同时完成打断、修复和加dATP反应三个步骤。同时将反应中的其它酶灭活,可直接进行下一步反应,节省建库时间,节约建库成本。
本发明的第四个实施方案使用打断酶能够随机产生切刻,然后在切刻处酶切断开形成dsDNA断裂,DNA聚合酶的使用能同时进行DNA末端修复和加dATP,从而节约时间和成本。而且此反应不需要其它设备支持,温控简单,完全能够满足自动化生产的需求。同时由于减少了操作和纯化步骤,可以减少DNA量的损失,从而满足低起始量文库构建的需求。此外,使用PCR-free的方法,不仅可以降低对温控设备的要求,而且可以降低由DNA聚合酶所引起的碱基不均,提高测序质量。
在第三个实施方案和第四个实施方案中,DNA聚合酶可以是Klenow大片段和TaqDNA聚合酶的组合或者DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的组合。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案,应当理解,实施例仅是示例性的,不能理解为对本发明保护范围的限制。
本方法适用于不同类型的样品,可以是基因组打断的样品,例如人类基因组DNA,大肠杆菌DNA,含有病原体的脑脊液DNA;也可以是自然片段化的DNA,例如作为血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。本方法适用于不同起始投入量的样品,以片段化之后的样品定量,投入量2ng-100ng均可。
实施例1:对8例血浆样品进行文库构建
1.样品收集及处理:
取静脉血2ml,1600g,4℃离心10分钟,将血细胞和血浆分开,血浆再以16000g,4℃离心10分钟,进一步去除残留的白细胞。提取血浆DNA,最后将DNA溶于40μL TE溶液。
2.末端修复-加腺苷酸脱氧核糖核酸:
按下表配置体系:
表3
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzematics公司) | 5μL |
T4多聚核苷酸激酶(Enzematics公司) | 0.4μL |
Klenow大片段(5U/μL)(NEB公司) | 0.4μL |
脱氧核糖核酸混合液(25mM each)(Enzematics公司) | 0.4μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.4μL |
腺苷酸脱氧核糖核酸(10mM)(Enzematics公司) | 1μL |
T4 DNA聚合酶(3U/μL)(Enzymatics公司) | 0.4μL |
无酶纯水 | 2μL |
总体积 | 10μL |
将10μL反应液加入均一化至40μL的DNA中,混匀,置于37℃混孵育10min;72℃匀孵育15min,以0.1秒的速率降温至4℃的。
3.接头连接:
本方案中使用的接头序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“,案中示修饰基团,“修饰基团,示磷酸化,B10示10个碱基的标签序列。)
长链:
/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(B10)CAACTCCTTGGCTCACA(SEQ IDNO:1);
短链:TTGTCTTCCTAAGACCGCGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:2)。
接头A混合液(10uM)按以下配方配制:
表4
将2μL配制好的接头混合液(10uM)加入上一步骤产物中,充分混匀
按下表配置体系:
表5
三磷酸腺苷(100mM) | 0.8μL |
连接酶(600U/μL)(Enzematics公司) | 0.5μL |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzematics公司) | 3μL |
聚乙二醇8000(50%) | 12μL |
无酶纯水 | 11.7μL |
总体积 | 28μL |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于23℃接孵育30min。反应完之后,加入40μL Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行吸纯化,42μL TE缓冲液溶解回收产物。(反应产物的纯化有多种方式,有磁珠法、柱纯化法、凝胶回收法等等。均可用于替换。本实施例如不做特殊说明,均采用磁珠法纯化。)
4.PCR(聚合酶链式反应)
引物序列如下:(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“,序列示修饰基团,“修饰基团,示磷酸化。)
引物1序列:/5Phos/GAACGACATGGCTACGA(SEQ ID NO:3);
引物2序列:TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO:4)。
按下表配制体系:
表6
10×pfx缓冲液(Thermo Science公司) | 10μL |
脱氧核糖核酸缓和液(25mM)(Enzematics公司) | 1.6μL |
硫酸镁(50mM)(Thermo Science公司) | 4μL |
引物1(25uM) | 2.5μL |
引物2(25uM) | 2.5μL |
Pfx DNA聚合酶(2.5U/μL)(Thermo Science公司) | 2μL |
无酶纯水 | 37.4μL |
总体积 | 60μL |
将上步骤40μL回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表条件进行反应:
表7
反应完成后使用100μL Ampure XP磁珠进行纯化,30μLTE缓冲液溶解回收产物。取1μL回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度(结果如表8所示)。取1μL进行电泳(结果如图5所示)。
表8示出本实施例的8个样品PCR产物的总量,符合单链环化对每个样品PCR产物20ng以上的要求。
表8
文库 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
总量(ng) | 514 | 190.4 | 212 | 1130 | 388 | 836 | 582 | 682 |
图5示出了本实例的8个样品PCR产物的电泳结果,产物片段大小在250bp左右,符合血浆DNA文库片段大小。
5.单链环化:
将8个带有不同标签序列的扩增产物各取20ng进行混合,用TE配置成48μL体系,加入5μL 20uM介导片段,混匀。将反应体系置于95℃段孵育3min,立马置于冰上。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列如下:(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端)
GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO:5)。
配制反应体系2:
表9
10×TA缓冲液(Enzematics公司) | 6μL |
三磷酸腺苷(100mM) | 0.6μL |
T4 DNA连接酶(快速)(600U/μL)(Enzematics公司) | 0.2μL |
总体积 | 6.8μL |
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃混孵育30min。
6.测序
取构建的单链环状DNA文库进行DNA纳米球制备、CG上机测序。测序过程严格按照Complete Genomics Inc.的标准操作流程进行上机操作及数据分析。
实施例2:对48例血浆进行PCR-Free文库构建
1.样品收集及处理:
取静脉血2ml,1600g,4℃离心10分钟,将血细胞和血浆分开,血浆再以16000g,4℃离心10分钟,进一步去除残留的白细胞。提取血浆DNA,最后将DNA溶于40μL TE溶液。
2.末端修复-加腺苷酸脱氧核糖核酸:
按下表配置体系:
表10
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzematics公司) | 5μL |
T4多聚核苷酸激酶(Enzematics公司) | 0.6μL |
脱氧核糖核酸混合液(各25mM)(Enzematics公司) | 0.5μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.4μL |
腺苷酸脱氧核糖核酸(10mM)(Enzematics公司) | 1μL |
T4 DNA聚合酶(3U/μL)(Enzymatics公司) | 0.6μL |
无酶纯水 | 1.9μL |
总体积 | 10μL |
将10μL反应液加入均一化至40μL的DNA中,混匀,置于37℃混孵育30min;65℃孵育15min,降温至4℃。
3.接头连接:
本方案中使用的接头序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“,案中示修饰基团,“修饰基团,示磷酸化,B10示10个碱基的标签序列。ideoxyU示尿嘧啶核苷酸)
长链:
/Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(B10)CAACTCCTTGGCTCACA(SEQ IDNO:1);
短链:AGCCAAGGAGT/ideoxyU/GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:6)。
接头A混合液(10uM)按以下配方配制:
表11
将2μL配制好的接头混合液(10uM)加入上一步骤产物中,充分混匀。
按下表配置体系:
表12
三磷酸腺苷(100mM) | 0.8μL |
连接酶(600U/μL)(Enzematics公司) | 1μL |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzematics公司) | 3μL |
聚乙二醇8000(50%) | 12μL |
无酶纯水 | 11.2μL |
总体积 | 28μL |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于23℃接孵育30min。反应完之后,将24个带不同标签序列的样品混合在一起,再加入一倍体积的Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行纯化,55μL TE缓冲液溶解回收产物。(反应产物的纯化有多种方式,有磁珠法、柱纯化法、凝胶回收法等等。均可用于替换。本实施例如不做特殊说明,均采用磁珠法纯化。)
4.User酶切
按下表配置体系:
表13
10×TA缓冲液(Enzematics公司) | 6μL |
User酶切(1U/μL)(NEB公司) | 1μL |
总体积 | 7μL |
将7μL反应液加入上一步骤产物中,混匀,置于37混孵育15min;降温至4℃。
5.单链环化:
配制反应体系1:将5μL 20uM介导片段加入上一步骤产物中,混匀。将反应体系置于95℃匀孵育3min,立马置于冰上。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列如下:(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端)
GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO:5)。
配制反应体系2:
表14
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃混孵育30min。
6.测序
取构建的单链环状DNA文库进行DNA nonoball制备、CG上机测序。测序过程严格按照Complete Genomics Inc.的标准操作流程进行上机操作及数据分析。
表15示出了本实施例的PCR-Free文库DNA纳米球的浓度,符合BGISEQ平台上机测序的要求。
表15
文库 | PCR-Free 1 | PCR-Free 2 |
浓度(ng/μL) | 61.3 | 60.1 |
图6示出了本实施例的PCR-Free文库DNA纳米球电泳结果,样品大部分在胶孔里,无法电泳出来,符合DNA纳米球在聚丙烯酰胺电泳时无法跑出胶孔的特点。
实施例3:对1例超声打断的基因组进行文库构建
1.DNA样本片段化:
取炎黄细胞系DNA 500ng,进行超声波打断,用1.5倍Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行纯化,22μL TE缓冲液溶解回收产物。
2.末端修复-加dATP:
按下表16配置体系。
表16
组分 | 用量 |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzymatics公司) | 5μL |
T4多聚核苷酸激酶(Enzymatics公司) | 0.6μL |
脱氧核糖核酸混合液(每种25mM)(Enzymatics公司) | 0.4μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.4μL |
Klenow大片段(5U/μL)(NEB公司) | 0.2μL |
dATP(100mM)(Enzymatics公司) | 0.25μL |
T4 DNA聚合酶(3U/μL)(Enzymatics公司) | 0.6μL |
无酶纯水 | 22.55μL |
总体积 | 30μL |
将30μL反应液加入均一化至20μL的DNA溶液中,混匀,置于37℃孵育30min;65℃孵育15min,降温至4℃。
3.接头连接:
本方案中使用的接头序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化,B10示10个碱基的标签序列)。
长链:
/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(B10)CAACTCCTTGGCTCACA(SEQ IDNO:1)。
短链:TTGTCTTCCTAAGACCGCGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:2)。
接头混合液(10μM)按以下表17配方配制:
表17
组分 | 用量 |
长链(100μM) | 40μL |
短链(100μM) | 40μL |
氯化钠(5M) | 4μL |
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(1M,pH7.8) | 4μL |
乙二胺四乙酸二钠(2mM) | 20μL |
无酶纯水 | 292μL |
总体积 | 400.0μL |
将5μL配制好的接头混合液(10μM)加入上一步骤产物中,充分混匀。
按下表18配置体系。
表18
组分 | 用量 |
三磷酸腺苷(100mM) | 0.8μL |
连接酶(600U/μL)(Enzymatics公司) | 1μL |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzymatics公司) | 3μL |
聚乙二醇8000(50%) | 12μL |
无酶纯水 | 8.2μL |
总体积 | 25μL |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于23℃孵育30min。反应完之后,加入40μL Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行纯化,42μL TE缓冲液溶解回收产物。
4.PCR(聚合酶链式反应)
引物序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化):
引物1序列:/5Phos/GAACGACATGGCTACGA(SEQ ID NO:3);
引物2序列:TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO:4)。
按下表19配制体系。
表19
组分 | 用量 |
10×pfx缓冲液(Thermo Science公司) | 10μL |
脱氧核糖核酸缓和液(25mM)(Enzymatics公司) | 1.6μL |
硫酸镁(50mM)(Thermo Science公司) | 4μL |
引物1(25μM) | 2.5μL |
引物2(25μM) | 2.5μL |
Pfx DNA聚合酶(2.5U/μL)(Thermo Science公司) | 2μL |
无酶纯水 | 57.4μL |
总体积 | 80μL |
将上步骤40μL回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表20的条件进行反应。
表20
反应完成后使用100μL Ampure XP磁珠进行纯化,30μLTE缓冲液溶解回收产物。取1μL回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度。进行下一步反应。
5.单链环化:
配制反应体系1:取扩增产物320ng进行混合,用TE配置成65μL体系,加入5μL 20μM介导片段,混匀。将反应体系置于95℃孵育3min,立马置于冰上。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列如下:(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端)。
GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO:5)。
配制表21的反应体系2。
表21
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃孵育30min。
6.测序
取构建的单链环状DNA文库进行DNA纳米球制备、BGISEQ-500/1000上机测序。测序过程严格按照BGISEQ-500/1000的标准操作流程进行上机操作及数据分析。
表22示出了1例基因组样品的PCR和测序结果,PCR产量满足打断文库上机的需求。测序数据产出量以及深度、覆盖度都达到了数据分析的需求。
表22
PCR产量(ng) | 723 |
总测序片段数 | 2,072,698,572 |
总比对碱基数 | 92,277,215,100 |
比对率 | 89.04% |
唯一比对率 | 82.94% |
评价测序深度 | 26.31x |
覆盖度 | 99.46% |
图7示出了1例基因组样品的测序深度分布图,测序深度符合泊松分布,测序深度集中在30x左右,符合人基因组重测序的数据需求。
图8示出了1例基因组样品的GC含量累积比例,虽然高GC含量的片段的覆盖度有所下降,但覆盖率接近1,说明大部分高GC含量的片段可以被检测到,所有不同GC含量的片段均一化后的覆盖度基本保持水平。
实施例4:对8例NEB打断酶打断的基因组进行文库构建
1.DNA样本片段化:
取炎黄细胞系DNA 100ng,用1.2倍Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行纯化(此步骤当DNA溶于无EDTA的溶液或者无酶纯水时不需要实施),18μL无酶纯水溶解回收产物。
按下表23配置体系。
表23
将4μL反应液加入均一化至16μL的DNA中,混匀,置于4℃孵育5min;37℃孵育20min,65℃孵育15min,降温至4℃。反应完之后,再加入20μL Ampure XP磁珠(Beckman公司),混匀,静置5分钟后,取上清,往上清中加入22μL Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行纯化,42μL TE缓冲液溶解回收产物。
2.末端修复-加dATP:
按下表24配置体系。
表24
组分 | 用量 |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzymatics公司) | 5μL |
T4多聚核苷酸激酶(Enzymatics公司) | 0.8μL |
脱氧核糖核酸混合液(每种25mM)(Enzymatics公司) | 0.4μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.4μL |
dATP(100mM)(Enzymatics公司) | 0.25μL |
T4 DNA聚合酶(3U/μL)(Enzymatics公司) | 1μL |
无酶纯水 | 1.97μL |
总体积 | 10μL |
将10μL反应液加入均一化至40μL的DNA溶液中,混匀,置于15℃孵育30min;65℃孵育15min,降温至4℃。
3.接头连接:
本方案中使用的接头序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化,B10示10个碱基的标签序列)。
长链:
/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(B10)CAACTCCTTGGCTCACA(SEQ IDNO:1);
短链:TTGTCTTCCTAAGACCGCGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:2)。
接头混合液(10μM)按以下表25配方配制。
表25
将2μL配制好的接头混合液(10μM)加入上一步骤产物中,充分混匀。
按下表26配置体系。
表26
组分 | 用量 |
三磷酸腺苷(100mM) | 0.8μL |
连接酶(600U/μL)(Enzymatics公司) | 1μL |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzymatics公司) | 3μL |
聚乙二醇8000(50%) | 12μL |
无酶纯水 | 12.2μL |
总体积 | 29μL |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于23℃孵育30min。反应完之后,加入40μL Ampure XP磁珠(Beckman公司)进行纯化,22μL TE缓冲液溶解回收产物。
4.PCR(聚合酶链式反应)
引物序列如下:(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化)。
引物1序列:/5Phos/GAACGACATGGCTACGA(SEQ ID NO:3);
引物2序列:TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO:4)。
按下表27配制体系。
表27
组分 | 用量 |
10×pfx缓冲液(Thermo Science公司) | 10μL |
脱氧核糖核酸缓和液(25mM)(Enzymatics公司) | 1.6μL |
硫酸镁(50mM)(Thermo Science公司) | 4μL |
引物1(25μM) | 2.5μL |
引物2(25μM) | 2.5μL |
Pfx DNA聚合酶(2.5U/μL)(Thermo Science公司) | 2μL |
无酶纯水 | 67.4μL |
总体积 | 90μL |
取上步骤10μL回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表28条件进行反应。
表28
反应完成后使用100μL Ampure XP磁珠进行纯化,22μLTE缓冲液溶解回收产物。取1μL回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度。进行下一步反应。
5.单链环化:
配制反应体系1:将8个带有不同标签序列的扩增产物各取20ng进行混合,用TE配置成48μL体系,加入5μL 20μM介导片段,混匀。将反应体系置于95℃孵育3min,立马置于冰上。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列如下:(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端)。
GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO:5)。
配制表29的反应体系2。
表29
组分 | 用量 |
10×TA缓冲液(Enzymatics公司) | 6μL |
三磷酸腺苷(100mM) | 0.6μL |
T4 DNA连接酶(快速)(600U/μL)(Enzymatics公司) | 0.2μL |
总体积 | 6.8μL |
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃孵育30min。
6.测序
取构建的单链环状DNA文库进行DNA纳米球制备、BGISEQ-500/1000上机测序。测序过程严格按照BGISEQ-500/1000的标准操作流程进行上机操作及数据分析。
表30示出了8例酶打断基因组样品的PCR产量,8个样品的产量都达到了BGISEQ-500/1000测序平台的上机要求。
表30
图9示出了8例酶打断基因组样品的PCR产物电泳图,PCR产物的片段大小在250bp左右,符合BGISEQ-500/1000测序平台的上机要求。
实施例5:基于CG平台的打断-末端修复-加A一步法构建文库
1.打断-末端修复-加腺苷酸脱氧核糖核酸:
将DNA样品均一化至10ng/μL。按下表31配置体系:
表31
组分 | 用量 |
10×NEB打断酶缓冲液V2(NEB公司) | 3μL |
氯化镁200mM)(NEB公司) | 1.5μL |
Klenow大片段(5U/μL)(NEB公司) | 1μL |
脱氧核糖核酸混合液(25mM每种)(Enzematics公司) | 0.12μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.5μL |
腺苷酸脱氧核糖核酸(100mM)(Enzematics公司) | 0.15μL |
NEB打断酶(NEB公司) | 2μL |
无酶纯水 | 11.88μL |
总体积 | 20μL |
将20μL反应液加入均一化的DNA中,混匀,置于37℃孵育15min;65℃孵育15min。
该步骤也可使用如下表32的体系:
表32
将10μL反应液加入均一化的DNA中,混匀,置于37℃孵育15min;65℃孵育15min。
2.接头连接:
本方案中使用的接头序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化,字体加粗示标签序列,*硫酸化修饰。)
长链1:
/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATGTCATAAATCAACTCCTTGGCTC*A*C*A(SEQ ID NO:6);
长链2:
5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATGTCATAAATCAACTCCTTGGCTCACA(SEQID NO:6)。
短链1:TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ IDNO:7);
短链2:TTGTCTTCCTAAGACCGCGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:8);
短链3:AGGAGTTGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:9);
短链4:AGCCAAGGTCAGTAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:10)。
接头A混合液(25μM)按以下表33的配方配制:
表33
组分 | 用量 |
长链(其中之一,200μM) | 12.5μL |
短链(其中之一,200μM) | 12.5μL |
氯化钠(5M) | 1.2μL |
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(1M,pH7.8) | 1.2μL |
乙二胺四乙酸二钠(20mM) | 0.5μL |
无酶纯水 | 72.5μL |
总体积 | 100.0μL |
将4μL配制好的接头混合液(25μM)加入上一步骤产物中,充分混匀。
按下表34配置体系:
表34
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于23℃孵育60min。反应完之后,用50ul Ampure XP磁珠进行纯化,46μLTE缓冲液溶解回收产物。
3.聚合酶链式反应
引物序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化):
引物1序列:/5Phos/GAACGACATGGCTACGA(SEQ ID NO:3);
引物2序列:TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO:4)。
按下表35配制体系:
表35
组分 | 用量 |
10×pfx缓冲液(Thermo Science公司) | 10μL |
脱氧核糖核酸缓和液(25mM)(Enzematics公司) | 1.6μL |
硫酸镁(50mM)(Thermo Science公司) | 4μL |
引物1(25μM) | 2.5μL |
引物2(25μM) | 2.5μL |
Pfx DNA聚合酶(2.5U/μL)(Thermo Science公司) | 2μL |
无酶纯水 | 57.4μL |
总体积 | 80μL |
将上步骤20μL回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表36条件进行反应:
表36
反应完成后使用100μL Ampure XP磁珠进行纯化,30μLTE缓冲液溶解回收产物。取1μL回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度。进行下一步反应。
4.单链环化:
将330ng上述DNA用TE配置成65μL体系(反应体系1),加入5μL 25μM介导片段,混匀。将反应体系置于95℃孵育3min;4℃孵育10min。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端):
GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO:5)。
配制反应体系2(表37):
表37
组分 | 用量 |
10×TA缓冲液(Enzematics公司) | 12μL |
三磷酸腺苷(100mM) | 1.2μL |
T4 DNA连接酶(快速)(600U/μL)(Enzematics公司) | 0.42μL |
无酶纯水 | 36.38μL |
总体积 | 50μL |
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃孵育60min。
5.消化线性单链:
配置以下表38的反应缓冲液:
表38
组分 | 用量 |
10×TA缓冲液(Enzematics公司) | 4μL |
核酸外切酶1(20U/μL)(NEB公司) | 1.9μL |
核酸外切酶3(100U/μL)(NEB公司) | 1.3μL |
无酶纯水 | 1.5μL |
总体积 | 8μL |
将8μL反应缓冲液加入上一步骤的120μL反应产物中,混匀,置于37℃孵育30min。加入6μL乙二胺四乙酸(500mM),混匀。使用170μLPEG32磁珠纯化回收,50μL TE缓冲液溶解产物。
图10示出了2例酶打断基因组样品的PCR产物的bio-analysis 2100结果,PCR产物的片段大小在250bp左右,符合BGISEQ-500/1000测序平台的上机要求。
实施例6:基于Illumina测序平台的打断-末端修复-加A一步法构建文库
1.打断-末端修复-加腺苷酸脱氧核糖核酸:
将DNA样品均一化至10ng/μL。按下表39配置体系:
表39
组分 | 用量 |
10×fragmentation缓冲液(NEB公司) | 3μL |
牛血清蛋白(100mg/mL)(NEB公司) | 0.3μL |
DNA聚合酶I(5U/μL)(NEB公司) | 1μL |
脱氧核糖核酸混合液(10mM每种)(Enzematics公司) | 0.5μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.5μL |
腺苷酸脱氧核糖核酸(10mM)(Enzematics公司) | 1μL |
Vvn非限制性DNA内切酶(1.3U/μL)(NEB公司) | 1μL |
无酶纯水 | 12.7μL |
总体积 | 20μL |
将20μL反应液加入均一化的DNA中,混匀,置于37℃孵育15min;70℃孵育15min。
2.接头连接:
按下表40配置体系:
表40
组分 | 用量 |
连接酶混合液(NEB公司) | 15μL |
NEBNext Illumina接头(NEB公司) | 2.5μL |
连接强化剂(NEB公司) | 1μL |
无酶纯水 | 35μL |
总体积 | 53.5μL |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于25℃孵育15min。反应完之后,加入3μL USER酶(NEB公司),置于37℃孵育15min。反应完成后,在反应体系中加入13.5μL无酶纯水,加入55μL Ampure XP磁珠进行纯化,15μLTE缓冲液溶解回收产物。
3.聚合酶链式反应
按下表41配制体系:
表41
组分 | 用量 |
NEBNext Q5热启动PCR混合液(NEB公司) | 25μL |
I7引物(NEB公司) | 5μL |
I5引物(NEB公司) | 5μL |
总体积 | 35μL |
将上步骤15μL回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表42的条件进行反应:
表42
反应完成后使用45μL Ampure XP磁珠进行纯化,33μLTE缓冲液溶解回收产物。取1μL回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度。
实施例7:基于CG平台的打断-末端修复-加A一步法构建文库
1.打断-末端修复-加腺苷酸脱氧核糖核酸:
将DNA样品均一化至10ng/μL。按下表43配置体系:
表43
组分 | 用量 |
10×fragmentation缓冲液V2(NEB公司) | 3μL |
Klenow大片段(5U/μL)(NEB公司) | 0.5μL |
脱氧核糖核酸混合液(1mM每种)(Enzematics公司) | 1.2μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.5μL |
腺苷酸脱氧核糖核酸(5mM)(Enzematics公司) | 1.8μL |
打断酶(NEB公司) | 3μL |
无酶纯水 | 10μL |
总体积 | 20μL |
将20μL反应液加入均一化的DNA中,混匀,置于4℃孵育5min;37℃孵育10min;65℃孵育15min。
该步骤也可使用如下表44的体系:
表44
该步骤也可使用如下表45的体系:
表45
组分 | 用量 |
10×fragmentation缓冲液V2(NEB公司) | 3μL |
DNA PolI(10U/μL)(NEB公司) | 0.5μL |
脱氧核糖核酸混合液(1mM每种)(Enzematics公司) | 1.2μL |
Taq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara公司) | 0.5μL |
腺苷酸脱氧核糖核酸(5mM)(Enzematics公司) | 1.8μL |
打断酶(NEB公司) | 3μL |
无酶纯水 | 9.5μL |
总体积 | 20μL |
将20μL反应液加入均一化的DNA中,混匀,置于4℃孵育5min;37℃孵育20min;65℃孵育15min。
2.接头连接:
本方案中使用的接头序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化,字体加粗示标签序列,*硫酸化修饰):
长链1:
/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATGTCATAAATCAACTCCTTGGCTC*A*C*A(SEQ ID NO:6);
长链2:
5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATGTCATAAATCAACTCCTTGGCTCACA(SEQID NO:6)。
短链1:TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:7);
短链2:TTGTCTTCCTAAGACCGCGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:8);
短链3:AGGAGTTGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:9);
短链4:AGCCAAGGTCAGTAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:10)。
接头A混合液(25μM)按以下表46的配方配制:
表46
将4μL配制好的接头混合液(25μM)加入上一步骤产物中,充分混匀。
按下表47配置体系:
表47
组分 | 用量 |
三磷酸腺苷(100mM) | 0.8μL |
连接酶(600U/μL)(Enzematics公司) | 1.2μL |
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Enzematics公司) | 5μL |
聚乙二醇8000(50%) | 12μL |
无酶纯水 | 27μL |
总体积 | 46μL |
将连接反应体系与接头和产物的混合液混匀,置于23℃孵育30min。反应完之后,加入20μL 1xTE,用50μL Axygen磁珠进行纯化,46μLTE缓冲液溶解回收产物。
3.聚合酶链式反应
引物序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端,“//”示修饰基团,“phos”示磷酸化):
引物1序列:/5Phos/GAACGACATGGCTACGA(SEQ ID NO:3);
引物2序列:TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO:4)。
按下表48配制体系:
表48
将上步骤20μL回收产物,加入到以上体系中,混匀后按下表49的条件进行反应:
表49
反应完成后使用100μL Ampure XP磁珠进行纯化,30μLTE缓冲液溶解回收产物。取1μL回收产物,用Qubit dsDNA HS分析试剂盒(invitrogen公司)定量产物浓度。进行下一步反应。
4.单链环化:
将330ng上述DNA用TE配置成65μL体系(反应体系1),加入5μL 25μM介导片段,混匀。将反应体系置于95℃孵育3min;4℃孵育10min。
其中介导片段具有相应互补序列用于连接单链两端,其序列如下(本实施例中的序列从左到右为5’端至3’端):
GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG(SEQ ID NO:5)。
按下表50配制反应体系2:
表50
组分 | 用量 |
10×TA缓冲液(Enzematics公司) | 12μL |
三磷酸腺苷(100mM) | 1.2μL |
T4 DNA连接酶(快速)(600U/μL)(Enzematics公司) | 0.42μL |
无酶纯水 | 36.38μL |
总体积 | 50μL |
将反应体系2加入反应体系1中,混匀,置于37℃孵育60min。
5.消化线性单链:
配置以下表51的反应缓冲液:
表51
将8μL反应缓冲液加入上一步骤的120μL反应产物中,混匀,置于37℃孵育30min。加入6μL乙二胺四乙酸(500mM),混匀。使用170μLPEG32磁珠纯化回收,50μL TE缓冲液溶解产物。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种DNA打断-末端修复-加A方法,其特征在于,所述方法包括:在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用非限制性DNA内切酶在DNA上形成切口或缺口,同时利用DNA聚合酶进行缺口平移或链置换并进行末端修复;在过量dATP存在下,利用DNA聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP。
2.一种基于DNA打断-末端修复-加A的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
在同一反应体系中,在dNTP存在下,利用非限制性DNA内切酶在DNA上形成切口或缺口,同时利用DNA聚合酶进行缺口平移或链置换并进行末端修复;在过量dATP存在下,利用DNA聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP;
在所述反应体系中,直接加入接头和连接反应混合液,使上一步产生的双链DNA与所述接头连接。
3.根据权利要求2所述的文库构建方法,其特征在于,所述接头是3’T突出鼓泡型接头;所述方法进一步包括:进行PCR扩增以及热变性和单链核酸环化;或者
所述接头是含U的鼓泡型接头;所述方法进一步包括:加入USER酶酶切以及热变性和单链核酸环化。
4.根据权利要求2所述的文库构建方法,其特征在于,所述接头是3’T突出Y型接头;所述方法进一步包括:进行PCR扩增和纯化PCR扩增产物。
5.根据权利要求2所述的文库构建方法,其特征在于,所述接头是3’T突出的颈环型接头。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述DNA聚合酶为Klenow大片段和TaqDNA聚合酶的组合,或者DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶的组合,或者T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的组合。
7.一种DNA打断-末端修复-加A的反应体系,其特征在于,所述体系按照每30μL的体系中含有,基因组DNA 5-100ng,NEB打断酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM;或者
所述体系按照每30μL的体系中含有,基因组DNA 5-100ng,非限制性DNA内切酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM。
8.一种DNA打断-末端修复-加A的反应试剂盒,其特征在于,所述试剂盒按照基因组DNA5-100ng,NEB打断酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM,形成用于稀释成30μL反应体系的试剂盒单位;或者
所述试剂盒按照基因组DNA 5-100ng,非限制性DNA内切酶0.5-3U,具有3’-5’外切活性的聚合酶0-20U或/和具有链置换活性的聚合酶0-20U,不具有3’-5’外切活性的聚合酶1-15U,每种dNTP 0.02-0.2mM,额外dATP 0.4-1mM,以及Mg离子8-15mM,形成用于稀释成30μL反应体系的试剂盒单位。
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