CN112144125B - 一种基于高通量测序检测胆管癌fgfr1/2/3融合基因的文库构建方法 - Google Patents

一种基于高通量测序检测胆管癌fgfr1/2/3融合基因的文库构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，属于生物技术领域。该文库构建方法包括如下步骤：(1)使用引物序列SEQ ID NO.1‑67进行多重PCR扩增获得文库；(2)文库的纯化。该方法可用于定性检测胆管癌患者包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病例组织、石蜡切片等样本中FGFR1/2/3基因融合的状态，可检测33种融合形式。该方法仅需要少量RNA逆转录成cDNA作为模板，在单管完成文库的构建，操作简单方便，仅需3.5个小时完成文库构建，大大缩减了检测成本。

Description

一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库 构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法。
背景技术
胆管癌(cholangiocarcinoma)是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其发生位置遍布于毛细胆管至胆总管。根据胆管癌的解剖学分类胆管癌分为肝内胆管癌(iCCA)、肝门部胆管癌(pCCA)和远端胆管癌(dCCA)；其中pCCA和dCCA也可统称为“肝外CCA(eCCA)，其中肝外胆管癌约占75％，肝内胆管癌占25％，肝内胆管癌的发病率仅次于原发性肝细胞癌，肝内胆管癌的组织学表现主要为胆管浸润性和周围浸润性两种类。在过去几十年中胆管癌的发病率呈现上升趋势，胆管癌的病因主要是胆汁淤积和慢性炎症的微环境状态引起。
目前，对于胆管癌的治疗多以综合治疗为主，包括手术切除、全身化疗、放疗等。手术切除仍然是唯一一种可能根治是肝内胆管癌的治疗方式，包括条件允许情况下的肝移植治疗。如果错过最佳手术机会，通常采取放疗、化疗或靶向治疗等手段。目前，吉西他滨+顺铂的化疗方案一直是晚期胆管癌的标准治疗方案，不过效果仍有待提高，且容易发生耐药。近几年随着高通量技术的发展，越来越多的胆管癌相关基因异常被发现。为靶向药物的研发及靶向治疗带来了曙光。研究发现在超过70％的胆管癌中至少可以检测到1个分子或遗传突变，主要突变基因有KRAS、BRAF、FGFR1/2/3、IDH1/2等，其中FGFR1/2/3融合基因发生频率较高。FGFR，即成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor)，FGFR家族主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4四种亚型，是负责细胞增殖和分化的酪氨酸激酶信号通路的一部分。现在已有多款针对该靶点的药物正在积极的推进和发展并进入到临床研究和审批阶段，进展最快的FGFR抑制剂pemigatinib于2020年4月17日被美国食品药品监督管理局(FDA)获批上市。Pemigatinib是FGFR1、FGFR2和FGFR3选择性竞争性抑制剂对携带FGFR2融合或重排的局部晚期或转移性胆管癌患者的疗效，治疗反应率高达35.5％。因为，检测胆管癌患者FGFR1/2/3融合基因，指导靶向治疗可以进一步改善胆管癌患者的生存。
分析胆管癌的FGFR1/2/3基因的融合状态可指导药物治疗，目前常用的检测FGFR1/2/3基因融合的方法有多重荧光PCR方法和靶向捕获高通量测序。多重荧光PCR法要实现涵盖多种融合形式的检测难度较大，往往需要分成多个反应管，增加成本。而靶向捕获高通量测序根据技术路线可分为探针杂交捕获和扩增子法。探针杂交捕获虽然能检测罕见的融合形式，但是建库构成繁琐，所需测序通量较大，分析难度也明显增加。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法。该方法可用于定性检测胆管癌患者石蜡组织切片样本中FGFR1/2/3基因融合的状态，共检测33种融合形式。上述方法基于扩增子靶向捕获高通量测序可以同时检测多种常见的FGFR1/2/3融合基因，仅需要少量RNA逆转录成cDNA作为模板，在单管完成文库的构建，操作简单方便，仅需3.5个小时完成文库构建，平均每个检测成本大大缩减。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，包括如下步骤：
1.根据文献和相关临床试验数据，明确常见的FGFR1/2/3融合基因类型，并通过相关数据库获得FGFR1/2/3融合基因序列，设计多对特异修饰性简并引物。引物设计要充分考虑到超多重PCR反应中，引物间的交联导致的非特异性，以及每对引物扩增效率不同导致的均一性差别，因此引物设计与常规的PCR反应的引物完全不同，难度加大。
本发明设计的胆管癌FGFR1/2/3融合基因检测引物序列SEQ ID NO.1-67如表1所示。
表1 FGFR1/2/3融合基因检测引物
Figure BDA0002711999670000021
Figure BDA0002711999670000031
Figure BDA0002711999670000041
表1中HMBS-F、HMBS-R、TBP-F、TBP-R、JUN-F、JUN-R、LRP1-F、LRP1-R、MRPL13-F、MRPL13-R为五个内控基因HMBS、TBP、JUN、LRP1、MRPL13对应的引物。
2.待测样品处理和模板提取
样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片等标本。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用美基公司石蜡包埋RNA提取试剂盒提取样本RNA并逆转录成cDNA，具体步骤按试剂盒操作说明。
3.超多重PCR反应体系的配制及PCR扩增
配制多重PCR扩增连接基因序列的反应体系，不仅要考虑到扩增反应的扩增效率，同时要考虑每对引物的扩增效率和特异性扩增。
(1)每人份FGFR富集反应引物MIX按照表2进行配制。
表2 FGFR富集反应引物MIX
Figure BDA0002711999670000042
Figure BDA0002711999670000051
(2)每人份DNA富集反应体系配方如表3所示。
表3 DNA富集反应体系的配方
Figure BDA0002711999670000052
Figure BDA0002711999670000061
其中Ion-BCXX-F和Ion-BCXX-R表示不对称连接探针组，包括Ion-BC1-F、Ion-BC1-R、Ion-BC2-F、Ion-BC2-R、Ion-BC3-F、Ion-BC3-R、Ion-BC4-F、Ion-BC4-R、Ion-BC5-F、Ion-BC5-R、Ion-BC6-F、Ion-BC6-R、Ion-BC7-F、Ion-BC7-R、Ion-BC8-F和Ion-BC8-R，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列，每种探针的浓度都是50μM，C-Primer为不与人类基因组形成互补的通用引物。
(3)步骤(2)中配制的反应体系按照表4所示的扩增程序进行PCR扩增。
表4 PCR扩增程序
Figure BDA0002711999670000062
4.将上述扩增产物通过磁珠纯化、毛细管电泳，获得扩增片段主要产物大小为280bp即得到样本的文库，将文库用于下一步高通量测序仪器进行检测，得到目标序列信息，通过与融合基因断裂点附近序列进行比对，即可知基因融合状态。
上述检测基于高通量测序平台检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法不包括对待测样品处理和模板提取步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品的片段化的RNA依然具有与新鲜组织样品RNA同样的扩增和检测能力。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在特异修饰性引物和环介链接扩增技术的基础上，建立了多重链接扩增PCR同时检测33种胆管癌FGFR1/2/3融合基因，此方法具有如下优点：(1)本发明的单管高通量测序文库的构建方法针对多个靶序列进行单管扩增，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要3小时，手动时间仅仅需要30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的满足目前临床上对于多种融合基因同时检测的需求，且成本低廉；
(2)本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台。
附图说明
图1为实施例1中核酸文库片段大小数据图。
图2为实施例1中多重PCR扩增检测FGFR1/2/3融合基因下机数据统计图。
图3为实施例1中多重PCR扩增检测FGFR1/2/3融合基因扩增子统计结果图。
具体实施方式
以下实施例中使用的MgCl2，dNTP购自中国大连宝生物公司。RingCap buffer和RingCap-Taq酶由厦门飞朔生物技术有限公司自行生产。
实施例1
本例收集临床胆管癌样本100例，按照本发明方法进行FGFR1/2/3融合基因的检测。本实施例中入组100例临床胆管癌癌样本均来自医院的捐赠，经病理诊断为胆管癌，样本经过石蜡包埋后切取5片5～8μm切片作为检测样本。
利用上述方法包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取质控：
蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用美基公司石蜡包埋RNA提取试剂盒提取基因组RNA，具体步骤按试剂盒操作说明。所提RNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，并逆转录成cDNA作为PCR扩增的模板。
(2)多重PCR扩增反应体系及PCR扩增
其中DNA富集反应引物MIX是上述表1中所有引物及探针序列，合成后稀释至50μM，并按照表2比例进行混合，从中取5μL，多重PCR扩增反应体系如表3所示，按照上述表4设置的扩增程序进行PCR扩增。
(3)文库纯化方法：
第一轮纯化步骤：
①向每个样品反应管25μL产物中分别加入12.5μL(0.5x样本体积)的AgencourtAMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
②室温孵育5分钟；
③放置在磁力架上面，孵育5分钟，一直到溶液澄清；
④小心地吸取上清液置于新的离心管，不要扰动磁珠；注意：上清液中含有扩增文库不要丢弃。
第二轮纯化步骤：
①向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x样本体积)的Agencourt AMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
②室温孵育5分钟；
③放置在磁力架上面，孵育3分钟，一直到溶液澄清，小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；注意：磁珠上含有扩增文库不要丢弃。
④加入150μl新鲜配制的70％乙醇，没过磁珠样品即可，离心管正反方向移动5次，然后磁力架上孵育2分钟，去除上清液；
⑤重复上述步骤4，进行第二次洗涤；
⑥确保乙醇液滴已全部从孔中吸走，将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。
⑦将样品管从磁力架上拿开，在每孔中加入25μLTE(PH8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀，快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；注意：上清液含有扩增文库不要丢弃。
⑧将样品管置于磁力架上2分钟。取出20μL上清，即为扩增文库。扩增的文库进行毛细管电泳，结果如图1所示，文库的主峰片段大小260-280bp符合预期，无明显的非特异片段。
(4)上机检测：上述获得的文库结合仪器配套试剂耗材，通过采用ion torrentPGM测序仪操作说明上进行上机测序。图2所示为4份样本的下机数据统计，4份样本的ontarget值均90％以上，测序所得的reads90％以上为目的序列，说明体系的捕获目的片段的特异性高。表5为一份阳性样本S039测序数据比对分析后的扩增子统计表，表中显示除了上述5个内控基因有双向读通reads外(fwd_e2e和rev_e2e)，FGFR2-AFF3.F17A8扩增子也对比到双向读通的reads，说明该样本为FGFR2-AFF3.F17A8融合阳性。
表5.本发明多重PCR扩增检测FGFR1/2/3融合基因阳性样本扩增子统计表
Figure BDA0002711999670000081
Figure BDA0002711999670000091
图3所示为一份阴性样本的FGFR1/2/3融合基因扩增子统计结果图，柱状图中每个柱代表一个扩增子，而深色柱表示有比对比读通reads数，该样本只有5个内控基因有读通的reads，没有融合基因对应的扩增子有读通的reads，所以结果判读为阴性。
对于100个胆管癌临床样本，检测到9份FGFR1/2/3融合阳性样本，具体结果如表6所示。
表6高通量测序FGFR1/2/3融合基因检测结果
Figure BDA0002711999670000092
Figure BDA0002711999670000101
实施例2
本实施例在于检验本发明方法的灵敏度和特异性，通过基因工程技术合成8个融合基因阳性质粒，其中融合方式分别如下：FGFR2-BICC1.F17B2；BAG4-FGFR1.B2F6.1；FN1-FGFR1.F22F3；SLC45A3-FGFR2.S1F2；FN1-FGFR1.F27F5；BAG4-FGFR1.B1F8.1；FGFR3-TACC3.F17T10；FGFR2-OFD1.F17O3；分别编号P1-P8，酶切线性化，数字PCR定量之后梯度稀释后作为检测模板，考察检测灵敏度。同时，检测10份野生型样本，检验方法的特异性。按照本发明方法完成文库构建，并上机测序，具体过程如下：
(1)样品处理
收集临床癌旁组织10例，经过上述方法提取后，逆转录成cDNA，分别命名为WT1～10，同时将合成的8个融合基因质粒梯度稀释至103拷贝/μL，102拷贝/μL，101拷贝/μL，100拷贝/μL，共计32个质粒样本和10份野生型DNA。
(2)多重PCR扩增反应体系及PCR扩增
其中DNA富集反应引物是上述表1中所有引物序列，合成后稀释至50μM，并按照表2比例进行混合，从中取5μL，后按照实施例1中表3进行扩增体系配制以及表4进行PCR扩增。
(3)文库纯化方法
第一轮纯化步骤：
①向每个样品反应管25μL产物中分别加入12.5μL(0.5x样本体积)的AgencourtAMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
②室温孵育5分钟；
③放置在磁力架上面，孵育5分钟，一直到溶液澄清；
④小心地吸取上清液置于新的离心管，不要扰动磁珠；注意：上清液中含有扩增文库不要丢弃。
第二轮纯化步骤：
①向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x样本体积)的Agencourt AMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
②室温孵育5分钟；
③放置在磁力架上面，孵育3分钟，一直到溶液澄清，小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；注意：磁珠上含有扩增文库不要丢弃。
④加入150μl新鲜配制的70％乙醇，没过磁珠样品即可，离心管正反方向移动5次，然后磁力架上孵育2分钟，去除上清液；
⑤重复上述步骤4，进行第二次洗涤；
⑥确保乙醇液滴已全部从孔中吸走，将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。
⑦将样品管从磁力架上拿开，在每孔中加入25μLTE(PH8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀，快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；注意：上清液含有扩增文库不要丢弃。
⑧将样品管置于磁力架上2分钟。上清液中含有扩增文库，取出20μL上清。
(4)上机检测：上述获得的文库结合仪器配套试剂耗材，通过采用iontorrent测PGM序仪操作说明上进行上机测序。
上述42个样本检测结果如表7所示，其中WT1～10代表10份野生型DNA，P1-8代表8个融合基因阳性质粒。
表7 42份样本检测结果
样本名称 检测结果 样本名称 检测结果 样本名称 检测结果
WT1 阴性 P1-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性 P5-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性
WT2 阴性 P1-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性 P5-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性
WT3 阴性 P1-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性 P5-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性
WT4 阴性 P1-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性 P5-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性
WT5 阴性 P2-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性 P6-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性
WT6 阴性 P2-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性 P6-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性
WT7 阴性 P2-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性 P6-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性
WT8 阴性 P2-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性 P6-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性
WT9 阴性 P3-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性 P7-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性
WT10 阴性 P3-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性 P7-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性
P3-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性 P7-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性
P3-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性 P7-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性
P4-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性 P8-10<sup>3</sup>拷贝/μl 阳性
P4-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性 P8-10<sup>2</sup>拷贝/μl 阳性
P4-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性 P8-10<sup>1</sup>拷贝/μl 阳性
P4-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性 P8-10<sup>0</sup>拷贝/μl 阴性
由上表可知，10份野生型样本没有检测出FGFR1/2/3基因融合，对于101拷贝/μl以上的融合基因阳性质粒均能被检测出为阳性，说明本发明方法有较高的特异性和检测灵敏度，使用8个梯度稀释的融合基因阳性质粒验证检测灵敏度可以达到101拷贝/μl。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 厦门飞朔生物技术有限公司
<120> 一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法
<130> 2020.09.09
<141> 2020-09-30
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttttttaggc gatggctact atccc 25
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttttttccca agtacatatc ctgtaagacc agaat 35
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttttttgtgc agcagtggag cca 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ttttttgctt gagcagcagc tga 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ttttttctcc cagagaccaa cgttc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ttttttgacc gtgtccttac cgtga 25
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ttttttggaa agagatgcgc caattgtaa 29
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ttttttggca aaccctgaca ctggag 26
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tttttttcaa tttctccttc agacaatgca 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ttttttatgg cagagaggaa agtccctta 29
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ttttttattt cagtttgctg aagtcaagga gg 32
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ttttttccga ttgcagctca tgct 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ttttttctgg ctccgggtga cag 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tttttttctg gcggagcaga tgag 24
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ttttttcaat ggttactagt ttagaagaat ccctg 35
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
ttttttccag tgggagggtc ttataatct 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
ttttttatgt aggcttttgt ttcgtttgtg 30
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
ttttttaatt tggttggttc cactttgc 28
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
ttttttgatc ttcggccagt tttggt 26
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
tttttttgag ttgagtagat gttacaagca ga 32
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
tttttttggc caagcaatct gcgta 25
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
ttttttgtct ggcttagcat ccactgaa 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
ttttttcctc ttcatccaca accccaaa 28
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
tttttttgct cctccaggtc tgtgatt 27
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
ttttttagaa gaaccccaga gttcatggat 30
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
ttttttgtga gctcgatcct ccttttc 27
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
ttttttgacc aggaaggact ccacttc 27
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
ttttttgagt catcatcatc atcatcatcc tcc 33
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ttttttccgg cactgcatgc aat 23
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
ttttttgagt ccattatgat gctccaggtg 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
ttttttctct ttgtcggtgg tattaactcc 30
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ttttttcctc cgcgacctgt gtt 23
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
ttttttccat gtggacgtta atcccatc 28
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
ttttttctca atacagggtg catcaactca 30
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
ttttttatag gtccggtgga caggg 25
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
ttttttacct gctcctcagc tcc 23
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
tttttttgat ccttgccagg taatcct 27
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
ttttttggcg atctcctcgt ttgc 24
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
ttttttctgg acagcttgtg ggaag 25
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
ttttttctgc ttcctcaagg ccga 24
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
ttttttgcac cctgaggaat gcatgtat 28
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
ttttttgcct caggaaggcc ctttca 26
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
ttttttgcgc aagggtttct ggtttg 26
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 44
ttttttccag tgccataagg catcattgg 29
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 45
ttttttggtt gactggtagc agataagtgt tg 32
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 46
ttttttacta tactgccgac ctggctg 27
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 47
tttttttcac ctccaagaca gtgcttt 27
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 48
tttttttcag ctcaggacct tcatacacaa 30
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 49
ttttttctgc ttgggtgtta gcgttt 26
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 50
ttttttccat attctagcaa aagtggccca ttg 33
<210> 51
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 51
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagctaagg 60
taacgatcgg aaaaa 75
<210> 52
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 52
atcaccgacg caagcctcag tagcgactaa ggtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 53
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 53
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagttacaa 60
cctcgatcgg aaaaa 75
<210> 54
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 54
atcaccgacg caagcctcag tagcgattac agtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 55
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 55
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagcctgcc 60
attcgcgatc ggaaaaa 77
<210> 56
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 56
atcaccgacg caagcctcag tagcgacctg cgtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 57
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 57
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagtggagg 60
acggacgatc ggaaaaa 77
<210> 58
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 58
atcaccgacg caagcctcag tagcgatgga ggtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 59
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 59
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagtgagcg 60
gaacgatcgg aaaaa 75
<210> 60
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 60
atcaccgacg caagcctcag tagcgatgag cgtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 61
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 61
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagccttag 60
agttcgatcg gaaaaa 76
<210> 62
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 62
atcaccgacg caagcctcag tagcgacctt agtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 63
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 63
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagtcctcg 60
aatcgatcgg aaaaa 75
<210> 64
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 64
atcaccgacg caagcctcag tagcgatcct cgtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 65
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 65
tccgatcgca agcctcagta gcgaccatct catccctgcg tgtctccgac tcagaacctc 60
attcgatcgg aaaaa 75
<210> 66
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 66
atcaccgacg caagcctcag tagcgaaacc tgtctcagcc tctctatggg cagtcggtga 60
taaaaa 66
<210> 67
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 67
tcgctactga ggcttgc 17

Claims (8)

1.一种基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，该文库构建方法使用的引物及探针序列如SEQ ID NO.1-67所示；
所述文库构建方法，包括以下步骤：
(1)使用引物及探针序列SEQ ID NO.1-67对待测样本进行多重PCR扩增获得文库；
(2)文库的纯化。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中样本为手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病例组织、石蜡切片中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增程序如下表所示
Figure FDA0003055176400000011
4.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增反应体系如下表所示
序号 物料 物料浓度 用量(μL) 1 RingCapbuffer 10× 2.5 2 MgCl<sub>2</sub> 25mM 4 3 dNTPs 5μM 2 4 FGFR富集反应引物MIX 50μM 4 5 H<sub>2</sub>O 纯化水 6.4 6 RingCap-Taq酶 5U/ul 0.5 7 Ion-BCXX-F 50μM 0.2 8 Ion-BCXX-R 50μM 0.2 9 C-Primer 50μM 0.2 10 cDNA - 5 总体积 25
。
5.根据权利要求4所述的基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，所述FGFR富集反应引物MIX按照下表配制
Figure FDA0003055176400000021
Figure FDA0003055176400000031
6.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中文库进行两次纯化。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于高通量测序检测胆管癌FGFR1/2/3融合基因的文库构建方法，其特征在于，所述方法鉴定的FGFR1/2/3基因的融合形式如下：
FGFR2-AFF3.F17A8；FGFR2-AHCYL1.F17A2；FGFR2-AHCYL1.F17A5；
FGFR2-BICC1.F17B2；FGFR2-CASP7.F17C2；FGFR2-CCAR2.F17C4；
FGFR2-CIT.F17C23；BCR-FGFR1.B4F10；CUX1-FGFR1.C11F10；
LRRFIP1-FGFR1.L8F10；RANBP2-FGFR1.R20F10int9.1；SQSTM1-FGFR1.S6F10；
TPR-FGFR1.T22F10；TRIM24-FGFR1.T11F10；BAG4-FGFR1.B1F2；
FN1-FGFR1.F22F3；FN1-FGFR1.F23F3；FN1-FGFR1.F22F4；FN1-FGFR1.F23F4；
FN1-FGFR1.F25F4；FN1-FGFR1.F27F5；WHSC1L1-FGFR1.W14F5；
BAG4-FGFR1.B2F6；BAG4-FGFR1.B1F8；SLC45A3-FGFR2.S1F1；
SLC45A3-FGFR2.S1F2；FGFR2-OFD1.F17O3；FGFR3-TACC3.F17T10；
FGFR3-TACC3.F17T11；FGFR3-TACC3.F17T14；FGFR3-TACC3.F17T14；
FGFR3-TACC3.F17T6；FGFR3-TACC3.F17T8。
8.一种采用权利要求1-6中任一项所述的文库构建方法所构建的文库。
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