CN107858409B - 一种微量降解基因组dna甲基化建库测序方法及其试剂盒 - Google Patents

一种微量降解基因组dna甲基化建库测序方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，本发明通过测试不同建库技术，优化反应流程，建立了一种可以检测低至1ng严重降解基因组DNA的甲基化建库技术。通过测试不同酶组合，实现了降解DNA的末端修复、3端加A和DNA双链由于降解形成缺口的修复，在同一反应体系中完成；通过优化反应体系，实现在原反应液中连接测序接头；进一步测试接头生物素标记后，通过生物素和链霉素磁珠的特异性结合，实现后续亚硫酸盐处理前已连接接头基因组片段的钓取，减少目的片段的丢失；此外还优化建立亚硫酸盐反应体系和反应时间，降低处理过程中DNA的损伤，保证甲基化转换率，实现微量降解样本的甲基化建库和测序。

Description

一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及基因组学和分子生物技术领域，尤其涉及一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法。
背景技术
DNA甲基化5mC是甲基转移酶(DNAmethyltransferase，MTase)介导的甲基供体S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)分子中的甲基基团转移到DNA胞嘧啶上的过程。在真核生物中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸胞嘧啶的5碳位上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA的甲基化修饰涉及动物胚胎发育、基因印迹和X染色体失活等过程，对基因的表达调控起重要作用。DNA甲基化修饰紊乱为胚胎异常发育、癌症发病机制的探索提供了新思路。为满足不同科研需求，在过去数十年中，已建立多种DNA甲基化检测方法，如甲基化胞嘧啶消化分离结合高效液相色谱法、毛细管电泳法，基于生物亲和蛋白结合荧光标记显色或免疫显色的甲基化检测技术等，均可分析DNA整体甲基化水平，但无法得知每一个位点的甲基化情况。
随着高通量测序技术的发展，DNA亚硫酸盐测序可以精确检测每一个碱基的甲基化水平，被誉为DNA甲基化检测的“金标准”。常规基因组DNA甲基化测序前建库构建需要微克级别，至少几百纳克的无降解、无污染完整的基因组DNA，建库流程包括：(1)基因组超声打断；(2)打断产物纯化浓缩；(3)片段化产物末端修复；(4)纯化回收；(5)修复产物3’端加“A”；(6)纯化回收；(7)加A产物连接“C”位点甲基化修饰的接头；(8)纯化回收；(9)亚硫酸盐处理及纯化回收；(10)文库PCR扩增；(11)纯化及质控等十多步骤的操作。由于操作步骤的繁琐，增加了DNA的起始量，微量DNA无法进行全基因组甲基化检测。此外，亚硫酸盐处理过程中，对于DNA的损伤及其严重，90％以上的DNA将发生断裂和片段化，进一步导致已连接测序接头的大部分片段无法正常测序，这又进一步增加了所需要的起始DNA量。
上述建库方法除了DNA起始量的要求高外，更难以应用到严重降解样品DNA的甲基化建库测序。而实际上，除了科研探索对于微量DNA甲基化技术有需求外，临床痕量样本甲基化检测技术的建立也亟需解决。体内组织DNA的提取只能采取侵入式采集，这种方式不仅操作麻烦还有可能对人体造成严重伤害。研究发现，组织来源DNA除了存在于体内，还存在于动物和人的体液中，目前在外周血、脑脊液，唾液、支气管灌洗液、胸腹腔积液、胃液、胆汁中均可检测到循环游离DNA(cfDNA)，同样可以检测到病灶组织来源的游离DNA，例如来源于肿瘤组织的循环肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)，这为疾病的预防和控制提供了理想的检测靶标。然而，临床病理检测的穿刺组织在福尔马林浸泡，石蜡包埋处理后(FFPE样本)及人体静脉外周血、粪便、尿液等分离的胞外游离DNA(cfDNA)含量极低，通常只有几纳克，且均存在严重降解的情况，部分DNA已降解到100bp以下。对于该类样品的基因组DNA甲基化建库测序技术或相关试剂盒产品少有报道。
随着单细胞测序技术的发展，单细胞基因组测序和单细胞转录组测序技术已经常态化。近年来，单细胞甲基化组测序技术的文章也已发表，国内也有相应的专利公开(申请公布号CN106283198A，专利名称：用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法)，实现了一个细胞水平的甲基化检测。其基本原理为单细胞裂解后，直接对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，处理产物通过含有接头序列的随机引物(N9)在模板两端随机延伸，形成测序文库。虽然该技术降低了DNA的起始量至1个细胞，然而由于随机延伸的偏好性，最多只能覆盖10％的基因组范围；另外一种单细胞甲基化测序技术，则通过细胞裂解后直接MspI酶切，形成5’端突出CG二核苷酸的DNA片段，产物进一步通过Klenow Fragment(exo-)进行3’端补平和加A，进一步在T4DNA连接酶的作用下，连接甲基化接头和亚硫酸盐处理、PCR扩增完成文库构建。该技术根据酶切后DNA片段序列特征单一的性质，优化反应体系，实现了末端补平、3’端加A和接头连接各步反应在一个管子中完成，减少了纯化和转管次数，实现单细胞酶切后片段化微量DNA的甲基化检测。上述两种方法虽然均实现了DNA的低起始量，但是都不适用于自身严重降解DNA片段的甲基化建库测序。自然降解的DNA片段序列特征复杂，有的片段3’端突出，有的片段5’端突出，还有极大部分的DNA片段在双链的不同位置处存在一条链降解的情况，形成缺口。因此无法检测穿刺FFPE、cfDNA等严重降解微量样本的基因组甲基化建库测序。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过测试不同建库技术，优化反应流程，建立了一种可以检测低至1ng严重降解基因组DNA的甲基化建库技术。通过测试不同酶组合，实现了降解DNA的末端修复、3端加A和DNA双链由于降解形成缺口的修复，在同一反应体系中完成；通过优化反应体系，实现在原反应液中连接测序接头；进一步测试接头生物素标记后，通过生物素和链霉素磁珠的特异性结合，实现后续亚硫酸盐处理前已连接接头基因组片段的钓取，减少目的片段的丢失；此外还优化建立亚硫酸盐反应体系和反应时间，降低处理过程中DNA的损伤，保证甲基化转换率，实现微量降解样本的甲基化建库和测序。
一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，方法步骤如下：
S1：将提取的DNA样品用超纯水或EB缓冲液进行洗脱，样品洗脱体积不超过30uL；
S2：DNA末端修复、3’端加A及降解缺口修复：基因组DNA片段在Repair Buffer和Repair Enzymes的作用下，分别在16-42℃、20-40min；75℃、25min；72℃、10-60min三个阶段进行反应，20℃保存，分别进行DNA的末端修复、3’端加A及双链DNA降解缺口的修复；
S3：修复DNA片段的接头连接及钓取：在上述反应体系中，分别加入连接Buffer A、Buffer B、甲基化和生物素共同修饰的接头及DNA连接酶，15-24℃反应10-30min，进行接头连接，连接产物通过链霉素标记的M280钓取连接接头的DNA片段，实现连接产物和未连接产物有效分离。对于未能成功捕获的未连接原始基因组DNA片段，可以再次连接，提高原始基因组的建库率；连接产物同样可以运用Agencourt AMPure DNA XP Beads或MiniElute PCRPurification Kit等不同的试剂盒进行回收纯化。
接头序列：
5’Phos-GATmCGGAAGAGmCAmCAmCGTmCTGAAmCTmCmCAGTmCAmC-Bio
5’Bio-TAmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT
可代替的接头序列包括：
5’Phos-GATmCGGAAGAGmCTmCGTATGmCmCGTmCTTmCTGmCTT-Bio
5'Phos-GATmCGGAAGAGmCGGTTmCAGmCAGGAATGmCmCGAG-Bio
5'Phos-GATmCGGAAGAGmCAmCAmCGTmCT-Bio
S4：亚硫酸盐处理，非甲基化C碱基转换：在回收产物中加入1uL的亚硫酸盐保护剂和增强剂，75uL的亚硫酸盐转换液，98℃反应5min，54℃反应1小时，加入300uL的Bindingbuffer进行柱纯化，产物脱磺酸基后洗脱到超纯水中；
S5：PCR扩增、质控和测序：对于亚硫酸盐转换的DNA为模板，采用扩增酶形成稳定的PCR扩增反应体系；PCR产物经0.9X磁珠纯化，质控合格后进行测序。
S6：测序数据质控及分析：下机数据分别进行去接头，低质量值reads过滤和统计，甲基化转换率统计，比对及比对率统计，基因组覆盖度统计，重复率统计，计算每一位点甲基化水平。
优选地，所述S1中样本DNA的使用量≥1ng。
优选地，所述S2中Repair Buffer的成分包括MgCl2、NaCl、DTT、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Tris-HCl，且浓度分别为10mM、50mM、5mM、4mM、1mM、1mM、1mM、60mM，所述Tris-HCl的pH值为7.6。
优选地，所述S2中Repair Enzymes包括DNA Polymerase I、T4DNA Polymerase、Klenow Fragment、Klenow Fragment(exo-)、T4Polynucleotide Kinase、PCR polymerase、Bst和T4DNA ligase、Taq polymerase中的一种或多种。
优选地，所述S2中Repair Enzymes为T4Polynucleotide Kinase、T4DNAPolymerase和Taq polymerase，且浓度分别为8U、2U、0.04U。
优选地，所述S3中Buffer A包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP，且浓度分别为190mM、27mM、14mM、7mM；Buffer B包括PEG6000和PEG8000，PEG6000的浓度为30％，PEG8000的浓度为20％。
优选地，所述S5中的扩增酶为taq酶或高保真酶。
优选地，所述S5中的扩增酶为taq酶，taq酶的筛选扩增效率高、偏好性地、基因组覆盖度高。
本发明中的有益效果：
本发明提出的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，该方法具有以下优点：
1、严重降解基因组样品甲基化可检测性：基因组DNA由于降解的原因，其片段长度显著减少。严重情况，例如FFPE样本，其片段范围可低至100bp以下，同时对于未完全片段化的样品，由于DNA双链可能部分降解，存在缺口，即使成功连接接头，在亚硫酸盐处理过程中，双链分离，也导致连接接头的DNA后续无法扩增。该技术方法在前期建库过程中，通过taq酶的扩增，可以使一条链中的缺失碱基进行扩增，同时再加入DNA连接酶，完成缺口修复，可以检测严重降解DNA的甲基化水平；
2、微量DNA(低至5ng)甲基化精确检测：传统DNA甲基化测序，亚硫酸盐处理前建库包括末端修复、末端加A和接头连接三步。与其它方法相比，如随机延伸，可以降低实验过程中的偏好性，并在最后数据中去除建库过程中的偏好性和重复性，实现对于整个下机数据，过滤后，每一条测序reads均代表不同细胞的甲基化水平，同一基因位置的所有reads均来自于不同的细胞。DNA甲基化检测更加准确。该技术保留所有传统技术方法的优点，通过测试不同的酶组合，减少实验流程，提高各步骤反应效率，减少纯化丢失，使起始量DNA尽可能多的被检测到，达到低起始量的目的。
3、连接接头DNA片段富集，特异性的钓取成功连接接头的文库进行亚硫酸盐处理，实现成功连接和未连接接头的DNA片段有效分离，实现二次连接。未钓取的DNA片段可以二次或多次连接，提高原始基因组的利用率。通过连接生物素标记的甲基化接头，运用链霉素磁珠将所有已连接接头的DNA片段特异性捕获，提高纯化效率，实现磁珠-DNA复合体一起进行亚硫酸盐处理，降低DNA的损失。
4、甲基化转换过程中DNA保护剂和反应增强剂：对于微量的DNA，通过添加脱嘌呤保护剂和亚硫酸盐转化增强剂，保证亚硫酸盐转换效率及处理过程中DNA的损伤。
5、建库过程，无需转管，可在一个管之中完成所有的建库流程，对于微量样品，降低了外源DNA的污染，同时节约了成本。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明提出的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法的算法整体流程图；
图2为实施例1中FFPE样品A穿刺组织提取DNA片段分布2100检测结果；
图3为实施例1中PCR产物2100检测结果如图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
试剂的配置：
Repair Buffer的成分包括MgCl2、NaCl、DTT、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Tris-HCl，且浓度分别为10mM、50mM、5mM、4mM、1mM、1mM、1mM、60mM，其中Tris-HCl的pH值为7.6；
Repair Enzymes为T4Polynucleotide Kinase、T4DNA Polymerase和Taqpolymerase，且浓度分别为8U、2U、0.04U；
Buffer A包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP，且浓度分别为190mM、27mM、14mM、7mM；
Buffer B包括PEG6000和PEG8000，PEG6000的浓度为30％，PEG8000的浓度为20％
实施例2
严重降解FFPE样品DNA甲基化建库
运用商业化试剂盒(Qiagen FFPE提取试剂盒)提取基因组DNA，以一个穿刺微量组织玻片提取DNA后，甲基化建库为例，DNA洗脱到30ul的超纯水中。
1、分别取1uL的样品进行Qubit HS dsDNA浓度测定及2100分析仪评估样品降解程度(如图2)，结果显示，样品在50bp-10kb的区间，几乎均匀分布，样品完全降解，Qubit检测结果样品总量为23ng。
2、不同区间范围DNA筛选及打断：在30ul的DNA样品中，加入19.5ul的Ampure XPBeads(Agencourt)作用3min，于磁力架上吸附磁珠。澄清后，将上清转移到一个新的EP管中，再加入30uL的Ampure XP Beads(Agencourt)反应5min，弃上清，新鲜配制的80％的乙醇洗涤磁珠一次，弃酒精，室温放置2min，洗脱至20uL的EB中；对于第一步作用3min取上清后的磁珠，用75％乙醇洗涤一次，弃酒精，室温放置2min，洗脱至10uL的EB中，使用Bioruptor或Covaris打断仪超声打断，超声破碎25秒，暂停30秒，8个循环；打断后将所有DNA片段合并得30ul的建库前DNA片段。
3、单管片段化微量DNA文库构建
在30uL的DNA样品中依次加入5uL的DNA Repair Buffer，2uL的Repair Enzymes和13uL的超纯水，混匀后在PCR仪上按照下述流程反应，37℃，30min；75℃，25min；72℃，25min；37℃，10min。反应后，在管子里分别依次加入11uL的Buffer A，12uL的Buffer B，1uL的退火接头，3uL的水和3uL的DNA连接酶，混匀后，20℃孵育25min。
注：不同量DNA对应的接头浓度：40-50ng DNA，接头浓度为15uM；30-40ng DNA，接头浓度为10uM；20-30ng DNA，接头浓度为6uM；10-20ng DNA，接头浓度为4uM；1-10ng DNA，接头浓度为2uM；
接头序列为：
5’Phos-GATmCGGAAGAGmCAmCAmCGTmCTGAAmCTmCmCAGTmCAmC-Bio
5’Bio-TAmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT
4、甲基化接头连接文库富集及亚硫酸盐处理
取10uL Dynabeads M-280Streptavidin(Invitrogen)磁珠置于1.5mL离心管中，使用20uL的EB洗涤两次，并尽量去除洗涤后的EB，将上述80uL的接头连接产物加入磁珠中，轻轻吹打混匀，室温旋转反应20min。置于磁力架上5min，上清转入新的离心管中，纯化后Qubit HS检测浓度，总量大约5ng，则进行二次连接；磁珠使用200uLEB重悬，洗涤一次，用9uL的EB重悬。多次连接产物则合并后进行下一步反应。接头连接产物亦可选用2倍体积的Ampure XP Beads(Agencourt)进行纯化。
运用试剂盒(ZYMO Research)亚硫酸盐处理试剂进行C-T转换，流程优化如下：在9uL的EB洗脱液中加入1uL的亚硫酸盐增强剂和DNA保护剂，加入75uL的配置好的亚硫酸盐转换液，按照一下程序进行反应：
98℃ 5min
54℃ 60min
4℃ 保存
反应后，在纯化柱中加入300uL的结合缓冲液，将反应产物转移至纯化柱中，全速离心30s；用100uL的漂洗缓冲液离心洗涤后，加入200uL的脱磺化缓冲液，室温孵育15min，离心后用200uL的漂洗缓冲液离心洗涤两次，产物溶解到15uL的EB洗脱液中。
运用自制亚硫酸盐配制试剂进行C-T转换，流程优化如下：
配pH为5.0的饱和焦亚硫酸钠溶液：在15mL超纯水中加入7.6g的Na2O5S2，再加入464uL的10M新配制NaOH，室温振荡10min，避光保存；
将1uL的3M NaOH加入到9uL重悬的Dynabeads M-280Streptavidin磁珠-文库DNA复合物中，终体积为10uL，混匀后放入37℃恒温仪孵育30min，取上清于一个新的PCR管中；
在10uL的DNA洗脱产物中分别加入104uL的亚硫酸盐配制液，6uL的10mM对苯二酚，PCR仪上55℃反应60min，产物运用2倍体积的Ampure XP Beads纯化，洗脱到15uL的EB中；
5、测序片段的PCR扩增
在PCR管中，按照以下体系配制PCR反应液
Figure BDA0001465146710000081
PCR反应条件为：95℃预变性1min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，45s进行12个循环扩增，72℃延伸5min，16℃保存；PCR产物扩增后，用1倍体积的Ampure XP Beads纯化，洗脱至20ul的EB洗脱液中。
6、文库质控及测序
文库构建后，分别运用安捷伦2100进行片段大小检测及QPCR浓度定量检测，合格后，运用Hiseq进行测序。
PCR产物2100检测结果如图3所示，其中82bp为过量的接头、139bp为引物二聚体，文库纯化可将其去除。
实施例3
本实施例中，在30uL的DNA样品中依次加入5uL的DNA Repair Buffer，2uL的Repair Enzymes和13uL的超纯水，混匀后在PCR仪上按照下述流程反应，16℃，40min；75℃，25min；72℃，25min；37℃，10min。反应后，在管子里分别依次加入11uL的Buffer A，12uL的Buffer B，1uL的退火接头，3uL的水和3uL的DNA连接酶，混匀后，24℃孵育10min。
其他步骤同实施例2。
实施例4
本实施例中，在30uL的DNA样品中依次加入5uL的DNA Repair Buffer，2uL的Repair Enzymes和13uL的超纯水，混匀后在PCR仪上按照下述流程反应，42℃，20min；75℃，25min；72℃，60min；37℃，10min。反应后，在管子里分别依次加入11uL的Buffer A，12uL的Buffer B，1uL的退火接头，3uL的水和3uL的DNA连接酶，混匀后，15℃孵育30min。
其余步骤同实施例2。
实施例5
片段化微量血浆游离DNA甲基化文库构建
1、样品收集及DNA提取：在含EDTA的采血管中收集全血5mL，颠倒混匀，1600g离心后，立即将上层血浆部分，进一步16000g 4℃离心10min，去除残余细胞及碎片，分离上清血浆至新的离心管中，-80度保存；
2、收集血浆运用商业化cfDNA提取试剂盒进行提取，该试剂盒为DSP Blood Minikit(Qiagen)；
3、cfDNA末端修复及末端加A及文库构建；
在30uL的cfDNA样品中依次加入5uL的DNA Repair Buffer，2uL的Repair Enzymes和13uL的超纯水，混匀后在PCR仪上按照下述流程反应，37℃，30min；75℃，25min；72℃，25min；37℃，10min。反应后，在管子里分别依次加入11uL的Buffer A，12uL的Buffer B，1uL的退火接头，3uL的水和3uL的DNA连接酶，混匀后，20℃孵育20min。
5’Phos-GATmCGGAAGAGmCAmCAmCGTmCTGAAmCTmCmCAGTmCAmC
5’TAmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT
注：不同量DNA对应的接头浓度：40-50ng DNA，接头浓度为20uM；30-40ng DNA，接头浓度为15uM；20-30ng DNA，接头浓度为10uM；10-20ng DNA，接头浓度为6uM；1-10ng DNA，接头浓度为5uM；
4、亚硫酸盐处理
纯化后，在9uL的EB洗脱液中加入1uL的亚硫酸盐增强剂和DNA保护剂，加入75uL的配置好的亚硫酸盐转换液，按照一下程序进行反应：
98℃ 5min
54℃ 60min
4℃ 保存
反应后，在纯化柱中加入300uL的结合缓冲液，将反应产物转移至纯化柱中，全速离心30s；用100uL的漂洗缓冲液离心洗涤后，加入200uL的脱磺化缓冲液，室温孵育15min，离心后用200uL的漂洗缓冲液离心洗涤两次，产物溶解到15uL的EB洗脱液中。
5、PCR扩增
在PCR管中，按照以下体系配制PCR反应液
Figure BDA0001465146710000101
PCR反应条件为：95℃预变性1min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，45s进行12个循环扩增，72℃延伸5min，16℃保存；PCR产物扩增后，用1倍体积的Ampure XP Beads纯化，洗脱至20uL的EB洗脱液中。
6、文库质控及测序
文库构建后，分别运用生物分析仪(安捷伦2100)进行片段大小检测及QPCR浓度定量检测，合格后，运用Hiseq进行测序。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：将提取的DNA样品用超纯水或EB缓冲液进行洗脱，样品洗脱体积不超过30uL；
S2：DNA末端修复、3’端加A及降解缺口修复：基因组DNA片段在Repair Buffer和RepairEnzymes的作用下，分别在16-42℃、20-40min；75℃、25min；72℃、10-60min，37℃，10min四个阶段进行反应，20℃保存，分别进行DNA的末端修复、3’端加A及双链DNA降解缺口的修复；
S3：修复DNA片段的接头连接及钓取：在上述反应体系中，分别加入连接Buffer A、Buffer B、甲基化和生物素共同修饰的接头及DNA连接酶，15-24℃反应10-30min，进行接头连接，连接产物通过链霉素标记的M280钓取连接接头的DNA片段，产物重悬至超纯水中；
S4：亚硫酸盐处理，非甲基化C碱基转换：在回收产物中加入亚硫酸盐保护剂和增强剂和亚硫酸盐转换液，98℃反应5min，54℃反应1小时，加入300uL的Binding buffer进行柱纯化，产物脱磺酸基后洗脱到超纯水中；
S5：PCR扩增、质控和测序：对于亚硫酸盐转换的DNA为模板，采用扩增酶形成稳定的PCR扩增反应体系；PCR产物经0.9X磁珠纯化，质控合格后进行测序；
S6：测序数据质控及分析：下机数据分别进行去接头，低质量值reads过滤和统计，甲基化转换率统计，比对及比对率统计，基因组覆盖度统计，重复率统计，计算每一位点甲基化水平；
所述S2中Repair Enzymes包括DNA Polymerase I、T4 DNA Polymerase、KlenowFragment、Klenow Fragment(exo-)、T4 Polynucleotide Kinase、PCR polymerase、Bst和T4 DNA ligase、Taq polymerase；
所述S2中Repair Enzymes为T4 Polynucleotide Kinase、T4 DNA Polymerase和Taqpolymerase，且浓度分别为8U、2U、0.04U；
所述S3中Buffer A包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP，且浓度分别为190mM、27mM、14mM、7mM；Buffer B包括PEG6000和PEG8000，PEG6000的浓度为30％，PEG8000的浓度为20％。
2.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S1中样本DNA的使用量≥1ng。
3.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S2中Repair Buffer的成分包括MgCl2、NaCl、DTT、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Tris-HCl，且浓度分别为10mM、50mM、5mM、4mM、1mM、1mM、1mM、60mM，所述Tris-HCl的pH值为7.6。
4.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S5中的扩增酶为taq酶或高保真酶。
5.根据权利要求1所述的一种微量降解基因组DNA甲基化建库测序方法，其特征在于，所述S5中的扩增酶为taq酶。
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