CN113862334B - 在rna建库过程中封闭核糖体rna或球蛋白rna的探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，探针长度为35‑60 nt，探针与核糖体RNA或球蛋白RNA通过互补配对形成三元封闭复合物。探针的后半区域与靶RNA严格互补配对，探针配对区域的5’端5‑9个碱基被修饰碱基代替；探针的前半区域是嘧啶碱基，用于嵌合到DNA/RNA双链的大沟中形成三元复合物。探针的3’‑OH利用MGB进行封闭，用于防止探针作为引物进行延伸；同时MGB可嵌合到DNA/RNA双链的小沟，提高三元复合物的稳定性。并公开了其在RNA建库中快速去除核糖体RNA或球蛋白RNA的应用。本发明具有操作简单、耗时极短、特异性强、适用性广、去除效率高和基因检出数高等优点，适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领域。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，随着高通量测序技术的快速发展，各类RNA建库技术和测序技术层出不穷并且迭代升级，大大地降低了RNA建库和测序的难度和成本，这也使得RNA高通量测序技术成为生命进展和疾病诊断等领域的重要研究手段。但是，不同来源的样本中的RNA种类占比具有极大的不均一性，如正常细胞中核糖体RNA(rRNA)约占总RNA的90％-95％，血液中球蛋白的mRNA约占总mRNA的76％以上，这些RNA的存在占据了大部分的测序数据，严重影响到低丰度RNA的检测，提高了测序的成本。
现在主要有两类策略来去除这些在RNA建库过程中不需要的高丰度RNA。第一类策略为磁珠捕获法。比如polyA富集法，利用oligo(dT)磁珠来捕获富集含有polyA的mRNA，这种方法只适用于完整性较好的RNA，能够捕获的RNA种类有限，大大降低了测序的多样性，而且这种方法对polyA长度越长的RNA存在捕获效率越高，会造成RNA建库的偏好性；或者靶RNA捕获去除法，利用带有biotin修饰的反义DNA探针与靶RNA杂交后，用链亲和霉素磁珠对靶RNA进行去除。另一类种策略为核酸酶降解法。比如RNase H切割去除法，利用RNase H特异性识别并降解DNA:RNA杂交链中RNA的活性对靶RNA进行降解；或者CRISPR/Cas9切割法，利用sgRNA-Cas9系统对构建好的双链DNA文库中靶RNA来源的双链DNA进行切割。这些方法存在成本高、操作复杂(约20-40步)、耗时长(约2h)、对样本来源和RNA丰度要求高、试剂难以储存等缺陷，严重阻碍了RNA二代测序建库技术的工业自动化发展和其在疾病快速诊断领域的应用。
我们之前开发了一种阻碍靶RNA逆转录的快速杂交技术，原理是利用探针与靶RNA形成双链复合物，继而阻碍靶RNA的逆转录。利用这个技术，我们成功地在RNA建库过程中高效特异性地降低核糖体RNA和球蛋白RNA的测序数据占比(202110257924.X；202110553161.3)。但这种方法对逆转录酶的性能要求比较严格，对于具有高链置换能力的逆转录酶，使用该方法去除效果不佳，原因是由于高链置换能力的逆转录酶会解开杂交探针与靶RNA形成的双螺旋，导致靶RNA的逆转录阻碍效应降低。对于高GC区域的RNA(如外显子区域)，逆转录酶的链置换活性是保证这些区域有效逆转录的关键。因此，使用这种方法在RNA建库过程中去除核糖体RNA和球蛋白RNA仍存在应用局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针。
本发明采用的技术方案为：
一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针，所述探针长度为35-60nt，由前半部分的嵌合区和后半部分的配对区组成，所述嵌合区为嘧啶碱基，所述配对区与靶RNA严格互补配对，且配对区的前5-9个碱基被修饰碱基代替，所述探针的3’-OH用MGB进行封闭。
优选的，所述探针有多个，探针覆盖核糖体RNA或球蛋白RNA区域不低于核糖体RNA或球蛋白RNA全长RNA的1/6，探针在核糖体RNA或球蛋白RNA上分布均匀，探针之间的距离不超过100nt，所述的修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU、2-O-甲基核糖、5-羟基丁酸酰基-脱氧尿苷、2-氨基脱氧腺苷或5-甲基脱氧胞苷修饰。
优选的，核糖体RNA为人的5.8S rRNA，探针为下表所示的5.8S probe的混合物：
优选的，探针3’端-MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
优选的，所述核糖体RNA为人的18S rRNA，探针为下表所示的18S probe的混合物：
优选的，探针3’端-MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
优选的，所述核糖体RNA为人的28S rRNA，探针为下表所示的28S probe的混合物：
优选的，探针3’端-MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
优选的，所述核糖体RNA为人的12S rRNA，探针为下表所示的12S probe的混合物：
优选的，探针3’端-MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
优选的，所述核糖体RNA为人的16S rRNA，探针为下表所示的16S probe的混合物：
优选的，探针3’端-MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
优选的，探针为下表所示的Globin probe的混合物：
优选的，探针3’端-MGB封闭，探针序列中斜体加粗碱基为PNA修饰碱基。
上述的探针在RNA建库中快速去除核糖体RNA或球蛋白RNA的应用。
优选的，其步骤包括：
(1)提取样本中的总RNA，在总RNA中加入探针，高温变性后退火反应；
(2)在反应产物中加入逆转录缓冲液和一链cDNA合成酶混合物，进行逆转录反应；
(3)RNA NGS建库。
CN202110257924.X公开的二元逆转录探针是与靶RNA形成双螺旋，该双螺旋结构在遇到具有解旋酶活性的逆转录酶时会被解开从而无法阻碍逆转录。本发明提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA和球蛋白RNA的探针及方法，原理是利用探针与核糖体RNA或球蛋白RNA通过互补配对形成三元封闭复合物(Triple complex)。探针长度为35-60nt，探针的后半区域与靶RNA严格互补配对，探针配对区域的5’端5-9个碱基被修饰碱基代替，用于增强与靶RNA结合的强度和能力；探针的前半区域是嘧啶碱基，用于嵌合到DNA/RNA双链的大沟中形成三元复合物。探针的3’-OH利用MGB进行封闭，用于防止探针作为引物进行延伸；同时MGB可嵌合到DNA/RNA双链的小沟，提高三元复合物的稳定性。本发明的三元复合物探针的多聚嘧啶区域的碱基较小，可以嵌合到DNA双螺旋区域的大沟中，MGB修饰可以嵌合到双螺旋的小沟，从而形成稳定的三元复合物结果，与二元逆转录探针相比，解旋酶无法有效解开这种结构。因此三元复合物探针与靶RNA的结合更加高效稳定，对逆转录的阻碍效果更强。本发明利用三元复合物封闭探针法在RNA建库的一链cDNA合成过程中实现对核糖体RNA和球蛋白RNA逆转录的高效率高特异性抑制，从而阻碍核糖体RNA和球蛋白RNA参与下游建库过程。本发明具有操作简单、耗时极短、特异性强、适用性广、去除效率高和基因检出数高等优点，非常适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领域。
附图说明
图1为逆转录阻碍探针法示意图。
图2为逆转录阻碍探针对5.8S rRNA逆转录合成的抑制示意图。
图3为qPCR法鉴定不同修饰种类探针对逆转录的抑制作用。
图4为qPCR法鉴定探针中PNA的分布位置对靶RNA逆转录的抑制效果。
图5为qPCR法鉴定不同长度PNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效果。
图6为全覆盖逆转录阻碍探针竞争结合靶RNA作用原理示意图。
图7为qPCR法鉴定全覆盖逆转录阻碍探针对5.8S rRNA逆转录合成的抑制作用。
图8为qPCR法鉴定全覆盖逆转录阻碍探针对rRNA逆转录合成的抑制作用。
图9为NGS RNA建库过程中五种去除rRNA方法的流程示意图。
图10为qPCR验证五种去除rRNA方法的效果。
图11为五种去除rRNA方法的RNA建库文库产量。
图12为RNA-seq比较五种去除rRNA方法的效果。
图13为六种建库方法测序相关性。
图14为同等测序深度下六种建库方法基因检出数。
图15为三元复合物封闭探针在Nanopore Direct cDNA sequencing上的应用流程示意图。
图16为三元复合物封闭探针对Nanopore Direct cDNA sequencing测序数据中RNA占比的影响。
图17为三元复合物封闭探针对Nanopore Direct cDNA sequencing测序数据中基因检出数的影响。
图18为三元复合物封闭探针在血液RNA检测中对rRNA和Globin mRNA的去除效果。
图19为三元复合物封闭探针在血液RNA检测中对基因检出数的影响。
图20为三元复合物封闭探针和双链逆转录阻碍探针的性能比较。
具体实施方式
以下实施例中所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示，N为随机碱基，即A、T、C、G中任意一种碱基，Random Hexamers为用于逆转录的通用引物。
表1探针及引物序列
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其中序列166-175为RT-qPCR的定量引物。
实施例1：不同修饰种类探针对靶RNA逆转录的抑制作用
参照图2，本实施例设计带有不同修饰的5.8S特异性探针(表1序号1-5)，实现对5.8SrRNA逆转录过程的抑制。具体实施方式如下：
表2
| 组分 | 用量 |
| Total RNA | 1μg |
| 1μM 5.8S修饰探针(表1序号1-5中任一个) | 1μL |
| 1μM 5.8S rRNA RT primer | 1μL |
| 10mM dNTPs mix(含0.5M KCl) | 1μL |
| 补DEPC H2O至 | 13μL |
混匀后瞬离。75℃反应1min，4℃保存。
表3
混匀后瞬离。25℃反应10min，42℃反应15min，70℃反应5min，4℃保存；
稀释1000倍后，用HieffqPCR SYBR Green Master Mix(11200ES03)对5.8ScDNA进行定量，定量引物见表1。定量结果见图3。
从定量结果可以看出，含肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、脱氧尿嘧啶(dU)、DNA小沟结合物(MGB)和2-氧甲基(2’-O-Me)修饰三元复合物探针都能够有效抑制靶RNA的逆转录，其中PNA探针抑制逆转录的效果最好(见表4)。
表4：不同5.8s rRNA探针投入量对靶RNA逆转录的抑制效率
| 探针修饰种类 | 未修饰 | PNA | LNA | dU | MGB | 2’-O-Me |
| 逆转录抑制效率(％) | 75.35 | 99.97 | 99.93 | 91.18 | 89.36 | 84.15 |
实施例2：探针中PNA的分布位置对靶RNA逆转录的抑制效果
本实施例设计不同PNA修饰位置的5.8S特异性探针(表1序号6-8序列的混合物)，实现对5.8S rRNA逆转录过程的抑制。具体实施方式参照实施例1，定量结果见图4。
从定量结果可以看出，当探针中PNA的位置靠近探针与靶RNA配对区域的左端(即5’端)，对靶RNA逆转录的阻碍效果要高于探针中PNA的位置靠近探针的右端(即3’端)。
表5：探针中LNA分布位置对靶RNA逆转录的抑制效率
| 探针中LNA修饰位置分布 | Left | Middle | Right |
| 逆转录抑制效率(％) | 98.94 | 95.13 | 86.81 |
实施例3：不同长度PNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效果
本实施例设计不同长度的带有PNA修饰的5.8S特异性探针(表1序号9-14序列的混合物)，实现对5.8S rRNA逆转录过程的抑制。具体实施方式参照实施例1，定量结果见图5。
从定量结果可以看出，当PNA探针与靶RNA的配对长度在达到15-20nt时，即可对靶RNA进行高效的逆转录抑制。
表6：不同长度PNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效率
| 不同长度LNA探针 | 15nt | 20nt | 25nt | 30nt | 35nt | 40nt |
| 逆转录抑制效率(％) | 98.39 | 98.57 | 98.62 | 98.68 | 98.77 | 98.72 |
实施例4：5.8S全覆盖逆转录阻碍探针对随机引物结合的竞争作用和一链cDNA合成的抑制作用
参照图6，本实施例利用5.8S特异性PNA修饰探针(表1序号15-17序列的混合物)高Tm值高结合能力的特点，实现对5.8S rRNA逆转录高效特异性的抑制。具体实施方式如下：
表7
| 组分 | 用量 |
| Total RNA | 1μg |
| 0.5-8μM 5.8S probe mix | 1μL |
| 50μM Random Hexamers | 1μL |
| 10mM dNTPs mix(含0.5M KCl) | 1μL |
| 补DEPC H2O至 | 13μL |
混匀后瞬离。75℃反应1min，4℃保存；
表8
混匀后瞬离。25℃反应10min，42℃反应15min，70℃反应5min，4℃保存；
稀释1000倍后，用HieffqPCR SYBR Green Master Mix(11200)对5.8S、18S、28S、Actin和Gadph cDNA进行定量，定量引物见表1，定量结果见图7。
从定量结果可以看出，本方法设计的5.8S探针混合物可以高效特异性的抑制靶RNA的逆转录，且对其他非靶RNA(GAPDH或ACTB mRNA)的逆转录影响很小。当探针投入量达到1μM时，5.8S rRNA的逆转录抑制效率能达到99％以上。
实施例5：18S、28S、12S和16S rRNA全覆盖逆转录阻碍探针对随机引物结合的竞争作用和一链cDNA合成的抑制作用
本实施例验证了18S rRNA(表1序号17-47序列的混合物)、28S rRNA(表1序号序列48-111序列的混合物)、12S rRNA(表1序号112-122序列的混合物)和16S rRNA(表1序号123-139序列的混合物)对靶RNA逆转录的抑制效率和特异性。探针序列和引物见表1，定量结果见图8。
从定量结果可以看出，本方法中设计的逆转录阻碍探针能够高效地阻碍18S、28S、12S和16S rRNA的逆转录，去除效率高达99％以上。
实施例6：去除核糖体RNA方法的比较
参照图9，本实施例系统性比较polyA RNA富集法、RNase H切割去除法、杂交捕获去除法、CRISPR切割去除法和三元复合物封闭探针法对靶RNA的去除效果。具体实施方式如下：
1)polyA富集法。使用HieffMaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kitfor Illumina(Yeasen,12300)对mRNA进行富集。
取1μg总RNA，用Nuclease free水将体积补至50μL。吸取50μL mRNA CaptureBeads加入至50μL总RNA样品中，吹打混匀。65℃ 5min；室温孵育5min。将样品置于磁力架中，室温静置5min，小心移除上清。将样品从磁力架上取出，用200μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，反复吹打混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5min，小心移除上清。重复洗涤磁珠一次。加入50μL Tris Buffer重悬磁珠，吹打混匀。80℃ 2min；25℃保存。将样品从PCR仪中取出，加入50μL Beads Binding Buffer，反复吹打混匀。室温放置5min。将样品置于磁力架中，室温静置5min，小心移除上清。用200μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，吹打混匀，将样品重新放回至磁力架中，室温静置5min，吸掉全部上清。将样品从磁力架上取出，用18.5μLFrag/Prime buffer重悬磁珠，吹打混匀。将样品置于PCR仪中,94℃ 5min，立即放在磁力架上。吸取17μL片段化mRNA，加入6μL Strand Specificity Reagent和2μL 1st StrandEnzyme Mix混匀后瞬离。25℃ 10min，42℃ 15min，70℃ 15min，4℃保存。取0.5μL产物稀释100倍后，用HieffqPCR SYBR Green Master Mix(11200)对5.8S、18S、28S和Actin cDNA进行定量。
2)RNase H切割去除法。使用HieffMaxUp rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)(Yeasen,12253)对rRNA进行去除。
表9
| 组分 | 用量 |
| Total RNA | 1μg |
| Hybridization Buffer | 3μL |
| Probe Mix(H/M/R) | 1μL |
| 补DEPC H2O至 | 15μL |
吹打混匀后瞬离。95℃反应2min，95℃-22℃-0.1℃/s，22℃反应5min，4℃保存。
表10
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 15μL |
| RNase H buffer | 3μL |
| RNase H | 2μL |
| 总体积 | 20μL |
吹打混匀后瞬离，37℃反应30min，4℃保存。
表11
吹打混匀后瞬离，37℃ 30min，4℃保存。加入110μLRNA Cleaner(Yeasen,12602)，充分吹打混匀，室温孵育5min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约3min)，小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL Nucleasefree H2O新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。重复漂洗一次。用10μL移液器吸干净残留液体。保持PCR管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠(5～10min)。用18.5μL Frag/Prime buffer重悬磁珠，吹打混匀，室温静置5min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约3min)，吸取17μL mRNA于新PCR管中。将样品置于PCR仪中,94℃ 5min，立即冰浴5min。
表12
| 组分 | 用量 |
| Frag/Prime buffer和RNA | 17μL |
| Strand Specificity Reagent | 6μL |
| 1st Strand Enzyme Mix | 2μL |
| 总体积 | 25μL |
混匀后瞬离。25℃反应10min，42℃反应15min，70℃反应5min，4℃保存。取0.5μL产物稀释100倍后，用HieffqPCR SYBR Green Master Mix(11200)对5.8S、18S、28S和Actin cDNA进行定量。
3)杂交捕获去除法：使用Illumina的Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit进行rRNA去除，操作流程按照说明书。
4)三元复合物封闭探针法。
表13
吹打混匀后瞬离。95℃反应5min，75℃反应1min，4℃保存。
表14
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 17μL |
| Strand Specificity Reagent | 6μL |
| 1st Strand Enzyme Mix | 2μL |
| 总体积 | 25μL |
混匀后瞬离。25℃反应10min，42℃反应15min，70℃反应5min，4℃保存。取0.5μL产物稀释100倍后，用HieffqPCR SYBR Green Master Mix对5.8S、18S、28S和Actin cDNA进行定量。
5)CRISPR切割去除法：使用TAKARA的Stranded Total RNA-Seq Kit进行rRNA去除，操作流程按照说明书。
定量结果见图10。从定量结果可以看出，三元复合物封闭探针在NGS RNA建库过程中能够有效抑制rRNA的一链合成效率，去除效果达到99％以上，已经显著超过RNase H切割去除法、杂交捕获去除法和CRISPR切割去除法的去除效率，与polyA富集法的去除效率相当，且具有更高的特异性，不影响其他非靶RNA的一链合成。
此外，将剩下的1st strand cDNA产物，通过HieffMaxUp II Dual-modemRNA Library Prep Kit for Illumina(Yeasen,12300)进行建库，流程包括：
1)二链合成
表15
| 组分 | 用量 |
| 1st strand cDNA | 24μL |
| DEPC H2O | 1μL |
| 2nd Strand Buffer | 30μL |
| 2nd Strand Enzyme Master Mix | 5μL |
| 总体积 | 60μL |
吹打混匀后瞬离。16℃反应30min，72℃反应15min，4℃保存。
2)接头连接
表16
| 组分 | 用量 |
| dA-tailed DNA | 60μL |
| Ligation Enhancer | 30μL |
| Quick T4 DNA Ligase | 5μL |
| DNA Adapter | 5μL |
| 总体积 | 100μL |
吹打混匀后瞬离。20℃反应15min，4℃保存。
3)两轮磁珠回收
加入60μL HieffDNA Selection Beads(Yeasen,12601)，充分吹打混匀，室温孵育5min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约3min)，小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL Nuclease free H2O新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s后，小心移除上清。重复漂洗一次。用10μL移液器吸干净残留液体。保持PCR管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠(5min)。加入53μL ddH2O，吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5min)，小心移取50μL上清至新PCR管中。
加入80μL HieffDNASelection Beads，重复上述回收操作。加入22μLddH2O，吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5min)，小心移取20μL上清至新PCR管中。
4)文库扩增、回收、定量及测序
表17
吹打混匀后瞬离。按照以下反应程序进行文库扩增。
表18
加入45μL HieffDNA Selection Beads，重复上述回收操作。加入22μLddH2O，吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5min)，小心移取20μL上清至新PCR管中。用dsDNA HS Assay Kit for Qubit(Yeasen,12640)对文库进行定量，并利用Illumina的NovaSeq 6000平台进行文库测序。
由图11和图12可知，相较于其他四种已有的方法，三元复合物封闭探针法能够显著提高RNA建库的产量，且对核糖体RNA的去除效果更加有效，这说明逆转录阻碍探针法能够高效快速的去除建库过程中的靶RNA，且不影响其他非靶RNA的逆转录，损失更小。此外，相关性分析(见图13)结果显示三元复合物封闭探针法与RNA直接建库具有更好的相关性，这说明逆转录阻碍探针法具有更小的建库偏好性，更能反映原始RNA的真实信息。同时，在同等测序深度下，逆转录探针法的基因检出数显著高于其他三种建库方式(见图14)，这表明结合逆转录探针法的RNA测序技术获得的信息更加完整、全面。
实施例7：三元复合物封闭探针在三代Nanopore测序上的应用。
本实施例测试了三元复合物封闭探针在三代Nanopore direct cDNA-seq上的应用，示意图如图15。具体实施方式如下：
表19
| 组分 | 用量 |
| Total RNA | 2μg |
| 10x E.coli poly(A)polymerase buffer | 1μL |
| poly(A)polymerase buffer | 1μL |
| 10mM ATP | 1μL |
| 补DEPC H2O至 | 10μL |
37℃反应30min。加入OligodT23VN和rRNA probe mix(表1序号15、18、48、112、123序列的混合物)，75℃ 1min，4℃保存。按照Nanopore的Direct cDNA Sequencing Kit流程进行文库构建并测序。
结果如图16和图17所示，使用RNA polyadenylation和三元复合物封闭探针能够显著降低测序数据中rRNA来源数据的占比，并提高Direct cDNA Sequencing的基因检出数。这表明三元复合物封闭探针在三代Nanopore测序中具有重要的应用价值。
实施例8：Globin RNA三元复合物封闭探针在血液RNA检测上的应用。
本实施例设计了Globin RNA三元复合物封闭探针(表1序号140-159序列的混合物)，并检测了其在血液RNA检测上的应用，具体实施方式如下
表20
吹打混匀后瞬离。95℃反应5min，75℃反应1min，4℃保存。
表21
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 17μL |
| Strand Specificity Reagent | 6μL |
| 1st Strand Enzyme Mix | 2μL |
| 总体积 | 25μL |
混匀后瞬离。25℃反应10min，42℃反应15min，70℃反应5min，4℃保存。按照上述实施例进行RNA建库并测序。
结果如图18和图19所示，三元复合物封闭探针能够显著降低RNA测序数据中rRNA和Globin RNA的占比，并极大地提高血液RNA检测的基因检出数。
实施例9：三元复合物封闭探针和双链逆转录阻碍探针的性能比较。
本实施例比较了本发明的三元复合物封闭探针和双链逆转录阻碍探针(CN202110257924.X)在RNA上的应用效果，具体实施方式如下
表22
吹打混匀后瞬离。95℃反应5min，75℃反应1min，4℃保存。
表23
| 组分 | 用量 |
| 上述反应体系 | 17μL |
| Strand Specificity Reagent | 6μL |
| 40U/μL RNase inhibitor | 1μL |
| 200U/μL逆转录酶 | 1μL |
| 总体积 | 25μL |
逆转录酶包括翌圣生物的Hifair II/III/IV/V Reverse transcriptase。
混匀后瞬离。25℃反应10min，42℃反应15min，70℃反应5min，4℃保存。按照上述实施例进行RNA建库并测序。
结果如图20所示，三元复合物封闭探针比双链逆转录阻碍探针在RNA建库上对逆转录酶的适用性更广、rRNA去除效率更高。
本发明提供一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA和球蛋白RNA的方法，原理是利用探针与核糖体RNA和球蛋白RNA通过互补配对形成三元封闭复合物(Triple complex)，在RNA建库的一链cDNA合成过程中实现对核糖体RNA和球蛋白RNA逆转录的高效率高特异性抑制，从而阻碍核糖体RNA和球蛋白RNA参与下游建库过程。本发明具有操作简单、耗时极短、特异性强、适用性广、去除效率高和基因检出数高等优点，非常适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领域。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> 在RNA建库过程中封闭核糖体RNA或球蛋白RNA的探针及其应用
<141> 2021-10-01
<160> 174
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
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tcctctcttt cttcttattg atcaatgtgt cct 33
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gctccatagg gtcttctcgt ctt 23
Claims (8)
1.一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA的探针，其特征在于：所述核糖体RNA为人的5.8S rRNA，探针为下表所示的5.8S probe的混合物：
其中探针的3’-OH用MGB进行封闭；探针序列中斜体下划线标记的碱基为修饰碱基，修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU或2-O-甲基核糖修饰。
2.一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA的探针，其特征在于：核糖体RNA为人的18SrRNA，探针为下表所示的18S probe的混合物：
其中探针的3’-OH用MGB进行封闭；探针序列中斜体下划线标记的碱基为修饰碱基，修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU或2-O-甲基核糖修饰。
3.一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA的探针，其特征在于：所述核糖体RNA为人的28S rRNA，探针为下表所示的28S probe的混合物：
其中探针的3’-OH用MGB进行封闭；探针序列中斜体下划线标记的碱基为修饰碱基，修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU或2-O-甲基核糖修饰。
4.一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA的探针，其特征在于：所述核糖体RNA为人的12S rRNA，探针为下表所示的12S probe的混合物：
其中探针的3’-OH用MGB进行封闭；探针序列中斜体下划线标记的碱基为修饰碱基，修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU或2-O-甲基核糖修饰。
5.一种在RNA建库过程中封闭核糖体RNA的探针，其特征在于：所述核糖体RNA为人的16S rRNA，探针为下表所示的16S probe的混合物：
其中探针的3’-OH用MGB进行封闭；探针序列中斜体下划线标记的碱基为修饰碱基，修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU或2-O-甲基核糖修饰。
6.一种在RNA建库过程中封闭球蛋白RNA的探针，其特征在于：探针为下表所示的Globin probe的混合物：
其中探针的3’-OH用MGB进行封闭；探针序列中斜体下划线标记的碱基为修饰碱基，修饰碱基的修饰种类为PNA、LNA、dU或2-O-甲基核糖修饰。
7.权利要求1-6中任一项所述的探针在RNA建库中快速去除核糖体RNA或球蛋白RNA的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于其步骤包括：
（1）提取样本中的总RNA，在总RNA中加入探针，高温变性后退火反应；
（2）在反应产物中加入逆转录缓冲液、随机引物和一链cDNA合成酶混合物，进行逆转录反应；
（3）RNA NGS建库。
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| Novel rRNA-depletion methods for total RNA sequencing and ribosome profiling developed for avian species;Hanwen Gu等;Poultry Science;第100卷(第9期);101321 * |
| 三链核酸分子探针的稳定性及其生物传感应用;王焕翔等;化学传感器;第40卷(第4期);第26页右栏第1段，第32页左栏第2段，表1 * |
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