CN111378720A - 长链非编码rna的测序文库构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用。其中，该长链非编码RNA的测序文库构建方法包括：对所述待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物；基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列；将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好。

Description

长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用。更具体地，本发明涉及长链非编码RNA的测序文库构建方法，和对长链非编码RNA进行测序的方法。

背景技术

全基因组范围内的转录组分析被广泛应用，早期的方法是从大量的组织样品中获取RNA进行测序。但此传统方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达，往往会掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的基因表达差异。并且，在健康组织或肿瘤等病变组织中，某些细胞的数量稀少，除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进行分析。

单细胞基因表达分析则克服了这些局限，可用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。将此技术应用于临床，理论上可以在生理或病理情况下连续追踪基因表达的动力学变化，从而监测疾病的进展。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚细胞成分的基因表达谱，例如对在神经元的轴突或树突部分特异表达的基因的转录组进行分析，这些基因往往对细胞的生物学功能发挥着重要作用。

目前常用的Smart-seq测序方法，产生的cDNA分子的链长更长并具有更高的产量，同时，覆盖度高并且有更低的技术偏差。但基于Smart-seq的真核细胞单细胞RNA-seq程序，仅限于检测具有poly(A)尾巴的mRNA(poly(A)+RNAs)。然而，有大量的非多聚腺苷酸RNA(poly(A)-RNA)在哺乳动物细胞中表达。标准的方法依赖于Oligo(dT)来启动逆转录(RT)。通过Oligo(dT)启动，可避免无信息核糖体RNA(rRNA)测序读长的优势，否则它们占哺乳动物细胞总RNA的90％。然而，这种方法不可避免地会排除其他没有poly(A)尾巴的RNA的信息。

因此，基于RNA的高通量基因测序方法仍有待于进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种长链非编码RNA的测序文库构建方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

发明人发现使用RNase H法去除rRNA就可以解决上述技术中存在的不足。RNase H是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解rRNA/rRNA杂交DNA探针中的rRNA。根据RNase H的这个特性，发明人设计针对去除相应物种rRNA的杂交探针，如针对人、小鼠和大鼠rRNA(包括细胞质28S,18S,5S rRNA以及线粒体12S,5.8S rRNA)设计相应rRNA探针。然后，将rRNA去除探针和单细胞RNA进行杂交，用RNaseH消化与rRNA去除探针杂交互补的rRNA，最后再用DNase I消化去除rRNA去除探针和单细胞中的基因组DNA。并且，发明人对逆转录的引物进行了优化处理，使逆转录仅针对长链非编码RNA(lncRNA)，避免了mRNA的干扰，从而构建针对lncRNA的测序文库。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种长链非编码RNA的测序文库构建方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对所述待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物；基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列；将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。

发明人惊奇的发现，该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该方法尤其适用于单细胞的文库构建。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种对长链非编码RNA进行测序的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前述的方法构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得所述待测样本的序列信息。

根据本发明的对待测样本进行测序的方法，其中构建测序文库先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该测序文库尤其适用于单细胞的测序，并且测序的效率更高，特异性和灵敏性好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的长链非编码RNA的测序文库构建方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的对长链非编码RNA进行测序的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

长链非编码RNA的测序文库构建方法

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种长链非编码RNA的测序文库构建方法。发明人惊奇的发现，该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该方法尤其适用于单细胞的文库构建。

参考图1，根据本发明的实施例，对该长链非编码RNA的测序文库构建方法进行解释说明，该方法包括：

S10 去除rRNA处理

根据本发明的实施例，对待测样本进行去除rRNA处理，得到去除rRNA的产物。由此，通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行后续的逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除。

根据本发明的实施例，该去除rRNA处理包括：将待测样本与rRNA去除探针进行杂交处理，得到杂交产物，该杂交产物为rRNA/rRNA杂交DNA探针杂交双链；利用RNase H去除杂交产物中的rRNA；利用DNase I去除杂交产物中的DNA，其中，该DNA即包括rRNA去除探针，还包括样本中含有的DNA，从而去除DNA对后续实验的影响。由此，通过该去除rRNA处理，快速高效去除待测样本中的rRNA和DNA，其中，去除了rRNA增加了有效数据的比例，而去除了DNA，可以避免了基因表达干扰，并且，方法简单，易操作，成本低。根据本发明的实施例，该杂交处理是利用PCR进行的，该PCR的条件是95℃，2分钟；95-22℃，0.1℃/秒；22℃，5分钟。由此，该条件下rRNA去除探针与rRNA结合的结合率高，特异性好。

根据本发明的实施例，该rRNA去除探针为DNA，其序列需根据不同的物种进行设计，例如针对人/小鼠/大鼠rRNA(包括细胞质28S、18S和5S rRNA以及线粒体12S和5.8SrRNA)设计相应rRNA去除探针。一般地，rRNA去除探针是DNA序列，该去除探针与rRNA反向互补，覆盖度为rRNA序列的50-100％。根据本发明的实施例，该rRNA去除探针的长度是50-120bp。rRNA去除探针的长度适宜，覆盖度大，特异性和灵敏度高，有利于充分去除rRNA。根据本发明的一些实施例，rRNA去除探针的终浓度为600-1500ng/μl。由此，有利于充分去除样本中的rRNA。

S20 逆转录处理

根据本发明的实施例，基于去除rRNA的产物进行逆转录处理，得到单链DNA，其中，该逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列，序列如下所示：

5'-GTCGACGGCGCGCCGGATCCATANNNNNNNNN-3'(SEQ ID NO：1)

该逆转录引物又一段随机引物序列(NNNNNNNNN)和一段锚定序列(GTCGACGGCGCGCCGGATCCATA)组成，由于mRNA的3’末端为polyA，为了使逆转录定向地增强对lncRNA的逆转录，同时，促进lncRNA的序列得以逆转录，发明人采用了随机引物与lncRNA结合，从而，随机扩增出关于lncRNA的cDNA片段组，而且，发明人通过对常规的单细胞样本中的lncRNA的含量进行测算，根据lncRNA的含量确定了随机引物序列，即含有9个N碱基；进一步地，为了保证cDNA片段组中各片段的全长得以全部扩增，发明人在引物中设计了锚定序列，从而使后续的第一扩增处理中，扩增引物与该锚定序列特异结合，保证各cDNA片段完整的扩增出来。

根据本发明的实施例，该逆转录处理是利用smart-seq法进行的，其中，该smart-seq法可以是smart-seq或smart-seq2。由于smart-seq法使用于微量RNA的逆转录，从而，利用smart-seq法可以针对单细胞样本等lncRNA含量很少的样本进行逆转录。

根据本发明的实施例，该逆转录处理的反应缓冲液成分可以包括：Triton X-100、0.2％RNase inhibitor和2U/μL Enzymatics。由此，逆转录的效率高、效果好。

进而，根据本发明的实施例，该待测样本为单细胞。由于单细胞中lncRNA的含量少，常规的逆转录方法难以对其进行逆转录，利用smart-seq法可以实现该单细胞中微量lncRNA的逆转录，从而使本发明实施例的长链非编码RNA的测序文库构建方法尤其适用于单细胞样本。

在此需要说明的是，标准的smart-seq方法通常依赖于Oligo(dT)来启动逆转录(RT)Oligo(dT)不仅会排除其他没有poly(A)尾巴的RNA的信息，例如本发明特异逆转录的lncRNA，还会使大量的mRNA被逆转录出来，干扰了lncRNA的转录组测序文库。所以，发明人设计了前述的具有随机序列的逆转录引物，使smart-seq法应用于lncRNA的特异逆转录。

S30 第一扩增处理

根据本发明的实施例，将单链DNA进行第一扩增处理，得到双链DNA。其中，该单链DNA为不纯化的单链DNA。

根据本发明的实施例，该第一扩增处理可以采用PCR扩增，该PCR反应体系如下：

第一扩增引物：10μM，序列：5′-GTCGACGGCGCGCCGGATCCATA-3′(SEQ ID NO：2)

反应程序如下：

98℃、3min，(98℃、15s，67℃、20s，72℃、6min)×18cycles，72℃、5min，4℃保存。

S40 片段化处理

根据本发明的实施例，将双链DNA进行片段化处理，得到DNA片段。由此，DNA片段易于进行后续的第二扩增处理。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：在片段化处理后，第二扩增处理前，对该DNA片段进行酶切处理，得到酶切产物。由此，通过酶切处理去除第一扩增的引物，增加有效数据比例，增强测序数据质量。

根据本发明的实施例，该酶切处理是利用RsaI限制性内切酶进行的。由此，该内切酶可以特异性切除第一扩增的引物。

S50 第二扩增处理

根据本发明的实施例，将DNA片段进行第二扩增处理，该第二扩增的产物构成测序文库。根据本发明的实施例，可以在扩增后，对产物进行分离纯化，分离纯化扩增产物的方法不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以通过磁珠纯化。

根据本发明的实施例，该第二扩增处理包括:对DNA片段进行末端修复，得到经过末端修复的DNA片段，从而便于添加碱基“A”；在该经过末端修复的DNA片段的末端添加碱基A，得到末端具有碱基A的DNA片段，从而便于后续连接接头；将该末端具有碱基A的DNA片段与接头相连，得到连接产物；将该连接产物进行PCR扩增，得到第二扩增的产物。

根据本发明的实施例，接头的类型不受特别的限制，可以根据实验需要进行选择。根据本发明的实施例，将DNA片段与接头相连前，可以预先通过磁珠对该DNA片段进行纯化。

根据本发明的实施例，可以在第二扩增后，对第二扩增产物进行分离纯化，分离纯化扩增产物的方法不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以通过磁珠纯化。

对长链非编码RNA进行测序的方法

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种对长链非编码RNA进行测序的方法。根据本发明的对待测样本进行测序的方法，其中构建测序文库先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该方法尤其适用于单细胞的测序，并且测序的效率更高，特异性和灵敏性好。

参考图2，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：

S100 构建测序文库

根据本发明的实施例，利用前述的方法构建测序文库。由此，先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好，尤其适用于微量RNA样本中的rRNA去除，从而，该测序文库尤其适用于单细胞的测序。

S200 测序

根据本发明的实施例，对该测序文库进行测序，获得待测样本的序列信息。

进一步地，根据本发明的实施例，该测序可以采用双端测序，例如利用Illumina平台(例如HiSeq4000或HiSeq X Ten或NextSeq500)进行的双端测序。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

采用本发明实施例的方法分别构建两个人样本(编号CS20161012和CS20161013)、一个大鼠和一个小鼠的单细胞lncRNA转录组测序文库，具体如下：

1、RNase H法去除rRNA

1.1 分别收集各样本的单细胞，将0.5μl单细胞置于0.2ml薄壁PCR管中，其中包含0.1μl rRNAProbe(H(人)/M(小鼠)/R(大鼠))、0.3μl Probe Buffer和0.1μl二甲基硅油，用Nuclease-free water补足1.5μl。

1.2 瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序操作，总共耗时约15-20分钟。

95℃ 2min

95-22℃ 0.1℃/sec

22℃ 5min

瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上，立即进入下步操作。

1.3 RNase H消化

1.3.1 在冰上制备如下反应液：

用移液器轻轻吹打混匀。

1.3.2 将样品置于PCR仪中，37℃作用30分钟。

1.3.3 瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上，立即进入下步操作。

1.4 DNase I消化：

1.4.1 在冰上制备如下反应液：

用移液器轻轻吹打混匀。

1.4.2 将样品置于PCR仪中，37℃作用30分钟。

1.4.3 瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上，立即进入下步操作。

1.5 使用2.2倍体积AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)对收集的样品进行磁珠纯化。

2、逆转录扩增cDNA

2.1 将“步骤1”中去除rRNA的0.5μl单细胞RNA加入到0.2mL薄壁PCR管中，其中包含2μl反应缓冲液，反应缓冲液成分如下：

Triton X-100、0.2％Sigma RNase inhibitor、2U/μL Enzymatics

2.2 反应缓冲液和1μl逆转录引物，1μl dNTP mix混合，在72℃3min进行变性并立刻放于冰上，然后，加入7μl的一链反应体系，反应体系包含如下：

逆转录引物：

10μM,5′-GTCGACGGCGCGCCGGATCCATANNNNNNNNN-3′(SEQ ID NO：1)

反转录反应程序如下：

42℃90min，(50℃2min,42℃2min)×10cycles，70℃15min，4℃保存。

2.3 在不纯化一链cDNA中，直接加入二链合成的PCR反应体系，把一链合成反应体系考虑成11μl，据此调节水的体积。PCR反应体系如下：

扩增引物：10μM,5′-GTCGACGGCGCGCCGGATCCATA-3′(SEQ ID NO：2)

反应程序如下：

98℃3min，(98℃、15s，67℃、20s，72℃、6min)×18cycles，72℃、5min，4℃保存。

2.4 用1倍AMPureXP磁珠(Beckman Coulter)纯化，然后，用15μl洗脱缓冲液EB洗脱，再使用Qubit HS检测cDNA浓度。

2.5 不用稀释直接用Agilent 2100bioanalyzer高灵敏DNA芯片检测cDNA峰图，片段大小在1.5～2.0kb。

3、DNA小片段文库构建

3.1 取20ng扩增产物cDNA，置于0.5ml低吸附离心管中，加入10mM Tris-EDTA缓冲液补充体积至75μl。在提前预冷4℃循环水的Bioruptor超声打断仪上进行200bp小片段超声打断，程序设置为：打断30s，冷却30s，进行22个循环。

3.2 配制末端修复反应体系，单个样本反应体系如下：

将样本置于PCR仪中，20℃温浴30min，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于32μl洗脱缓冲液EB中回收DNA。

3.3 配制加A反应体系，单个样本反应体系如下：

将末端修复后的样本置于PCR仪中，37℃温浴30min，使用1.8倍体积AmpureXP磁珠纯化，溶于18μL洗脱缓冲液EB中回收DNA。

3.4 配制加Adapter反应体系，单个样本反应体系如下：

将加A碱基的样本置于PCR仪中，20℃温浴15min，使用1.8倍体积AmpureXP磁珠纯化，溶于25μl洗脱缓冲液EB中回收DNA。

3.5 配制PCR反应Mix，单个样本反应体系如下：

对于样本human-1，使用Index-67；对于样本human-2，使用Index-69；对于样本mouse-1，使用Index-66；对于样本rat-1，使用Index-68。

Index-66：

5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTAACCTGTGACTGGAGTTC-3′(SEQ ID NO：3)

Index-67：

5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTGCAACGTGACTGGAGTTC-3′(SEQ ID NO：4)

Index-68：

5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAATTGAGGTGACTGGAGTTC-3′(SEQ ID NO：5)

Index-69：

5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGACTTGGTGACTGGAGTTC-3′(SEQ ID NO：6)

反应程序如下：

94℃、2min，(94℃、15s，62℃、30s，72℃30s)×10cycles，72℃、10min，4℃保存。

3.6 配制2％Bio-Rad Low Range Ultra琼脂糖凝胶，切胶回收PCR产物中320-370bp范围条带，使用康为世纪快速琼脂糖凝胶回收试剂盒进行DNA回收，最终溶于44μl EBsolution。

4、RsaI限制性内切酶处理

4.1 使用RsaI限制性内切酶处理回收的DNA文库。

RsaI酶切反应体系如下：

将样本置于PCR仪中，37℃温浴15min，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于25μl缓冲液EB中回收DNA。

4.2 使用与“步骤2.5”中PCR相同的反应体系和Index，PCR扩增5个循环，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于20μl缓冲液EB中回收DNA，回收得到的DNA即为最终文库。

文库构建完成后，使用Agilent 2100bioanalyzer对文库进行检测，insert size检测合格后，使用Bio-RADCFX96荧光定量PCR仪，Bio-RAD KIT iQSYBRGRN进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量，然后，在HiSeq X Ten测序平台上运行双端测序程序(PE150)，得到150bp的双端测序reads。

对于2个人的样本(编号CS20161012和CS20161013)，所构建的文库信息如表1所示。

对比例

将人样本CS20161010和CS20161011以SUPeR-seq方法建库，过滤后数据质控如表1所示。

表1 数据质控

其中有效数据率是指：经过数据过滤，除去不合格reads之后剩余的reads为有效数据，其占总reads的比例即为有效数据比例(clean reads rate)。

由上述表1的对比可知：采用常规的SUPeR-seq方法构建2个文库的rRNA MappingRate比例较高，约9.8-12.2％，造成了测序数据的浪费。对于人的样本，采用本发明实施例1的方法构建的2个文库的rRNA Mapping Rate比例降至0.5-1.63％，Mapping rate明显下降，表明实施例1的测序的有效数据量显著提高，可明显降低成本。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 浙江安诺优达生物科技有限公司

安诺优达基因科技（北京）有限公司

<120> 长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用

<130> 1625-1

<141> 2018-12-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtcgacggcg cgccggatcc atannnnnnn nn 32

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtcgacggcg cgccggatcc ata 23

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agatgttaac ctgtgactgg agttc 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatgttgca acgtgactgg agttc 45

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agattaattg aggtgactgg agttc 45

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agattagact tggtgactgg agttc 45

Claims (10)

1.一种长链非编码RNA的测序文库构建方法，其特征在于，包括：

对待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物，其中，所述去除处理是利用rRNA去除探针进行的；

基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列；

将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；

将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及

将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除rRNA处理包括：

将所述待测样本与rRNA去除探针进行杂交处理，以便得到杂交产物；

利用RNase H去除所述杂交产物中的rRNA；以及

利用DNase I去除所述杂交产物中的DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂交处理是利用PCR进行的，所述杂交处理的条件是95℃，2分钟；95-22℃，0.1℃/秒；22℃，5分钟。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述rRNA去除探针的长度是50-120bp。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录处理是利用smart-seq法进行的。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

在所述片段化处理后，所述第二扩增处理前，对所述DNA片段进行酶切处理，以便得到酶切产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶切处理是利用RsaI限制性内切酶进行的。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二扩增处理包括：

对所述DNA片段进行末端修复，以便得到经过末端修复的DNA片段；

在所述经过末端修复的DNA片段的末端添加碱基A，以便得到末端具有碱基A的DNA片段；

将所述末端具有碱基A的DNA片段与接头相连，以便得到连接产物；以及

将所述连接产物进行PCR扩增，以便得到所述第二扩增的产物，

任选地，所述待测样本为单细胞。

9.一种对长链非编码RNA进行测序的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1-8任一项所述的方法构建测序文库；以及

对所述测序文库进行测序，以便获得所述长链非编码RNA的序列信息。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本为单细胞。

Images