CN113957125B - 适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA、其制备方法及其应用 - Google Patents

适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA、其制备方法及其应用。该方法包括以下步骤获得片段化的基因组DNA、获得转化的基因组DNA片段、获得连接产物以及获得Cot DNA的步骤。其中，连接产物由所述转化的基因组DNA片段连接接头后扩增得到，由连接产物进行变性、复性和纯化处理得到Cot DNA。本申请提供的Cot DNA通过与目标文库中的重复序列竞争性杂交，减少了重复序列对捕获核酸的影响，提高了捕获探针的杂交效率与中靶率。

Description

适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及重亚硫酸盐测序库技术领域，尤其涉及适用于重亚硫酸盐测序库CotDNA、其制备方法及其应用。
背景技术
在分子生物学中，Cot为表示DNA复性动力学中的一个单位，表示的是单位浓度(Co，mol/L)下DNA单链的复性时间(t，sec)，Cot值本质上表示杂交液中单链起始浓度(Co)和反应时间(t)的乘积。在相同的条件下，具有重复序列的DNA分子的Cot值小，而具有非重复序列的DNA分子则具有较大的Cot值。Cot DNA通常作为DNA竞争性阻断剂，在基因组杂交中阻断可能引起非特异性杂交的重复序列。例如，当用含有重复序列的探针来进行Northern杂交、Southern杂交、FISH定位和体细胞原位杂交等实验时，存在于探针中的重复序列将会产生广泛的非特异性强杂交背景信号，从而将那些要检测的低拷贝或单拷贝序列的杂交信号掩盖掉。所以，在进行以上实验操作时，需要考虑如何去掉探针中的的重复序列，以避免产生非特异性杂交信号，从而达到捕获单拷贝或低拷贝序列外显子和增强外显子的检测信号的目的。最理想的解决方法是采用过量的基因组重复序列DNA，如Cot DNA来预先对这类探针进行封闭杂交，去掉存在于探针中的那些重复序列DNA。
基于重亚硫酸盐转化的方法核心是重亚硫酸盐测序，经其处理后能够使5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶得以准确区分，即提供了单核苷酸水平的分辨率，被称为是DNA甲基化分析的金标准。
由于重亚硫酸盐测序首先要对原始样本进行亚硫酸盐或酶处理，处理的目的是将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以便与甲基化修饰的胞嘧啶区分开来。然而样本经处理后再建立的DNA文库里，有大量的碱基相较于原始序列发生了变化，重复序列的序列结构(尤其是动物基因组，如人类基因组中存在大量的重复序列)也发生改变会对后续的靶向捕获造成不利影响。重复序列虽然广泛存在，但是目前其生物学意义尚未明确，而表观遗传学中关于甲基化修饰的研究主要集中于启动子区及第一外显子区，所以需要一种能对重复序列进行封闭的物质来降低其对甲基化检测结果的影响。
目前还无适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA，现有用来封闭序列中这些重复序列的Cot DNA无法适应发生了碱基变化的亚硫酸盐测序文库，起不到良好的封闭重复序列的效果。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于至少提供一种适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA，以达到封闭重亚硫酸盐测序过程中对重复序列起到封闭作用的目的。
第一方面，本申请实施例公开了适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA的制备方法，包括以下步骤：
获得片段化的基因组DNA；
获得转化的基因组DNA片段，所述转化的基因组DNA片段由所述基因组DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶氧化成为尿嘧啶得到；
获得连接产物，所述连接产物由所述转化的基因组DNA片段连接接头后扩增得到；以及
得到所述Cot DNA，所述Cot DNA为双链核酸分子，由所述连接产物进行变性、复性和纯化处理得到。
在本申请实施例中，所述片段化的基因组DNA长度为200～500bp。
在本申请实施例中，所述接头序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，SEQ ID NO 3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列中的至少一种。
在本申请实施例中，所述接头连接至处理后的核酸片段两端，再进行扩增以得到所述连接产物。
在本申请实施例中，所述处理处理时间与Cot值成正比关系。
第二方面，本申请实施例公开了第一方面公开的制备方法制得的Cot DNA，用于封闭亚硫酸盐转化后测序文库中的重复序列的核酸。
第三方面，本申请实施例公开了一种核酸杂交的方法，包括使用第二方面公开的Cot DNA进行封闭的步骤。
在本申请实施例中，第三方面公开的方法中，所述核酸杂交为Northern杂交、Southern杂交、原位杂交或液相杂交。
第四方面，本申请实施例公开了一种序列捕获的方法，包括使用第三方面公开的Cot DNA进行封闭的步骤。
第五方面，本申请实施例公开了一种核酸杂交或检测的试剂盒，包含第二方面公开的Cot DNA。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
在DNA甲基化文库的液相杂交捕获中，本申请实施例提供的Cot DNA通过与目标文库中的重复序列竞争性杂交，减少了重复序列对捕获核酸的影响，提高了捕获探针的杂交效率与中靶率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的gDNA片段化凝胶电泳结果(DL2000marker)：根据表1所用参数，泳道1～4为依次对样本以200bp、300bp、400bp和500bp size进行打断后进行电泳检测的结果。
图2为本申请实施例提供的Cot-1 DNA片段大小分布图。
图3为本申请实施例提供的亚硫酸盐测序文库液相杂交捕获产物片段大小分布图。
图4为本申请实施例1和对比例1提供的Cot-1 DNA用于重亚硫酸盐测序构建文库测序在chr4:49,516,347-49,516,696处的可视化输出结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本申请实施例所涉及的仪器和试剂，除无特殊说明，均可从商业途径获得。
本实施例以人类基因组为例，制备用于重亚硫酸盐建立测序文库封闭其重复序列的Cot-1 DNA，具体过程如下。
1、样本
使用QIAamp DNA Blood Kits(Qiagen,51104)从人全血中提取的5μg DNA样品。
2、样本片段化处理：
将Covaris S220非接触式超声波破碎仪(美国Chromatin Shearin)提前预冷至4～10℃，取5μg DNA样品，放入Covaris S220专用管中，纯水补充体积至130μL，开启CovarisS220将该DNA样本进行超声破碎，获得200～500bp的DNA片段，Covaris S220的运行参数如表1所示。
表1
使用Invitrogen Qubit4.0荧光定量仪对所得的DNA片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测和荧光定量检测。电泳检测结果如图1所示，荧光定量结果如表2中间一列所示。
3、获得转化的基因组DNA片段
取1μg的片段化DNA产物，使用EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZymoResearch公司，货号D5005)对上述DNA片段进行尿嘧啶转化处理，转化后的样品使用ssDNA qubit(Invitrogen)对其进行定量检测，结果如表2右侧一列结果所示。
表2
4、获得连接产物
将上述转化后基因组DNA片段连接接头并进行扩增，即可得到连接产物。具体过程如下：
(1)预处理
PCR热循环仪(Thermofisher ABI，Proflex)提前预热至95℃，热盖温度设定为105℃，配制第二步通用接头序列连接所需体系，置于冰上待用。
取5份片段化后的300bp再进行转化的样品300ng至0.2mL的PCR管中，加入Low-EDTA TE稀释到总体积为15μL；待PCR仪器稳定到95℃后，将PCR管放入PCR仪中，进行95℃孵育2min后，立即将PCR管置于冰上进行冷却，静置2min。
(2)接头连接
1)接头工作液
第一接头母液：获得如SEQ ID NO.1～NO.2所示的DNA序列以作为接头使用，由上海生工公司提供。将接头用双蒸水稀释分别至100μM，再分别取100μL含有如SEQ ID NO.1所示、100μL如SEQ ID NO.2所示序列的稀释液进行混合，加入50μL的退火缓冲液，退火缓冲液包含10mM Tris(pH 7.5)、50mM NaCl和1mM EDTA，将混合物在水浴锅中95℃保持5分钟后，冷却至室温，得到第一接头母液。
第二接头母液，获得如SEQ ID NO.3～NO.4所示的DNA序列以作为接头使用，使用上述相同方法制备得到第二接头母液。
将第一接头母液与第二接头母液等体积混合后，稀释浓度至20μM，即为可参与反应的接头工作液。
2)核酸片段磷酸化处理
磷酸化处理反应体系如表3所示。反应程序为37℃30分钟，65℃20分钟。
表3
试剂 体积(μL)
转化后gDNA 15
10×T4 PNK reaction buffer 3
T4 PNK(10U) 3
ddH2O 9
Total 30
3)连接接头
反应结束后，再将磷酸化全部产物加入至连接反应体系中，连接反应体系如表4所示，反应程序为37℃1h，4℃保持，反应产物使用0.9倍体积的Ampure xp beads(Beckman)进行纯化，纯化两次后使用25μL纯水回收。
表4
4)接头序列扩增
将上述步骤的连接产物使用如表5所示的反应体系和如6所示的反应程序进行PCR扩增。其中使用的Universal sequence primer的序列如SEQ ID NO.5～NO.6所示，由上海生工公司进行合成。将合成的两条引物使用双蒸水稀释至20μM，等体积混合，即为Universal sequence primer。
表5反应体系
试剂 体积(μL)
回收的连接产物 23
2×PCR Master Mix 25
Universal sequence primer 2
Total 50
表6反应程序
连接产物用0.9倍体积的Ampure xp beads(Beckman)进行纯化，使用20μL的纯水进行回收，得到连接产物，使用Qubit(Invitrogen)对其进行定量，平均产出约5μg。
5、连接产物的变性、复性以及纯化
将得到的连接产物依次进行变性、复性和纯化处理处理，即可得到Cot DNA。具体过程如下：
1)变性处理
取上述连接产物20μL，加入5M NaCl(国药)溶液1.34μL，加入1M Tris-HCl(pH8.0)buffer(Solarbio,T1150)0.22μL，加入纯水0.72μL。
使用10mM Tris-HCl(pH8.0)，NaCl(国药)和纯水将扩增后的连接产物稀释至250ng/μL，并使得溶液NaCl终浓度为0.3M。
上述稀释的连接产物全部转移至一个0.2mL PCR管中，准备一台带有热盖(hotlid)功能的热循环仪(Thermofisher ABI，Proflex)，预热至95℃、热盖温度105℃，将样品置于其中保持10min，使得核酸充分变性。
2)复性
再设定以4℃/s的降温速率进行降温至65℃，保持时间为T(sec)。当固定浓度为250ng/μL、固定片段长度为200～500bp、Cot为1时，T的值可用公式T≈Cot×1315，即复性保持时间为1315秒。
3)纯化
将复性得到的转移文库样本快速转至冰上静置30～60s后，在冰上将5份样本进行混合，混合后总体积为111.4μL。
取1μL S1 Nuclease(180U/μL)(Takara，2410A)，加入至99μL 10x S1 NucleaseBuffer中，吹打混匀后，吸取0.2μL加入至111.4μL的混合物中，再加入12μL的10×S1Nuclease Buffer。
将变性后的样本取出后快速振荡离心，转移至37℃的热循环仪(hotlid off)上，孵育1小时。本实例中，孵育完的样品使用0.9倍体积的Ampurexp beads(Beckman)进行纯化，或者使用0.8x/0.2x的比例进行分选纯化，可以得到更高质量的Cot-1 DNA，见图2，其长度大小分布在200～300bp之间。
以上述制备的Cot-1 DNA，本申请实施例还公开了一种核酸杂交或检测的试剂盒，该试剂盒包含上述Cot DNA，该Cot DNA适用于封闭重亚硫酸盐测序文库过程中的重复序列。具体实施过程如下：
1、检测样本
使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen,55114)从人血浆中提取)cfDNA 10ng，作为检测样本。
2、文库构建及液相杂交
取人cfDNA 10ng进行片段化处理后，使用EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZYMO，D5005)进行亚硫酸盐转化处理，再使用Scale Methyl-DNA Lib Prep Kit for Illumina(Abclonal,RK20220)进行单链建库，文库使用Qubit(Invitrogen)进行定量检测，随后进行文库液相杂交捕获。
(1)文库杂交
表7杂交体系
文库体系如表7所示，表7中，“+”表示添加相同物质和含量。“－”表示添加等体积的纯水。对比例1使用的为商品化Cot-1 DNA，购自Invitrogen，货号15279011。实施例1和对比例1提供的Cot-1 DNA的片段分布如图3所示，实施例1提供的Cot-1 DNA产物主峰在250～300bp，对比例1提供的Human Cot-1 DNA(Invitrogen,15279011)主峰在240～260bp。
按照表8所示配制杂交预混液。
表8
组分 体积
2x Hybridization Buffer 8.5μL
甲酰胺(Sigma,47671) 2.7μL
H2O 1.8μL
Methylation Targeted Panel 4μL
总体积 17μL
表8中，2×Hybridization Buffer中包含5×SSC缓冲液，50×Denhardt buffer(Solarbio，S1030)，1％(v/v)SDS(Solarbio,S8010)，0.05mM EDTA(Solarbio，E8040)。其中，20×SSC缓冲液包含3M NaCl和0.3M柠檬酸钠，pH7.0。
表8中，Methylation Targeted Panel为380条生物素修饰的DNA探针，由上海生工公司提供合成与混合，使用TE稀释至50μM备用。
使用移液器按照表8的体系将上述溶液混合均匀后加入到已经真空浓缩干燥的离心管底部，使用移液器轻柔吹吸混匀15～20次，瞬时离心，25℃孵育5～10min。
离心管中的全部17μL杂交反应混合液转移至一个新的0.2mLPCR管中，瞬时离心，放进PCR仪中，启动如下杂交程序(Hot lib 100℃)，杂交程序为95℃30s，65℃16h和65℃Hold。
(2)磁珠捕获
采用磁珠对杂交后的文库样品进行杂交，按照如表9所示的体系磁珠悬浮缓冲液。
表9
表9中，2×Hybridization Bufferr中包含5×SSC缓冲液，50×Denhardt buffer(Solarbio，S1030)，1％(v/v)SDS(Solarbio,S8010)，0.05mM EDTA(Solarbio，E8040)。
磁珠捕获过程如下：
1)吸取50μL M270 Streptavidin Beads(Thermo,65305)至低吸附离心管中；加入100μL Bead wash buffer，吹打混匀后置于磁力架上等待1分钟，待澄清后移除上清液；
2)从磁力架上取出，重复上述操作2次，取17μL磁珠重悬缓冲液重悬磁珠；将17μL的磁珠重悬液加入至杂交后的文库中。
3)吹打混匀磁珠重悬液与文库，将混合液置于预热至65℃的热循环仪中孵育45分钟，每隔10～12分钟取出文库轻轻振荡，保持磁珠充分悬浮在文库中。
4)预热Wash buffer1、Stringent wash buffer至65℃，待孵育结束后，立即加入100μL预热的Wash buffer1至文库中，吹打混匀后置于磁力架上1分钟，待澄清后移除上清液。
5)从磁力架上取出，加入150μL预热的Stringent wash buffer，吹打混匀后，置于65℃孵育5分钟，孵育完成后置于磁力架上1分钟，待澄清后移除上清液。重复上述步骤1次。
6)从磁力架上取出，加入150μL的室温的Wash buffer1，振荡混匀后室温孵育2min，期间涡旋混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。
7)将PCR管置于磁力架上1min，待澄清后移除上清液，加入150μL室温的Washbuffer2，振荡混匀后室温孵育2min，期间涡旋混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。
8)将PCR管置于磁力架上1min，待澄清后移除上清液，加入150μL室温的Washbuffer3，振荡混匀后室温孵育2min，期间涡旋混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。
9)将PCR管置于磁力架上1min，待澄清后移除上清液，加入21μL纯水，吹打混匀后，转移全部液体和磁珠至一个新的0.2ml PCR管中。
上述过程中，Bead wash buffer、Stringent wash buffer、Wash buffer1、Washbuffer2、Wash buffer3均来于商品化试剂IDT Hybridization and Wash Kit(IDT，Cat1080577)。
3、文库扩增
使用适用于二代测序平台的Universal PCR primer与PCR Index primer进行扩增，所选用2X Master PCR Mix为高保真DNA聚合酶(Kapa，KK2631)，扩增反应体系和反应程序分别如表10、11所示。
表10反应体系
试剂 体积
纯化后的产物(步骤2.11) 20μL
2X Master PCR Mix 25μL
Universal PCR Primer 2.5μL
PCR Index Primer 2.5μL
总体积 50μL
表11反应程序
扩增产物用1.0×磁珠纯化1次后使用20μL low-EDTA-TE回收。扩增产物使用qPCR定量后可以在二代测序平台上机测序。结果如表12所示和图4所示。
如图4中，对具体实施例1中所构建的文库进行高通量测序，测序得到的数据进行均一化处理、接头过滤、参考基因组比对后，使用IGV软件对结果进行可视化输出。如在位置chr4:49,516,347-49,516,696处，此处在参考基因组上被标注为连续重复序列。图4中的上半部分为实施例1对应的可视化输出结果，下半部分为对比例1对应的可视化输出结果。由图4可知，上半部分并无测序数据产生，而下半部分在chr4:49,516,347-49,516,696处仍然有大量测序数据产生。由此表明，实施例1使用本申请通过的Cot-1 DNA能够避免所构建的文库中含有或者富集到重复序列，而使用对比例1提供的商业Cot-1 DNA则无法达到这种效果。由此，说明本申请实施例提供的Cot-1 DNA更加适用于重亚硫酸盐测序的文库构建。
另外，表12可知，在比对率差异较小的条件下，实施例1测序的中靶率均显著高于对比例1和2，以证明了本申请实施例提供的Cot-1 DNA更加适用于重亚硫酸盐测序。
表12
实施方式 比对率 中靶率
实施例1 56.6％/59％ 36.3％/37.5％
对比例1 55.2％/50.9％ 26.9％/30.1％
对比例2 51.5％/55％ 11.8％/9.7％
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海英基生物科技有限公司
<120> 适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA、其制备方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (7)

1.适用于重亚硫酸盐测序的Cot DNA的制备方法，包括以下步骤：
获得片段化的基因组DNA；
获得转化的基因组DNA片段，所述转化的基因组DNA片段由所述基因组DNA中未甲基化修饰的胞嘧啶氧化成为尿嘧啶得到；
获得连接序列，所述连接序列由所述转化的基因组DNA片段连接接头后扩增得到；以及
得到所述Cot DNA，所述Cot DNA为双链核酸分子，由所述连接序列进行变性、复性和纯化处理得到；
其中，所述连接序列的制备步骤包括：
PCR热循环仪提前预热至95℃，热盖温度设定为105℃，配制连接所需体系，置于冰上待用；取5份片段化后的300bp再进行转化的基因组DNA片段300ng至0.2mL的PCR管中，加入Low-EDTA TE稀释到总体积为15μL；待PCR仪器稳定到95℃后，将PCR管放入PCR仪中，进行95℃孵育2min后，立即将PCR管置于冰上进行冷却，静置2min；
获得如SEQ ID NO.1~NO.2所示的DNA序列以作为接头使用，将接头用双蒸水稀释分别至100μM，再分别取100μL含有如SEQ ID NO.1所示、100μL如SEQ ID NO.2所示序列的稀释液进行混合，加入50μL的退火缓冲液，退火缓冲液包含10mM pH 7.5的Tris、50mM NaCl和1mMEDTA，将混合物在水浴锅中95℃保持5分钟后，冷却至室温，得到第一接头母液；
获得如SEQ ID NO.3~NO.4所示的DNA序列以作为接头使用，将接头用双蒸水稀释分别至100μM，再分别取100μL含有如SEQ ID NO.3所示、100μL如SEQ ID NO.4所示序列的稀释液进行混合，加入50μL的退火缓冲液，退火缓冲液包含10mM pH 7.5的Tris、50mM NaCl和1mMEDTA，将混合物在水浴锅中95℃保持5分钟后，冷却至室温，得到第二接头母液；
将所述第一接头母液与所述第二接头母液等体积混合后，稀释浓度至20μM，即为可参与反应的接头工作液；
将经预处理的所述转化的基因组DNA片段进行磷酸化处理，获得磷酸化基因组DNA片段，所述磷酸化处理的反应体系以30μL计由15μL所述转化的基因组DNA片段、3μL 10×T4PNK reaction buffer、3μL 10U的T4 PNK和9μL ddH2O组成；所述磷酸化处理的反应条件为37℃ min、65℃ 20min；
将所述磷酸化基因组DNA片段与所述接头工作液加至一连接反应体系中反应以得到连接序列，所述连接反应体系以90μL计包含30μL所述磷酸化基因组DNA片段、33.3μL PEG-8000、9μL 10×T4 DNA ligase buffer、4μL 800U的T4连接酶、2μL所述接头工作液和11.7μL H2O；所述连接反应条件为37℃ 1h，4℃保持反应产物使用0.9倍体积的Ampure xp beads进行纯化，纯化两次后使用25μL纯水回收；所述接头连接至处理后的核酸片段两端，再进行扩增以得到所述连接序列；
对所述接头序列进行PCR扩增，所述PCR扩增使用的引物如SEQ ID NO.5~NO.6所示，将合成的两条引物使用双蒸水稀释至20μM，等体积混合；所述PCR扩增的反应体系以50μL计由23μL回收的连接产物、25μL 2×PCR Master Mix和2μL引物组成，所述PCR扩增的反应程序为98℃ 45s 1个循环，98℃15s、60℃30s和72℃30s，共6~7个循环，72℃2min1个循环以及4℃ 1个循环；连接产物用0.9倍体积的Ampure xp beads进行纯化，使用20μL的纯水进行回收，得到连接产物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复性的处理时间与Cot值成正比关系。
3.权利要求1或2任一项所述的制备方法制得的Cot DNA，用于封闭亚硫酸盐测序文库中重复序列的核酸。
4.一种核酸杂交的方法，包括使用权利要求3所述的Cot DNA进行封闭的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述核酸杂交为Northern杂交、Southern杂交、原位杂交或液相杂交。
6.一种序列捕获的方法，包括使用权利要求3所述的Cot DNA进行封闭的步骤。
7.一种核酸杂交或检测的试剂盒，包含如权利要求3所述的Cot DNA。
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