CN110484627B - 用于监控a/j近交系小鼠遗传质量的方法、引物组及其应用 - Google Patents

用于监控a/j近交系小鼠遗传质量的方法、引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的方法、引物组及其应用，其包括检测待测小鼠的特异性SNP位点的基因型，以快速高效地从相关近交品系中快速鉴定出A/J品系，从而快速高效地将A/J品系与其他品系的遗传信息有效区分，实现遗传质量监控中杂交品系溯源的检测需求，该方法具有能够采用低成本监控A/J近交系小鼠遗传质量的优点。

Description

用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的方法、引物组及其应用
技术领域
本发明属于近交系小鼠品系遗传背景鉴定与遗传污染检测领域，涉及一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，尤其涉及一种基于KASP法进行A/J近交系小鼠遗传质量监控的检测方法及SNP位点和其引物。
背景技术
实验动物质量控制是实验动物行业健康发展的核心问题，小鼠微生物质量控制及遗传背景质量控制是其中的重要控制因素。国内的遗传质量监控缺少成熟的行业标准，建立一种快速且精准性高的高通量基因分型技术平台至关重要。
用于遗传背景质量控制检测方法主要有3种：生化标记分析法、微卫星DNA、SNP(单核苷酸的多态性)检测等。目前国际所规定的遗传检测方法是生化标记分析法，这一方法是检测同工酶或异构蛋白酶的变化来推测相应的基因变化；使用此方法进行检测，存在准确度低、灵敏度低、检测位点有限、反映遗传概貌有限等弊端。而分子遗传标记可以对实验动物进行更精细的监管，是一种更完善的实验动物质量检测手段；其中SNP检测作为分子遗传标记的一门技术，在基因组水平上检测由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性；SNP所表现的多态性可以监测到单个碱基的变异，具有密度高、代表性、遗传稳定性等特点，能够全面地反映基因组的遗传及变异情况。
KASP法是指竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)，以高灵敏度的荧光检测为基础，对目标SNPs进行精准的双等位基因分型。与传统Taqman技术不同的是，此种方法无需对靶点即特异性引物/探针进行标记，不需要根据每个SNP位点合成特异的荧光引物，其独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了实验成本。优化的PCR体系可满足不同位点高通量反应的需求，既有金标准的准确，又降低了使用成本，比Taqman具有更好的位点适应性。KASP技术将传统检测等位基因的2个反应合成了1个反应，成本低。SNPs检测不但弥补了传统PCR、切胶、测序流程时间长的缺点，而且大大节省了测序的费用。
本发明设计一套针对特定近交系A/J近交系小鼠品系的基因组SNP监控位点组合及其监控方法，从而实现高效检测实验动物的遗传稳定性及实验稳定性的方法。
发明内容
本发明提供一种用于监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量的方法，其能够快速高效地从相关近交品系中快速鉴定出A/J近交系品系，从而快速高效地将A/J近交系品系与其他品系的遗传信息有效区分，实现遗传质量监控中杂交品系溯源的检测需求，该方法具有能够采用低成本监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量的优点。
本发明还提供一种用于监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量的引物组，该引物组能够有效扩增用于监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量的特异性SNP位点，以达到快速鉴定A/J近交系小鼠及其相关品系的检测目的。
本发明还提供一种用于监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量的试剂盒，其能够快速鉴定A/J近交系小鼠及其相关品系。
本发明还提供上述引物组或试剂盒在监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量中的应用。
本发明是这样实现的：
分子遗传标记可以对实验动物进行精细监管，是一种完善的实验动物质量检测手段，其中，SNP检测作为分子遗传标记的一门技术，在基因组水平检测由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
本发明实施例提供了一种用于监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量的方法，其包括检测待测小鼠如下SNP位点(A/J近交系特异SNP)的基因型：
7 SNP位点(本品系特异)
Figure BDA0002148532510000021
如果待测小鼠在上述SNP位点的基因型如A/J基因型所示，则待测小鼠为A/J品系。
优选地，在本发明的一些实施例中，上述用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的方法检测如下SNP位点的基因型：
96 SNP位点
Figure BDA0002148532510000031
Figure BDA0002148532510000041
Figure BDA0002148532510000051
如果待测小鼠在上述SNP位点的基因型如表中所列A/J近交系的基因型所示，则待测小鼠为A/J近交系品系；如果待测小鼠的如上SNP位点的基因型如上表所示的其他品系基因型一致，则待测小鼠为对应品系。
进一步地，本发明实施例提供一种监控A/J近交系小鼠遗传质量的引物组，其包括引物组合1～引物组合96。引物组合1～引物组合96分别用于检测表2所列SNP位点的基因型。
具体地，每组引物组合用于KASP(KompetitiveAllele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)法检测待测样品的SNP位点。每组引物组合均包括3条引物序列，两条正向引物以及一条反向引物。
优选地，引物组合1包括SEQ ID No.1～3所示的引物；引物组合2包括SEQ ID No.4～6所示的引物；以此类推。
进一步地，本发明实施例还提供上述引物组在监控A/J近交系小鼠遗传质量中的应用。
在本发明实施例中，该应用包括：采用KASP法用引物组对待侧样品进行PCR扩增。
具体地，KASP法的反应体系为：待测小鼠5～15ng/μL DNA0.8μL、2×KASP MasterMix 0.778μL、KASPPrimer mix 0.022μL。其中，KASP Primer mix为上述引物组合1～引物组合96中的任意一种引物组合。
KASP法是指竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitice Allele Specific PCR)以高灵敏度的荧光检测为基础，对目标SNPs进行精准的双等位基因分型。与传统Taqman技术不同的是，此种方法无需对靶点即特异性引物/探针进行标记，不需要根据每个SNP位点合成特意的荧光引物，其独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增。
在监控A/J近交系小鼠的遗传质量的时候，每一次都通过高通量基因组测序，会耗费大量的成本和人力，不利于长期实施。而本实施例提供以梯度性检测(指对1条染色体上的SNP位点进行等间距检测)SNP位点的方式实现A/J体系的检测，以最低成本的方式实现检测目的，且操作者可以根据实际不同的需要，选择性地根据本发明提供的SNP位点对待测小鼠的品系进行基因型的确认，以能够低成本的方式快速精准地达到检测结果。
具体地，KASP的反应程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s，61℃～55℃复性(第一次退火)60s，10个循环；94℃预变性15min，55℃复性(第二次退火)60s，26～32个循环；或：94℃预变性15min，94℃变性20s，61℃～55℃复性(第一次退火)60s，10个循环；94℃预变性15min，68℃～62℃复性(第二次退火)60s，26～32个循环。
本发明实施例提供的优化后的检测条件，能有效匹配本发明实施例提供的SNP位点组合，以提高检测效果和更高的分型成功率，避免或减少出现分型失败或无扩展等问题。
本发明具有以下积极效果：
1、本发明提供了一种用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的方法，该方法使用了A/J近交系特异性的SNP位点组合、多背景检测组合以及通用SNP组合，通过检测目标SNP位点的基因型，快速高效地从相关近交品系中快速鉴定出A/J品系，从而快速高效地将A/J品系与其他品系的遗传信息有效区分，实现遗传质量监控中杂交品系溯源的检测需求，该方法具有能够采用低成本监控A/J近交系小鼠遗传质量的优点。
2、提供一种了用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的引物组以及用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的试剂盒，该引物组是发明人付出创造性劳动进行优化和筛选获得的，其能够有效扩增用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的特异性SNP位点，快速鉴定A/J小鼠及其相关品系。该引物组在检测时特异性达到100％，灵敏度可以达到0.005ng基因组DNA/反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明测试例1提供的SNP位点rs3697980条件优化前的检测结果。
图2为本发明测试例1提供的SNP位点rs3697980条件优化后的检测结果。
图3为本发明测试例2提供的SNP位点rs3711196条件优化前的检测结果。
图4为本发明测试例2提供的SNP位点rs3711196条件优化后的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：SNPpanel设计
1、确定SNPpanel中包含的近交品系
A/J中选取A/J-2作为代表，最终确定8个近交系来建立A/J近交品系的SNP检测panel(如表1)。在后续实验中A/J品系SNPpanel可用于常规SNP检测，用于与C57BL/6、129S1/SvImJ、BALB/CJ、CBA/CAJ、DBA/1J、FVB/NJ、NOD/LTJ品系的区分，同时，可以用于C57BL/6N、C57BL/10J、C57BLKS/J、B6(Cg)-Tyrc-2J品系及相关突变品系的常规遗传质量监控。
表1 SNP检测panel近交系列表
序号 品系名称
1 CBA/CaJNju
2 C57BL/6JNju
3 A/Jnju
4 BALB/cJNju
5 FVB/NJNju
6 DBA/1JNju
7 NOD/ShiLtJNju
8 129S1/SvImJNju
2、筛选A/J近交系与其它品系间特异性区分的位点
a)筛选目的：用于品系污染检测。
b)设计原则：以染色体为单位，SNP panel中应包括至少5对含特异性区分位点的染色体，且每对染色体应含有2个以上特异性区分位点，则认为特异性区分panel可将品系小鼠与其它近交系进行区分。可特异性区分位点：在某一品系中，位点与其它品系位点均不相同。如果一个SNP检测位点不能够完全与其它品系进行区分，检测后若出现突变，则不能确定是遗传漂变还是品系污染。
遗传质量监控的频率为1年/次，若出现污染，则最长污染周期应为1年，污染小鼠代数最长为4代。第四代小鼠出现染色体污染的概率最低为5条(按照F1代与其它品系配繁，后续小鼠全部与纯背景品系进行回交计算。则F2代污染染色体为全部，F3污染染色体为10条，F4污染染色体条数为5条)。
以此概率进行计算，若5条以上染色体含有特异性位点，则panel能够将品系小鼠与其它近交系进行区分。每条染色体上含有2个以上位点则认为检测结果具有参考性。
c)筛选结果：A/J近交系小鼠共筛选出7个与其他品系可特异性区分位点(即表2)。该panel用于A/J品系的SNP检测，A/J的特异性区分位点panel可用于与BALB/c、129S1/SvImJ、BALB/CJ、CBA/CAJ、DBA/1J、FVB/NJ、NOD/LTJ品系的区分。
表2 7个特异性SNP位点
Figure BDA0002148532510000081
品系特异性区分位点使用编程的方式进行筛选，筛选原则为同一品系中，筛选与其它品系均不相同的位点。筛选出的位点根据在染色体上等间距的原则进行人工二次筛选(每条染色体上位点数为4-5个，特异性位点数应不少于2个)，确定每个品系的特异性区分panel。
3、筛选A/J品系常规遗传质量监控的位点
a)筛选目的：用于A/J品系常规遗传质量监控。
b)设计原则：品系特异性位点通常数量过少，不够用于常规遗传质量监控。在确定上述特异性区分位点panel的基础上，我们将每个品系检测panel SNP数量补足为96个，其作用如下：既可以保证SNP检测结果可靠性，又方便鉴定操作。
在特异性位点的基础上，按照每条染色体上4-5个等间距位点原则进行常规位点的补足；同时，优先选取在多种品系panel中多适用性的位点。
c)筛选结果：共筛选出包含96个位点的A/J品系遗传质量监控SNP检测panel(表3)。
表3
Figure BDA0002148532510000091
Figure BDA0002148532510000101
Figure BDA0002148532510000111
实施例2：A/J SNP位点引物设计
SNP位点筛选完成后，SNP位点上下游序列各100bp序列使用编程工具在小鼠基因组序列中进行拉取；5’端引物设计：在SNP位点的上游分别设计20-30bp的引物，在引物的末端分别为SNP的两个突变碱基，引物5’端增加一段约20bp的分别识别不同信号的序列，如FAM及HEX信号；3’设计下游引物，长度约18-28bp。Tm(℃)在55-65℃之间，GC％在34％-60％之间。将3条引物同时进行PCR扩增，若体系中产生其中一个信号，则说明样品模板中含有该碱基突变类型。
所设计的引物不仅满足高特异性，同时还要满足高灵敏度。为此，发明人进行大量的试验调整，获得如下引物列表。优化后的引物拥有最优Tm及更合适的PCR反应体系，有更好的检测效果与更高的分型成功率；相反，未经优化设计的相邻位点，引物出现了分型失败或无扩增等问题。对比显示，优化后的引物比对照引物信号更强、更特异，具有显著优势。引物序列见表4。
表4
Figure BDA0002148532510000121
Figure BDA0002148532510000131
Figure BDA0002148532510000141
Figure BDA0002148532510000151
Figure BDA0002148532510000161
Figure BDA0002148532510000171
Figure BDA0002148532510000181
Figure BDA0002148532510000191
Figure BDA0002148532510000201
Figure BDA0002148532510000211
Figure BDA0002148532510000221
Figure BDA0002148532510000231
Figure BDA0002148532510000241
Figure BDA0002148532510000251
Figure BDA0002148532510000252
Figure BDA0002148532510000261
Figure BDA0002148532510000271
Figure BDA0002148532510000281
Figure BDA0002148532510000291
Figure BDA0002148532510000301
Figure BDA0002148532510000311
Figure BDA0002148532510000321
Figure BDA0002148532510000331
Figure BDA0002148532510000341
Figure BDA0002148532510000351
Figure BDA0002148532510000361
Figure BDA0002148532510000371
Figure BDA0002148532510000381
具体地，采用KASP法用引物组对待侧样品进行PCR扩增。KASP法的反应体系为：待测小鼠25ng/μLDNA0.8μL、2×KASP Master Mix 0.778μL、KASP Primer mix 0.022μL。其中，KASP Primer mix为上述引物组合1～引物组合96中的任意组合。
使用IntelliQube荧光检测进行读数，使用IntelliScore进行PCR后的数据分析，自动导出基因型进行分析。
在特异性试验中，所有的SNP位点扩增引物均能准确指示出SNP位点的分型。在灵敏度试验中，用灭菌去离子水将提取的小鼠基因组DNA(初始浓度为10ng/μL)10倍梯度稀释成6个系列梯度，稀释后浓度分别为10g/μL至0.0001ng/μL，取5μL作为模板进行灵敏度检测。结果显示，0.001ng/μL浓度以上均获得强的荧光信号，故最低检测限是0.005ng DNA/反应。
实施例3
使用实施例2提供的方法对A/J近交系小鼠分型测试。
采用实施例2提供的方法对A/J小鼠进行分型，使用IntelliQube荧光检测进行读数，使用IntelliScore进行PCR后的数据分析，自动导出基因型进行分析。
对A/J小鼠进行SNP分型鉴定：以DBA/1J作为对照品系，对A/J进行96个位点的引物测试，及小鼠的基因分型；结果详见下表5。
表5
Figure BDA0002148532510000391
Figure BDA0002148532510000401
Figure BDA0002148532510000411
实施案例：
检测步骤及方法均一致，不同的是样本DNA不同。选取1个品系，与A/J遗传背景相似的A/J的近交系小鼠进行SNP位点检测，查看小鼠遗传质量情况，结果显示A/J近交系小鼠位点与NCBI数据库均一致，具体见下表6。
表6
Figure BDA0002148532510000412
Figure BDA0002148532510000413
Figure BDA0002148532510000421
Figure BDA0002148532510000431
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
引物测试条件优化实施例(两例)：
1.测试例rs3697980:
使用SNP位点rs3697980，检测A/J近交系，已知基因型的A/J为阳性对照，已知基因型的DBA/1J为阴性对照,比较该SNP位点优化前后实验结果。
两组测试均使用同一组针对该位点的SNP检测引物
本位点测试条件优化：测试温度从55-61℃温度区间调整为优化后的62-68℃温度区间。效果如下：
未优化时，温度区间55-61℃，测试结果不能分辨待测样本在该位点基因型归属(图1)。
优化后，温度区间调整为62-68℃，测试结果有显著改善，能明确分离阴性对照(黑色样品点，信号均小于0.10)，Hex阳性纯合(X:小于0.10，Y:大于0.35)，Fam阳性纯合(X:大于0.35，Y:小于0.10)；结果符合仪器的信号检出限为>0.15的要求。在此测试条件下，来自前述两近交系杂合小鼠的多个样品(已知样本)，在这一SNP位点(rs3697980)可被鉴定出杂合遗传背景(图2)。结论：优化后，该引物及测试条件可以满足这一检测位点的测试要求。
2.测试例rs3711196：
使用通用性SNP位点：位点rs3711196，检测DBA/1J与A/J杂合小鼠样品，通过对该位点的检测，比较该SNP位点优化前后测试结果：
位点测试条件优化如下：测试温度从55-61℃温度区间调整为优化后的62-68℃温度区间，效果如下：
未优化时，温度区间55-61℃，Hex与FAM信号均在检出限以下(<0.15),测试结果不能分辨待测样本在该位点基因型归属(图3)。
优化后，温度区间调整为62-68℃，测试结果有显著改善，能明确分离阴性对照(X:小于0.10，Y:小于0.10)，Hex阳性纯合(X:小于0.15，Y:大于0.30)，Fam阳性纯合(X:大于0.25，Y:小于0.15)；结果符合仪器的信号检出限为>0.15的要求。在此测试条件下，来自DBA/1J与A/J两近交系杂合小鼠的多个样品，在这一SNP位点(rs3711196)可被鉴定出杂合遗传背景(图4，样本点群落，坐标:X：0.25,Y：0.30附近)。结论：优化后，该引物及测试条件可以满足这一检测位点的测试要求。

Claims (4)

1.一种用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的方法，其能够快速高效地从相关近交品系中鉴定出A/J品系，从而快速高效地将A/J品系与其他品系的遗传信息有效区分，其特征在于：检测待测小鼠的如下SNP位点的基因型
，
如果待测小鼠在上述SNP位点的基因型如表中所列A/J近交系的基因型所示，则待测小鼠为A/J近交系品系；如果待测小鼠的如上SNP位点的基因型如上表所示的其他品系基因型一致，则待测小鼠为对应品系。
2.一种用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的引物组，其特征在于：包括引物组合1~引物组合96，引物组合1~引物组合96用于检测权利要求1中所述的96个SNP位点的基因型，其中每组引物组合用于KASP法检测待测样品的SNP位点，每组引物组合均包括两条正向引物和一条反向引物，具体引物序列如下表所示
。
3.一种用于监控A/J近交系小鼠遗传质量的试剂盒，其包括权利要求2所述的引物组。
4.权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在监控A/J近交系近交系小鼠遗传质量中的应用，包括：采用KASP法用引物组对待测样品进行PCR扩增。
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