CN112553298B - 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法 - Google Patents

一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112553298B
CN112553298B CN201910851085.7A CN201910851085A CN112553298B CN 112553298 B CN112553298 B CN 112553298B CN 201910851085 A CN201910851085 A CN 201910851085A CN 112553298 B CN112553298 B CN 112553298B
Authority
CN
China
Prior art keywords
methylation
added
addition
dna
end repair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910851085.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112553298A (zh
Inventor
罗慧娟
杨琴
罗甜
于源
吴逵
李旺胜
辜伦达
李南南
陈小芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Priority to CN201910851085.7A priority Critical patent/CN112553298B/zh
Publication of CN112553298A publication Critical patent/CN112553298A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112553298B publication Critical patent/CN112553298B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法。本发明提供了一种制备甲基化测序文库的方法，依次包括如下步骤：(1)在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNA Polymerase I；(2)连接甲基化修饰接头；(3)进行亚硫酸盐处理。本发明具有操作简单，周期短的优点，可对高甲基化修饰的样本进行更为准确的甲基化检测，可提供适用于任何物种的5甲基胞嘧啶全基因组甲基化检测技术服务。

Description

一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法
技术领域
本发明涉及一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法。
背景技术
胞嘧啶第五个碳分子的DNA甲基化修饰是一种稳定的表观遗传修饰，在许多物种中从细菌到高等真核生物都存在此修饰。这种修饰就是我们常说的DNA甲基化修饰，它在胚胎发育过程的转录调节中发挥作用，例如基因组印记，转座子沉默，另外在干细胞分化期间以及X染色体失活中也起着重要的作用。而且在肿瘤研究中发现DNA甲基化水平的变化也与肿瘤的进展有关。因此，DNA甲基化检测为生物体的生理功能的研究提供了重要的手段。
基于重亚硫酸盐原理的甲基化建库测序已经成为DNA甲基化分析的金标准。基因组DNA经过重亚硫酸盐处理后，未经修饰的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，而甲基化修饰的胞嘧啶则保持不变，经过PCR和测序后可以通过单碱基分辨率获取基因组范围内的甲基化信息。随着NGS测序成本减少，WGBS(全基因组甲基化测序)方法越来越多地用于基础和临床研究。
传统的WGBS流程中，首先将基因组DNA随机打断，得到具有平末端以及3'或5'突出端的片段化DNA。随后使用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和Klenow聚合酶将突出端转化为平末端。接下来钝性DNA在Klenow(3'-5'exo-)酶作用下在3’端加入“A”，然后将带有突出T的甲基化修饰接头在T4DNA连接酶作用下连接到上述产物中。这时候再进行重亚硫酸盐处理，插入片段上的没有甲基化C就会脱氨基形成U，进一步通过PCR转换成T，从而得到上机测序的产物。
传统的WGBS中，对粘性末端DNA进行修复时，引入的寡聚核苷酸通常是A、T、C、G这四种碱基。这样会造成粘性末端引入虚假的甲基化信息的情况。如果打断后的粘性末端的胞嘧啶是高甲基化修饰，其所得到的CG甲基化水平就会出现严重的偏向性，导致落在此位点的甲基化信息出现重大偏差。尽管后续可以在信息分析的时候将出现这种情况的片段截去，但是，随之带来测序数据的浪费以及降低覆盖度等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法。
本发明提供了一种制备甲基化测序文库的方法，依次包括如下步骤：
(1)在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNAPolymerase I；
(2)连接甲基化修饰接头；
(3)进行亚硫酸盐处理。
在末端修复和加A的反应体系中，加入的酶不包括T4DNA Polymerase(不加入T4DNA Polymerase)(用DNA Polymerase I代替T4DNA Polymerase)。
在末端修复和加A的反应体系中，加入的酶为T4Polynucleotide Kinase、KlenowFragment、rTaq DNA Polymerase和DNA Polymerase I。
所述双链DNA片段可为100-300bp的DNA片段。
所述双链DNA片段可为基因组DNA进行打断得到的DNA片段。
所述打断的方法具体可为采用打断仪进行打断。
所述打断的方法具体可为：取基因组DNA，采用covaris-E220打断仪进行片段破碎。参数具体可如表1所示。
基因组DNA进行打断后，可采用XP磁珠回收100-300bp的DNA片段并重新溶于去离子水中，即为片段化DNA溶液。
所述双链DNA片段可为ctDNA。
末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNA Polymerase I的配比依次为5-7U：0.25-0.75U：0.25-0.75U：15-25U。
末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNA Polymerase I的配比依次为6U：0.5U：0.5U：20U。
dTTP和dGTP的摩尔配比为0.5-1.5：1，dATP与dTTP的配比为4-6：1。
dTTP和dGTP的摩尔配比为1：1，dATP与dTTP的配比为5：1。
50μl末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为5-7U,Klenow Fragment的加入量为0.25-0.75U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.25-0.75U，DNA Polymerase I的加入量为15-25U。
50μl末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为6U,Klenow Fragment的加入量为0.5U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.5U，DNAPolymerase I的加入量为20U。
50μl末端修复和加A的反应体系中，dNTP溶液的加入量为0.3-1.5μl。50μl末端修复和加A的反应体系中，dNTP溶液的加入量为0.6μl。dNTP溶液中提供的有效成分为dATP、dTTP和dGTP。dNTP溶液中，dATP的浓度为100-150mM，dTTP和dGTP的浓度均为20-30mM。dNTP溶液中，dATP的浓度为125mM，dTTP和dGTP的浓度均为25mM。dNTP溶液中不含有dCTP。
50μl末端修复和加A的反应体系具体可为：按表2配制反应体系(10μl)，然后加入片段化DNA溶液(40μl，DNA含量为10ng)中。
末端修复和加A的反应条件具体可为：37℃反应30分钟，然后65℃反应15分钟。
连接甲基化修饰接头的反应体系中，含有T4DNA Ligase。
80μl连接甲基化修饰接头的反应体系中，T4DNA Ligase的加入量为800-1100U。
80μl连接甲基化修饰接头的反应体系中，T4DNA Ligase的加入量为960U。
连接甲基化修饰接头的反应体系中，含有甲基化接头。甲基化接头由如下两条单链DNA分子组成：Ad153Ω_Bottom_2(序列表的序列1)和Ad153_5T_1(序列表的序列2)。Ad153Ω_Bottom_2和Ad153_5T_1中，C均代表5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。
80μl连接甲基化修饰接头的反应体系中，甲基化接头溶液的加入量为2-5μl。80μl连接甲基化修饰接头的反应体系中，甲基化接头溶液的加入量为3μl。甲基化接头溶液提供的有效成分为甲基化接头。甲基化接头溶液中，甲基化接头的浓度为10-30μM。甲基化接头溶液中，甲基化接头的浓度为20μM。
80μl连接甲基化修饰接头的反应体系具体可为：按表3配制反应体系(30μl)，然后加入末端修复和加A的反应产物(50μl)中。
连接甲基化修饰接头的反应条件具体可为：20℃反应30分钟。
连接甲基化修饰接头完成后，用XP磁珠纯化回收DNA并将纯化产物重溶于去离子水中。
所述亚硫酸盐处理包括但不限于亚硫酸氢盐处理或者重亚硫酸盐处理。
所述亚硫酸盐处理也可以为本领域技术人员公知的其它亚硫酸盐处理。
亚硫酸盐处理前，在前一步骤的产物溶液中，加入片段化的外源λDNA作为内参。
所述方法还包括如下步骤：
(4)PCR扩增。
所述PCR扩增采用的引物为AD153-F和AD153-R。AD153-F如序列表的序列3所示。AD153-R如序列表的序列4所示。
所述PCR扩增的反应体系具体如表4所示。
所述PCR扩增的反应条件具体如表5所示。
所述方法还包括如下步骤：
(5)单链环化。
所述单链环化采用的环化连接寡聚核苷酸为Ad153splint oligo。Ad153splintoligo如序列表的序列5所示。
所述单链环化依次包括两个步骤：热变性和酶切。
所述酶切采用Exonuclease I和Exonuclease III。
所述热变性的方法具体为：取前一步骤得到的产物溶液(DNA含量为170ng)，加水补足48.2μl体系，混匀后95℃反应5分钟，然后立即置于4℃，按照表6依次加入试剂，混匀后37℃反应30分钟。
所述酶切的方法具体为：取热变性得到的产物溶液(60μl)，按照表7依次加入试剂，混匀后，37℃反应30分钟。
完成酶切后，采用XP磁珠纯化回收DNA并将纯化产物重溶于去离子水中，即为文库溶液。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库的方法，包括末端修复和加A的步骤，其特征在于：
在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNAPolymerase I。在末端修复和加A的反应体系中，加入的酶不包括T4DNA Polymerase(不加入T4DNA Polymerase)(用DNA Polymerase I代替T4DNA Polymerase)。在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶为T4PolynucleotideKinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase和DNA Polymerase I。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库中进行末端修复和加A的方法，依次包括如下步骤：
在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNAPolymerase I。在末端修复和加A的反应体系中，加入的酶不包括T4DNA Polymerase(不加入T4DNA Polymerase)(用DNA Polymerase I代替T4DNA Polymerase)。在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶为T4PolynucleotideKinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase和DNA Polymerase I。
末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNA Polymerase I的配比依次为5-7U：0.25-0.75U：0.25-0.75U：15-25U。
末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNA Polymerase I的配比依次为6U：0.5U：0.5U：20U。
dTTP和dGTP的摩尔配比为0.5-1.5：1，dATP与dTTP的配比为4-6：1。
dTTP和dGTP的摩尔配比为1：1，dATP与dTTP的配比为5：1。
50μl末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为5-7U,Klenow Fragment的加入量为0.25-0.75U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.25-0.75U，DNA Polymerase I的加入量为15-25U。
50μl末端修复和加A的反应体系中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为6U,Klenow Fragment的加入量为0.5U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.5U，DNAPolymerase I的加入量为20U。
50μl末端修复和加A的反应体系中，dNTP溶液的加入量为0.3-1.5μl。50μl末端修复和加A的反应体系中，dNTP溶液的加入量为0.6μl。dNTP溶液中提供的有效成分为dATP、dTTP和dGTP。dNTP溶液中，dATP的浓度为100-150mM，dTTP和dGTP的浓度均为20-30mM。dNTP溶液中，dATP的浓度为125mM，dTTP和dGTP的浓度均为25mM。dNTP溶液中不含有dCTP。
50μl末端修复和加A的反应体系具体可为：按表2配制反应体系(10μl)，然后加入片段化DNA溶液(40μl，DNA含量为10ng)中。
末端修复和加A的反应条件具体可为：37℃反应30分钟，然后65℃反应15分钟。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库的方法，包括末端修复的步骤，其特征在于：
在末端修复的体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNA Polymerase I。在末端修复的体系中加入的酶，不包括T4DNAPolymerase(用DNA Polymerase I取代T4DNA Polymerase)。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库中进行末端修复的方法，其特征在于：
在末端修复的体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNA Polymerase I。在末端修复的体系中加入的酶，不包括T4DNAPolymerase(用DNA Polymerase I取代T4DNA Polymerase)。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库的试剂盒，包括组件1、组件2和组件3；
所述组件1用于末端修复和加A；所述组件1包括dNTP和DNA Polymerase I；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成；
所述组件2用于连接甲基化修饰接头；
所述组件3用于进行亚硫酸盐处理。
所述组件1不包括dCTP。
所述组件1不包括T4DNA Polymerase。
所述组件1包括dNTP、T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNAPolymerase和DNA Polymerase I；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成；
T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNAPolymerase I的配比依次为5-7U：0.25-0.75U：0.25-0.75U：15-25U。
T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNAPolymerase I的配比依次为6U：0.5U：0.5U：20U。
dNTP中，dTTP和dGTP的摩尔配比为0.5-1.5：1，dATP与dTTP的配比为4-6：1。
dNTP中，dTTP和dGTP的摩尔配比为1：1，dATP与dTTP的配比为5：1。
所述组件2包括T4DNA Ligase和甲基化修饰接头。
甲基化接头由如下两条单链DNA分子组成：Ad153Ω_Bottom_2(序列表的序列1)和Ad153_5T_1(序列表的序列2)。Ad153Ω_Bottom_2和Ad153_5T_1中，C均代表5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。
所述亚硫酸盐处理包括但不限于亚硫酸氢盐处理或者重亚硫酸盐处理。
所述亚硫酸盐处理也可以为本领域技术人员公知的其它亚硫酸盐处理。
所述组件3具体可为EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZYMO，货号D5042)。
所述试剂盒还包括组件4；所述组件4用于PCR扩增。所述组件4包括PCR扩增的引物对。所述引物对具体由AD153-F和AD153-R组成。AD153-F如序列表的序列3所示。AD153-R如序列表的序列4所示。
所述试剂盒还包括组件5；所述组件5用于单链环化。所述组件5包括组件5-1和组件5-2。所述组件5-1用于热变性。所述组件5-2用于酶切。所述组件5-1包括环化连接寡聚核苷酸。所述环化连接寡聚核苷酸具体为Ad153splint oligo。Ad153splint oligo如序列表的序列5所示。所述组件5-2包括Exonuclease I和Exonuclease III。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库中进行末端修复和加A的试剂盒，包括dNTP和DNA Polymerase I；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成。
所述试剂盒不包括dCTP。
所述试剂盒不包括T4DNA Polymerase。
所述试剂盒包括dNTP、T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNAPolymerase和DNA Polymerase I；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成；
T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNAPolymerase I的配比依次为5-7U：0.25-0.75U：0.25-0.75U：15-25U。
T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、rTaq DNA Polymerase、DNAPolymerase I的配比依次为6U：0.5U：0.5U：20U。
dNTP中，dTTP和dGTP的摩尔配比为0.5-1.5：1，dATP与dTTP的配比为4-6：1。
dNTP中，dTTP和dGTP的摩尔配比为1：1，dATP与dTTP的配比为5：1。
本发明还保护一种制备甲基化测序文库中进行末端修复的试剂盒，包括dNTP和DNA Polymerase I；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成。
所述试剂盒不包括dCTP。
所述试剂盒不包括T4DNA Polymerase。
本发明的主要流程：①将基因组DNA进行随机打断(物理法或者酶切法)；②加入A、T、G三种碱基进行末端修复以及3’末端加A；③连接已知序列的甲基化接头；④进行重亚硫酸盐处理；⑤PCR扩增，环化成单链环后，即为文库；⑥用新一代测序仪进行高通量测序，最后进行甲基化偏向性分析。
本发明的主要发明点：在进行末端修复的时候，引入的寡聚核苷酸为A、T、G这三种碱基(杜绝了虚假胞嘧啶信息的引入)，用DNA polymerase I(具有3′～5′和5′～3′外切酶活性，将突出的粘性末端切为平末端)代替只有5′～3′外切酶活性T4DNA聚合酶，在其作用下可以防止片段化样本粘性末端中需要C碱基进行末端修复的模板丢失，不会减少片段化的样本量，从而维持稳定的PCR产量。
在相同起始DNA建库前提下，本发明可以大大改善传统的WGBS方法现有中存在的DNA甲基化偏向性问题，并且与传统的WGBS方法产量相差无异，Duplication才10％左右。
本发明可用于对ctDNA这种量比较少，而且片段化的DNA进行具有单碱基分辨率的全基因组甲基化分析，并具有操作简单，建库周期短的特点。由于此方法检测得到结果覆盖度广，因此可以更为精确地获取肿瘤循环DNA甲基化数据，为筛选可靠的肿瘤甲基化标志物提供重要的手段。本发明不一定局限用于肿瘤循环DNA甲基化检测，也可应用于样本纯度，完整性较低且样本量少的DNA甲基化检测。
本发明具有操作简单，周期短的优点，可对高甲基化修饰的样本进行更为准确的甲基化检测，可提供适用于任何物种的5甲基胞嘧啶全基因组甲基化检测技术服务。
附图说明
图1为2100检测的叠加图。
图2为2100检测的图(实施例1-1)。
图3为2100检测的图(实施例1-2)。
图4为2100检测的图(对比例1-1)。
图5为2100检测的图(对比例1-2)。
图6为2100检测的图(对比例2-1)。
图7为2100检测的图(对比例2-2)。
图8为对比例1中步骤七的测序结果中，read1和read2在每个碱基下平均甲基化水平。
图9为对比例2中步骤七的测序结果中，read1和read2在每个碱基下平均甲基化水平。
图10为实施例1中步骤七的测序结果中，read1和read2在每个碱基下平均甲基化水平。
图11为实施例1、对比例1和对比例2的步骤七的测序结果的全基因组覆盖度情况。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。NF water：纳滤水。如无特殊说明，实施例中的DNA分子中，A均代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，T均代表胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸,C均代表胞嘧啶脱氧核糖核苷酸,G均代表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸。实施例中，采用Qubit ds DNA Hs Assay kit进行DNA定量。AgencourtAMPure XP磁珠，简称XP磁珠：https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr。
实施例1、
一、基因组DNA片段化处理
取500ng基因组DNA，采用covaris-E220打断仪(美国Covaris E220System，按照说明书操作)进行片段破碎(参数见表1)。然后采用XP磁珠回收(先用1.5倍体积XP磁珠反应收集上清，然后用0.5倍体积XP磁珠回收片段)100-300bp的DNA片段并重新溶于32μl去离子水中，即为片段化DNA溶液。取DNA含量为10ng的片段化DNA溶液，用去离子水补足至40μl，即为产物溶液。
表1
Figure BDA0002196959290000081
二、末端修复和加A
按表2配制反应体系(10μl)，然后加入步骤一的产物溶液(40μl)中，完成加入后体系体积为50μl，37℃反应30分钟，然后65℃反应15分钟。
表2
Figure BDA0002196959290000082
Figure BDA0002196959290000091
表2制备的反应体系(10μl)中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为6U,KlenowFragment的加入量为0.5U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.5U，DNA Polymerase I的加入量为20U。
T4Polynucleotide Kinase：QIAGEN,Y9040L；产品规格：10000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/t4-polynucleotide-kinase/。提供配套的10XPolynucleotide Kinase Buffer(B9040)。
Klenow Fragment：QIAGEN,P7060L；产品规格：5000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/klenow-fragment/。
rTaq DNA Polymerase：TOYOBO Ideas&Chemistry,Code No.TAP-201 250U；产品规格：2.5U/μl；产品链接：https://www.toyobo-global.com/seihin/xr/lifescience/products/pcr_007.html。
DNA Polymerase I：QIAGEN,P7050L；产品规格：10000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/dna-polymerase-i/。
dNTP溶液中提供的有效成分为dATP、dTTP和dGTP。dNTP溶液中，dATP的浓度为125mM，dTTP和dGTP的浓度均为25mM。dNTP溶液中不含有dCTP。
三、连接甲基化修饰接头
按表3配制反应体系(30μl)，然后加入步骤二的反应产物(50μl)中，完成加入后体系体积为80μl，20℃反应30分钟，然后采用1倍体积XP磁珠纯化回收DNA并将纯化产物重新溶于22μl去离子水中。
表3
10X Polynucleotide Kinase Buffer 3μl
ATP溶液 0.8μl
NF water 5.6μl
PEG8000溶液 16μl
T4DNA Ligase 1.6μl
甲基化接头溶液 3μl
总体积 30μl
T4DNA Ligase：ENZYMATICS，L6030-HC-L；产品规格：600000U/mL；产品链接：https://shop.enzymatics.com/ProductDetails.asp？ProductCode＝L6030-HC-L。
表3制备的反应体系(30μl)中，T4DNA Ligase的加入量为960U。
表3中的10X Polynucleotide Kinase Buffer同表2中的10X PolynucleotideKinase Buffer。
ATP溶液中提供的有效成分为ATP。ATP溶液中，ATP的浓度为100mM。
PEG8000溶液：含50g/100ml PEG8000,余量为水。
甲基化接头溶液提供的有效成分为甲基化接头。甲基化接头溶液中，甲基化接头的浓度为20μM。
甲基化接头由如下两条单链DNA分子组成：Ad153Ω_Bottom_2(序列表的序列1)和Ad153_5T_1(序列表的序列2)。Ad153Ω_Bottom_2和Ad153_5T_1中，C均代表5-甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。
Ad153Ω_Bottom_2：5’-TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'
Ad153_5T_1：5’-AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA
Figure BDA0002196959290000101
CAACTCCTTGGCTCACA-3'；Ad153_5T_1中，下划线标注的为区别标识(指的是区分不同样本的标识)，N为A、T、C、G任意。对于具体实施例来说，采用的区别标识为TGTCATAAAT。
四、重亚硫酸盐处理
取19μl步骤三的产物溶液，加入1μl片段化的外源λDNA(DNA含量为200ng)，然后采用EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZYMO，货号D5042)并按试剂盒说明操作(目的是将DNA进行亚硫酸氢盐处理)，得到10μl产物溶液。
非甲基化λDNA，即Unmethylated Lambda DNA：Promega,D1521；产品链接：https://www.promega.com.cn/products/biochemicals-and-labware/nucleic-acids/unmethylated-lambda-dna/？catNum＝D1521。
片段化的外源λDNA的制备方法：取非甲基化λDNA，采用covaris-E220打断仪(美国Covaris E220System，按照说明书操作)进行片段破碎(参数见表1)。
五、PCR扩增
按表4配制反应体系，然后按照表5进行PCR扩增，然后采用采用1倍体积XP磁珠纯化回收DNA并将纯化产物重新溶于22μl去离子水中。
表4
步骤四得到的产物溶液 10μl
2×KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix 25μl
AD153-F溶液 1.5μl
AD153-R溶液 1.5μl
H2O 12μl
总体积 50μl
2×KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix：Roche；
https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/pcr-2/kapa-hifi-uracil/。
AD153-F溶液提供的有效成分为AD153-F(扩增引物，单链DNA分子)。AD153-F溶液中，AD153-F的浓度为25μM。
AD153-R溶液提供的有效成分为AD153-R(扩增引物，单链DNA分子)。AD153-R溶液中，AD153-R的浓度为25μM。
AD153-F(序列表的序列3)：5’-GAACGACATGGCTACGA-3'；
AD153-R(序列表的序列4)：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3'。
表5
Figure BDA0002196959290000111
六、单链环化
1、热变性
取步骤五得到的产物溶液(DNA含量为170ng)，加水补足48.2μl体系，混匀后95℃反应5分钟，然后立即置于4℃，按照表6依次加入试剂，完成加入后体系体积为60μl，混匀后37℃反应30分钟。
表6
10×TA buffer 6μl
ATP溶液 0.6μl
环化连接寡聚核苷酸溶液 5μl
T4DNA Ligase 0.2μl
总体积 11.8μl
10×TA buffer：Epicentre；http://www.epibio.com/applications/genomic-library-construction-kits-gene-pcr-cloning-kits/additional-reagents/10x-ta-buffer。
ATP溶液，提供的有效成分为ATP。ATP溶液中，ATP的浓度为100mM。
环化连接寡聚核苷酸溶液提供的有效成分为Ad153splint oligo(单链DNA分子)。环化连接寡聚核苷酸溶液中，Ad153splint oligo的浓度为20μM。
Ad153splint oligo(序列表的序列5)：5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3'。
T4DNA Ligase同表3的T4DNA Ligase。
表6(11.8μl)中，T4DNA Ligase的加入量为120U。
2、exo I和exo III酶切
取步骤1得到的产物溶液(60μl)，按照表7依次加入试剂，完成加入后体系体积为64μl，混匀后，37℃反应30分钟。然后采用2.5倍体积XP磁珠纯化回收DNA并将纯化产物重新溶于42μl去离子水中，即为文库溶液。
表7
10×TA buffer 0.4μl
exo I 1.95μl
exo III 0.65μl
H2O 1μl
总体积 4μl
Exonuclease I，简称exo I：QIAGEN,X8010L；产品规格：20000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/exonuclease-i/。
Exonuclease III，简称exo III：QIAGEN,X8020L；产品规格：100000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/exonuclease-iii/。
表7(4μl)中，exo I的加入量为39U，exo III的加入量为65U。
七、测序及数据分析：
将单链环文库于BGI seq-500测序平台中进行双末端测序。分析数据时参考的序列为hg19(已知的全基因组序列)，比对h19.fa参考基因组得到甲基化胞嘧啶信息，统计所有序列每bp平均甲基化率，获取插入片段是否存在甲基化偏向性信息。
对比例1、
对比例1代表传统WGBS方法。
用表8取代表2，其他同实施例1。
表8
NF water 1.5μl
10X Polynucleotide Kinase Buffer 5μl
dNTP溶液 0.6μl
T4Polynucleotide Kinase 0.6μl
Klenow Fragment 0.1μl
rTaq DNA Polymerase 0.2μl
T4DNA Polymerase 2μl
总体积 10μl
表8制备的反应体系(10μl)中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为6U,KlenowFragment的加入量为0.5U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.5U，T4DNA Polymerase的加入量为6U。
dNTP溶液中提供的有效成分为dATP、dTTP、dGTP和dCTP。dNTP溶液中，dATP的浓度为125mM，dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为25mM。
T4DNA Polymerase：QIAGEN,P7080L；产品规格：3000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/t4-dna-polymerase/。
T4Polynucleotide Kinase：QIAGEN,Y9040L；产品规格：10000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/t4-polynucleotide-kinase/。提供配套的10XPolynucleotide Kinase Buffer(B9040)。
Klenow Fragment：QIAGEN,P7060L；产品规格：5000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/klenow-fragment/。
rTaq DNA Polymerase：TOYOBO Ideas&Chemistry,Code No.TAP-201 250U；产品规格：2.5U/μl；产品链接：https://www.toyobo-global.com/seihin/xr/lifescience/products/pcr_007.html。
对比例2、
对比例2代表改进方法，即在传统WGBS方法的基础上，将含四种dNTP的dNTP溶液改进为含三种dNTP的dNTP溶液(不含有dCTP)。
用表9取代表2，其他同实施例1。
表9
NF water 1.5μl
10X Polynucleotide Kinase Buffer 5μl
dNTP溶液 0.6μl
T4Polynucleotide Kinase 0.6μl
Klenow Fragment 0.1μl
rTaq DNA Polymerase 0.2μl
T4DNA Polymerase 2μl
总体积 10μl
表9制备的反应体系(10μl)中，T4Polynucleotide Kinase的加入量为6U,KlenowFragment的加入量为0.5U，rTaq DNA Polymerase的加入量为0.5U，T4DNA Polymerase的加入量为6U。
dNTP溶液中提供的有效成分为dATP、dTTP和dGTP。dNTP溶液中，dATP的浓度为125mM，dTTP和dGTP的浓度均为25mM。dNTP溶液中不含有dCTP。
T4DNA Polymerase：QIAGEN,P7080L；产品规格：3000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/t4-dna-polymerase/。
T4Polynucleotide Kinase：QIAGEN,Y9040L；产品规格：10000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/t4-polynucleotide-kinase/。提供配套的10XPolynucleotide Kinase Buffer(B9040)。
Klenow Fragment：QIAGEN,P7060L；产品规格：5000U/ml；产品链接：http://www.enzymatics.com/products/klenow-fragment/。
rTaq DNA Polymerase：TOYOBO Ideas&Chemistry,Code No.TAP-201 250U；产品规格：2.5U/μl；产品链接：https://www.toyobo-global.com/seihin/xr/lifescience/products/pcr_007.html。
实施例1、对比例1和对比例2中所用的基因组DNA是从知情同意的志愿者的胆管癌组织样本中提取的同一基因组DNA。
实施例1、对比例1和对比例2的步骤五得到的产物溶液，分别取样1μl，进行DNA定量，结果见表10。表10中，-1和-2分别代表两次重复试验的结果。对比例2的DNA产量最低，这是由于粘性末端里面需要C嘧啶修复的插入片段没能被修复，从而造成这部分的插入片段不能继续被扩增而导致最终的PCR产量低于其它两种末端修复方式。实施例的方法中同样不含C碱基，但是由于引入的DNA polymerase I具3′～5′和5′～3′活性，在不含C碱基下，5端突出的nick被具有5′～3′外切酶活性的DNA polymerase I切掉，提高了插入片段的连接效率，从而提高PCR产量，因此与对比例1的DNA产量相差很小。
表10
DNA定量结果(ng)
对比例2-1 235.5
对比例2-2 129.5
对比例1-1 445
对比例1-2 407.5
实施例1-1 472.5
实施例1-2 425
实施例1、对比例1和对比例2的步骤五得到的产物溶液，分别取样，进行2100检测，结果见图1至图7。结果表明，实施例1、对比例1和对比例2三种方法得到的产物溶液中的片段主带一致，片段分布没有太大区别，只是产量有差异，这与DNA定量的检测结果一致。
对比例1中步骤七的测序结果中，read1和read2在每个碱基下平均甲基化水平见图8，read2前端甲基化水平急剧下降，前20bp甲基化率较reads1偏低，用此方法进行后续数据分析时，需要截取20bp数据进行后续实验，这就会浪费五分之一的数据量。对比例2中步骤七的测序结果中，read1和read2在每个碱基下平均甲基化水平见图9，reads2仅前3bp甲基化率较reads1低。实施例1中步骤七的测序结果中，read1和read2在每个碱基下平均甲基化水平见图10，reads2仅前1-2bp甲基化率较低。对比例1代表传统WGBS方法，对比例2代表专利文献CN104532360的方法。相对于传统WGBS方法，本发明和专利文献的方法都能明显改善read2前端DNA甲基化水平偏向性问题，避免了将近五分之一数据量的浪费。
实施例1、对比例1和对比例2的步骤七的测序结果基本数据见表11。三种不同建库方法相同建库起始量相同PCR循环数下，在将近100G的数据量中，Dup率最低的是本发明，明显优于其它两种方法。
表11
Figure BDA0002196959290000151
实施例1、对比例1和对比例2的步骤七的测序结果的全基因组覆盖度情况见图11。在相同测序深度下，三种方法中，本发明的全基因组覆盖度都高于另外两种方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法
<130> GNCYX191259
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttgtcttcct aaggaacgac atggctacga tccgactt 38
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca annnnnnnnn ncaactcctt ggctcaca 58
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gaacgacatg gctacga 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgtgagccaa ggagttg 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gccatgtcgt tctgtgagcc aagg 24

Claims (10)

1.一种制备甲基化测序文库的方法，依次包括如下步骤：
(1)在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶包括DNA PolymeraseI；
(2)连接甲基化修饰接头；
(3)进行亚硫酸盐处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：
(4)PCR扩增。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：
(5)单链环化。
4.一种制备甲基化测序文库的方法，包括末端修复和加A的步骤，其特征在于：
在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶包括DNA Polymerase I。
5.一种制备甲基化测序文库中进行末端修复和加A的方法，其特征在于：
在同一体系内进行双链DNA片段的末端修复和加A；在末端修复和加A的反应体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶包括DNA Polymerase I。
6.一种制备甲基化测序文库的方法，包括末端修复的步骤，其特征在于：
在末端修复的体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶包括DNAPolymerase I。
7.一种制备甲基化测序文库中进行末端修复的方法，其特征在于：
在末端修复的体系中，加入的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP和dGTP，加入的酶包括DNAPolymerase I。
8.一种制备甲基化测序文库的试剂盒，包括组件1、组件2和组件3；
所述组件1用于末端修复和加A；所述组件1包括dNTP和DNA PolymeraseI；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成；
所述组件2用于连接甲基化修饰接头；
所述组件3用于进行亚硫酸盐处理。
9.一种制备甲基化测序文库中进行末端修复和加A的试剂盒，包括dNTP和DNAPolymerase I；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成。
10.一种制备甲基化测序文库中进行末端修复的试剂盒，包括dNTP和DNA PolymeraseI；所述dNTP由dATP、dTTP和dGTP组成。
CN201910851085.7A 2019-09-10 2019-09-10 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法 Active CN112553298B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910851085.7A CN112553298B (zh) 2019-09-10 2019-09-10 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910851085.7A CN112553298B (zh) 2019-09-10 2019-09-10 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112553298A CN112553298A (zh) 2021-03-26
CN112553298B true CN112553298B (zh) 2023-06-23

Family

ID=75028710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910851085.7A Active CN112553298B (zh) 2019-09-10 2019-09-10 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112553298B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101230490A (zh) * 2008-02-26 2008-07-30 北京林业大学 一种染色体步移文库的构建方法
CN102409408A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法
CN102796808A (zh) * 2011-05-23 2012-11-28 深圳华大基因科技有限公司 甲基化高通量检测方法
CN104532360A (zh) * 2014-12-17 2015-04-22 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 全基因组甲基化测序文库及其构建方法
CN105274629A (zh) * 2015-11-17 2016-01-27 安诺优达基因科技(北京)有限公司 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒
WO2018090373A1 (zh) * 2016-11-21 2018-05-24 深圳华大智造科技有限公司 一种dna末端修复与加a的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101230490A (zh) * 2008-02-26 2008-07-30 北京林业大学 一种染色体步移文库的构建方法
CN102409408A (zh) * 2010-09-21 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法
CN102796808A (zh) * 2011-05-23 2012-11-28 深圳华大基因科技有限公司 甲基化高通量检测方法
CN104532360A (zh) * 2014-12-17 2015-04-22 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 全基因组甲基化测序文库及其构建方法
CN105274629A (zh) * 2015-11-17 2016-01-27 安诺优达基因科技(北京)有限公司 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒
WO2018090373A1 (zh) * 2016-11-21 2018-05-24 深圳华大智造科技有限公司 一种dna末端修复与加a的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing;Michael J Ziller等;《Nat Methods》;第12卷(第3期);第230-232页 *
DNA修饰及其检测方法研究;张莉君;《中国优秀硕士论文全文数据库基础科学辑》(第3期);第A006-21页 *
Improved tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing for input DNA from less than 100 mammalian cells;Hanlin Lu等;《Epigenomics》;第7卷(第1期);第47-56页 *
代测序技术及其应用研究进展;马丽娜等;《中国畜牧兽医》;第46卷(第8期);第2246-2256页 *
高通量检测全基因组DNA甲基化方法的建立;张锋;虞闰六;任绪义;;中华肿瘤防治杂志(21);第19-22页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112553298A (zh) 2021-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11873529B2 (en) Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays
JP6571895B1 (ja) 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法
EP1147217B1 (en) A method of dna sequencing
CN107541546B (zh) 用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒
US9745614B2 (en) Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
EP2619329B1 (en) Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
CA2910861C (en) High throughput screening of mutagenized populations
CN110699426B (zh) 基因目标区域富集方法及试剂盒
US20020058250A1 (en) Extraction and utilisation of vntr alleles
CN113046413A (zh) 从血液特异性靶向捕获人类基因组和转录组区域的方法
US10465241B2 (en) High resolution STR analysis using next generation sequencing
CN110886021B (zh) 一种单细胞dna文库的构建方法
WO2014182574A1 (en) Enrichment of dna sequencing libraries from samples containing small amounts of target dna
US20050100911A1 (en) Methods for enriching populations of nucleic acid samples
US20190169603A1 (en) Compositions and Methods for Labeling Target Nucleic Acid Molecules
CN111378720A (zh) 长链非编码rna的测序文库构建方法及其应用
CN110699425B (zh) 基因目标区域的富集方法及体系
EP4083205A1 (en) Double-stranded nucleic acid molecules and method for removing glass adaptor in dna library by means of same
CN112553298B (zh) 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法
CN111020711A (zh) 一种带有分子标签的单链建库方法和接头组合、试剂盒
WO2018081666A1 (en) Methods of single dna/rna molecule counting
CN115996938A (zh) 用于免校准和多重变体等位基因频率定量的定量阻断剂置换扩增（qbda）测序
KR20220063169A (ko) 폴리뉴클레오타이드 분자 집단의 생성 방법
WO2024063036A1 (ja) ゲノムｄｎａのメチル化検出法
CN113490750B (zh) 微量dna甲基化高通量测序方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant