CN107190329B - 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA的融合基因定量测序建库方法，步骤包括：1)构建基因组片段化DNA文库并纯化；2)PCR扩增捕获融合基因发生区域，并纯化、富集包含引物特异片段的序列；3)巢式PCR扩增捕获包含融合基因的目的片段；4)构建用于高通量测序的DNA测序文库。本发明还公开了用上述方法制备的DNA测序文库进行融合基因定量测序检测的方法、该方法的用途，以及包含该DNA测序文库的检测试剂盒。本发明使用单向特异引物锚定融合断点发生的下游，通过特异和通用引物配对，运用PCR方法获取目的序列，再运用标签富集和巢式PCR进一步降低背景，如此提高了特异性，减少了建库时间和成本，适合用于FFPE样本或液态活检。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及融合基因的测序检测，更具体地说，是涉及融合基因的DNA测序文库的制备，以及使用该DNA测序文库进行融合基因的高通量测序检测的方法。
背景技术
自20世纪80年代早期第一个融合基因(BCR/ABL1)被检测证实，融合基因已成为多个癌种的重要标志，例如：BCR/ABL1用于检测慢性骨髓性白血病；EML4/ALK用于检测恶性肺腺癌；TMPRSS2/ERG用于检测前列腺癌，等等。
21世纪开始，随着靶向药物的兴起，癌症治疗药物，尤其非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗药物，也开始使用融合基因所在的代谢通路。例如，2011年克唑替尼获得FDA许可用于ALK和ROS1基因融合的治疗；2015年艾乐替尼获得FDA许可用于ALK基因融合的治疗；索拉非尼和舒尼替尼获得RET基因融合的治疗许可。
在恶性肿瘤精准检测及个性化治疗概念被提出的今天，为了避免药物禁忌和耐受引起无效治疗，耽误宝贵的治疗时间，对于融合基因的有效特异检测成为临床医师给药的重要依据。早期的融合基因检测是在传统组织活检的基础上，采用荧光原位杂交、染色体条带分析以及RT-PCR分析技术来确认患者的肿瘤细胞是否发生了特定基因的基因融合。但是这些早期的细胞学及分子生物学技术对于融合基因的检测存在以下缺陷：1)检测时间久；2)假阳性率偏高；3)检测技术要求高，需要熟练有经验的检测人员，不利于标准化；4)在融合基因基因型细胞在癌组织中含量少的情况下，无法有效检出。随着NGS(高通量测序)技术的日益成熟，并全面进入临床基因检测领域，上述问题得到了有效解决。NGS检测技术具有灵敏度、特异性高，检测样本DNA需要量少，以及技术成熟、操作简便快速等一系列优点，在技术应用成本降低和通量不断增高的发展背景下，NGS技术成为融合基因检测的主流平台。
对于用测序或PCR方法检测融合基因，最为直接的方式是提取组织样本的RNA，通过反转录技术合成cDNA，捕获发生融合的外显子来分析完成。这样的方式是基于在基因组DNA层次，两个基因的融合点都发生融合的外显子序列间的内含子序列区域，而这个区域可能>1kb，即使是读长较长的一代测序技术，也无法有效覆盖(NGS测序技术的读长一般在100-400bp)，无法直接分析融合的内含子区域；有些基因融合的融合点的位置仅仅在COSMIC数据库中有报导的就超过20个，无法确认融合位置的位置样本，也不可能通过特异PCR来富集融合位置的序列用于测序，而发生剪切后的成熟融合基因RNA的两侧序列则是已知的，可以通过PCR扩增富集长度小于200bp的序列，用于NGS高通量测序。基于以上原因，目前主流的融合基因测序检测技术是基于RNA的。但是，随着液态活检概念的引入及其优势性，基于RNA的融合基因检测方法突显了其局限性。
液态活检技术，是指仅提取患者的血浆或尿液中游离的肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)，通过基因捕获技术来快速检测肿瘤细胞基因型。在肿瘤细胞的生活周期中，会发生细胞死亡(发生的多种原因，此处不再赘述)，从而将内部核酸物质释放出来，并进入循环系统或排泄系统，当然这里也存在健康细胞的核酸，常规情况下每毫升血浆中游离DNA的得率是5-20ng，这样少量的游离DNA中，ctDNA的含量可能只有0.1-5％，而正因为高灵敏的NGS技术的应用，使检测ctDNA成为可能。可以看到液态活检技术相比传统组织活检具有多种优势：1)对患者侵害小；2)可多次取样监测；3)无需对取样进行病理区分。因此，各种肿瘤细胞的检测技术都纷纷改进，以适用于液态活检。
然而，相比于ctDNA，ctRNA的碎片化程度更为严重，一般在10-25bp(ctDNA的碎片化程度一般在150-200bp)，因此，ctRNA在现有技术下并不适合用于融合基因的检测，这使得基于RNA的融合基因检测很难在液态活检中应用。
此外，基于RNA的融合基因检测还面临着大部分患者很难接受多次穿刺取样，只能取得病理检测剩余的FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样本的问题。FFPE样本由于甲醛固定的原因，其中的RNA已经发生了严重的降解，很难提供检测需要的足够长度的RNA片段。
目前，基于DNA的融合基因测序方法是通过在基因组文库中用探针捕获融合基因区域来进行鉴定的，这种方法的优点是目的性强，可以节约数据量和成本；缺点是容易脱靶，尤其是在液态活检中检测游离DNA时，有效数据比例低，需要提高起始DNA量和测序数据量，从而导致成本高，操作时间长，操作难度高，甚至影响检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种基于DNA的融合基因定量测序建库方法，该方法建库时间短，成本低，可应用于液态活检。
为解决上述技术问题，本发明的基于DNA的融合基因定量测序建库方法，包括以下步骤：
1)构建基因组片段化DNA文库，并纯化；
2)以步骤1)纯化后的DNA文库为模板，通过PCR扩增反应捕获融合基因发生区域，对扩增产物进行纯化，并富集包含有引物特异片段的序列；
3)以步骤2)所得产物为模板，用巢式PCR扩增反应捕获包含有融合基因的目的片段；
4)用步骤3)所得产物构建用于高通量测序的DNA测序文库。
上述步骤1)进一步包括：
末端修复及加A尾的步骤；
在末端修复及加A尾产物上连接文库接头，并对接头连接产物进行纯化的步骤；
以纯化后的接头连接产物为模板，进行DNA文库扩增反应，并对扩增产物进行纯化的步骤。
对于ctDNA，上述步骤1)在末端修复及加A尾的步骤前，还包括DNA酶切片段化步骤。
上述步骤2)，PCR反应的正向引物为通用引物；反向引物为一组序列与编码链方向反向互补的特异引物，且5’端带有标签。较佳的，通用引物为P5引物；反向引物的序列如SEQID NO:1～20所示，反向引物的5’端用生物素修饰。
上述步骤3)，较佳的，巢式PCR扩增反应的引物组的序列如SEQ ID NO:21～40所示。
上述步骤4)进一步包括：
对步骤3)所得产物进行末端修复及磷酸化，并进行纯化的步骤；
在纯化后的末端修复及磷酸化产物上连接通用测序接头，并对连接产物进行纯化的步骤；
以纯化后的连接产物为模板，进行文库扩增反应，并对文库扩增产物进行纯化的步骤；
对纯化后的文库进行定量、质检，获得用于高通量测序的DNA文库。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种用上述建库方法制备的DNA测序文库对融合基因进行高通量定量测序检测的方法，该方法可应用于FFPE样本或液态活检。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种融合基因定量测序检测试剂盒，该试剂盒包含有用上述建库方法制备的DNA测序文库。
本发明要解决的技术问题之四是提供上述融合基因定量测序检测方法在FFPE样本或液态活检中的应用。
本发明要解决的技术问题之五是提供一组特异性扩增融合基因发生区域的引物，该引物组的序列如SEQ ID NO:1～20所示。
本发明使用单向特异引物来锚定融合断点发生的下游，通过特异引物和通用引物配对，运用PCR方式来获取需要的序列，再运用标签富集和巢式PCR进一步降低背景，最后在捕获的目的片段两端加上通用测序接头，构建成最终的融合基因测序文库。相比传统的基于RNA的融合基因检测方法和探针捕获建库方法，本发明的融合基因建库和检测方法具有以下优点和有益效果：
1.特异性高，背景低，测序数据中不匹配读数的比例低。
2.只需运用简便的PCR技术，无需探针杂交、封闭等繁琐的过程，操作简单，建库时间短(建库时间可从3天缩短至1-1.5天)，成本低(成本可降低50％)。
3.样本起始量可低至10ng，适用于血浆游离DNA(ctDNA和cfDNA)的检出。
4.可适用于目前所有的ALK(间变性淋巴瘤激酶)融合基因型，不限制上游是哪个基因与ALK融合，甚至可发现未知的融合型或已知融合型中的未知断点。
5.解决了现有的基于RNA的融合基因检测难以获得适当质量的RNA的问题，可应用于FFPE样本或液态活检。
6.对照样本检测结果表明，和金标准的RNA捕获测序结果高度一致。
附图说明
图1为本发明实施例的基因融合reads分布图。其中，(A)图为EML4基因，(B)图为ALK基因。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例中所用仪器设备、实验材料和试剂如下：
一、仪器
AB ProFlex PCR仪、IKA MS3Digital漩涡振荡器、IVGN Qubit 3.0荧光光度计、IKA Mini G掌上离心机；
二、材料
Rainin移液器(规格10、20、200、1000μl)、AXYGEN通用过滤接头(Universal FitFilter Tips，规格10、20、200、1000μl)、DYNAL DynaMagTM-2magnet磁力架、AmbionMagnetic Stand-96、AXYGEN 0.2ml透明平盖低吸附PCR薄壁管、AXYGEN无色低吸附离心管(1.5ml、2.0ml)；
三、试剂
分析纯无水乙醇、IVGNdsDNA HS试剂盒、NEB T4DNA连接酶、NEB T4多聚核苷酸激酶、NEB Phusion超保真PCR Master Mix、BECKMANXP、IVGNMyOneTMStreptavidin(链霉亲和素)C1、KAPA HyperPlus LibraryPreparation Kit(文库制备试剂盒)。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例的基于DNA的ALK融合基因定量测序建库方法流程如下：
一、基因组片段化DNA建库
采用KAPA Hyperplus Library Preparation Kit构建基因组片段化DNA文库(如果是cfDNA，则不需要进行DNA酶切片段化步骤，且保证起始量10ng)。
1.DNA酶切片段化
1)在冰上的0.2ml离心管中混合下列组分：DNA 100ng(提取自患者FFPE、血浆或活组织)35μl，10X KAPA片段化反应缓冲液5μl，KAPA片段酶10μl，总计50μl。
2)涡旋震荡3秒，短暂离心，尽快进行下一步。
3)在热循环仪上进行片段化反应(不使用热盖)，反应程序为：4℃预冷10min；37℃片段化反应20min；4℃保持。
2.末端修复及加“A”(A-Tailing)
1)在完成DNA酶切片段化的离心管中添加以下成分：50μl片段化DNA或cfDNA，末端修复和加“A”尾缓冲液7μl，末端修复和加“A”尾酶混合物3μl，总计60μl。
2)涡旋震荡，短暂离心，尽快进行下一步。
3)在热循环仪上进行末端修复及加“A”尾反应，反应程序为：65℃末端修复及加“A”尾反应30min；4℃保持。反应结束后尽快进行下一步。
3.接头连接并纯化
1)在完成末端修复及加“A”尾反应的体系中加入以下成分：末端修复及加“A”尾产物60μl，文库接头15μl，水(PCR级别)5μl，连接缓冲液(Ligation Buffer)30μl；DNA连接酶10μl，总计110μl。
其中，文库接头由P5和P7退火得到。
P5序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:41)
P7序列为：
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQID NO:42)
2)用移液器小心吸打混匀，短暂离心，20℃孵育15min。
3)在110μl接头连接产物中加入88μlXP试剂(纯化磁珠)，总体积198μl，混匀，短暂离心，室温放置5分钟，将反应管置于磁架上2min或直至溶液澄清，弃去上清。
4)反应管保持在磁架上，加入200μl 80％新鲜制备的乙醇，保持至少30s，随后小心弃去上清。重复本步骤一次，保证乙醇被充分吸去。
5)反应管保持在磁架上，室温干燥3min(不要过度干燥，可能会导致回收率较低)，取下，加入25μl 0.1×TE(Tris-EDTA缓冲液)，吸打混匀5次，室温放置2分钟。将反应管放回磁架，直至溶液澄清，吸取25μl上清放入新的0.2ml反应管中。
4.DNA文库扩增并纯化
1)在离心管中加入2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix(热启动高保真酶)25μl，10×KAPA Library Amplification Primer Mix(文库扩增引物混合物)5μl，纯化后的接头连接产物20μl，总计50μl。吸打混匀，短暂离心。
2)在热循环仪上进行文库扩增反应，反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃复性30s，72℃延伸30s，5个循环；72℃后延伸1min；4℃保持。
3)取50μl扩增产物，加入50μlXP试剂，总计100μl。混匀，短暂离心，室温放置5分钟，将反应管置于磁架上2min或直至溶液澄清，弃去上清。
4)反应管保持在磁架上，加入200μl 80％新鲜制备的乙醇，保持至少30s，随后小心弃去上清。重复本步骤一次，保证乙醇被充分吸去。
5)反应管保持在磁架上，室温干燥3min，取下，加入22μl 0.1×TE，吸打混匀5次，室温放置2分钟。将反应管放回磁架，直至溶液澄清，吸取20μl上清放入新的0.2ml反应管中。
二、目的区域扩增捕获
1.第一轮融合基因发生区域扩增捕获
在PCR管中混合如下反应体系：2×Phusion HF PCR Master Mix 25μl，Taq聚合酶1μl，DMSO(二甲亚砜)1μl，1μM Fusion panel引物混合物10μl，纯化后的DNA文库10μl，无核酸酶水3μl，总计50μl。吸打混匀，短暂离心后，按表1程序进行PCR扩增。
其中，引物混合物中，正向引物使用基因组文库的P5通用引物序列(SEQ ID NO:41)，反向引物是一组与编码链方向反向互补的特异序列，且5’端用生物素修饰，以便后一步富集特异序列时，降低测序背景。这组反向引物的序列为：
表1第一轮扩增捕获PCR反应程序
2.扩增产物纯化
1)向扩增产物中加入50μl无核酸酶水，转入1.5ml低吸附管中，加入90μl(0.9倍体积)XP试剂，吸打混匀5次，室温放置5min。
2)将反应管置于磁架上2min或直至溶液澄清，将上清吸入新的反应管中(上清中是需要的文库片段，不要丢弃)，加入15μl(0.15倍体积)XP试剂，吸打混匀5次，室温放置5min。
3)将反应管置于磁架上2min或直至溶液澄清，弃去上清。
4)加入500μl新鲜制备的80％乙醇，保持大于30s，然后吸去上清。重复本步骤一次，保证乙醇被充分吸去。
5)反应管保持在磁架上，室温干燥3min，取下，加入200μl无核酸酶水，吸打混匀5次，放在磁架上静置2min，吸取上清至新的1.5ml反应管，再加入200μl 2×B&W缓冲液，吸打混匀。
3.富集引物特异片段
1)取50μl 10mg/ml的BSA(标准蛋白质溶液)加无核酸酶水450μl，稀释成1×BSA。
2)漩涡振荡MyOneTM链霉亲和素C1磁珠，吸取50μl磁珠到1.5ml低吸附管中，加入500μl 1×B&W缓冲液，漩涡振荡15s，短暂离心，置于磁架上至少1min，直至溶液变清，吸掉上清，加500μl 1×BSA，漩涡振荡15s，短暂离心后，置于磁架上至少1min，等溶液变清后，吸掉上清，加入500μl 1×B&W缓冲液，漩涡振荡15s，短暂离心，放置备用。
3)将含磁珠的离心管置于磁架上，等溶液变清后，吸掉上清，向洗好的磁珠中加入纯化后的第一轮扩增产物，室温(20-25℃)垂直转动反应管，杂交30min。
4)将杂交好的磁珠DNA混合物短暂离心，置于磁架上至少1min，等溶液变清后，吸去上清。
5)用500μl 1×B&W缓冲液悬浮磁珠，漩涡振荡15s，短暂离心后置于磁架上至少1min，等溶液变清后，吸去上清。重复本步骤2次，共清洗3次磁珠。
6)用500μl 0.1×TE悬浮磁珠，放置备用。
4.第二轮目的片段扩增(巢式PCR)
1)将上一步所得含有磁珠的反应管置于磁架上，待溶液澄清后，尽量弃去上清，用20μl巢式PCR扩增反应体系再悬浮磁珠，一起转入新的0.2ml反应管中，在热循环仪上按照表2所示程序进行巢式PCR扩增反应。
20μl巢式PCR扩增反应体系包含：2×Phusion HF PCR Master Mix 10μl，Taq聚合酶0.5μl，DMSO 0.5μl，1μM巢式Fusion panel引物混合物9μl。其中，引物混合物包含有以下引物：
表2第二轮巢式PCR扩增反应程序
2)扩增反应结束后，将反应管置于磁架上，待溶液澄清后，吸取最终捕获产物至新的反应管中，可在-20℃保存1-2周。
三、建库
1.末端修复及磷酸化
在PCR反应管中加入以下成分：上一步所得最终捕获产物20μl，T4连接酶缓冲液10μl，10mg/ml BSA 1μl，10mM dNTPs 2μl，T4聚合酶1μl，T4多聚核苷酸激酶1μl，无核酸酶水75μl，总计100μl。小心吸打混匀，室温孵育20min。
2.末端修复产物纯化
1)在末端修复产物中加入XP试剂100μl(1倍体积)，吸打混匀5次，室温静置5min。将反应管置于磁架上，静置2min或待溶液澄清，小心吸去上清，避免碰到磁珠沉淀。
2)加入200μl新鲜配置的80％乙醇，贴着磁架轻轻地上下移动反应管来清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，并确保所有的80％乙醇都被吸去。
3)将反应管保持在磁架上，室温干燥3min，取下，加入42μl无核酸酶水，旋涡振荡2s，短暂离心2s，放回磁架上，静置2min或待溶液澄清，吸取40μl上清至新的0.2ml低吸附PCR管中，避免碰到磁珠。
3.测序接头连接
向40μl纯化后的末端修复产物中加入如下试剂：T4连接酶缓冲液5μl，Barcode X(不同样本所用Barcode不同，X编号不同)1μl，P1接头1μl，10mM dNTPs 1μl，T4连接酶1μl，Taq聚合酶1μl，总体积50μl。用移液器小心吸打混匀5次，在热循环仪上进行测序接头连接反应。连接反应条件为：22℃20min，72℃10min，10℃保持。产物可在-20℃保存。
4.连接产物纯化
1)在连接产物中加入30μlXP试剂，吸打混匀5次，室温放置5min。将反应管置于磁架上，静置5min或直至溶液澄清，将上清吸入新的反应管中(上清中是需要的文库片段，不要丢弃)。
2)在上一步吸取的上清中加入20μlXP试剂，吸打混匀5次，室温放置5min。将反应管置于磁架上5min或直至溶液澄清，弃去上清。
3)加入200μl新鲜配制的80％乙醇，贴着磁架轻轻上下移动反应管来清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，保证乙醇被充分吸去。
4)保持在磁架上，室温干燥3min(干燥期间马上开始下一步文库扩增)。
5.文库扩增
1)向上一步纯化后的连接产物中加入2×Phusion HF PCR Master Mix 25μl、文库扩增引物1μl、无核酸酶水24μl，将反应管从磁架上取下，用移液器吸打混匀5次，放回磁架上，静置2min或待溶液澄清。
其中，文库扩增引物由20μM AF和PF引物等体积混合而成，AF、PF引物序列如下：
AF：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO:43)
PF：GTCTCAGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO:44)
2)小心将上清移入新的反应管中，避免吸到磁珠。对上清反应体系进行PCR扩增。PCR扩增反应程序为：98℃2min；98℃15s，60℃1min，共5个循环；10℃保持。
6.文库扩增产物纯化
1)在文库扩增中加入XP 50μl(1倍体积)，吸打混匀5次，室温静置5min。
2)将反应管置于磁架上，静置2min或待溶液澄清，小心吸去上清，避免碰到磁珠沉淀。
3)加入200μl新鲜配制的80％乙醇，贴着磁架轻轻上下移动反应管来清洗磁珠，然后吸去上清。重复本步骤一次，确保所有80％乙醇都被吸去。
4)将反应管保持在磁架上，室温干燥3min，取下，加入50μl无核酸酶水，吸打混匀5次，放置在磁架上静置2min，待溶液澄清后，吸取上清至新的反应管，用于Qubit定量。
7.Qubit2.0定量
1)用dsDNA HS Assay Kit试剂盒在Qubit荧光光度计上定量样本DNA。
2)在一个1.5ml离心管中，合并597μl Qubit dsDNA HS缓冲液和3μl Qubit dsDNAHS试剂，漩涡振荡混匀，制备成Qubit工作溶液。
3)分别标记3个Qubit试管：#1标准品管、#2标准品管、#3样品管。在#1标准品管和#2标准品管中，加入190μl Qubit工作溶液，然后分别将Qubit standard HS#1和#2标准品10μl加入相应的#1标准品管和#2标准品管中，漩涡振荡混匀。在#3样品管中加入198μl Qubit工作溶液和2μl纯化后的文库扩增产物，漩涡振荡混匀。
4)静置2min后，打开Qubit，选择DNA测定，校正#1标准品管和#2标准品管中的标准品。
5)将#3样品管放入Qubit中读数定量，并计算使用2μl样品的定量值。
6)将文库稀释至100pM(约20ng/ml)，获得可用于Ion Torrent高通量测序仪的DNA文库。
将上述DNA文库送入Ion Torrent高通量测序仪进行测序检测。
基因融合检测方法的原理是：利用二代测序的单分子reads(每个read来自于一个单分子DNA序列)，如果同一个reads(包含双端和单端)的两部分分别比对到基因组的不同位置，且不为repeat(重复)区域，那么这个read就可能是潜在的发生融合的reads。最后根据cutoff>100，筛选出阳性的融合基因及其配对基因。具体步骤如下：
1)使用fastqc对所有原始测序的reads进行质量控制，然后去除接头序列。
2)取质量合格的序列，用BWA比对软件，与hg19基因组染色体进行比对。
3)筛选出目的基因(ALK)上的非正常比对的reads。
4)将非正常比对的reads，转化成fasta格式，利用blat软件比对到基因组上，找出所有可能的匹配位置，与hg19中基因的位置做maping，并计算个数。
5)根据reads个数>100个，并去掉几个基因组经常出现的重复区间，用IGV查看基因融合reads分布，筛选出阳性的融合基因及其配对基因。
检测结果显示EML4与ALK基因发生融合(参见图1所示)。
序列表
<110> 领星生物科技（上海）有限公司
<120> 基于DNA的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用
<130> CPC-NP-17-100461
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<220>
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<223> 引物
<400> 44
gtctcagcctctctatgggcagtcggtgat 30
Claims (5)
1.基于DNA的ALK融合基因定量测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建基因组片段化DNA文库，并纯化；
2)以步骤1)纯化后的DNA文库为模板，通过PCR扩增反应捕获融合基因发生区域，对扩增产物进行纯化，并富集包含有引物特异片段的序列；所述PCR反应的正向引物为通用引物；反向引物为一组序列如SEQ ID NO:1～20所示且5’端用生物素修饰的特异引物；
3)以步骤2)所得产物为模板，用巢式PCR扩增反应捕获包含有融合基因的目的片段；
4)用步骤3)所得产物构建用于高通量测序的DNA测序文库。
2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤1)进一步包括：
末端修复及加A尾的步骤；
在末端修复及加A尾产物上连接文库接头，并对接头连接产物进行纯化的步骤；
以纯化后的接头连接产物为模板，进行DNA文库扩增反应，并对扩增产物进行纯化的步骤。
3.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤2)，所述正向引物为P5引物。
4.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤3)，巢式PCR扩增反应的引物组的序列如SEQ ID NO:21～40所示。
5.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，步骤4)进一步包括：
对步骤3)所得产物进行末端修复及磷酸化，并进行纯化的步骤；
在纯化后的末端修复及磷酸化产物上连接通用测序接头，并对连接产物进行纯化的步骤；
以纯化后的连接产物为模板，进行文库扩增反应，并对文库扩增产物进行纯化的步骤；
对纯化后的文库进行定量、质检，获得用于高通量测序的DNA文库。
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