CN110592200B - 一种改善扩增特异性和均一性的多重pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。该方法包括：从样本中提取基因组DNA；将所提取到的基因组DNA进行片段化，并进行纯化；以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化温度进行退火。本发明对DNA片段化并纯化处理，可以使模板与引物快速结合，提高引物使用率。先在较低的退火温度模式下，让扩增引物充分结合到模板DNA上，再逐步提高退火温度，提高各引物结合的特异性；这使得多重PCR的扩增特异性和均一性得到明显改善。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。
背景技术
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，是在普通PCR的基础上加以改进，于同一PCR反应体系里加上二对以上特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。由于多重PCR具有高效性、系统性及经济简便性等特点，被提出以后便得到迅速发展，现已成为生命科学等领域一项重要的应用技术。广泛用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定等方面。
多重PCR体系中含有多对扩增引物，需要同时对多个位点进行特异性扩增，这并非是单一PCR的简单混合，在实际操作中会受到多种因素的影响。比如多重PCR中的不同扩增片段会互相竞争资源，而且，引物对与引物对之间可能会发生错配等现象，从而降低多重PCR的扩增特异性和不同片段扩增的均一性。为了突破多重PCR的上述难点，很多研究从引物设计这一关键环节进行优化调整，获得了一些突破，但当扩增引物数增加到一定数量后，扩增特异性和均一性无法得到保证。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明从引物设计、模板DNA优化和扩增引物退火温度等方面进行研究，提供一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。
因此，本发明的目的之一在于提供一种多重PCR方法。
本发明所采用的技术方案如下文所述。
一种多重PCR方法，包括以下步骤：
从样本中提取基因组DNA；
将所提取到的基因组DNA进行片段化，并进行纯化；
以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化退火温度进行退火。
进一步地，所述差异化退火温度可以为从50℃，每次升高1～5℃，逐渐升高至70℃，优选每次升高2～5℃、3～5℃或3～4℃，最优选每次升高3℃。
进一步地，所述PCR扩增反应中，退火时间可以为10～40s，优选为15～35s，更优选为20～30s。在本发明的一个实施方式中，所述PCR扩增反应的退火时间为30s。退火时间太短会导致引物结合不充分，退火时间太长会导致模板自连。
进一步地，在所述多个特异性引物对中，各上游引物和下游引物的5’端均添加有通用接头序列，优选所述上游引物或所述下游引物还包括条形码序列。
进一步地，通过超声打断，打断所述基因组DNA，使基因组DNA片段化，以得到150～550bp，优选150～450bp，更优选150～350bp的DNA片段。较长的模板DNA容易形成高级结构，使DNA聚合酶难以与模板结合，也就实现不了其聚合功能，且存在变性困难的问题，这都将影响PCR扩增的效率。模板DNA太短，将影响引物与模板的结合，从而影响多重PCR扩增的特异性。
进一步地，通过磁珠或切胶回收的方式，对片段化的所述基因组DNA进行。
进一步地，上述PCR扩增的程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(3)98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(4)98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(5)98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(6)98℃变性10s，70℃退火延伸1min，6个循环；(7)72℃延伸5min；
进一步地，多个所述特异性引物对包括10个或更多的引物对。
进一步地，多个所述特异性引物对包括50个或更多的引物对。
进一步地，多个所述特异性引物对包括184个或更多的引物对。
进一步地，所述特异性引物选自SEQ ID NO:3～370。
进一步地，各所述上游引物的5’端添加有如SEQ ID NO:1所示的通用接头序列，各所述下游引物的5’端添加有如SEQ ID NO:2所示的通用接头序列。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR扩增的反应体系可以使用本领域常用的多重PCR的酶或者酶预混液，例如可以为Phusion HF muster mix、AmpliTaq 
360MasterMix、KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2×)等。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR扩增的反应体系可以为：38μL Phusion HFmuster mix、7μL Primer mix、15ng模板DNA和4μL DMSO。
更进一步地，所述多重PCR方法还包括使用针对所述通用接头序列的引物，进行第二轮PCR扩增反应。优选地，在进行所述第二轮PCR扩增反应之前，对PCR产物进行纯化。
进一步地，所述第二轮PCR扩增的程序为：
(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，3个循环；(3)98℃变性10s，72℃退火延伸1min，8个循环；(7)72℃延伸5min。
进一步地，上述第二轮PCR扩增反应可以使用本领域常用的PCR酶或者酶预混液。
所述第二轮PCR扩增的反应体系为：25μL Phusion HF muster mix、24μL第一轮多重PCR纯化产物、4μL DMSO、0.5μL 25uM通用PCR外侧上游引物和0.5μL 25uM通用PCR外侧下游引物。
在本发明的一个实施方式中，在特异性引物对的上、下游引物上分别添加了适用于Illumina测序的接头序列。在本发明的一个实施方式中，在特异性引物对的上、下游引物上分别添加了19bp和34bp的适用于Illumina测序的接头序列。因此，前两个PCR循环中若退火温度太高，就会影响引物和模板的结合，从而降低引物的扩增效率和特异性。
本发明还提供一种上述多重PCR方法在构建二代测序平台文库中的应用。
本发明的有益效果：
本发明将提取的基因组DNA进行片段化和纯化处理之后，再进行PCR扩增。在片段化处理过程中，由于是机械作用力，打断后的DNA片段大小是呈一个正态分布。除了大部分设定的目标大小片段外，还会存在部分小于目标大小的片段。这部分小于目标大小的片段通常包括几个或者几十个碱基，这些较小DNA片段会造成非特异性扩增，从而影响特异性。为了克服这一问题，本发明采用了磁珠或切胶回收的方式对打断后的模板进行纯化，从而消除这部分较小DNA片段的不利影响。通过筛选出特定长度的DNA作为模板进行扩增，可以使多重PCR的特异性引物与模板充分快速的结合，从而提高引物的使用率。
另外，本发明根据扩增引物的退火温度，建立了一种从低到高的差异化退火循环的PCR扩增反应方法，即上述的TOCHUP差异化退火循环模式。本发明的多重PCR扩增反应，一方面可以先在较低的退火温度模式下，让扩增引物充分结合到模板DNA上，对模板DNA进行初步扩增，得到最大丰度的扩增产物，另一方面，通过差异化的退火温度，使不同的引物在相应最适合的退火温度下，充分结合到模板DNA上，使不同的引物对得到充分的利用，从而改善多重扩增均一性。在此基础上，再逐步提高退火温度，提高各引物结合的特异性，从而使得多重PCR的扩增特异性和均一性得到明显改善。
本发明的多重PCR方法，从反应体系、引物设计、DNA模板和扩增程序等多个方向进行研究，得到重数达到184时仍能保证扩增的特异性和均一性的方法，极大的提升了扩增效率和质量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如按照《分子克隆实验指南(第四版)》或试剂制造商所建议的条件来进行。多重PCR扩增用的酶为购自NEB的
High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer，纯化用的AMPure XP Beads购自Beckman，Qubit浓度测定用的仪器和试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。
实施例1.引物设计
根据NCBI的SNP数据库，查找人类基因组中有关肿瘤风险、健康风险、遗传性疾病、营养代谢、药物代谢等共计184个携带SNP位点的目标区段序列，使用Primer5引物设计软件进行引物设计，然后用化学方法合成上下游特异性引物(如下表1所示)，引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。
在筛选或设计好的每对特异性上游引物和下游引物的5’端都分别加上通用接头。上游引物的通用接头(Universal adapter-F)的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG AGACAG-3’(SEQ ID NO：1)。下游引物的通用接头(Universal adapter-R)的包含三部分，从5’端开始依次是二代测序接头引物、条形码序列(即index序列)和通用引物，序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index-GTGACTGGAGTTC-3’(SEQ ID NO：2)。将加上接头的通用上下游引物命名为通用PCR外侧引物。为了区分不同模板身份，每一对接头引物的index序列是不同的。
下表1中示出了SNP特异性引物的部分序列。
表1 SNP特异性引物
实施例2.模板DNA的制备
45人份待检者白细胞基因组的提取
采用基因组提取试剂盒(购自QIAOGEN)，参照该试剂盒使用说明书提取白细胞的基因组，具体步骤如下：
(1.1)将血液样本置于室温解冻，混匀，瞬离，取100μl白细胞至1.5ml离心管，加100μl PBS，混匀，瞬离；
(1.2)加入10μl RnaseA，20μl蛋白酶K，涡旋混匀，放置1min，加入200μl BufferAL，混匀离心；
(1.3)金属浴56℃，10min；
(1.4)取下，降至室温后，加入200μl无水乙醇，混匀，瞬离；
(1.5)转移至离心柱上，室温放置5min，10000g，1min，弃滤液；
(1.6)加入500μl Buffer AW1，10000g×1min，弃滤液；
(1.7)加入500μl Buffer AW2，20000g×3min，弃滤液；20000g，空转1min；
(1.8)柱子转移至新的离心管，开盖室温放置5min，加入100μl Buffer AE，放置5min，10000g×1min；再加100μl Buffer AE，放置1min，10000g×1min。
对基因组DNA进行纯化
采用的纯化试剂盒(购自ZYMO RESEEARCH)，参照该试剂盒的使用说明书进行基因组DNA纯化，具体步骤如下：
(2.1)在上述提取的200μl DNA中加400μl(2倍体积的)DNA Binding Buffer，混匀，瞬离；
(2.2)转移至柱子中，13000g×30s，弃滤液；
(2.3)加入200μl Washing Buffer，13000g×30s，弃滤液；
(2.4)重复步骤(2.3)；
(2.5)柱子转移至新的离心管中，加入40μl Buffer AE，放置1min，10000g×30s；
(2.6)再加入40μl Buffer AE，放置1min；10000g×30s；
(2.7)Qubit浓度测定。
对DNA进行片段化和纯化
(3.1)准备好超声打断仪器(购自Covaris，型号为M220)和50μl专用超声打断管子(购自Covaris)，取50μl上述纯化好的DNA，转移至专用管中；
(3.2)设置程序为300bp，运行90s；
(3.3)超声结束后，用2倍体积的AMPure XP Beads纯化，35μl ddH2O洗脱；
(3.4)再将洗脱获得的片段化DNA用0.8倍体积AMPure XP Beads纯化，35μl ddH2O洗脱；
(3.5)Qubit浓度测定。
实施例3.多重PCR反应
采集45份血液样本，每个样本都按上述方法进行处理，各样本对应的index序列如表2所示。
表2样本编号和其对应的index序列
| 样本编号 | Index序列 | 样本编号 | Index序列 | 样本编号 | Index序列 |
| SGC01 | CCTTAAT | SGC16 | GCATTGG | SGC31 | GCTCGAA |
| SGC02 | TAGGCCG | SGC17 | AGTCAGA | SGC32 | TACTCGC |
| SGC03 | GTCCGGC | SGC18 | TAGTCTA | SGC33 | GTACTAT |
| SGC04 | AGAATTA | SGC19 | CTCAGAT | SGC34 | TTGGATC |
| SGC05 | ATCCTCT | SGC20 | CCATACC | SGC35 | ACTTGCG |
| SGC06 | GAATCTC | SGC21 | ATAGCTG | SGC36 | CGCTATT |
| SGC07 | CCTAGGT | SGC22 | GACCGAT | SGC37 | ACTATCA |
| SGC08 | TGGAATA | SGC23 | CCTAACG | SGC38 | GACGTAC |
| SGC09 | CGCGCAG | SGC24 | TGCATGA | SGC39 | CGGACGT |
| SGC10 | ACGCGGA | SGC25 | AGGTACC | SGC40 | TGACGTC |
| SGC11 | GAGTAAC | SGC26 | GCTGGTT | SGC41 | ATTCCAG |
| SGC12 | TTAATAG | SGC27 | ATGCCGC | SGC42 | TTGGTCA |
| SGC13 | GATGCCA | SGC28 | TAAGTAA | SGC43 | GCATATT |
| SGC14 | CTTCGTT | SGC29 | AGAACCG | SGC44 | CATAGAC |
| SGC15 | TGCGTCC | SGC30 | CAGGAGG | SGC45 | ACCGAGG |
多重PCR反应分两轮进行，分别为第一轮的特异性引物扩增和第二轮的通用PCR外侧引物扩增。
配置第一轮多重PCR反应体系(如表3所示)，然后采用TOCHUP差异化退火循环模式进行PCR扩增。其中，Primer mix中包括表1所示的184对特异性引物，模板DNA为对45个样本使用实施例2的方法制备得到的片段化的纯化DNA。
表3第一轮多重PCR反应体系
| 组分 | 体积(μl) |
| Phusion HF muster mix(购自NEB公司) | 38 |
| 引物混合物(25μM) | 7 |
| 模板DNA(15ng/μl) | 1 |
| DMSO | 4 |
TOCHUP差异化退火循环模式程序为：
(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(3)98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(4)98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(5)98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(6)98℃变性10s，70℃退火延伸1min，6个循环；(7)72℃延伸5min。
第一轮多重PCR结束之后，将第一轮的PCR产物用1.2倍体积的AMPure XP Beads进行纯化，然后再进行第二轮PCR反应。
AMPure XP Beads纯化的步骤如下：
1、提前30min取出AMPure XP Beads置于室温，使用前充分震荡混匀。
2、将50μl第一轮PCR产物转移至干净的1.5ml离心管中，再吸取60μl AMPure XPBeads至50μl第一轮PCR产物中，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。
3、室温孵育5min。
4、将离心管瞬时离心，置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清并丢弃。
5、保持离心管置于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取上清并丢弃。
6、重复步骤5，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。
7、保持离心管置于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。
8、将离心管从磁力架上取下，加入26μl DB Buffer(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀。
9、室温下孵育5min。
10、将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，用移液器吸取24μl上清液转移到新的0.2ml PCR管中，待进行第二轮PCR反应。
第二轮多重PCR反应体系如表4所示。第二轮反应体系配制好后，同样根据通用PCR外侧引物的退火温度，采用TOCHUP差异化退火循环模式进行扩增，具体反应程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，3个循环；(3)98℃变性10s，72℃退火延伸1min，8个循环；(4)72℃延伸5min。
表4第二轮多重PCR反应体系
| 组分 | 体积(μl) |
| Phusion HF muster mix(购自NEB公司) | 25 |
| 第一轮多重PCR纯化产物 | 24 |
| DMSO | 4 |
| 通用PCR外侧的上游引物(25μM) | 0.5 |
| 通用PCR外侧的下游引物(25μM) | 0.5 |
两轮TUCHUP的差异化退火PCR扩增程序结束后，用1倍体积的AMPure XP Beads对PCR产物进行纯化，纯化后的产物置于-20℃保存待二代测序平台测序用。本发明所使用的测序平台是Illumina的NextSeq平台，测序步骤严格按照供应商的要求使用。
测序结果如表5所示。通过检测45个样本的引物率(PrimerRatio)和不同扩增子的目标区间的捕获率(CaptureRatio)来判断本发明描述的多重PCR的特异性。结果显示：测试的45个样本，其PrimerRatio大部分介于70％～80％；CaptureRatio均≥99.8％。通过检测45个样本中不同扩增子的测定序列数(Reads)＞0和＞50的覆盖率(Coverage)及不同扩增子的平均测序深度(AverDepth)来判断本发明多重PCR的均一性。
结果显示：目标位点不同扩增子的测定序列数＞0的覆盖度(Coverage)均大于93％，＞50的覆盖度(Coverage)均大于80％；目标位点的平均深度(AverDepth)均大于13,000。
表5. 45个样本的测序结果
| 样品编号 | 引物率 | 捕获率 | 覆盖度(>0X) | 覆盖度(>50X) | 平均深度 |
| 1 | 78.66％ | 99.94％ | 95.23％ | 88.49％ | 17,154 |
| 2 | 76.08％ | 99.87％ | 94.87％ | 85.20％ | 16,795 |
| 3 | 75.85％ | 99.89％ | 95.12％ | 86.34％ | 15,711 |
| 4 | 79.70％ | 99.81％ | 96.04％ | 88.09％ | 15,288 |
| 5 | 79.39％ | 99.91％ | 96.47％ | 89.47％ | 15,558 |
| 6 | 75.09％ | 99.88％ | 95.62％ | 82.16％ | 13,159 |
| 7 | 75.91％ | 99.92％ | 94.89％ | 84.56％ | 15,617 |
| 8 | 78.74％ | 99.87％ | 95.56％ | 80.15％ | 14,124 |
| 9 | 78.87％ | 99.91％ | 95.69％ | 81.23％ | 14,800 |
| 10 | 71.33％ | 100.00％ | 96.04％ | 86.32％ | 16,746 |
| 11 | 75.94％ | 99.91％ | 94.98％ | 85.67％ | 15,965 |
| 12 | 74.98％ | 99.92％ | 95.68％ | 84.26％ | 13,527 |
| 13 | 81.38％ | 99.87％ | 93.87％ | 87.24％ | 14,363 |
| 14 | 79.88％ | 99.93％ | 95.68％ | 85.36％ | 13,413 |
| 15 | 79.12％ | 99.95％ | 96.08％ | 83.56％ | 15,205 |
| 16 | 76.51％ | 99.92％ | 96.54％ | 85.25％ | 13,124 |
| 17 | 79.39％ | 99.94％ | 95.95％ | 84.97％ | 14,551 |
| 18 | 75.11％ | 99.95％ | 95.38％ | 83.68％ | 15,491 |
| 19 | 77.77％ | 99.94％ | 96.38％ | 88.47％ | 17,129 |
| 20 | 74.08％ | 99.99％ | 95.14％ | 82.36％ | 14,911 |
| 21 | 70.20％ | 99.98％ | 94.69％ | 83.89％ | 14,673 |
| 22 | 77.10％ | 99.97％ | 95.26％ | 81.19％ | 13,129 |
| 23 | 74.58％ | 99.99％ | 96.87％ | 84.29％ | 14,123 |
| 24 | 71.57％ | 99.98％ | 95.92％ | 83.67％ | 14,268 |
| 25 | 78.70％ | 99.88％ | 95.49％ | 82.79％ | 15,089 |
| 26 | 72.79％ | 99.81％ | 95.24％ | 82.71％ | 15,017 |
| 27 | 78.63％ | 99.99％ | 94.68％ | 83.13％ | 14,338 |
| 28 | 75.49％ | 99.81％ | 93.68％ | 82.45％ | 14,476 |
| 29 | 76.48％ | 99.99％ | 96.89％ | 82.79％ | 14,529 |
| 30 | 81.19％ | 99.80％ | 96.57％ | 84.58％ | 17,012 |
| 31 | 71.78％ | 99.90％ | 96.87％ | 81.14％ | 13,987 |
| 32 | 78.67％ | 99.93％ | 95.97％ | 84.08％ | 15,129 |
| 33 | 78.60％ | 99.98％ | 96.35％ | 81.38％ | 13,123 |
| 34 | 76.5％ | 99.85％ | 95.47％ | 85.30％ | 15,268 |
| 35 | 79.3％ | 99.96％ | 96.42％ | 85.11％ | 14,089 |
| 36 | 72.7％ | 99.84％ | 94.93％ | 84.98％ | 14,017 |
| 37 | 76.16％ | 99.87％ | 96.58％ | 86.51％ | 15,338 |
| 38 | 77.33％ | 99.98％ | 96.51％ | 83.53％ | 15,476 |
| 39 | 78.87％ | 99.96％ | 96.61％ | 84.67％ | 16,529 |
| 40 | 72.45％ | 99.88％ | 95.34％ | 83.87％ | 15,363 |
| 41 | 80.87％ | 99.92％ | 96.87％ | 84.45％ | 14,413 |
| 42 | 75.30％ | 99.96％ | 96.78％ | 83.78％ | 15,605 |
| 43 | 73.13％ | 99.99％ | 96.84％ | 82.69％ | 14,124 |
| 44 | 71.14％ | 99.92％ | 96.32％ | 84.51％ | 14,751 |
| 45 | 77.48％ | 99.88％ | 95.41％ | 85.21％ | 15,891 |
实施例4.DNA片段化后明显改善多重PCR的特异性和均一性
为了验证基因组DNA在经片段化后能够明显改善特异性和均一性，在实施例3中采集的45份血液样本中随机选取了5份样本进行对比测试，以未经打断的基因组DNA和打断后未经纯化的片段化DNA作为模板。按照与实施例3相同的步骤进行了实验。
结果如表6所示：未经打断的基因组DNA作为模板，其PrimerRatio介于50％～60％；CaptureRatio均≥99.7％；打断后未经纯化的片段化DNA作为模板，其PrimerRatio为50％左右；CaptureRatio均≥99.8％。目标位点不同扩增子的测定序列数＞0的覆盖度(Coverage)和＞50的覆盖度(Coverage)、目标位点的平均深度(AverDepth)均低于本发明DNA模板的技术效果，可见，本发明中的片段化DNA可明显改善多重PCR的特异性和均一性。
表6. 5个不同模板的对比测序结果
| 样品编号 | 引物率 | 捕获率 | 覆盖度(>0X) | 覆盖度(>50X) | 平均深度 |
| 1-1 | 58.66％ | 99.94％ | 74.71％ | 51.57％ | 10,154 |
| 2-1 | 57.08％ | 99.87％ | 78.72％ | 50.64％ | 9,795 |
| 3-1 | 60.28％ | 99.89％ | 74.95％ | 51.96％ | 10,211 |
| 4-1 | 58.32％ | 99.79％ | 75.87％ | 50.07％ | 9,868 |
| 5-1 | 53.85％ | 99.91％ | 76.03％ | 51.78％ | 9,858 |
| 1-2 | 50.47％ | 99.88％ | 70.67％ | 45.27％ | 9,858 |
| 2-2 | 52.15％ | 99.92％ | 72.51％ | 47.67％ | 8,582 |
| 3-2 | 52.47％ | 99.93％ | 70.72％ | 47.30％ | 9,435 |
| 4-2 | 50.06％ | 99.93％ | 74.49％ | 46.17％ | 8,954 |
| 5-2 | 49.72％ | 99.92％ | 74.48％ | 46.55％ | 8,764 |
注：“n-1”表示未经打断的基因组DNA作为模板的5个样本；“n-2”表示打断后未经纯化的片段化DNA作为模板的5个样本。
实施例5.差异化退火循环模式明显改善多重PCR的特异性和均一性
为了验证多重PCR扩增中两轮TUCHUP的差异化退火PCR扩增程序能够明显改善特异性和均一性，随机测试了实施例3中采集的45份血液样本中的5份样本，按照与实施例3相同的步骤进行了实验。
改变PCR扩增程序，其他步骤同实施例3。
PCR扩增程序修改为：
第一轮PCR扩增程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；(3)72℃延伸5min。
第二轮PCR扩增程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，11个循环；(3)72℃延伸5min。
结果如表7所示：不改变退火温度的PCR扩增程序下，其PrimerRatio约50％；CaptureRatio均≥99.5％；目标位点不同扩增子的测定序列数＞0的覆盖度(Coverage)和＞50的覆盖度(Coverage)、目标位点的平均深度(AverDepth)均低于本发明的技术效果，可见，本发明的差异化退火循环模式可明显改善多重PCR的特异性和均一性。
表7. 5个样本在不同PCR扩增程序下的对比测序结果
| 样品编号 | 引物率 | 捕获率 | 覆盖度(>0X) | 覆盖度(>50X) | 平均深度 |
| 1-1 | 48.66％ | 99.54％ | 65.23％ | 48.29％ | 8,878 |
| 2-1 | 50.08％ | 99.57％ | 64.87％ | 45.40％ | 8,622 |
| 3-1 | 52.85％ | 99.59％ | 65.12％ | 46.54％ | 8,435 |
| 4-1 | 49.70％ | 99.51％ | 66.04％ | 48.09％ | 8,244 |
| 5-1 | 49.39％ | 99.51％ | 66.47％ | 49.77％ | 8,534 |
实施例6.由低至高的差异化退火循环模式明显改善了多重PCR的特异性和均一性
随机选取实施例3中采集的45份血液样本中的5份样本，改变PCR扩增程序，其他步骤按照实施例3进行实验。
PCR扩增程序修改为：
第一轮PCR扩增程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，70℃退火延伸1min，6个循环；(3)98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(4)98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(5)98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(6)98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(7)72℃延伸5min。
第二轮PCR扩增程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，72℃退火延伸1min，3个循环；(3)98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环；(4)72℃延伸5min。
结果如表8所示：当PCR扩增程序为两轮从高到低的差异化退火时，其PrimerRatio介于66％～72％；CaptureRatio均≥99.8％。目标位点不同扩增子的测定序列数＞0的覆盖度(Coverage)和＞50的覆盖度(Coverage)、目标位点的平均深度(AverDepth)均低于本发明的技术效果可见，本发明的由低到高的差异化退火循环模式可明显改善多重PCR的特异性和均一性。
表8. 5个样本在不同PCR扩增程序下的对比测序结果
| 样品编号 | 引物率 | 捕获率 | 覆盖度(>0X) | 覆盖度(>50X) | 平均深度 |
| 1-2 | 68.66％ | 99.84％ | 89.23％ | 78.49％ | 14,711 |
| 2-2 | 66.08％ | 99.87％ | 86.87％ | 75.20％ | 13,288 |
| 3-2 | 71.85％ | 99.89％ | 89.12％ | 76.34％ | 14,558 |
| 4-2 | 69.70％ | 99.91％ | 87.04％ | 78.09％ | 13,871 |
| 5-2 | 69.39％ | 99.81％ | 86.47％ | 79.47％ | 14,578 |
综上所述，本发明中的多重PCR通过基因组模板优化和两轮TUCHUP的差异化退火PCR扩增程序，其特异性和均一性得到显著改善。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 人和未来生物科技(长沙)有限公司
<120> 一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法
<130> 11
<160> 370
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn ngtgactgga gttc 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
agatgtgtat aagagacagg tgaaaggact aagaaagacc cgag 44
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctga cttctcggac accactgt 58
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
agatgtgtat aagagacagg atttgcaggt tgaggggagt cag 43
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtgcc ggtagtggat ttggtttc 58
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
agatgtgtat aagagacagg tgaaggaatg gcttctggcc cat 43
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaacat ccatcctact gcacatact 59
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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agatgtgtat aagagacagg tcccataacc cacctagacc cta 43
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtaccg ctgattggct gagggttc 58
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
agatgtgtat aagagacagc ctgtgattaa ctgaatggtt tagg 44
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<212> DNA
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<400> 12
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcgaa tttgttgtat ttaaacactg 60
g 61
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
agatgtgtat aagagacagt tcacagtgta aaacggatca gag 43
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctagtg ggtcctgacc tggggaag 58
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<211> 45
<212> DNA
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<400> 15
agatgtgtat aagagacagc tcctgctgaa agcacatatc ttact 45
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgatctc ttcaatcttc tgatttttta 60
cag 63
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<212> DNA
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<400> 17
agatgtgtat aagagacagc tcaccctgca gcacttcgt 39
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcagga tcaaagagac agacga 56
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
agatgtgtat aagagacagg ccctgagcaa acccatga 38
<210> 20
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggatgg ggttcgcgat gag 53
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
agatgtgtat aagagacagc aactactcag aggctgaggt g 41
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtctg tttgagggac aagactct 58
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
agatgtgtat aagagacagg agaaagaaat aggagcagga tc 42
<210> 24
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctgtg actcctaata ggccagt 57
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
agatgtgtat aagagacagc ctgtgtgtga ggggtgtgtg tgag 44
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctctg agcctctgga tccttcctc 59
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
agatgtgtat aagagacagc tctaatgaca ggatggtcag ccct 44
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtaatt aggctgcagg tgactgtgt 59
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
agatgtgtat aagagacagc ttctctctgt gggatgggat ggtg 44
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaatg atgagcagaa cgtggaggat 60
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 31
agatgtgtat aagagacagc ttctgctcgc agtaggtgtc aat 43
<210> 32
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 32
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccttat cggctggaac gagttcat 58
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 33
agatgtgtat aagagacaga gggagaatag gaaggagacc ggacc 45
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 34
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggaa ggaggagaag aaaagaggt 59
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 35
agatgtgtat aagagacaga gtaacaagag agaatggagg gaatc 45
<210> 36
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 36
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaatag gcctgtggat atagcctcaa 60
aag 63
<210> 37
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 37
agatgtgtat aagagacagc tacacccact ttagaaatta gatcagag 48
<210> 38
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 38
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtttg aggctgcagt taactacgat 60
a 61
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 39
agatgtgtat aagagacaga caaagtcgaa gttccatcgc tcac 44
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 40
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgacc agggccttcc ttgtatctct 60
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 41
agatgtgtat aagagacaga gcatacctga gcagatgggc tcct 44
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 42
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcctt catgctgagc tgcaacttt 59
<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 43
agatgtgtat aagagacaga agtcatgtcc tctgtctggt ttgt 44
<210> 44
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 44
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagtgg caaagaggga caactaaag 59
<210> 45
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 45
agatgtgtat aagagacaga tcacagacct cacggacatc atttt 45
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 46
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgcaag atatttcttc acacgcttc 59
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 47
agatgtgtat aagagacagc ttcagctttc tttagttcct cagttt 46
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 48
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagccac tagagcctga actgccagg 59
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 49
agatgtgtat aagagacagg ctcatctgct gacctagaaa taag 44
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 50
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagatc agagtccaga atgggtctt 59
<400> 51
agatgtgtat aagagacaga gtaggattgg ccttggaaga tgaa 44
<210> 52
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 52
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcactag tgctgtgtgg cctgcaat 58
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 53
agatgtgtat aagagacagc ttggctgtga atcagagtgt tct 43
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 54
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagactt ctagggatgg gaaatttgt 59
<210> 55
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 55
agatgtgtat aagagacagc ccccacataa aataaaataa agtcaatag 49
<210> 56
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 56
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcaaa ttgcttaacc tcttcctatc 60
t 61
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 57
agatgtgtat aagagacaga caccttgata gtccaacgaa agttag 46
<210> 58
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 58
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgaat cctcacaaga aaataagcta 60
<210> 59
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 59
agatgtgtat aagagacagc tgagaagatt gacaggttca tgcag 45
<210> 60
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 60
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatctcc aaggcctgac tggctgatct 60
<210> 61
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 61
agatgtgtat aagagacagc tacctggtgt gccctctgat gtttttat 48
<210> 62
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 62
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatttga ataagatttc ctgtgcattt 60
tctg 64
<210> 63
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 63
agatgtgtat aagagacagt aaatacctta ttgaaagagt gcttgtaga 49
<210> 64
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 64
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttttaa gaaatgttgc accatcaata 60
ctct 64
<210> 65
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 65
agatgtgtat aagagacagt tatgtctttg ttagcattgt gagaac 46
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 66
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtctt gatgaggtgg attggaaata 60
ct 62
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 67
agatgtgtat aagagacagg tccatgagtt ggtagatttt caa 43
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<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 68
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttctta tctatcaatg ttatgcccac 60
t 61
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 69
agatgtgtat aagagacagc atatctccca ggagctccct gacc 44
<210> 70
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 70
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacagag ggctcaaagg gagcaagag 59
Claims (9)
1.一种多重PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：
从样本中提取基因组DNA；
将所提取的基因组DNA进行片段化，以得到150~550bp的DNA片段，并进行纯化；
以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化退火温度进行退火；
所述差异化退火温度从50℃，每次升高3℃，逐渐升高至70℃；退火时间为20~30s；
所述特异性引物对选自SEQID NO: 3~370。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述多个特异性引物对中，各上游引物和下游引物的5’端均添加有通用接头序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上游引物或所述下游引物还包括条形码序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括使用针对所述通用接头序列的引物，进行第二轮PCR扩增反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行所述第二轮PCR扩增反应之前，对PCR产物进行纯化。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述基因组DNA片段化，以得到150~450bp的DNA片段。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使所述基因组DNA片段化，以得到150~350bp的DNA片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过磁珠或切胶回收的方式，对片段化的所述基因组DNA进行纯化。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，各所述上游引物的5’端添加有如SEQIDNO:1所示的通用接头序列，各所述下游引物的5’端添加有如SEQ IDNO: 2所示的通用接头序列。
Priority Applications (1)
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