CN116179649A - 富集单细胞测序小片段cDNA的方法及其在鉴定单细胞转录组中miRNA表达的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富集单细胞测序小片段cDNA以用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达的方法，采用SPRISlect磁珠分选文库片段，在磁珠结合液中加入PEG10000、异丙醇和三氯六氨络合钴，以提高小片段100～300bp富集。本发明创新地将DNA线性扩增和磁珠小片段分选技术与10xGenomics单细胞文库构建方法相融合，解决现有技术中存在的单细胞测序过程中由小片段富集能力不足而导致小片段PrimRNA数据丢失的问题。本发明具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富集单细胞测序小片段cDNA的方法及其用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达中的应用。
背景技术
miRNA在靶基因表达的转录后调控中发挥作用，一个miRNA可以同时靶向位于同一细胞信号通路中的多个基因，影响细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育和细胞凋亡等重要的生物学过程。失调的miRNA在各种疾病的进展中起关键作用，例如衰老、心血管疾病和癌症。由于miRNA参与多种生物学过程并影响多种人类疾病，使其成为潜在的诊断生物标志物。利用单细胞转录组测序技术，可以解析出miRNA在细胞调控网络中的生物学意义。
目前使用最广泛的高通量单细胞转录组测序技术是10x genomics公司开发的基于液滴微流控平台的单细胞测序技术，该技术使用的反转录引物均为Poly(dT)反转录引物，用于捕获有polyA尾的转录本。通过将miRNA转录本与mRNA转录本结合能够挖掘更系统、详尽的网络运作机制，解答更复杂的生物学问题，洞悉更深刻的生物学机制。
目前我们开发了利用pri-miRNA鉴定单细胞转录组中表达miRNA的方法，但由于一些pri-miRNA长度太短，现有的转录组常规建库方法不能捕获到这些小片段，所以亟需一种适用的方法富集100～300bp的cDNA，作为补充miRNA转录本信息的一种方法。
目前常规的10x单细胞测序建库流程无法有效的识别到更多的pri-miRNA，其中一个重要的制约因素是不能进行小片段的富集。常见可以分选不同大小片段的靶核酸方法有两种，一种采用切胶回收，但其实验方法操作繁琐，耗时长，产物回收效率低，对于小片段的分选需要专业的知识，而且紫外照射存在一定的危险性，并且易使核酸碱基发生突变。另一种方法在常规的10x单细胞测序建库流程描述到利用聚乙二醇(PEG)和氯化钠来分离沉淀核酸，分选出目的核酸片段，但需要处理较长时间，操作复杂，而且分选小片段cDNA能力弱。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明提出一种新的技术方案，一种用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达的富集单细胞测序小片段cDNA的方法，本发明采用SPRI Slect磁珠分选文库片段，在磁珠结合液中加入PEG 10000、异丙醇和三氯六氨络合钴，有效提高小片段(100～300bp)富集效果。同时为进一步提高富集到小片段cDNA含量，改进反转录体系以及cDNA PCR扩增体系。且本发明所达到的富集效果的提高/提高程度可以明显地与现有的10X Genomics磁珠结合液区分出来。
本发明的目的之一是提出一个简单，回收率高，还能实现高通量的一种富集单细胞测序小片段cDNA的方法，采用SPRI Slect磁珠分选文库片段，在磁珠结合液中加入PEG10000、异丙醇和三氯六氨络合钴，以提高小片段100～300bp富集效率。
所述方法包括以下步骤：
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒ChromiumNext GEMSingl e Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。其中，反转录体系包含RT ReagentB 18.8μl，Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。所述反转录体系中加入5μg T4Gene 32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1～1.5h。；
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物、5×PlatinumTMII PCRBuffer10μl、10mM dNTP mix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase(InvitrogenTM，14966100)0.8μl、5μg SSB(Thermo ScientificTM，70032Z500UG)，上一步所有cDNA模板；
(3)cDNA线性扩增；
(4)PCR产物纯化；
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小；
(6)cDNA 5′端磷酸化；
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段(NEB，E7335L)10μM；10x T4 DNA Ligase buffer 5μl；聚赖氨酸(Sigma,P3150-100MG)4mM；T4DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶；
(8)酶切接头：
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增；
(10)配制DNA片段分选纯化试剂；磁珠结合液为含400mMTris pH 8.0(Invitrogen,15567027)、1M异硫氰酸胍(Sigma-Aldrich,G9277-100G)、0.1％吐温-20(Sigma-Aldrich，P9416-50ML)、7％(W/V)PEG10000(Sigma-Aldrich，8218811000)、0.2mM三氯六氨络合钴(Sigma-Aldr ich，481521-100G)、40％(V/V)的异丙醇(Sigma-Aldrich，I9030-100ML)及50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇(生工，A500737-0500)；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水(InvitrogenTM，AM9916)；
(11)cDNA片段筛选；第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用。
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
具体地，所述步骤为：
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒ChromiumNext GEMSingl e Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。其中，反转录体系包含RT ReagentB 18.8μl，Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。所述反转录体系中加入5μg T4Gene 32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物、5×PlatinumTMII PCRBuffer10μl、10mM dNTP mix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase(InvitrogenTM，14966100)0.8μl、5μg SSB(Thermo ScientificTM，70032Z500UG)，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上按照上述PCR扩增程序进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent(BECKMAN,B23319)，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化：在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ngcDNA；T4多核苷酸激酶(Thermo ScientificTM，EK0032)10U，ATP 10mM，10x reactionbuffer4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段(NEB，E7335L)10μM；10x T4 DNA Ligase buffer 5μl；聚赖氨酸(Sigma,P3150-100MG)4mM；T4DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer(NEB，B6004SVIAL)2μl；User enzyme(NEB，M5505L)3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix(NEB，M0544L)40μl，i7 index primer 2μl，i5 indexprimer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(10)配制DNA片段分选纯化试剂：磁珠结合液为含400mMTris pH 8.0(Invitrogen,15567027)、1M异硫氰酸胍(Sigma-Aldrich,G9277-100G)、0.1％吐温-20(Sigma-Aldrich，P9416-50ML)、7％(W/V)PEG10000(Sigma-Aldrich，8218811000)、0.2mM三氯六氨络合钴(Sigma-Aldr ich，481521-100G)、40％(V/V)的异丙醇(Sigma-Aldrich，I9030-100ML)及50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇(生工，A500737-0500)；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水(InvitrogenTM，AM9916)。
(11)cDNA片段筛选
第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用。
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序：进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
步骤(1)中，所述步骤均使用10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1(CG000204·Rev D)凝胶珠试剂盒按照常规操作进行。所述反转录体系中T4 Gene32Protein用量为1～7μg，优选的为5μg。所述反转录时间为1～1.5h，优选地，为1.5h。
步骤(2)中，所述cDNA扩增混合溶液成分为：2μM～8μM引物、0.5×～2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase，4～6μg SSB，上一步所有cDNA模板。优选的，引物终浓度为4μM，PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase终用量为2×，SSB用量为5μg。所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1)。
步骤(3)中，所述cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMCcDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。优选地，退火温度为58℃，循环数为20个。
步骤(3)中，所述PCR仪为Long Gene-T30D超级梯度PCR仪。
步骤(4)中，所述磁珠为SPRIselect Reagent(BECKMAN,B23319)。所述乙醇浓度为70％～80％，优选地，乙醇浓度为80％。
步骤(5)中，所述质检仪器为Qubit 4荧光仪(Thermo Fisher Q33238)及自动化电泳系统(Agilent 4150 TapeStation)。
步骤(6)中，所述T4多核苷酸激酶用量为1～10U，优选的，T4多核苷酸激酶用量为10U；所述37℃温育时间为15～30min，优选地，37℃温育时间为30min。
步骤(7)中，所述连接酶为T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)；聚赖氨酸用量为0.1～5mM，优选地，聚赖氨酸用量为4mM；所述连接反应条件22℃温育时间为10～30min，优选的，温育时间为10min；所述接头是指合成的能够自身互补的DNA片段，接头序列为：5′-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCdnACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3′(SEQ ID NO.2)。
其中，SEQ ID NO.2中n为U碱基，作为一个酶切位点添加进去，后续通过酶User特异性切除U碱基。
步骤(8)中，所述User enzyme酶切时间为10～30min，优选地，酶切时间为15min。
步骤(9)中，所述对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 20μl，i7 index primer 1μl，i5 indexprimer 1μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10～20个循环。4℃保存。优选地，循环数为20个。
步骤(10)中，所述配制DNA片段分选纯化试剂：磁珠结合液为含1～400mM Tris pH8.0、1mM～1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、5％～8％(W/V)PEG10000、0.05～1mM三氯六氨络合钴、30％～40％(V/V)的异丙醇及20～50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为70％～80％无水乙醇；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水。
优选地，Tris pH 8.0终浓度为400mM；异硫氰酸胍终浓度为1M、PEG10000终浓度为7％(W/V)、三氯六氨络合钴终浓度为0.2mM、异丙醇终浓度为40％(V/V)、SPRI磁性颗粒终浓度为50mg/ml、无水乙醇终浓度为80％。
步骤(11)中，所述第一次基于SPRI的大小选择，利用核酸纯化磁珠通过控制PEG10000、异丙醇和三氯六氨络合钴百分比浓度配比进行第一轮纯化，收取磁珠上清液回收300nt以下的核酸片段。
步骤(11)中，所述第二次基于SPRI的大小选择，利用核酸纯化磁珠通过控制PEG10000、异丙醇和三氯六氨络合钴百分比浓度配比进行第二轮纯化，回收核酸纯化磁珠上所吸附的核酸片段，核酸片段的长度大于100nt。
步骤(11)中，所述的PEG优选分子量为4000～10000，更优选为分子量10000。所述磁珠结合液的PH为7～8。更优选为PH8。所述磁珠为表面包裹亲水性高分子介质并具有活性功能基团羟基的四氧化三铁颗粒，所述颗粒具有超顺性。
步骤(12)中，所述质检仪器为Qubit 4荧光仪(Thermo Fisher Q33238)及自动化电泳系统(Agilent 4150 TapeStation)。
本发明的有益效果在于：本发明创新地将DNA线性扩增和磁珠小片段分选技术与10xGenomics单细胞文库构建方法相融合，解决现有技术中存在的单细胞测序过程中由小片段富集能力不足而导致小片段Pri mRNA数据丢失的问题。本发明具有广泛应用前景。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl，Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4 Gene32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5×PlatinumTMII PCRBuffer 10μl、10mM dNTPmix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase 0.8μl，5μg SSB，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150 Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的500ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4DNA Ligase buffer 5μl；聚赖氨酸(Sigma,P3150-100MG)4mM；T4 DNA连接酶(ThermoScientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 40μl,i7 index primer 2μl,i5 indexprimer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(10)配制DNA片段分选纯化试剂
磁珠结合液为含400mM Tris pH 8.0、1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、7％(W/V)PEG10000、0.2mM三氯六氨络合钴、40％(V/V)的异丙醇及50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水。
(11)cDNA片段筛选
第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用。
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
结果见表1。
实施例2：
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl，Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4 Gene32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5×PlatinumTMII PCRBuffer 10μl、10mM dNTPmix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase 0.8μl，5μg SSB，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150 Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4DNA Ligase buffer 5μl；聚赖氨酸(Sigma,P3150-100MG)4mM；T4 DNA连接酶(ThermoScientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 40μl，i7 index primer 2μl,i5 index primer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(10)配制DNA片段分选纯化试剂
磁珠结合液为含400mM Tris pH 8.0、1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、7％(W/V)PEG10000、0.2mM三氯六氨络合钴、40％(V/V)的异丙醇及50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水。
(11)cDNA片段筛选
第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用。
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
结果见表1。
实施例3：
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl，Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4 Gene32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5×PlatinumTMII PCRBuffer 10μl、10mM dNTPmix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase 0.8μl，5μg SSB，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150 Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的50ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4DNA Ligase buffer 5μl；聚赖氨酸(Sigma,P3150-100MG)4mM；T4 DNA连接酶(ThermoScientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 40μl,i7 indexprimer 2μl,i5 index primer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(10)配制DNA片段分选纯化试剂
磁珠结合液为含400mM Tris pH 8.0、1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、7％(W/V)PEG10000、0.2mM三氯六氨络合钴、40％(V/V)的异丙醇及50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水。
(11)cDNA片段筛选
第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用。
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
结果见表1。
对比实施例1
本对比实施例使用10X Genomins 3’V3.1文库构建说明书中的cDNA常规指数扩增程序进行文库构建。
(1)人PBMC单细胞分离：按照常规PBMC单细胞分离方法获取PBMC单细胞悬液。
(2)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。
(3)配制cDNA扩增试剂：扩增混合溶液成分为：Amp Mix 50μl(10x GenomicsChromium Next GEM Single Cell 3′Reagent Kits v3.1)、cDNA引物1μM(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、第一链cDNA模板35μl。
(4)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数13个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(5)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(6)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(7)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(8)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3Weiss U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育25min以灭活T4 DNA连接酶。
(9)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(10)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 20μl,i7 indexprimer 1μl,i5 index primer 1μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(11)依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行文库片段筛选。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析。
结果见表2。
对比实施例2
本对比实施例将10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)中的反转录时间延长至1h，其余步骤与对比实施例1相同。
(1)人PBMC单细胞分离：按照常规PBMC单细胞分离方法获取PBMC单细胞悬液。
(2)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒ChromiumNext GEMSing le Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录时间由原来45min延长至1h。
(3)配制cDNA扩增试剂：扩增混合溶液成分为：Amp Mix 50μl(10x GenomicsChromium Next GEM Single Cell 3′Reagent Kits v3.1)、cDNA引物1μM(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、第一链cDNA模板35μl。
(4)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数13个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(5)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(6)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(7)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(8)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3Weiss U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育25min以灭活T4 DNA连接酶。
(9)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(10)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 20μl,i7 index primer 1μl，i5 index primer 1μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(11)依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行文库片段筛选。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序：进行后续单细胞测序分析。
结果见表2。
对比实施例3
本对比实施例将10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)中的反转录时间延长至1.5h，其余步骤与对比实施例1相同。
结果见表2。
对比实施例4
本对比实施例将10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)中的反转录体系中添加5μg T4Gene 32Protein(NEB)，同时反转录时间延长至1.5h，其余步骤与对比实施例1相同。
对比实施例5
本对比实施例将10X Genomins 3’V3.1文库构建说明书中的cDNA扩增循环数增加至20个，其余步骤与对比实施例1相同。
(1)人PBMC单细胞分离：按照常规PBMC单细胞分离方法获取PBMC单细胞悬液。
(2)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒ChromiumNext GEMSing le Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。
(3)配制cDNA扩增试剂：扩增混合溶液成分为：Amp Mix 50μl(10x GenomicsChromium Next GEM Single Cell 3′Reagent Kits v3.1)、cDNA引物1μM(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、第一链cDNA模板35μl。
(4)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(5)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(6)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(7)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(8)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3Weiss U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育25min以灭活T4 DNA连接酶。
(9)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(10)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 20μl,i7 index primer 1μl，i5 index primer 1μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(11)依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行文库片段筛选。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析。
结果见表2。
对比实施例6
本对比实施例将10X Genomins 3’V3.1文库构建说明书中的cDNA扩增循环数减少至10个，其余步骤与对比实施例1相同。
结果见表2。
对比实施例7
本对比实施例将10X Genomins 3’V3.1文库构建说明书中的文库扩增循环数增加至20个，其余步骤与对比实施例1相同
结果见表2。
对比实施例8
本对比实施例扩增酶使用PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase PCRKit(Roche，kk2602)并按照该试剂说明书对cDNA进行扩增，其余步骤与对比实施例5相同。
(1)人PBMC单细胞分离：按照常规PBMC单细胞分离方法获取PBMC单细胞悬液。
(2)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒ChromiumNext GEMSingl e Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。
(3)配置PCR扩增混合溶液。扩增混合溶液成分为：1μM cDNA引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、1×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNAPolymerase，上一步所有cDNA模板。
(4)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火60℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(5)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(6)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(7)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(8)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3Weiss U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min。然后于70℃温育25min以灭活T4 DNA连接酶。
(9)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(10)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 20μl,i7 indexprimer 1μl,i5 index primer 1μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(11)依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行文库片段筛选。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析。
结果见表3。
对比实施例9
本对比实施例将cDNA引物终浓度提升至2μM，其余步骤与对比实施例8完全一致。
结果见表3。
对比实施例10
本对比实施例将cDNA引物终浓度提升至4μM，其余步骤与对比实施例8完全一致。
结果见表3。
对比实施例11
本对比实施例将cDNA引物终浓度提升至8μM，其余步骤与对比实施例8完全一致。
结果见表3。
对比实施例12
本对比实施例使用常规PCR扩增程序，将cDNA扩增的退火温度设置为58℃，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例10一致。
结果见表4。
对比实施例13
本对比实施例使用常规PCR扩增程序，将cDNA扩增的退火温度设置为65℃，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例10一致。
结果见表4。
对比实施例14
使用SSB作为一种PCR反应添加剂，在cDNA扩增反应体系中加入5μg SSB，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例12一致。
结果见表4。
对比实施例15
使用SSB作为一种PCR反应添加剂。在cDNA扩增反应体系中加入6μg SSB，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例12一致。
结果见表4。
对比实施例16
使用SSB作为一种PCR反应添加剂。在cDNA扩增反应体系中加入4μg SSB，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例12一致。
结果见表4。
对比实施例17
本对比实施例将PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase用量减至0.5×，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例14一致。
结果见表4。
对比实施例18
本对比实施例将PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase用量减至0.2×，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例14一致。
结果见表4。
对比实施例19
本对比实施例将PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase用量增至2×，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例14一致。
结果见表4。
对比实施例20
本对比实施例对扩增后的cDNA使用新配制的2％琼脂糖凝胶跑电泳，根据QiagenQIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(28704)说明书回收100-300bp文库片段，其余步骤与对比实施例19相同。
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl,Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4 Gene32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5×PlatinumTMII PCRBuffer 10μl、10mM dNTPmix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase 0.8μl，5μg SSB，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150 Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育25min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 40μl,i7 indexprimer 2μl,i5 index primer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(10)使用新鲜的TAE/TBE Buffer和新配制的2％琼脂糖凝胶电泳分离cDNA片段，片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。
(11)根据Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(28704)说明书回收100-300bp文库片段。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
结果见表6。
对比实施例21
本对比实施例对扩增后的文库使用Invitrogen E-GelTMEX 2％琼脂糖凝胶跑电泳，根据Thermo Scientific GeneJET凝胶回收试剂盒说明书回收100-300bp文库片段，其余步骤与对比实施例19相同。
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl,Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4 Gene32 Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5×PlatinumTMII PCRBuffer 10μl、10mM dNTPmix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase 0.8μl，5μg SSB，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150 Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育25min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 40μl,i7 index primer 2μl，i5 index primer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(10)使用Invitrogen E-GelTMEX 2％琼脂糖凝胶电泳分离cDNA片段，片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。
(11)根据Thermo Scientific GeneJET凝胶回收试剂盒说明书回收100-300bp文库片段。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
结果见表6。
对比实施例22
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液：400mMTris pH 8.0、1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、6％(W/V)PEG4000、30％(V/V)的异丙醇及50mg/ml SPRI磁性颗粒。其余步骤与对比实施例19相同。
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl,Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4 Gene32Protein(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5×PlatinumTMII PCRBuffer 10μl、10mM dNTPmix 1μl、2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase 0.8μl，5μg SSB，上一步所有cDNA模板。
(3)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(4)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150 Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(6)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育25min。然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶。
(8)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 40μl,i7 index primer 2μl,i5 indexprimer 2μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，10个循环。4℃保存。
(9)配制DNA片段分选纯化试剂
磁珠结合液为含400mM Tris pH 8.0、1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、6％(W/V)PEG4000、30％(V/V)的异丙醇及50mg/ml SPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水。
(10)cDNA片段筛选
第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用。
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
(11)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(12)高通量测序:进行后续单细胞测序分析，测序深度为30K Reads/细胞。
结果见表6。
对比实施例23
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用6％PEG10000和30％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例24
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用6％PEG10000和35％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例25
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用6％PEG10000和40％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例26
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000和30％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例27
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000和35％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例28
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000和40％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例29
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用8％PEG10000和30％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例30
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用8％PEG10000和35％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例31
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用8％PEG10000和40％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例32
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用9％PEG10000和30％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例33
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用9％PEG10000和35％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例34
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用9％PEG10000和40％异丙醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表6。
对比实施例35
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％甲醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表7。
对比实施例36
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％戊二醇，其他组分不变。其余步骤与对比实施例19相同。
结果见表7。
对比实施例37
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％异丙醇和10mM氯化钠，其他组分不变。其余步骤与对比实施例28相同。
结果见表8。
对比实施例38
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％异丙醇和10mM氯化镁，其他组分不变。其余步骤与对比实施例28相同。
结果见表8。
对比实施例39
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％异丙醇和10mM三氯六氨络合钴，其他组分不变。其余步骤与对比实施例28相同。
结果见表8。
对比实施例40
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％异丙醇和1mM三氯六氨络合钴，其他组分不变。其余步骤与对比实施例28相同。
结果见表8。
对比实施例41
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％异丙醇和0.2mM三氯六氨络合钴，其他组分不变。其余步骤与对比实施例28相同。
结果见表8。
对比实施例42
本对比实施例对扩增后的文库采用磁珠法进行片段筛选，配制磁珠结合液中采用7％PEG10000、40％异丙醇和0.05mM三氯六氨络合钴，其他组分不变。其余步骤与对比实施例28相同。
结果见表8。
对比实施例43
本对比实施例在cDNA加接头反应体系中加入1mM PEG 4000，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例41一致。
(1)人PBMC单细胞分离：按照常规PBMC单细胞分离方法获取PBMC单细胞悬液。
(2)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒ChromiumNext GEMSingl e Cell 3′Reagent Kits v3.1(CG000204·Rev D)进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA。反转录体系包含RT Reagent B18.8μl,Tem plate Switch Oligo 2.4μl,RT Enzyme C 8.7μl。反转录体系中加入5μg T4Gene 32Prote in(NEB，M0300L)，反转录时间1.5h。
(3)配置PCR扩增混合溶液。扩增混合溶液成分为：4μM cDNA引物(所述引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))、5μg SSB、2×PlatinumTMII Taq Hot-StartDNA Polymerase，上一步所有cDNA模板。
(4)cDNA扩增：设置PCR扩增程序：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。将配制好包含PBMC cDNA模板的PCR混合液放置于PCR仪上进行cDNA扩增。
(5)PCR产物纯化：依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行PCR产物纯化，PCR反应结束后向样品中加入1.2×SPRIselect Reagent，混匀，室温孵育5min，转至磁力架上至溶液澄清，弃上清，加入新鲜配制80％乙醇200μl，室温静置30s，弃上清，重复一次，气干，加入22μl Buffer EB，混匀，室温孵育2min，转移至磁力架上至溶液澄清，吸20μl上清于新PCR管中。
(6)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小。
(7)cDNA 5′端磷酸化
在PCR管中加入下列反应混合物：上一步捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP 10mM，10x reaction buffer 4μl，ddH2O to 40μl。反应混合物于37℃温育20min。然后于70℃温育15min以灭活T4多核苷酸激酶。
(8)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段10μM；10xT4 DNA Ligase buffer 5μl；1mM PEG 4000；T4 DNA连接酶(Thermo Scientific,EL0016)3Weiss U。H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育17min。然后于70℃温育15min以灭活T4DNA连接酶。
(9)酶切接头：在上一步PCR管中加入：10x rCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme3μl。反应物于37℃温育15min。
(10)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：NEBNext Ultra Q5 Master Mix 20μl，i7 index primer 1μl,i5 index primer 1μl。根据如下条件进行反应：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火/延伸65s，终延伸5min，20个循环。4℃保存。
(11)依照10x Genomics Chromium Single Cell 3′v3.1文库构建试剂盒说明书，进行文库片段筛选。
(12)文库质检：使用Qubit测定并记录文库浓度，并用质检仪器Agilent 4150Tape Station对得到的文库进行质检，并记录文库片段大小。
(13)高通量测序:进行后续单细胞测序分析。
结果见表9。
对比实施例44
本对比实施例在cDNA加接头反应体系中加入1mM聚赖氨酸，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例41一致。
结果见表9。
对比实施例45
本对比实施例在cDNA加接头反应体系中加入4mM聚赖氨酸，其余操作步骤及试剂使用均与对比实施例41一致。
结果见表9。
本发明提出了一个简单，回收率高，还能实现高通量的一种富集单细胞测序小片段cDNA以用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达的方法。本发明所述的cDNA线性扩增和磁珠小片段分选方法可以直接嫁接于常规10x Genomics单细胞文库构建标准流程中，解决当前单细胞测序过程中由小片段富集能力不足而导致小片段Pri mRNA数据丢失的缺陷。
根据本发明表1提供的关于本发明实施例1～3的实验结果，说明本发明所提供的实验方法能够满足50ng以上cDNA起始样本量进行建库，同时富集单细胞测序小片段cDNA以用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达，实验各项质量指标达到理想要求。
表1实施例1～3
为了开发一种可在同一种富集单细胞测序小片段cDNA以用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达的方法，本发明进行了一系列对比实验，结果如对比实施例1～45所示。进行了从RNA转录条件、cDNA扩增方式、扩增条件、优化磁珠结合液体系等方面的一系列探索，通过创造性研究得到了本发明中的内容。
对比实施例1使用目前常规10X Genomins 3’V3.1单细胞文库构建说明书对得到的人-PBMC样品进行文库构建，结果如表2所示：对比实施例1在常规10X Genomins 3’V3.1文库构建方法下，样品cDNA质量在正常范围内，但经后续的小片段文库分选，最终仅富集到到极少量小片段文库，将分选的文库送测序难以检测到单细胞转录组中miRNA的表达信息。小片段文库量少可能是反转录产量低导致，接下来通过延长反转录时间来改变此状况。对比实施例2～3将反转录时间增加到1h和1.5h，结果显示cDNA浓度较对比实施例1有所增加。将反转录时间增加1.5h比1h的反转录得到的cDNA产率并没有明显提高，结果显示虽然对比实施例2～3的cDNA浓度较对比实施例1有所增加，但小片段文库分选后得率低，将分选的文库送测序难以检测到单细胞转录组中miRNA的表达信息。因此单纯增加反转录时间并不能提高小片段文库得率，从提高RNA的反转录效率角度入手，RNA二级结构的问题不可忽略，因为反转录酶在遇到此类结构后会终止反应或从模板上脱落下来。T4 gene 32protein是一种单链DNA结合蛋白，在RT-PCR过程中，增加反转录的产量和延伸能力。通过在反转录过程中引入T4 Gene 32Protein，表2结果显示，对比实施例4在反转录过程中引入T4 Gene32Protein后cDNA浓度较对比实施例3有所增加，cDNA产量相应大幅度增多，但小片段文库分选后浓度低，未达到上机测序标准。综上，本发明选取在10X Genomins 3’V3.1反转录体系中引入T4 Gene 32Protein。
接下来本发明对cDNA扩增方式、扩增条件进行一系列的摸索性实验，首先对比实施例5～11增加cDNA扩增循环数及文库扩增循环数，对比实施例5～6结果显示cDNA扩增循环数增加至20个，cDNA产量相应增多，但二聚体小片段增多，小片段文库分选后得率低，未达到上机测序标准。cDNA扩增循环数减少导致cDNA产量相应减少，二聚体小片段减少。对比实施例7将文库扩增循环数增加至20个，但小片段文库分选后得率未达到理想效果。由此判定，单纯改变扩增循环数和文库扩增循环数不足以提高小片段文库质量。其次在普通转录组测序中解决基因片段丢失的途径还包括：更改高保真DNA聚合酶、增加引物浓度、更改PCR扩增程序。结果如表3显示，对比实施例5使用10x Genomics Chromium Next GEM SingleCell 3′Reagent Kits v3.1中提供的扩增酶进行扩增，但扩增后的cDNA浓度极低，增加扩增循环数后依然未达到理想建库浓度，且cDNA扩增后的产物有小条带出现，减少扩增循环数后可以避免产物出现小条带。对比实施例8使用一种带热启动的cDNA扩增酶PlatinumTMIITaq Hot-Start DNAPolymerase(InvitrogenTM,14966001)并按照其说明书条件进行扩增，该酶扩增产物3'末端引入单脱氧腺苷(A)。结果如表3显示，改用PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase后，cDNA浓度有所提升，且观察cDNA扩增条带，基本无二聚体小条带，但仍未达到理想建库浓度。故接下来又在对比实施例8的条件基础上对cDNA引物浓度进行调整，对比实施例9～11将cDNA引物终浓度调整为2μM、4μM及8μM，结果如表3所示，cDNA引物终浓度增加为4μM时，cDNA浓度有所提升，二聚体小条带较少，但未能达到理想建库浓度；cDNA引物终浓度为8μM，最终得到的cDNA产物浓度有较高提升，但PCR产物二聚体小条带较多。
另一方面，由于cDNA引物的Tm值在60℃，所以对比实施例12～13对PCR退火温度进行摸索，结果如表3所示，退火温度设置为58℃时，cDNA质检后浓度比较好，退火温度较低导致cDNA扩增后有非特异扩增小条带；退火温度设置为65℃时，cDNA产物浓度略有下降，可能是退火温度设置较高，影响引物和模板未能有效结合，未能促进cDNA扩增。综合判定，cDNA扩增体系中，扩增酶使用PlatinumTMII Taq Hot-Start DNAPolymerase，cDNA引物浓度为4μM，cDNA扩增时退火温度58℃。
表2对比实施例1-4
表3对比实施例5-13
在对比实施例1-13验证基础上，确定了提高反转录效率的方法，以及能提高cDNA产量的高保真DNA聚合酶、cDNA引物浓度，cDNA扩增循环数等一系列条件。但出现了在高循环数下容易出现二聚体小条带的情况，为此需要找到一种方法，达到既能提高cDNA扩增效率，又能降低二聚体小片段的目的。Single-Stranded DNA Binding Protein(SSB)以高亲和力协同结合单链DNA，其与双链DNA的结合度不高。与单链DNA结合后，SSB使螺旋二聚体变得不稳定，因此DNA聚合酶可以更容易地接触到底物。PCR可通过将这种结合蛋白添加到反应液中而得到优化。SSB可在PCR试验过程中添加以使变性DNA保持稳定，也可将其用作一种PCR反应添加剂，以此保护ssDNA不被核酸酶消化。研究表明SSB通过直接或间接作用于聚合酶，增加链置换活性以及对引物模板的亲和力，从而可改善复杂模板下的PCR性能。本发明中使用SSB(Thermo Scientific，70032Z500UG)作为一种cDNA扩增反应添加剂。结果如表4所示，对比实施例14在cDNA扩增反应体系中加入5μg SSB时，cDNA扩增产物浓度有显著提升。对SSB最适用量进行摸索。对比实施例15～16结果显示，在cDNA扩增反应体系中加入6μgSSB时，cDNA扩增产物与文库浓度较对比实施例14没有较大提升。在cDNA扩增反应体系中加入4μg SSB时，cDNA扩增产物与文库浓度较对比实施例14有所降低。因此，综合判定，最终确定使用5μg SSB以提高cDNA扩增反应效率。
由于SSB使螺旋二聚体变得不稳定，让DNA聚合酶可以更容易地接触到底物，改变DNA聚合酶用量也许能进一步提高cDNA扩增效率。因此本发明接下来对比不同PlatinumTMIITaq Hot-Start DNAPolymerase用量，以cDNA质量作为质控指标。如表4中对比实施例17～19结果显示，将PlatinumTMII Taq Hot-Start DNAPolymerase用量减至0.5×和0.2×，cDNA产物质量随着PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase用量的减少而减少，将PlatinumTMII Taq Hot-Start DNAPolymerase用量增至2×，PCR产物浓度得到提升，二聚体小条带较少。
因此本发明确定，cDNA扩增体系中，扩增酶使用2×PlatinumTMII Taq Hot-StartDNA Polymerase，cDNA引物浓度为4μM，SSB用量5μg，PCR扩增条件为预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。
表4对比实施例14-19
对比实施例19根据常规的10X Genomins 3’V3.1单细胞文库构建说明书对文库进行片段筛选，结果如表5所示：样品cDNA质量在正常范围内，经过片段分选后，富集到的小片段文库浓度很低，未达到理想上机测序要求，即使PlatinumTMII Taq Hot-Start DNAPolymerase用量增至2×，经过20个循环的PCR扩增。由此判定，低浓度小片段文库可能是由于常规10XGenomins 3’V3.1单细胞文库片段分选过程中所用到的磁珠体系不适用于小片段文库的富集，对小片段DNA的凝聚力较弱，在有限的结合能力下没办法筛选到足够多的小片段文库。cDNA扩增各项参数确定后，cDNA浓度得到很大的提升，已经满足建库要求，接下来需要对文库片段大小筛选条件进行摸索和改进。
当前大量对比实施例实验结果表明，为了富集高质量的单细胞测序小片段文库，单靠增加cDNA产量的方法不可行，直接靶向小片段文库富集方法可能是解决问题的途径。因此，在本发明中尝试了两种可以分选不同大小片段DNA的方法，一种方法是采用常规琼脂糖凝胶切割回收目的片段，另一种方法通过优化磁珠结合液体系增加DNA凝聚力，以此来直接捕获在常规单细胞转录组测序中易丢失的小片段。首先是采用常规琼脂糖凝胶切割回收目的片段，对比实施例20、21通过设置2％琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的DNA片段，利用凝胶回收试剂盒回收小片段DNA。实验结果如表5所示，对比实施例20～21选用市场上购买到的凝胶回收试剂盒进行文库小片段筛选，参照illumina Hiseq 2500测序平台上机测序标准，以文库质量进行综合比较和判定。结果显示切胶回收试剂盒方法富集到的小片段文库浓度很低，未能满足上机测序的要求。可能原因是凝胶回收过程中小片段DNA损失较多，导致小片段文库质量过低。由此判定，胶回收试剂盒方案不能达到本发明的目的，直接改进磁珠分选体系，靶向小片段cDNA富集可能是解决问题的途径。
表5对比实施例20-21
现有的10X Genomins 3’V3.1磁珠体系难以达到理想小片段富集效果，开始尝试自制磁珠分选体系以回收溶液中的小片段文库，并且随着磁珠体系主要几种试剂用量不同，对于不同分子量大小的DNA片段具有选择性的回收能力。对比实施例22使用6％(W/V)PEG4000、30％(V/V)的异丙醇配制磁珠结合液体系，分选到的小片段浓度低。对比实施例23使用6％(W/V)PEG10000、30％(V/V)的异丙醇配制磁珠结合液体系，分选到的小片段浓度有所提高。
接下来对比实施例24～34在其他条件不变的情况下对PEG10000和异丙醇用量最佳组合进行探索，经过一系列参数组合的对比，结果如表6所示，几种浓度的PEG10000得到的cDNA量差别不大，其中7％PEG10000、40％异丙醇组合的数据表现得最好，富集到小片段文库浓度有很大的提升，文库质检浓度满足上机要求。在对比实施例35、36中，本发明尝试了两种醇类(甲醇和戊二醇)替代异丙醇配制磁珠结合液，结果如表7显示40％异丙醇的数据表现得最好，富集到小片段浓度最佳。综合以上，确定了采用7％PEG10000、40％异丙醇配制的磁珠结合液体系。
研究表明在DNA凝聚过程中离子的相互作用扮演着重要的角色。物理定律指出，要使带负电荷的DNA片段相互靠近，其负电荷必须大量被中和才能克服强烈的相互排斥力。本发明尝试了一系列验证实验，探究单价钠离子、二价镁离子以及三价钴离子对DNA凝聚效果的影响，进一步改进本发明中磁珠体系的小片段富集效果。对比实施例37～39中经过一系列参数组合的对比，结果如表8所示，分别在自制磁珠结合液体系中引入10mM氯化钠、10mM氯化镁、10mM三氯六氨络合钴，对比结果显示三氯六氨络合钴对提高磁珠结合液的小片段富集能力最佳，因此决定在磁珠结合液体系中引入氯六氨络合钴。
对比实施例39～42对三氯六氨络合钴最佳用量进行摸索，结果显示引入10mM三氯六氨络合钴可以有效提高富集小片段文库浓度。三氯六氨络合钴用量降至1mM和0.05mM并不能带来整体小片段文库浓度提高，三氯六氨络合钴用量减少至0.2mM可以显著提高富集小片段cDNA文库浓度，达到理想上机测序需求。综合判定，7％PEG10000、40％异丙醇、0.2mM三氯六氨络合钴组合的磁珠结合液分选体系的数据表现得最好。综合以上结果，最终选定7％PEG10000、40％异丙醇、0.2mM三氯六氨络合钴组合构成磁珠结合液分选体系。
在cDNA加接头反应体系中，增加DNA凝聚力或许能提高连接效率，缩短反应时间。因此，对比实施例43～45尝试在cDNA加接头反应体系中加入1mM PEG 4000、1mM聚赖氨酸，结果显如表9显示在同等条件取得相似建库数据的背景下，加入1mM聚赖氨酸后，反应时间可缩短至15min，比加入1mM PEG 4000节省了2min。对比实施例45进一步调整聚赖氨酸用量，结果显示加入4mM聚赖氨酸后，反应时间可缩短至10min，极大地缩短反应时间。综合以上，在cDNA加接头反应体系中，添加4mM聚赖氨酸可提高连接效率，缩短连接反应时间。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
表6对比实施例22-34
表7对比实施例35-36
表8对比实施例37-42
表9对比实施例43-45
Claims (8)
1.一种富集单细胞测序小片段cDNA的方法，其特征在于，采用SPRI Slect磁珠分选文库片段，在磁珠结合液中加入PEG 10000、异丙醇和三氯六氨络合钴，以提高小片段100～300bp富集；所述方法用于鉴定单细胞转录组中miRNA表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)样本准备：根据10X Genomics单细胞转录组建库试剂盒Chromium Next GEMSingle Cel l 3′Reagent Kits v3.1进行实验操作，将用Poly(dT)捕获的人PBMC样品RNA反转录为带细胞标签的第一链cDNA；其中，反转录体系包含RT Reagent B 18.8μl，Template Switch Oligo 2.4μl，RT Enzyme C 8.7μl；所述反转录体系中加入5μg T4 Gene32Protein，反转录时间为1～1.5h；
(2)配置cDNA扩增混合溶液：扩增混合溶液成分为：4μM引物、5×PlatinumTMII PCRBuffer10μl、10mM dNTP mix 1μl、0.8μl 2×PlatinumTMII Taq Hot-Start DNAPolymerase、5μg SSB，上一步所有cDNA模板；
(3)cDNA线性扩增；
(4)PCR产物纯化；
(5)cDNA质检：使用Qubit测定并记录纯化后cDNA浓度，并用质检仪器Agilent4150Tape Station对得到的cDNA进行质检，并记录cDNA片段大小；
(6)cDNA 5′端磷酸化；
(7)cDNA加接头：在上一步PCR管中加入下列连接反应混合物：接头片段(NEB，E7335L)10μM；10x T4 DNA Ligase buffer 5μl；聚赖氨酸0.1～5mM；T4 DNA连接酶3U，H2O补至50μl；反应混合物于22℃温育10min，然后于70℃温育15min以灭活T4 DNA连接酶；
(8)酶切接头：
(9)对加接头连接后的cDNA进行PCR扩增：
(10)配制DNA片段分选纯化试剂：磁珠结合液为含400mMTris pH 8.0、1M异硫氰酸胍、0.1％吐温-20、7％(W/V)PEG10000、0.2mM三氯六氨络合钴、40％(V/V)的异丙醇及50mg/mlSPRI磁性颗粒；洗涤液为80％无水乙醇；洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水；
(11)cDNA片段筛选；第一次基于SPRI的大小选择：取1个新的PCR管，分别加入上一步cDNA，混合上一步cDNA样品与SPRI select磁珠(0.75x)，旋涡混匀，室温放置5min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，上清液转移至新的PCR管备用；
第二次基于SPRI的大小选择：往上一步上清液中加入SPRI select磁珠(0.2x)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将PCR管置于磁力架静置3min，丢弃上清液，使用80％乙醇清洗磁珠两次，然后风干，最后使用洗脱液洗脱目的片段cDNA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引物如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述cDNA线性扩增为：预变性94℃2min，变性94℃15s，退火58℃20s，延伸68℃1min，循环数20个，终延伸68℃1min，4℃保持。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述cDNA 5′端磷酸化步骤为：在PCR管中加入下列反应混合物：所述步骤(5)捕获的100ng cDNA；T4多核苷酸激酶10U，ATP10mM，10x reactionbuffer 4μl，ddH2O to 40μl。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，反应混合物于37℃温育20min。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(8)中，具体步骤为：加入10xrCutSmartTMBuffer 2μl；User enzyme 3μl；反应物于37℃温育15min。
8.如权利要求1-7之任一项所述的富集单细胞测序小片段cDNA的方法在鉴定单细胞转录组中miRNA表达中的应用。
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