CN112094892B - 一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，包括探针组合物一和探针组合物二；探针组合物一包括针对rRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，其中探针组合一的序列如SEQ ID NO.1‑187所示；探针组合物二包括针对Globin mRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，其中探针组合二的序列如SEQ ID NO.188‑220所示。本发明的组合物中的rRNA和Globin mRNA的捕获探针特异性强，去除率达99%以上；无需使用生物素标记和链霉亲和素磁珠，节省了大量成本。

Description

一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物。
背景技术
转录组测序已成为转录组信息研究、发现新转录本、新的可变性剪切的重要手段，但总RNA中含有大量的核糖体RNA（rRNA），占总RNA量的80%-95%，不利于转录组序列的研究，由于rRNA存在所引起的诸多问题是对其他相关RNA分子分析的难题，若存在rRNA，在做转录组测序时，会产生大量冗余的数据，造成很大的浪费和成本的上升，如果能很好的去除样本中的rRNA将会极大地提高数据的有效利用率，全血RNA样本则更具有挑战性：由于球蛋白mRNA(Globin mRNA)占总mRNA的76%以上，因此，如果不将球蛋白mRNA和/或核糖体RNA全部去除，会对低丰度转录本的分析造成严重的影响。
使用poly(A)富集mRNA不仅需要大量的起始样本总RNA，还存在着不能捕获全部的RNA(如miRNA和lncRNA)、核糖体RNA残留度高、仅适用于高完整度RNA样本和真核生物等多方面缺陷。
目前，主流的去除rRNA的方法还是用带有生物素标记的DNA探针杂交rRNA，然后用带有链霉亲和素修饰的磁珠结合rRNA-DNA探针复合体，从而将rRNA去除，现有的商品试剂盒，如Ribo-Zero gold(Epicentre)，Globin-Zero™ Gold Kit(Epicentre)，RiboMinus™技术(Thermo Fisher Scientific)，他们虽然能去除大部分rRNA和/或Globin mRNA，但是基于生物素标记和链霉亲和素磁珠的去除方法成本比较高，而且去除的效果不是很理想，特别是一些小rRNA，如5S rRNA和5.8S rRNA，去除效率都不高，这些未去除的小rRNA分子会在测序分析中占据大量的数据量，造成很大的浪费；其次，上述去除方法对于样品总RNA的质量要求很高，若总RNA有轻微降解，也会很大程度上影响去除效果。
因此，需要对现有去除rRNA和/或Globin mRNA的技术进行改进，以实现高效且费用低的去除rRNA和/或Globin mRNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种去除人总RNA中rRNA和GlobinmRNA的组合物，包括探针组合物一和探针组合物二；
所述探针组合物一包括针对rRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，其中探针组合一的序列如SEQ ID NO.1-187所示；
所述探针组合物二包括针对Globin mRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，其中探针组合二的序列如SEQ ID NO.188-220所示。
优选的是，所述rRNA分子包括5S rRNA、5.8S rRNA、12S rRNA、16S rRNA、18S rRNA和28S rRNA中的一种或者多种的组合。
上述任一方案中优选的是，所述Globin mRNA分子包括HBA1 mRNA、HBA2 mRNA、HBBmRNA、HBG1 mRNA和HBG2 mRNA中的一种或者多种的组合。
上述任一方案中优选的是，每条所述单链DNA探针的长度为30nt-100nt；相邻所述单链DNA探针之间的长度间距小于30nt。
上述任一方案中优选的是，每条所述单链DNA探针的浓度为0.5μM。
本发明还提出一种去除人总RNA中rRNA和/或Globin mRNA的方法，包括以下步骤：
S1：提供包含总RNA分子的样本，其中所述总RNA分子包含rRNA分子和/或GlobinmRNA分子和其他RNA分子；
S2：针对rRNA和/或Globin mRNA分子的全长序列，按照每段RNA序列设计一条与其序列反向互补配对的单链DNA探针，获得所有探针组合物一和/或探针组合物二；
S3：在杂交缓冲液中，让总RNA分子接触探针组合物一和/或探针组合物二，以使探针与其中的rRNA和/或Globin mRNA分子杂交形成RNA:DNA的杂交双链，获得杂交混合物；
S4：在一定条件下将上述步骤中杂交混合物接触RNase H，特异性消化杂交双链中的RNA分子，从而生成rRNA和/或Globin mRNA分子去除的RNA样本；
S5：在一定条件下将上述步骤中生成rRNA和/或Globin mRNA分子去除的RNA样本接触DNase I，去除样本中痕量的双链DNA和/或消化剩余的DNA探针组合物；
S6：纯化，得到所需的RNA样本。
优选的，步骤S1中所述总RNA分子的样本，可以是组织样本、细胞样本、石蜡包埋样本、福尔马林固定石蜡包埋样本或全血样本。
上述任一方案中优选的是，步骤S3中所述探针与其中的rRNA和/或Globin mRNA分子杂交形成RNA:DNA的杂交双链的具体操作为将总RNA样本与探针组合物一和/或探针组合物二混合，加入Tris-HCl和NaCl组成的反应试剂，然后在PCR仪上进行杂交反应。
上述任一方案中优选的是，所述总RNA样本与组合物的用量比例为1:1至1:5。
本发明的技术效果和优点：1、本发明设计了特异性的rRNA捕获探针，有效去除转录产物中99％以上的核糖体RNA序列，克服了原核生物mRNA不含polyA尾巴，无法通过oligodT富集分离的问题；
2、而且rRNA捕获探针在用于转录组测序分析等高通量测序时，除了检测到mRNA外，还可以检测到非编码RNA，如lncRNA、tRNA、circle RNA和小RNA等；
3、本发明设计了特异性的Globin mRNA的捕获探针，有效去除转录产物中99％以上的Globin mRNA序列，节省了全血mRNA分析中的大量数据量和成本。
附图说明
图1为本发明的方法原理图；
图2为本发明的人通用参比总RNA中去除rRNA前的文库Qsep质检图；
图3为本发明的人通用参比总RNA中去除rRNA后的文库Qsep质检图；
图4为本发明的实施例4的文库2100质检图；
图5为本发明的人血液总RNA样本中去除rRNA和Globin mRNA前的文库Qsep质检图；
图6为本发明的人血液总RNA样本中去除rRNA和Globin mRNA后的文库Qsep质检图；
图7为本发明的实施例6的文库2100质检图；
图8为本发明的实施例7的文库2100质检图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例提供的rRNA和Globin mRNA捕获探针，可以适用于多种高通量测序平台，如illμMina、华大MGI-seq或者life等，应用于转录组学研究和表观转录组学研究等检测范围，用于有效的去除总RNA中的rRNA和/或Globin mRNA。
捕获探针与总RNA杂交完成，形成RNA-DNA杂交双链后，可以通过任何合适的方式将RNA-DNA杂交双链从总RNA中剔除，以进行后续的测序和检测步骤。
还可以使用双链特异性核酸酶(DSN)而达到同样的效果。具体为在杂交完成后，在双链特异性核酸酶的选择性降解下，去除杂交后形成的所述DNA-RNA杂合链，从而达到去除总RNA中的rRNA和/或Globin mRNA的目的。
对于DNase I处理完后的纯化步骤，可以使用硅胶模柱法，也可以使用Trizol®(Ambion®)纯化方法、乙醇沉淀法和磁珠法对RNA进行纯化。
一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，包括探针组合物一和探针组合物二；
探针组合物一包括针对rRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，其中探针组合一的序列如SEQ ID NO.1-187所示，rRNA分子包括5S rRNA、5.8SrRNA、12S rRNA、16S rRNA、18S rRNA和28S rRNA中的一种或者多种的组合。
探针组合物二包括针对Globin mRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针中的一种或多种的组合，其中探针组合二的序列如SEQ ID NO.188-220所示，Globin mRNA分子包括HBA1 mRNA、HBA2 mRNA、HBB mRNA、HBG1 mRNA和HBG2 mRNA中的一种或者多种的组合。
每条单链DNA探针的长度为30nt-100nt；相邻单链DNA探针之间的长度间距小于30nt。
每条单链DNA探针的浓度为0.5μM。
基于探针杂交、酶降解法去除人总RNA样本中的rRNA和/或Globin mRNA的方法原理，本发明提供一种去除人总RNA中rRNA和/或Globin mRNA的方法，包括以下步骤，如图1所示：
S1：提供包含总RNA分子的样本，其中总RNA分子包含rRNA分子和/或Globin mRNA分子和其他RNA分子；
S2：针对rRNA和/或Globin mRNA分子的全长序列，按照每段RNA序列设计一条与其序列反向互补配对的单链DNA探针，获得所有探针组合物一和/或探针组合物二；
S3：在杂交缓冲液中，让总RNA分子接触探针组合物一和/或探针组合物二，以使探针与其中的rRNA和/或Globin mRNA分子杂交形成RNA:DNA的杂交双链，获得杂交混合物；
S4：在一定条件下将上述步骤中杂交混合物接触RNase H，特异性消化杂交双链中的RNA分子，从而生成rRNA和/或Globin mRNA分子去除的RNA样本；
S5：在一定条件下将上述步骤中生成rRNA和/或Globin mRNA分子去除的RNA样本接触DNase I，去除样本中痕量的双链DNA和/或消化剩余的DNA探针组合物；
S6：纯化，得到所需的RNA样本。
具体的，步骤S1中总RNA分子的样本，可以是组织样本、细胞样本、石蜡包埋样本、福尔马林固定石蜡包埋样本或全血样本。
具体的，步骤S3中探针与其中的rRNA和/或Globin mRNA分子杂交形成RNA:DNA的杂交双链的具体操作为将总RNA样本与探针组合物一和/或探针组合物二混合，加入Tris-HCl和NaCl组成的反应试剂，然后在PCR仪上进行杂交反应。
具体的，总RNA样本与组合物的用量比例为1:1至1:5。
实施例1：单链DNA探针的设计
对人类rRNA（包含5S rRNA、5.8S rRNA、12S rRNA、16S rRNA、18S rRNA和28SrRNA）设计探针组合物一，对人类Globin mRNA（包含HBA1 mRNA、HBA2 mRNA、HBB mRNA、HBG1mRNA和HBG2 mRNA）设计探针组合物二。具体方法如下：
从NCBI官网上获取人类rRNA全长序列，5S rRNA（登录号：NR_023379）、5.8S rRNA（登录号：NR_003285）、12S rRNA（登录号：NC_012920.1（648-1601））、16S rRNA（登录号：NC_012920.1（1671-3229））、18S rRNA（登录号：NR_003286）、28S rRNA（登录号：NR_003287）。从NCBI官网上获取人类Globin mRNA全长序列，HBA1 mRNA（登录号：NM_000558.5）、HBA2 mRNA（登录号：NM_000517.6）、HBB mRNA（登录号：NM_000518.5）、HBG1 mRNA（登录号：NM_000559.3）、HBG2 mRNA（登录号：NM_000184.3）。
针对人类rRNA的5S rRNA（120nt）、5.8S rRNA（157nt）、12S rRNA（954nt）、16SrRNA（1559nt）、18S rRNA（1869nt）和28S rRNA（5070nt）全长序列，每隔5nt设计一条长度约50nt的与rRNA序列反向互补配对的单链DNA探针，组成探针组合物一，共187条，如表1的SEQID NO.1-187。
针对人类Globin mRNA的 HBA1 mRNA（577nt）、HBA2 mRNA（576nt）、HBB mRNA（628nt）、HBG1 mRNA（587nt）和HBG2 mRNA（586nt）全长序列，每隔5nt设计一条长度约50nt的与Globin mRNA序列反向互补配对的单链DNA探针，组成探针组合物二，共33条，表1的SEQID NO.188-220。
实施例2：获得单链DNA探针序列
rRNA设计并合成单链DNA探针，探针组合物一和探针组合物二的具体序列如表1所示：
表1
序列1 AAGCGACGCTCAGACAGGCGTAGCCCCGGGAGGAACCCGGGGCCGCA
序列2 TTCGAAGTGTCGATGATCAATGTGTCCTGCAATTCACATTAATTCTCGCA
序列3 TGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTC
序列4 GATAGTCAAGTTCGACCGTCTTCTCAGCGCTCCGCCAGGGCCGTGGGCCG
序列5 GCGGGGCCGATCCGAGGGCCTCACTAAACCATCCAATCGGTAGTAGCGAC
序列6 GTGTGTACAAAGGGCAGGGACTTAATCAACGCAAGCTTATGACCCGCACT
序列7 GGAATTCCTCGTTCATGGGGAATAATTGCAATCCCCGATCCCCATCACGA
序列8 GTTCAACGGGTTACCCGCGCCTGCCGGCGTAGGGTAGGCACACGCTGAGC
序列9 AGTGTAGCGCGCGTGCAGCCCCGGACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTT
序列10 TCAATCTCGGGTGGCTGAACGCCACTTGTCCCTCTAAGAAGTTGGGGGAC
序列11 CCGCTCGGGGGTCGCGTAACTAGTTAGCATGCCAGAGTCTCGTTCGTTAT
序列12 TTAACCAGACAAATCGCTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACC
序列13 AATCGAGAAAGAGCTATCAATCTGTCAATCCTGTCCGTGTCCGGGCCGGG
序列14 TTTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCC
序列15 GTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCTTTGCAACCATACTCCCCCCGGAACCCA
序列16 TTTGGTTTCCCGGAAGCTGCCCGGCGGGTCATGGGAATAACGCCGCCGCA
序列17 GGTCGGCATCGTTTATGGTCGGAACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGA
序列18 CGACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTC
序列19 CGTCTTGCGCCGGTCCAAGAATTTCACCTCTAGCGGCGCAATACGAATGC
序列20 GCCGTCCCTCTTAATCATGGCCTCAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGAAC
序列21 TCCTATTCCATTATTCCTAGCTGCGGTATCCAGGCGGCTCGGGCCTGCTT
序列22 ACTCTAATTTTTTCAAAGTAAACGCTTCGGGCCCCGCGGGACACTCAGCT
序列23 CATCGAGGGGGCGCCGAGAGGCAAGGGGCGGGGACGGGCGGTGGCTCGCC
序列24 GCGGACCGCCCGCCCGCTCCCAAGATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA
序列25 TTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGAC
序列26 CTCCAATGGATCCTCGTTAAAGGATTTAAAGTGGACTCATTCCAATTACA
序列27 TCGAAAGAGTCCTGTATTGTTATTTTTCGTCACTACCTCCCCGGGTCGGG
序列28 GTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGG
序列29 TCTCCGGAATCGAACCCTGATTCCCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGG
序列30 CGACTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGACGTTCGAATGGGTCGTCGCCG
序列31 GGGGGCGTGCGATCGGCCCGAGGTTATCTAGAGTCACCAAAGCCGCCGGC
序列32 CCCCCCGGCCGGGGCCGGAGAGGGGCTGACCGGGTTGGTTTTGATCTGAT
序列33 CACGCATCCCCCCCGCGAAGGGGGTCAGCGCCCGTCGGCATGTATTAGCT
序列34 ATTACCACAGTTATCCAAGTAGGAGAGGAGCGAGCGACCAAAGGAACCAT
序列35 ATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTACCGGCCGTGCGTACTCAGAC
序列36 TGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGCTACTGGCAGGATCAACCAGGTA
序列37 GTAGAGCGCGGCGAGGCCCCGACGCGGCCGGACGGCCGGCCGGGGGGCCT
序列38 CCCTTGTGTCGAGGGCTGACTTTCAATAGATCGCAGCGAGGGAGCTGCTC
序列39 CGTACGAAACCCCGACCCAGAAGCAGGTCGTCTACGAATGGTTTAGCGCC
序列40 CCCCACGAACGTGCGGTGCGTGACGGGCGAGGGGGCGGCCGCCTCTCCGG
序列41 CCCCGTTTCCCAGGACGAAGGGCACTCCGCACCGGACCCCGGTCCCGGCG
序列42 CGGGGCACGCGCCCTCCCGCGCGCGCGGGGCGCGTGGAGGGGGGGGGCGG
序列43 GGGGACAGGCGGGGGACCGGCTATCCGAGGCCAACCGAGGCTCCGCGGCG
序列44 GTATCGTTCCGCCTGGGCGGGATTCTGACTTAGAGGCGTTCAGTCATAAT
序列45 GATGGTAGCTTCGCCCCATTGGCTCCTCAGCCAAGCACATACACCAAATG
序列46 ACCTGCGGTTCCTCTCGTACTGAGCAGGATTACCATGGCAACAACACATC
序列47 TAGGGTAAAACTAACCTGTCTCACGACGGTCTAAACCCAGCTCACGTTCC
序列48 AGTGGGTGAACAATCCAACGCTTGGTGAATTCTGCTTCACAATGATAGGA
序列49 CGACATCGAAGGATCAAAAAGCGACGTCGCTATGAACGCTTGGCCGCCAC
序列50 AGTTATCCCTGTGGTAACTTTTCTGACACCTCCTGCTTAAAACCCAAAAG
序列51 AAGGATCGTGAGGCCCCGCTTTCACGGTCTGTATTCGTACTGAAAATCAA
序列52 AGCGAGCTTTTGCCCTTCTGCTCCACGGGAGGTTTCTGTCCTCCCTGAGC
序列53 TTAGGACACCTGCGTTACCGTTTGACAGGTGTACCGCCCCAGTCAAACTC
序列54 CTGGCACTGTCCCCGGAGCGGGTCGCGCCCGGCCGGCGCGCGGCCGGGCG
序列55 CGCCAGAAGCGAGAGCCCCTCGGGGCTCGCCCCCCCGCCTCACCGGGTCA
序列56 AAAACGATCAGAGTAGTGGTATTTCACCGGCGGCCCGCAGGGCCGGCGGA
序列57 CCTCGCGGGGACACCGGGGGGGCGCCGGGGGCCTCCCACTTATTCTACAC
序列58 ATGTCTCTTCACCGTGCCAGACTAGAGTCAAGCTCAACAGGGTCTTCTTT
序列59 CTGATTCCGCCAAGCCCGTTCCCTTGGCTGTGGTTTCGCTGGATAGTAGG
序列60 ACAGTGGGAATCTCGTTCATCCATTCATGCGCGTCACTAATTAGATGACG
序列62 AATTTCTTCACTTTGACATTCAGAGCACTGGGCAGAAATCACATCGCGTC
序列63 CCGCCGCGGGCCTTCGCGATGCTTTGTTTTAATTAAACAGTCGGATTCCC
序列64 CCGCACCAGTTCTAAGTCGGCTGCTAGGCGCCGGCCGAGGCGAGGCGCCG
序列65 AACCGCGGCCCCGGGGGCGGACCCGGCGGGGGGGACCGGCCCGCGGCCCC
序列66 CGCCTGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGGAGGAGGGGGGAACGGGGGG
序列67 GGGGCCGGGGGGGTAGGGCGGGGGGACGAACCGCCCCGCCCCGCCGCCCG
序列68 CGCCGCCGCCCGACCGCTCCCCGCCCCCAGCGGACGCGCGCGCGACGAGA
序列69 GGTGGGGGGGGGGGCGCGCCGGCGCCCGCCGGGCTCCCCGGGGGCGGCCG
序列70 CCCGCCGCAGCTGGGGCGATCCACGGGAAGGGCCCGGCTCGCGTCCAGAG
序列71 GCCGCCGCCGGCCCCCCGGGTGCCCGGGCCCCCCTCGCGGGGGACCGTGC
序列72 CCGCCGGGGCCCCGCGGCGGGCCGCCGCCGGCCCCTGCCGCCCCGACCCT
序列73 CCGCCGCCCCCACGCGGCGCTCCCCCGGGGAGGGGGGAGGACGGGGAGCG
序列74 GAGAGAGAGAGAGAGGGCGCGGGGCGGGGAGGGAGCGAGCGGCGCGCGCG
序列75 GGGCGGGGGAGGGCCGCGAGGGGGGTGCCCCGGGCGTGGGGGGGGCGGCG
序列76 TCCAGCCGCGGCGCGCGCCCAGCCCCGCTTCGCGCCCCAGCCCGACCGAC
序列77 CCTTAGAGCCAATCCTTATCCCGAAGTTACGGATCCGGCTTGCCGACTTC
序列78 CCTACATTGTTCCAACATGCCAGAGGCTGTTCACCTTGGAGACCTGCTGC
序列79 TGGGTACGGCCCGGCGCGAGATTTACACCCTCTCCCCCGGATTTTCAAGG
序列80 CGAGAGCTCACCGGACGCCGCCGGAACCGCGACGCTTTCCAAGGCACGGG
序列81 CTCTCGGGGCGAACCCATTCCAGGGCGCCCTGCCCTTCACAAAGAAAAGA
序列82 CTCCCCGGGGCTCCCGCCGGCTTCTCCGGGATCGGTCGCGTTACCGCACT
序列83 CCTCGCGGCGCCCATCTCCGCCACTCCGGATTCGGGGATCTGAACCCGAC
序列84 TTCGATCGGCCGAGGGCAACGGAGGCCATCGCCCGTCCCTTCGGAACGGC
序列85 CCCATCTCTCAGGACCGACTGACCCATGTTCAACTGCTGTTCACATGGAA
序列86 CTCCACTTCGGCCTTCAAAGTTCTCGTTTGAATATTTGCTACTACCACCA
序列87 TGCACCTGCGGCGGCTCCACCCGGGCCCGCGCCCTAGGCTTCAAGGCTCA
序列88 GCGGCCCTCCTACTCGTCGCGGCGTAGCGTCCGCGGGGCTCCGGGGGCGG
序列89 GGGGCGTGGGCGGGAGGAGGGGAGGAGGCGTGGGGGGGGGGGCGGGGGAA
序列90 CCACACCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCTCCGACGCACACCACACG
序列91 CGCGCGCGCCGCCCCCGCCGCTCCCGTCCACTCTCGACTGCCGGCGACGG
序列92 TATGGGCCCGACGCTCCAGCGCCATCCATTTTCAGGGCTAGTTGATTCGG
序列93 GAGTTGTTACACACTCCTTAGCGGATTCCGACTTCCATGGCCACCGTCCT
序列94 CTATATCAACCAACACCTTTTCTGGGGTCTGATGAGCGTCGGCATCGGGC
序列95 AACCCGGCGTTCGGTTCATCCCGCAGCGCCAGTTCTGCTTACCAAAAGTG
序列96 CTAGGCACTCGCATTCCACGCCCGGCTCCACGCCAGCGAGCCGGGCTTCT
序列97 TTTAAAGTTTGAGAATAGGTTGAGATCGTTTCGGCCCCAAGACCTCTAAT
序列98 GCTTTACCGGATAAAACTGCGTGGCGGGGGTGCGTCGGGTCTGCGAGAGC
序列99 CTATCCTGAGGGAAACTTCGGAGGGAACCAGCTACTAGATGGTTCGATTA
序列100 TCGCCCCTATACCCAGGTCGGACGACCGATTTGCACGTCAGGACCGCTAC
序列101 TCCACCAGAGTTTCCTCTGGCTTCGCCCTGCCCAGGCATAGTTCACCATC
序列102 GGTCCTAACACGTGCGCTCGTGCTCCACCTCCCCGGCGCGGCGGGCGAGA
序列103 CGGTGGTGCGCCCTCGGCGGACTGGAGAGGCCTCGGGATCCCACCTCGGC
序列104 AGCGCGCCGGCCTTCACCTTCATTGCGCCACGGCGGCTTTCGTGCGAGCC
序列105 TCGCGCACGTGTTAGACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGGGTGG
序列106 CGACGTCGCCGCCGACCCCGTGCGCTCGCTCCGCCGTCCCCCTCTTCGGG
序列107 CGCGCGTGGCCCCGAGAGAACCTCCCCCGGGCCCGACGGCGCGACCCGCC
序列108 CGCACTGGGGACAGTCCGCCCCGCCCCCCGACCCGCGCGCGGCACCCCCC
序列109 CGGGGCGGGGGCGCGGGGAGGATGGGTGGGACAGTCTTCTCGCCGTGGGA
序列110 GTGGCCCGGCCCCCCCACGAGGAGACGCCGGCGCGCCCCCGCGGGGGAGA
序列111 CTCGCGGGGGATTCCCCGCGGGGGTGGGCGCCGGGAGGGGGGAGAGCGCG
序列112 GGGTCTCGCTCCCTCGGCCCCGGGATTCGGCGAGTGCTGCTGCCGGGGGG
序列113 AACACTCGGGGGGGGTTTCGGTCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCACCG
序列114 CCGCCGCCCCGACCCGCGCGCCCTCCCGAGGGAGGACGCGGGGCCGGGGG
序列115 GACGGGGGAGGAGGAGGACGGACGGACGGACGGACGGGGCCCCCCGAGCC
序列116 CCCCGCCGGGCCTTCCCAGCCGTCCCGGAGCCGGTCGCGGCGCACCGCCG
序列117 GAAATGCGCCCGGCGGCGGCCGGTCGCCGGTCGGGGGACGGTCCCCCGCC
序列118 CACCCCCGGCCCCGCCCGCCCACCCCCGCACCCGCCGGAGCCCGCCCCCT
序列119 GAGGAGGAGGAGGGGCGGCGGGGGAAGGGAGGGCGGGTGGAGGGGTCGGG
序列120 CGGGAAAGATCCGCCGGGCCGCCGACACGGCCGGACCCGCCGCCGGGTTG
序列121 TCCGGGCGGACTGCGCGGACCCCACCCGTTTACCTCTTAACGGTTTCACG
序列122 TTGAACTCTCTCTTCAAAGTTCTTTTCAACTTTCCCTTACGGTACTTGTT
序列123 TCGGTCTCGTGCCGGTATTTAGCCTTAGATGGAGTTTACCACCCGCTTTG
序列124 CATTCCCAAGCAACCCGACTCCGGGAAGACCCGGGCCCGGCGCGCCGGGG
序列125 CGGCCTCACACCGTCCACGGGCTGGGCCTCGATCAGAAGGACTTGGGCCC
序列126 CGGCGCCGGGGAGCGGGTCTTCCGTACGCCACATGTCCCGCGCCCCGCCG
序列127 GGATTCGGCGCTGGGCTCTTCCCTGTTCACTCGCCGTTACTGAGGGAATC
序列128 TAGTTTCTTCTCCTCCGCTGACTAATATGCTTAAATTCAGCGGGTCGCCA
序列129 CCAAGTGCACTTTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTGTCTCCTCTAT
序列130 TGCGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGGGTG
序列131 CGGTGTGTACGCGCTTCAGGGCCCTGTTCAACTAAGCACTCTACTCTTAG
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序列133 CTTTACGTGGGTACTTGCGCTTACTTTGTAGCCTTCATCAGGGTTTGCTG
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序列137 GGGCTAAGCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGTCTTAGCTATTGT
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序列141 GACCAACCCTGGGGTTAGTATAGCTTAGTTAAACTTTCGTTTATTGCTAA
序列142 AATCACTGCTGTTTCCCGTGGGGGTGTGGCTAGGCTAAGCGTTTTGAGCT
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序列147 TTTGAANGTAGATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGTCTGAACTCAGAT
序列148 AGGACTTTAATCGTTGAACAAACGAACCTTTAATAGCGGCTGCACCATCG
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序列151 TTGAGTATAGTAGTTCGCTTTGACTGGTGAAGTCTTAGCATGTACTGCTC
序列152 TTGGGTTCTGCTCCGAGGTCGCCCCAACCGAAATTTTTAATGCAGGTTTG
序列153 TTAGGACCTGTGGGTTTGTTAGGTACTGTTTGCATTAATAAATTAAAGCT
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序列157 AAACATGTGTCACTGGGCAGGCGGTGCCTCTAATACTGGTGATGCTAGAG
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序列161 CAGGCTTATGCGGAGGAGAATGTTTTCATGTTACTTATACTAACATTAGT
序列162 TATAGGGTGATAGATTGGTCCAATTGGGTGTGAGGAGTTCAGTTATATGT
序列163 ATTTTTTAGGTAGTGGGTGTTGAGCTTGAACGCTTTCTTAATTGGTGGCT
序列164 TAGGCCTACTATGGGTGTTAAATTTTTTACTCTCTCTACAAGGTTTTTTC
序列165 GTCCAAAGAGCTGTTCCTCTTTGGACTAACAGTTAAATTTACAAGGGGAT
序列166 GGGTTCTGTGGGCAAATTTAAAGTTGAACTAAGATTCTATCTTGGACAAC
序列167 ATCACCAGGCTCGGTAGGTTTGTCGCCTCTACCTATAAATCTTCCCACTA
序列168 CTACATAGACGGGTGTGCTCTTTTAGCTGTTCTTAGGTAGCTCGTCTGGT
序列169 GGGTCTTAGCTTTGGCTCTCCTTGCAAAGTTATTTCTAGTTAATTCATTA
序列170 AAGGTATAGGGGTTAGTCCTTGCTATATTATGCTTGGTTATAATTTTTCA
序列171 CCCTTGCGGTACTATATCTATTGCGCCAGGTTTCAATTTCTATCGCCTAT
序列172 ATTTGGGTAAATGGTTTGGCTAAGGTTGTCTGGTAGTAAGGTGGAGTGGG
序列173 AGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCAGGCCCG
序列174 GCTTCCGAGATCAGACGAGARCGGGCGCGTTCAGGGTGGTATGGCCGTAG
序列175 ATAACGGAGGCAGAGACAGAGGCGGCGGCCCGGGGGATCCGGTACCCCCA
序列176 CGCCTCTCAGATCGCTAGAGAAGGCTTTTCTCACCGAGGGTCCTGCGCGC
序列177 GGCGCCGAGGGACGCCTGGGGAAGGGAGGGGGCCCTGCGGTACGAGGAAA
序列178 CGTTCAGGGCGGGGGCCCGGCCGGTGCGCGCGTGCGCGCAACCCCACCAG
序列179 CCGAGGCAGAGCGCCTCCGAAGTCAACCCACACACGACCGGTCGGAGGCA
序列180 GAACCCACCGCGATCGCTCACACGGCCCGCGCGCACCCGCCAGAGGGGAG
序列181 CCGAACCCCACACCGACGAGCTCCCTCAGGACCCACGCGCGGACACCGCG
序列182 CGAGAGCAGGCGGGCGCCCTTCCCCGCGTGGGAGGGGCGCGTCTCGTCTC
序列183 AGGGGGCGCCGGGGGCGGGAACGACACACCACCGTTCGGCCTCGGGCACC
序列184 GCCCAGGCGGAGCCGACGCTCGCGCAAACCCCCCGAGAGGGCAGCACGAC
序列185 AGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCAGGCCCG
序列186 TTAGCTTCCGAGATCAGACGAGATCGGGCGCGTTCAGGGTGGTATGGCCG
序列187 CGTTCTTCATCGACGCACGAGCCGAGTGATCCACCGCTAAGAGTCG
序列188 GTCTTGTCGGCAGGAGACAGCACCATGGTGGGTTCTCTCTGAGTCTGTGG
序列189 CGCACCATACTCGCCAGCGTGCGCGCCGACCTTACCCCAGGCGGCCTTGA
序列190 GCGGGAAGTAGGTCTTGGTGGTGGGGAAGGACAGGAACATCCTCTCCAGG
序列191 GCCACCTTCTTGCCGTGGCCCTTAACCTGGGCAGAGCCGTGGCTCAGGTC
序列192 GGACAGCGCGTTGGGCATGTCGTCCACGTGCGCCACGGCGTTGGTCAGCG
序列193 GCTTGAAGTTGACCGGGTCCACCCGAAGCTTGTGCGCGTGCAGGTCGCTC
序列194 GTGAACTCGGCGGGGAGGTGGGCGGCCAGGGTCACCAGCAGGCAGTGGCT
序列195 CAGCACGGTGCTCACAGAAGCCAGGAACTTGTCCAGGGAGGCGTGCACCG
序列196 CCCAAGGGGCAAGAAGCATGGCCACCGAGGCTCCAGCTTAACGGTATTTG
序列197 TATTCAAAGACCACGGGGGTACGGGTGCAGGAAGGGGAGGAGGGGCTGGG
序列198 CCCAGCGGGCAGGAGGAACGGCTACCGAGGCTCCAGCTTAACGGTATTTG
序列199 TATTCAAAGACCAGGAAGGGCCGGTGCAAGGAGGGGAGGAGGGCCCGTTG
序列200 CAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTC
序列201 CATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCA
序列202 CTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCAGCCTGCCCAGGGCCTCACCACC
序列203 AGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAA
序列204 GAGCCAGGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCCATGAGCCTTC
序列205 TTGTCACAGTGCAGCTCACTCAGTGTGGCAAAGGTGCCCTTGAGGTTGTC
序列206 CACACAGACCAGCACGTTGCCCAGGAGCCTGAAGTTCTCAGGATCCACGT
序列207 TCTGATAGGCAGCCTGCACTGGTGGGGTGAATTCTTTGCCAAAGTGATGG
序列208 AAGCGAGCTTAGTGATACTTGTGGGCCAGGGCATTAGCCACACCAGCCAC
序列209 TTAGTAGTTGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTTTAATAGAAATTGGACAG
序列210 ATGTTTTTTATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAGGCCCTTCATAATATCC
序列211 AATGACCCATGGCGTCTGGACTAGGAGCTTATTGATAACCTCAGACGTTC
序列212 TTCCACATTCACCTTGCCCCACAGGCTTGTGATAGTAGCCTTGTCCTCCT
序列213 TCTGGGTCCATGGGTAGACAACCAGGAGCCTTCCCAGGGTTTCTCCTCCA
序列214 GGGGTTGCCCATGATGGCAGAGGCAGAGGACAGGTTGCCAAAGCTGTCAA
序列215 GCTTTRTGGCATCTCCCAAGGAAGTCAGCACCTTCTTGCCATGTGCCTTG
序列216 TTGTCACAGTGCAGTTCACTCAGCTGGGCAAAGGTGCCCTTGAGATCATC
序列217 AACGGTCACCAGCACATTTCCCAGGAGCTTGAAGTTCTCAGGATCCACAT
序列218 TCTGCCAGGAAGCCTGCACCTCAGGGGTGAATTCTTTGCCGAAATGGATT
序列219 CAGTGAGCTCAGTGGTATCTGGAGGACAGGGCACTGGCCACTSCAGTCAC
序列220 KATTGCTTGCAGAATAAAGCCTATCCTTGAAAGCTCTGMATC
探针1-187的所有探针等比例混合，组成去除总RNA中rRNA的探针组合；探针188-220的所有探针等比例混合，组成去除总RNA中Globin mRNA的探针组合；探针1-220的所有探针等比例混合，组成去除总RNA中rRNA和Globin mRNA的探针组合，每个探针组合中的每条探针的浓度为0.5μM。
实施例3：人通用参比总RNA中去除rRNA
1.探针合成制备
按照实施例2中的序列1-187，设计合成去除rRNA的探针组合物，所有探针等比例混合且混合物中每条探针的浓度为0.5μM。
2.RNA样品与探针杂交
RNA样品：人通用参比总RNA，购买于Agilent公司，货号#740000，该参考品由10种人类细胞系的总RNA组成。来自各细胞系的等量总RNA经DNase处理后合并制成通用人类参比总RNA。
配制probe buffer:500mM Tris-HCl(pH 7.0)、1M NaCl，按照Qubit定量浓度取1μg人通用参比总RNA样本于干净的0.2ml离心管中，用无核酸酶水稀释到11μL，加入probemix和probe buffer，如下表2所示，配制成15μL的反应体系：
表2
组分 体积（μL）
总RNA 11
probe buffer 3
probe mix 1
总计 15
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，95℃加热2min，然后从95℃开始每隔1sec降低0.1℃，直到温度到达22℃，并维持22℃ 5min；
3.RNase H消化
将杂交后的离心管置于冰上，加入RNase H buffer，RNase H和无核酸酶水，如下表3所示，配制成20μL的反应体系：
表3
组分 体积（μL）
杂交反应产物 15
RNase H buffer 2
RNase H 1
无核酸酶水 2
总计 20
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，置于冰上，立即进入下一步；
4.DNase I消化
保持离心管在冰上，加入DNase I buffer，DNase I和无核酸酶水，如下表4所示，配制成30μL的反应体系：
表4
组分 体积（μL）
RNase H消化产物 20
DNase I buffer 3
DNase I 1
无核酸酶水 6
总计 30
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，立即进入纯化步骤。
5.纯化去除rRNA的RNA样本
这步的纯化方法有很多，可以使用硅胶模柱法，也可以使用Trizol® (Ambion®)纯化方法、乙醇沉淀法和磁珠法对RNA进行纯化。本实施例使用RNA Clean Beads对去除rRNA后的RNA样本进行纯化回收，具体方法如下：
5.1涡旋振荡混匀RNA Clean Beads（确保在室温平衡30分钟以上），吸取66μL(2.2×)至上步RNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀。
5.2冰上静置15 min，使RNA结合到磁珠上。
5.3将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后(约5 min)，小心移除上清。
5.4保持样品始终处于磁力架中，加入200μL 无核酸酶水新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
5.5 重复步骤5.4一次。
5.6保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠。
5.7将样品从磁力架上取出，加入10μL NFW，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置2 min，在磁力架上静置5 min，待溶液澄清后(约5 min)，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中。
洗脱下来的RNA可立即进入下一步反应，也可以置于-80℃保存。使用Qubit和Qsep-100仪器对去除前后的RNA样本进行质检，从下表5和图2、图3可以看出，去除后，RNA的量降低了很多，大片段的RNA没有了，18S和28S的峰没有了。
表5
实验 总量ng
rRNA去除前 1000
rRNA去除后 144
实施例4：人通用参比总RNA中去除rRNA后建库测序分析
1.探针合成制备
按照实施例2中的序列1-187，设计合成去除rRNA的探针组合物，所有探针等比例混合且混合物中每条探针的浓度为0.5μM。
2.RNA样品与探针杂交
RNA样品：人通用参比总RNA，购买于Agilent公司，货号#740000，该参考品由10种人类细胞系的总RNA组成。来自各细胞系的等量总RNA经DNase处理后合并制成通用人类参比总RNA。
配制probe buffer:500mM Tris-HCl(pH 7.0)、1M NaCl，按照Qubit定量浓度取1μg人通用参比总RNA样本于干净的0.2ml离心管中，用无核酸酶水稀释到11μL，加入probemix和probe buffer，如下表6所示，配制成15μL的反应体系：
表6
组分 体积（μL）
总RNA 11
probe buffer 3
probe mix 1
总计 15
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，95℃加热2min，然后从95℃开始每隔1sec降低0.1℃，直到温度到达22℃，并维持22℃ 5min；
3.RNase H消化
将杂交后的离心管置于冰上，加入RNase H buffer，RNase H和无核酸酶水，如下表7所示，配制成20μL的反应体系：
表7
组分 体积（μL）
杂交反应产物 15
RNase H buffer 2
RNase H 1
无核酸酶水 2
总计 20
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，置于冰上，立即进入下一步；
4.DNase I消化
保持离心管在冰上，加入DNase I buffer，DNase I和无核酸酶水，如下表8所示，配制成30μL的反应体系：
表8
组分 体积（μL）
RNase H消化产物 20
DNase I buffer 3
DNase I 1
无核酸酶水 6
总计 30
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，立即进入纯化步骤。
5.纯化去除rRNA的RNA样本
这步的纯化方法有很多，可以使用硅胶模柱法，也可以使用Trizol® (Ambion®)纯化方法、乙醇沉淀法和磁珠法对RNA进行纯化。本实施例使用RNA Clean Beads对去除rRNA后的RNA样本进行纯化回收，具体方法如下：
5.1涡旋振荡混匀RNA Clean Beads（确保在室温平衡30分钟以上），吸取66μL(2.2×)至上步RNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀。
5.2冰上静置15 min，使RNA结合到磁珠上。
5.3将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后(约5 min)，小心移除上清。
5.4保持样品始终处于磁力架中，加入200μL 无核酸酶水新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
5.5 重复步骤5.4一次。
5.6保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠。
5.7将样品从磁力架上取出，加入18.5μL Frag/Prime Buffer，用移液器吹打6次以充分混匀。
6.RNA片段化
将样品管置于PCR仪中，94℃反应6min，结束后将样品置于磁力架上，待溶液变澄清后(约5 min)，小心吸取17μL上清至一个新的PCR管中，立刻进行第一链cDNA合成反应。
7.RNA反转录
其中，cDNA第一链的合成：向上述片段化的上清液中加入6μL 1st Strand Buffer和2μL 1st Strand Enzyme Mix，配成25μL的体系，置于PCR仪上，执行如下表9的程序反应：
表9
温度 时间
25℃ 10min
42℃ 15min
70℃ 15min
4℃ Hold
cDNA第二链的合成：cDNA第一链反应结束后，加入25μL 2nd Strand Buffer和15μL 2nd Strand Enzyme Super Mix，配成65μL的体系，置于PCR仪上，执行如下表10的程序反应：
表10
温度 时间
16℃ 30min
65℃ 15min
4℃ Hold
8.接头连接
RNA反转录后，不经过纯化，直接加入5μL RNA Adapter、 25μL Rapid Ligationbuffer和5μL Rapid DNA Ligase，配成100μL的体系，置于PCR仪上，20℃反应15min。
9.纯化
向接头连接产物中加入0.8×DNA Clean beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于磁力架上2min，小心吸出上清；加入80％乙醇200μL，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20μL 无核酸酶水重悬磁珠，室温反应5min，置于磁力架上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中进行下一步反应。
10.PCR扩增
往上清产物管中加入5μL PCR Primer Mix和25μL HiFi Amplification Mix，配成50μL的体系，置于PCR仪上，执行如下表11程序：
表11
Figure DEST_PATH_IMAGE002
11.纯化
向扩增产物中加入0.9×DNA Clean beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于磁力架上2min，小心吸出上清；加入80％乙醇200μL，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20μL 无核酸酶水重悬磁珠，室温反应5min，置于磁力架上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中进行下一步质检和测序。
12.结果
文库质检结果如表12和图4所示，测序结果如表13，可以看出，rRNA残留很低，残留的Reads数在1%以下。
表12
总RNA量ng 文库浓度ng/μL 文库总量ng
1000 44.4 888
表13
TotalReads 18002840
TotalBase(G) 2.7
residual rRNA Reads 19608(0.11%)
RawReads 17992314
RawBase(G) 2.7
CleanReads 17828638
CleanBase(G) 2.45
RawQ20(%) 97.71
CleanQ20(%) 98.41
RawQ30(%) 94.41
CleanQ30(%) 95.45
Duplication(%) 17.1551
实施例5：人血液总RNA样本中去除rRNA和Globin mRNA
1.探针合成制备
按照实施例2中的序列1-220，设计合成去除rRNA和Globin mRNA的探针组合物，所有探针等比例混合且混合物中每条探针的浓度为0.5μM。
2.RNA样品与探针杂交
配制probe buffer: 500mM Tris-HCl(pH 7.0)、1M NaCl。按照Qubit定量浓度取1μg人血液总RNA样本于干净的0.2ml离心管中，用无核酸酶水稀释到11μL，加入probe mix和probe buffer，如下表14所示，配制成15μL的反应体系：
表14
组分 体积（μL）
总RNA 11
probe buffer 3
probe mix 1
总计 15
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，95℃加热2min，然后从95℃开始每隔1sec降低0.1℃，直到温度到达22℃，并维持22℃ 5min；
3.RNase H消化
将杂交后的离心管置于冰上，加入RNase H buffer，RNase H和无核酸酶水，如下表15所示，配制成20μL的反应体系：
表15
组分 体积（μL）
杂交反应产物 15
RNase H buffer 2
RNase H 1
无核酸酶水 2
总计 20
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，置于冰上，立即进入下一步；
4.DNase I消化
保持离心管在冰上，加入DNase I buffer，DNase I和无核酸酶水，如下表16所示，配制成30μL的反应体系：
表16
组分 体积（μL）
RNase H消化产物 20
DNase I buffer 3
DNase I 1
无核酸酶水 6
总计 30
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，立即进入纯化步骤。
5.纯化去除rRNA的RNA样本
这步的纯化方法有很多，可以使用硅胶模柱法，也可以使用Trizol® (Ambion®)纯化方法、乙醇沉淀法和磁珠法对RNA进行纯化。本实施例使用RNA Clean Beads对去除rRNA后的RNA样本进行纯化回收，具体方法如下：
5.1涡旋振荡混匀RNA Clean Beads（确保在室温平衡30分钟以上），吸取66μL(2.2×)至上步RNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀。
5.2冰上静置15 min，使RNA结合到磁珠上。
5.3将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后(约5 min)，小心移除上清。
5.4保持样品始终处于磁力架中，加入200μL 无核酸酶水新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
5.5 重复步骤5.4一次。
5.6保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠。
5.7将样品从磁力架上取出，加入10μL NFW，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置2 min，在磁力架上静置5 min，待溶液澄清后(约5 min)，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中。
洗脱下来的RNA可立即进入下一步反应，也可以置于-80℃保存。使用Qubit和Qsep-100仪器对去除前后的RNA样本进行质检，从下表17和图5、图6可以看出，去除后，RNA的量降低了很多，大片段的RNA也没有了，18S和28S的峰没有了。
表17
实验 总量ng
rRNA和Globin mRNA去除前 1000
rRNA和Globin mRNA去除后 194
实施例6：人血液总RNA样本中去除rRNA和Globin mRNA后建库测序分析一
1.探针合成制备
按照实施例2中的序列1-220，设计合成去除rRNA和Globin mRNA的探针组合物，所有探针等比例混合且混合物中每条探针的浓度为0.5μM。
2.RNA样品与探针杂交
配制probe buffer: 500mM Tris-HCl(pH 7 .0)、1M NaCl。按照Qubit定量浓度取200ng人血液总RNA样本于干净的0.2ml离心管中，用无核酸酶水稀释到11μL，加入probemix和probe buffer，如下表18所示，配制成15μL的反应体系：
表18
组分 体积（μL）
总RNA 11
probe buffer 3
probe mix 1
总计 15
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，95℃加热2min，然后从95℃开始每隔1sec降低0.1℃，直到温度到达22℃，并维持22℃ 5min；
3.RNase H消化
将杂交后的离心管置于冰上，加入RNase H buffer，RNase H和无核酸酶水，如下表19所示，配制成20μL的反应体系：
表19
组分 体积（μL）
杂交反应产物 15
RNase H buffer 2
RNase H 1
无核酸酶水 2
总计 20
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，置于冰上，立即进入下一步；
4.DNase I消化
保持离心管在冰上，加入DNase I buffer，DNase I和无核酸酶水，如下表20所示，配制成30μL的反应体系：
表20
组分 体积（μL）
RNase H消化产物 20
DNase I buffer 3
DNase I 1
无核酸酶水 6
总计 30
体系配制完后，用移液器轻轻吹打充分混匀，置于PCR仪上，37℃反应30min。反应结束后，立即进入纯化步骤。
5.纯化去除rRNA的RNA样本
这步的纯化方法有很多，可以使用硅胶模柱法，也可以使用Trizol® (Ambion®)纯化方法、乙醇沉淀法和磁珠法对RNA进行纯化。本实施例使用RNA Clean Beads对去除rRNA后的RNA样本进行纯化回收，具体方法如下：
5.1涡旋振荡混匀RNA Clean Beads（确保在室温平衡30分钟以上），吸取66μL(2.2×)至上步RNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀。
5.2冰上静置15 min，使RNA结合到磁珠上。
5.3将样品置于磁力架5 min，待溶液澄清后(约5 min)，小心移除上清。
5.4保持样品始终处于磁力架中，加入200μL 无核酸酶水新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
5.5 重复步骤5.4一次。
5.6保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠。
5.7将样品从磁力架上取出，加入18.5μL Frag/Prime Buffer，用移液器吹打6次以充分混匀。
6.RNA片段化
将样品管置于PCR仪中，94℃反应6min，结束后将样品置于磁力架上，待溶液变澄清后(约5 min)，小心吸取17μL上清至一个新的PCR管中，立刻进行第一链cDNA合成反应。
7.RNA反转录
其中，cDNA第一链的合成：向上述片段化的上清液中加入6μL 1st Strand Buffer和2μL 1st Strand Enzyme Mix，配成25μL的体系，置于PCR仪上，执行如下表21的程序反应：
表21
温度 时间
25℃ 10min
42℃ 15min
70℃ 15min
4℃ Hold
cDNA第二链的合成：cDNA第一链反应结束后，加入25μL 2nd Strand Buffer和15μL 2nd Strand Enzyme Super Mix，配成65μL的体系，置于PCR仪上，执行如下表22的程序反应：
表22
温度 时间
16℃ 30min
65℃ 15min
4℃ Hold
8.接头连接
RNA反转录后，不经过纯化，直接加入5μL RNA Adapter、 25μL Rapid Ligationbuffer和5μL Rapid DNA Ligase，配成100μL的体系，置于PCR仪上，20℃反应15min。
9.纯化
向接头连接产物中加入0.8×DNA Clean beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于磁力架上2min，小心吸出上清；加入80％乙醇200μL，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20μL 无核酸酶水重悬磁珠，室温反应5min，置于磁力架上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中进行下一步反应。
10.PCR扩增
往上清产物管中加入5μL PCR Primer Mix和25μL HiFi Amplification Mix，配成50μL的体系，置于PCR仪上，执行如下表23程序：
表23
Figure DEST_PATH_IMAGE004
11.纯化
向扩增产物中加入0.9×DNA Clean beads(磁珠需预先室温平衡30min)，混匀后静置反应5min，置于磁力架上2min，小心吸出上清；加入80％乙醇200μL，洗涤磁珠两次，最后一次尽量将乙醇去除干净，待烘干残余酒精后，加入20μL 无核酸酶水重悬磁珠，室温反应5min，置于磁力架上2min，吸取上清于新1.5ml EP管中进行下一步质检和测序。
12.结果
文库质检结果如表24和图7所示，测序结果如表25，可以看出，rRNA和Globin mRNA残留都很低，残留的Reads数都在1%以下。
表24
总RNA量ng 文库浓度ng/μL 文库总量ng
200 43.6 872
表25
TotalReads 17148644
TotalBase(G) 2.57
residual rRNA Reads 29066(0.17%)
residual HB Reads 9528(0.06%)
RawReads 17127032
RawBase(G) 2.57
CleanReads 16995746
CleanBase(G) 2.36
RawQ20(%) 97.68
CleanQ20(%) 98.27
RawQ30(%) 94.03
CleanQ30(%) 94.92
Duplication(%) 16.0048
实施例7：人血液总RNA样本中去除rRNA和Globin mRNA后建库测序分析二
提高总RNA的进入量至1μg，其余条件都与实施例6一样，文库构建结果如表26和图8所示，测序结果如表27，可以看出，总RNA量增加到1μg，rRNA和Globin mRNA的残留也都很低，虽然比200ng总RNA进入时残留率有所上升，但是总残留率依然都在1%以下，说明本发明的探针组合物可以适用于宽范围的总RNA投入量，实验上的选择更加灵活。
表26
总RNA量ng 文库浓度ng/μL 文库总量ng
1000 42.6 852
表27
TotalReads 16754632
TotalBase(G) 2.51
Residual rRNA Reads 151622(0.90%)
residual HB Reads 12542(0.07%)
RawReads 16668084
RawBase(G) 2.5
CleanReads 16400986
CleanBase(G) 2.29
RawQ20(%) 97.4
CleanQ20(%) 98.17
RawQ30(%) 93.86
CleanQ30(%) 94.97
Duplication(%) 17.5532
综上所述，本发明实施例通过设计合成去除人rRNA和Globin mRNA的单链DNA探针，基于探针杂交、酶降解法构建了去除的体系，可有效去除99%以上的rRNA和GlobinmRNA。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 南京实践医学检验有限公司
<120> 一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物
<160> 220
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcgacgct cagacaggcg tagccccggg aggaacccgg ggccgca 47
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcgaagtgt cgatgatcaa tgtgtcctgc aattcacatt aattctcgca 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgatccttcc gcaggttcac ctacggaaac cttgttacga cttttacttc 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatagtcaag ttcgaccgtc ttctcagcgc tccgccaggg ccgtgggccg 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcggggccga tccgagggcc tcactaaacc atccaatcgg tagtagcgac 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgtgtacaa agggcaggga cttaatcaac gcaagcttat gacccgcact 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaattcctc gttcatgggg aataattgca atccccgatc cccatcacga 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcaacggg ttacccgcgc ctgccggcgt agggtaggca cacgctgagc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtgtagcgc gcgtgcagcc ccggacatct aagggcatca cagacctgtt 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaatctcgg gtggctgaac gccacttgtc cctctaagaa gttgggggac 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgctcgggg gtcgcgtaac tagttagcat gccagagtct cgttcgttat 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttaaccagac aaatcgctcc accaactaag aacggccatg caccaccacc 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatcgagaaa gagctatcaa tctgtcaatc ctgtccgtgt ccgggccggg 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttcccgtgt tgagtcaaat taagccgcag gctccactcc tggtggtgcc 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcaattcct ttaagtttca gctttgcaac catactcccc ccggaaccca 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tttggtttcc cggaagctgc ccggcgggtc atgggaataa cgccgccgca 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtcggcatc gtttatggtc ggaactacga cggtatctga tcgtcttcga 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgactttcgt tcttgattaa tgaaaacatt cttggcaaat gctttcgctc 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgtcttgcgc cggtccaaga atttcacctc tagcggcgca atacgaatgc 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccgtccctc ttaatcatgg cctcagttcc gaaaaccaac aaaatagaac 50
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcctattcca ttattcctag ctgcggtatc caggcggctc gggcctgctt 50
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
actctaattt tttcaaagta aacgcttcgg gccccgcggg acactcagct 50
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
catcgagggg gcgccgagag gcaaggggcg gggacgggcg gtggctcgcc 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcggaccgcc cgcccgctcc caagatccaa ctacgagctt tttaactgca 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tttaatatac gctattggag ctggaattac cgcggctgct ggcaccagac 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctccaatgga tcctcgttaa aggatttaaa gtggactcat tccaattaca 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgaaagagt cctgtattgt tatttttcgt cactacctcc ccgggtcggg 50
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtaatttgcg cgcctgctgc cttccttgga tgtggtagcc gtttctcagg 50
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctccggaat cgaaccctga ttccccgtca cccgtggtca ccatggtagg 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgactaccat cgaaagttga tagggcagac gttcgaatgg gtcgtcgccg 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gggggcgtgc gatcggcccg aggttatcta gagtcaccaa agccgccggc 50
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccccccggcc ggggccggag aggggctgac cgggttggtt ttgatctgat 50
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cacgcatccc ccccgcgaag ggggtcagcg cccgtcggca tgtattagct 50
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
attaccacag ttatccaagt aggagaggag cgagcgacca aaggaaccat 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atttaatgag ccattcgcag tttcactgta ccggccgtgc gtactcagac 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tggcttaatc tttgagacaa gcatatgcta ctggcaggat caaccaggta 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtagagcgcg gcgaggcccc gacgcggccg gacggccggc cggggggcct 50
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cccttgtgtc gagggctgac tttcaataga tcgcagcgag ggagctgctc 50
<210> 39
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgtacgaaac cccgacccag aagcaggtcg tctacgaatg gtttagcgcc 50
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccccacgaac gtgcggtgcg tgacgggcga gggggcggcc gcctctccgg 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccccgtttcc caggacgaag ggcactccgc accggacccc ggtcccggcg 50
<210> 42
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cggggcacgc gccctcccgc gcgcgcgggg cgcgtggagg gggggggcgg 50
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggggacaggc gggggaccgg ctatccgagg ccaaccgagg ctccgcggcg 50
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gtatcgttcc gcctgggcgg gattctgact tagaggcgtt cagtcataat 50
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gatggtagct tcgccccatt ggctcctcag ccaagcacat acaccaaatg 50
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acctgcggtt cctctcgtac tgagcaggat taccatggca acaacacatc 50
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tagggtaaaa ctaacctgtc tcacgacggt ctaaacccag ctcacgttcc 50
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
agtgggtgaa caatccaacg cttggtgaat tctgcttcac aatgatagga 50
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cgacatcgaa ggatcaaaaa gcgacgtcgc tatgaacgct tggccgccac 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agttatccct gtggtaactt ttctgacacc tcctgcttaa aacccaaaag 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaggatcgtg aggccccgct ttcacggtct gtattcgtac tgaaaatcaa 50
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agcgagcttt tgcccttctg ctccacggga ggtttctgtc ctccctgagc 50
<210> 53
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttaggacacc tgcgttaccg tttgacaggt gtaccgcccc agtcaaactc 50
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctggcactgt ccccggagcg ggtcgcgccc ggccggcgcg cggccgggcg 50
<210> 55
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cgccagaagc gagagcccct cggggctcgc ccccccgcct caccgggtca 50
<210> 56
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aaaacgatca gagtagtggt atttcaccgg cggcccgcag ggccggcgga 50
<210> 57
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cctcgcgggg acaccggggg ggcgccgggg gcctcccact tattctacac 50
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
atgtctcttc accgtgccag actagagtca agctcaacag ggtcttcttt 50
<210> 59
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctgattccgc caagcccgtt cccttggctg tggtttcgct ggatagtagg 50
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acagtgggaa tctcgttcat ccattcatgc gcgtcactaa ttagatgacg 50
<210> 61
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tttggctacc ttaagagagt catagttact cccgccgttt acccgcgctt 50
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aatttcttca ctttgacatt cagagcactg ggcagaaatc acatcgcgtc 50
<210> 63
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ccgccgcggg ccttcgcgat gctttgtttt aattaaacag tcggattccc 50
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ccgcaccagt tctaagtcgg ctgctaggcg ccggccgagg cgaggcgccg 50
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aaccgcggcc ccgggggcgg acccggcggg ggggaccggc ccgcggcccc 50
<210> 66
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cgcctgccgc cgccgccgcc gcgcgccgag gaggaggggg gaacgggggg 50
<210> 67
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ggggccgggg gggtagggcg gggggacgaa ccgccccgcc ccgccgcccg 50
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cgccgccgcc cgaccgctcc ccgcccccag cggacgcgcg cgcgacgaga 50
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ggtggggggg ggggcgcgcc ggcgcccgcc gggctccccg ggggcggccg 50
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cccgccgcag ctggggcgat ccacgggaag ggcccggctc gcgtccagag 50
<210> 71
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gccgccgccg gccccccggg tgcccgggcc cccctcgcgg gggaccgtgc 50
<210> 72
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ccgccggggc cccgcggcgg gccgccgccg gcccctgccg ccccgaccct 50
<210> 73
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ccgccgcccc cacgcggcgc tcccccgggg aggggggagg acggggagcg 50
<210> 74
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gagagagaga gagagggcgc ggggcgggga gggagcgagc ggcgcgcgcg 50
<210> 75
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gggcggggga gggccgcgag gggggtgccc cgggcgtggg gggggcggcg 50
<210> 76
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tccagccgcg gcgcgcgccc agccccgctt cgcgccccag cccgaccgac 50
<210> 77
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ccttagagcc aatccttatc ccgaagttac ggatccggct tgccgacttc 50
<210> 78
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cctacattgt tccaacatgc cagaggctgt tcaccttgga gacctgctgc 50
<210> 79
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tgggtacggc ccggcgcgag atttacaccc tctcccccgg attttcaagg 50
<210> 80
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cgagagctca ccggacgccg ccggaaccgc gacgctttcc aaggcacggg 50
<210> 81
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ctctcggggc gaacccattc cagggcgccc tgcccttcac aaagaaaaga 50
<210> 82
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ctccccgggg ctcccgccgg cttctccggg atcggtcgcg ttaccgcact 50
<210> 83
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcgcggcg cccatctccg ccactccgga ttcggggatc tgaacccgac 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcgatcggc cgagggcaac ggaggccatc gcccgtccct tcggaacggc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccatctctc aggaccgact gacccatgtt caactgctgt tcacatggaa 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctccacttcg gccttcaaag ttctcgtttg aatatttgct actaccacca 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcacctgcg gcggctccac ccgggcccgc gccctaggct tcaaggctca 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggggcgtggg cgggaggagg ggaggaggcg tggggggggg ggcgggggaa 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccacaccccc gccgccgccg ccgccgccgc cctccgacgc acaccacacg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcgcgcgcc gcccccgccg ctcccgtcca ctctcgactg ccggcgacgg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatgggcccg acgctccagc gccatccatt ttcagggcta gttgattcgg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggtggtgcg ccctcggcgg actggagagg cctcgggatc ccacctcggc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcgcgccgg ccttcacctt cattgcgcca cggcggcttt cgtgcgagcc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgcgcacgt gttagactcc ttggtccgtg tttcaagacg ggtcgggtgg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
cgacgtcgcc gccgaccccg tgcgctcgct ccgccgtccc cctcttcggg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgaactctc tcttcaaagt tcttttcaac tttcccttac ggtacttgtt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcggtctcgt gccggtattt agccttagat ggagtttacc acccgctttg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cattcccaag caacccgact ccgggaagac ccgggcccgg cgcgccgggg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggcctcaca ccgtccacgg gctgggcctc gatcagaagg acttgggccc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggattcggcg ctgggctctt ccctgttcac tcgccgttac tgagggaatc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcgtagggg ttttagttaa atgtcctttg aagtatactt gaggagggtg 50
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cggtgtgtac gcgcttcagg gccctgttca actaagcact ctactcttag 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtagaaaatg tagcccattt cttgccacct catgggctac accttgacct 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
ggcggtatat aggctgagca agaggtggtg aggttgatcg gggtttatcg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gggctaagca tagtggggta tctaatccca gtttgggtct tagctattgt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
cagatatgtt aaagccactt tcgtagtcta ttttgtgtca actggagttt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aactcaggtg agttttagct ttattgggga gggggtgatc taaaacactc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaccaaccct ggggttagta tagcttagtt aaactttcgt ttattgctaa 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
gctgcgtgct tgatgcttgt tccttttgat cgtggtgatt tagagggtga 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
tgttcttggg tgggtgtggg tataatacta agttgagatg atatcattta 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
tttgaangta gatagaaacc gacctggatt actccggtct gaactcagat 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctgatcca acatcgaggt cgtaaaccct attgttgata tggactctag 50
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gattgcgctg ttatccctag ggtaacttgt tccgttggtc aagttattgg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
ttgggttctg ctccgaggtc gccccaaccg aaatttttaa tgcaggtttg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
ttaggacctg tgggtttgtt aggtactgtt tgcattaata aattaaagct 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggtcttctc gtcttgctgt gttatgcccg cctcttcacg ggcaggtcaa 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atttaaggaa caagtgatta tgctaccttt gcacggttag ggtaccgcgg 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaacatgtgt cactgggcag gcggtgcctc taatactggt gatgctagag 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
gtttttggta aacaggcggg gtaagatttg ccgagttcct tttacttttt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttccttat gagcatgcct gtgttgggtt gacagtgagg gtaataatga 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
tggttgattg tagatattgg gctgttaatt gtcagttcag tgttttaatc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
caggcttatg cggaggagaa tgttttcatg ttacttatac taacattagt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
tatagggtga tagattggtc caattgggtg tgaggagttc agttatatgt 50
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<400> 163
attttttagg tagtgggtgt tgagcttgaa cgctttctta attggtggct 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
taggcctact atgggtgtta aattttttac tctctctaca aggttttttc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
gtccaaagag ctgttcctct ttggactaac agttaaattt acaaggggat 50
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<211> 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
gggttctgtg ggcaaattta aagttgaact aagattctat cttggacaac 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
atcaccaggc tcggtaggtt tgtcgcctct acctataaat cttcccacta 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacatagac gggtgtgctc ttttagctgt tcttaggtag ctcgtctggt 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaggtatagg ggttagtcct tgctatatta tgcttggtta taatttttca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
cccttgcggt actatatcta ttgcgccagg tttcaatttc tatcgcctat 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
atttgggtaa atggtttggc taaggttgtc tggtagtaag gtggagtggg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
agcacccggt attcccaggc ggtctcccat ccaagtacta accaggcccg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
gcttccgaga tcagacgaga rcgggcgcgt tcagggtggt atggccgtag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
ataacggagg cagagacaga ggcggcggcc cgggggatcc ggtaccccca 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
cgcctctcag atcgctagag aaggcttttc tcaccgaggg tcctgcgcgc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
ggcgccgagg gacgcctggg gaagggaggg ggccctgcgg tacgaggaaa 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgttcagggc gggggcccgg ccggtgcgcg cgtgcgcgca accccaccag 50
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<400> 182
cgagagcagg cgggcgccct tccccgcgtg ggaggggcgc gtctcgtctc 50
<210> 183
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
agggggcgcc gggggcggga acgacacacc accgttcggc ctcgggcacc 50
<210> 184
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
gcccaggcgg agccgacgct cgcgcaaacc ccccgagagg gcagcacgac 50
<210> 185
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
agcacccggt attcccaggc ggtctcccat ccaagtacta accaggcccg 50
<210> 186
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
ttagcttccg agatcagacg agatcgggcg cgttcagggt ggtatggccg 50
<210> 187
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
cgttcttcat cgacgcacga gccgagtgat ccaccgctaa gagtcg 46
<210> 188
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
gtcttgtcgg caggagacag caccatggtg ggttctctct gagtctgtgg 50
<210> 189
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
cgcaccatac tcgccagcgt gcgcgccgac cttaccccag gcggccttga 50
<210> 190
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
gcgggaagta ggtcttggtg gtggggaagg acaggaacat cctctccagg 50
<210> 191
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
gccaccttct tgccgtggcc cttaacctgg gcagagccgt ggctcaggtc 50
<210> 192
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
ggacagcgcg ttgggcatgt cgtccacgtg cgccacggcg ttggtcagcg 50
<210> 193
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
gcttgaagtt gaccgggtcc acccgaagct tgtgcgcgtg caggtcgctc 50
<210> 194
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
gtgaactcgg cggggaggtg ggcggccagg gtcaccagca ggcagtggct 50
<210> 195
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
cagcacggtg ctcacagaag ccaggaactt gtccagggag gcgtgcaccg 50
<210> 196
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
cccaaggggc aagaagcatg gccaccgagg ctccagctta acggtatttg 50
<210> 197
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
tattcaaaga ccacgggggt acgggtgcag gaaggggagg aggggctggg 50
<210> 198
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
cccagcgggc aggaggaacg gctaccgagg ctccagctta acggtatttg 50
<210> 199
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
tattcaaaga ccaggaaggg ccggtgcaag gaggggagga gggcccgttg 50
<210> 200
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
cagatgcacc atggtgtctg tttgaggttg ctagtgaaca cagttgtgtc 50
<210> 201
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
catccacgtt caccttgccc cacagggcag taacggcaga cttctcctca 50
<210> 202
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
ctctgggtcc aagggtagac caccagcagc ctgcccaggg cctcaccacc 50
<210> 203
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
agggttgccc ataacagcat caggagtgga cagatcccca aaggactcaa 50
<210> 204
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
gagccaggcc atcactaaag gcaccgagca ctttcttgcc atgagccttc 50
<210> 205
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
ttgtcacagt gcagctcact cagtgtggca aaggtgccct tgaggttgtc 50
<210> 206
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
cacacagacc agcacgttgc ccaggagcct gaagttctca ggatccacgt 50
<210> 207
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
tctgataggc agcctgcact ggtggggtga attctttgcc aaagtgatgg 50
<210> 208
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
aagcgagctt agtgatactt gtgggccagg gcattagcca caccagccac 50
<210> 209
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
ttagtagttg gacttaggga acaaaggaac ctttaataga aattggacag 50
<210> 210
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
atgtttttta ttaggcagaa tccagatgct caaggccctt cataatatcc 50
<210> 211
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
aatgacccat ggcgtctgga ctaggagctt attgataacc tcagacgttc 50
<210> 212
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
ttccacattc accttgcccc acaggcttgt gatagtagcc ttgtcctcct 50
<210> 213
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
tctgggtcca tgggtagaca accaggagcc ttcccagggt ttctcctcca 50
<210> 214
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
ggggttgccc atgatggcag aggcagagga caggttgcca aagctgtcaa 50
<210> 215
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
gctttrtggc atctcccaag gaagtcagca ccttcttgcc atgtgccttg 50
<210> 216
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
ttgtcacagt gcagttcact cagctgggca aaggtgccct tgagatcatc 50
<210> 217
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
aacggtcacc agcacatttc ccaggagctt gaagttctca ggatccacat 50
<210> 218
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
tctgccagga agcctgcacc tcaggggtga attctttgcc gaaatggatt 50
<210> 219
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 219
cagtgagctc agtggtatct ggaggacagg gcactggcca ctscagtcac 50
<210> 220
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 220
kattgcttgc agaataaagc ctatccttga aagctctgma tc 42

Claims (4)

1.一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，其特征在于：包括探针组合物一和探针组合物二；
所述探针组合物一包括针对rRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针，其中探针组合物 一的序列如SEQ ID NO.1-187所示；
所述探针组合物二包括针对Globin mRNA分子全长序列设计合成的单链DNA探针，其中探针组合物 二的序列如SEQ ID NO.188-220所示；
每条所述单链DNA探针的浓度为0.5μM。
2.根据权利要求1所述的一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，其特征在于：所述rRNA分子包括5S rRNA、5.8S rRNA、12S rRNA、16S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。
3.根据权利要求1所述的一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，其特征在于：所述Globin mRNA分子包括HBA1 mRNA、HBA2 mRNA、HBB mRNA、HBG1 mRNA和HBG2 mRNA。
4.根据权利要求1所述的一种去除人总RNA中rRNA和Globin mRNA的组合物，其特征在于：每条所述单链DNA探针的长度为30nt-100nt；相邻所述单链DNA探针之间的长度间距小于30nt。
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NEB.NEBNext® Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)NEB #E7750S/L/X, #E7755S/L/X.《NEB》.2019,第1-31页，尤其是第3页全部. *

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Denomination of invention: A composition for removing rRNA and Globin mRNA from human total RNA

Effective date of registration: 20221012

Granted publication date: 20210202

Pledgee: Nanjing Branch of Jiangsu Bank Co.,Ltd.

Pledgor: Nanjing experimental medicine examines Co.,Ltd.

Registration number: Y2022980018002

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