CN108384841B - 一种高通量区分转基因植物纯合体和杂合体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于KASP(竞争性等位基因PCR)技术的高通量区分转基因植物纯合体和杂合体的方法。利用KASP技术结合特定的引物设计策略,通过一个反应即可鉴定植物样品是纯合体、杂合体还是野生型。本方法检测通量远远高于荧光定量PCR和普通PCR，还具有准确率高、成本低、自动化程度高以及易于操作等优点。

Description

一种高通量区分转基因植物纯合体和杂合体的方法

技术领域：

本发明属于基因鉴定领域，具体的涉及一种转基因植物纯合体或杂合体的鉴定方法。

背景技术：

相对于传统育种技术而言，转基因育种技术具有精准和高效的优势。通过遗传转化直接获得的转基因品系，往往由于综合性状不太好，不能够直接应用于生产，需要通过回交的手段，将外源基因导入一个具有优良农艺性状背景的材料中，然后才能获得可用于生产的转基因品系。在回交育种中，需要对转基因植株中外源片段的纯合和杂合情况进行判定。目前主要方法有实时定量PCR、普通PCR以及Southern杂交。

上述检测方法中，普通PCR需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长。Southern杂交的过程更加复杂，而且需要用到放射性元素。荧光定量PCR相对前两者流程简化了很多，CN104195225A公开了一种鉴定转基因水稻纯合体的定量PCR方法，所述定量PCR方法以水稻RBE4基因作为内参基因，以转入水稻基因组的外源基因作为目的基因，分别在相同的反应体系中进行定量PCR反应；并根据比较Ct值2^-△△Ct法计算鉴别纯合体和杂合体。利用荧光定量PCR检测比较方便，但是如果染色体上有多个外源片段插入时，利用荧光定量PCR的方法进行检测，结果的准确度会受到影响。三种方法的自动化程度均不高，单位时间内能检测的样本数量有限，而且手工操作容易导致实验误差和实验污染。依靠上述常规的方法，很难实现对转基因作物进行高通量且低成本的转基因植物纯合体和杂合体的区分。

因此，亟需开发一种高效且费用低廉的区分转基因植物纯合体和杂合体的方法。

发明内容：

竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光(一般是FAM荧光和HEX荧光)检测样品某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位、以及种子资源鉴定的主要技术手段。

本发明中，我们利用KASP技术开发了一种高通量、低成本、精准的鉴定转基因产品纯合体或杂合体的方法，其检测效率是荧光定量PCR的14倍以上，检测的成本也大幅度降低。该方法与Southern杂交和普通PCR相比，除了检测通量大幅度提高之外，检测的流程也大大简化，特别适合对大量样品的筛选。

因此，本发明的第一方面，提供了一种鉴定转基因产品纯合体/杂合体的方法，其步骤包括：(1)DNA提取；(2)引物设计以及合成；(3)进行KASP反应；(4)进行结果判定。

优选的，所述转基因产品为转基因植物。步骤(1)中，从新鲜叶片中提取样品的DNA。

具体的，步骤(2)为：设计两对引物(图1)，第一对的正向引物(F1)和反向引物(R1)分别设计在外源插入片段两侧的植物基因组区域，正向引物(F1)5'端添加了一种荧光标签序列；第二对的正向引物(F2)和反向引物(R2)分别设计在外源插入片段区域以及插入片段侧翼的基因组区域，正向引物(F2)5'端添加另一种荧光标签序列。如果将上述两对引物和不同植物样品DNA进行PCR反应将出现如下结果：(1)野生型植物DNA：利用F1/R1能扩增出目的片段，但利用F2/R2不能扩增出目的片段；(2)转基因杂合体植物DNA：利用F1/R1与F2/R2分别能扩增出相应的目的片段；(3)转基因纯合体植物DNA：利用F2/R2能扩增出目的片段，但利用F2/R2不能扩增出目的片段(虽然F1/R1在染色体上也有对应的位点，但是由于F1与R1之间的插入片段一般长达几kb，在较短的延伸时间下无法扩增出目的片段)。因此，利用上述引物进行KASP反应，得到反应产物将释放出不同的荧光信号，最后能根据荧光信号的种类区分植物样品是转基因纯合体、杂合体还是野生型。

优选的，步骤(2)中的荧光标签序列选自HEX标签序列(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)，及FAM标签序列(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)。

更优选的，第一对的正向引物5'端添加了HEX标签序列(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)，第二对的正向引物5'端添加FAM标签序列(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)(如图1所示)。

具体的，步骤(3)为：将添加了标签序列转化体的引物和内源基因引物、DNA模板以及KASP Master Mix按照一定比例混合构建KASP反应体系(表2)，然后在热循环仪(Hydrocycler)中进行反应。反应条件为：90-95℃预变性10-20分钟；第一步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，退火并延伸30-90秒，5-20个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.1-3.0℃)；第二步扩增反应，90-95℃变性10-30秒，55-60℃退火并延伸30-90秒，20-30个循环。

优选的，第一步扩增反应，退火起始的温度为62-68℃，退火结束的温度55-59℃，退火并延伸30-90秒，经历5-20个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.15-2.6℃)。

表2：反应体系的构建

优选的，KASP反应体系如表3所示的组分构建。

表3：反应体系的构建

反应体系组分	终浓度
		100μMF1	0.17μM
100μMR1	0.42μM
		100μMF2	0.17μM
100μMR2	0.42μM
		2xKASPMasterMix	1x
DNA*	预先加入并烘干
		总体积	3μL

优选的，构建KASP反应体系后，分配到384孔反应板在热循环仪(Hydrocycler)中进行反应。

优选的，热循环仪(Hydrocycler)为LGC SNPLine仪器平台的水浴PCR仪。

优选的，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

具体的，步骤(4)为：反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，由于引物F1具有HEX标签序列，引物F2具有FAM标签序列。不同基因型植物样品的反应产物将具有不同的荧光：(1)野生型植物DNA：F1/R1能扩增出释放HEX荧光目的片段，F2/R2无法扩增；(2)转基因杂合体植物DNA：F1/R1能扩增出释放HEX荧光的目的片段，F2/R2能扩增出释放FAM荧光的目的片段；(3)转基因纯合体植物DNA：F2/R2能扩增出释放FAM荧光的目的片段，F1/R1无法扩增(由于F1与R1之间的插入片段过长，一般长达几kb)。

根据上述原理，如果从某样品的产物中检测出显著的FAM荧光和HEX荧光，则表明该样品是转基因杂合体；如果仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到FAM荧光，则表明该样品是不含转基因片段，可能为野生型；如果检测到显著的FAM荧光但没有检测到HEX荧光，则表明该样品是转基因纯合体；如果没有检测到显著的HEX荧光以及FAM荧光，则需要重新检测(图2)。因此，本发明通过对引物起点位置的设置，可以达到一个反应就能确定待测样品为转基因纯合体、转基因杂合体或野生型

本发明的有益效果为：利用本发明方法能高效率且低成本地鉴定某样品是转基因纯合体还是杂合体。该方法使用通用的荧光探针，不需要合成特异性的探针，跟探针法荧光定量PCR相比,极大地降低了成本；该方法的荧光扫描是在反应终点进行，所以可以先进行大批量样品的PCR扩增，反应结束后再集中进行荧光扫描检测，实现了高通量的检测，其检测效率是荧光定量PCR的14～56倍；反应结束后不需要进行凝胶电泳，反应体系构建已经实现了自动化，这样不仅能省了操作者的时间和人力，而且能有效降低了出错的概率。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为引物设计思路示意图。直线代表植物基因组，箭头线代表外源插入片段，叉形代表无法扩增得到目的片段。

图2为反应产物的荧光扫描结果。横坐标表示产物的释放的FAM荧光数值，纵坐标表示它释放的HEX荧光数值。

图3为利用本发明方法对已知基因型水稻样品的检测结果示意图。图中正方形表示反应孔中没有DNA模板(NTC)，三角形表示模板是mfb-MH86杂合体DNA，圆形表示模板是非转基因水稻DNA，菱形表示模板是mfb-MH86纯合体DNA；

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1利用本发明方法对已知基因型的水稻样品进行高通量的检测

利用本发明方法进行检测时，反应体系中加入了两对引物，如何保证两对引物之间没有互相干扰是本应用的一个难点。另外利用本发明方法对大批量的样品进行高通量检测时，检测结果的准确性和可靠性是另外一个难点。为了测试本发明方法中引物的效果以及利用本发明方法进行高通量检测的准确性，对已知基因型的转基因水稻样品进行纯合体和杂合体的检测，然后将检测的结果和样品本身的基因型信息进行比较。

mfb-MH86是抗虫转基因水稻。利用本发明方法对mfb-MH86纯合体、mfb-MH86杂合体、非转基因水稻的DNA进行检测，然后对比检测结果是否与样品本身的基因型是否一致。实验的具体步骤如下：

1.DNA模板的准备：分别准备mfb-MH86纯合体、mfb-MH86杂合体以及非转基因水稻的DNA。利用CTAB提取方法分别从mfb-MH86纯合体和非转基因水稻提取出DNA，将mfb-MH86纯合体和非转基因水稻的DNA以等摩尔数混合从而得到模拟的mfb-MH86杂合体DNA。

2.引物的设计以及合成：针对转基因水稻外源片段的插入位点分别设计了两对引物(图1)，第一对引物的正向引物F1和反向引物R1分别设计在外源插入片段两侧的水稻基因组区域,正向引物F1的5'端添加HEX标签序列(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)。第二对引物的正向引物F2设计在外源插入片段内部，反向引物R2设计在外源插入片段侧翼的水稻基因组区域，正向引物F2的5'端添加FAM标签序列(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)。引物序列的具体序列如表4所示。

表4：引物序列(合成引物时需要在正向引物F1和F2的5'端添加标签序列)

转化体名称	引物名称	SEQ ID NO.	引物序列(5'-->3')
				mfb-MH86	F1	1	CAGAAGGGATTATGACCCTATACAC
mfb-MH86	R1	2	TGTCGGAGATCATCGAGTTGTA
				mfb-MH86	F2	3	ATGCTTCTCCTCTAGTATCTCCCG
mfb-MH86	R2	4	GACCTGTCGGAGATCATCGAGT

3.反应体系的构建：将添加了标签序列引物、DNA模板以及KASP反应液(表5)构建反应体系加入384孔PCR反应板。每个反应的DNA模板量为30ng。加样完成之后，反应板需要封膜和离心。

表5：反应体系的构建

反应体系组分	终浓度
		100μMF1	0.17μM
100μMR1	0.42μM
		100μMF2	0.17μM
100μMR2	0.42μM
		2xKASPMasterMix	1x
DNA	预先加入并烘干
		总体积	3μL

4.反应的进行：将加样完毕的反应板进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

5.结果分析：反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，扫描的结果会以散点图的形式出现，根据散点图判断该样品的基因型：图形的横坐标表示产物释放的FAM荧光，纵坐标表示产物释放的HEX荧光。如果能检测出显著的FAM荧光和HEX荧光，则表明样品是mfb-MH86转基因杂合体；如果仅检测到显著的FAM荧光但没有检测到显著的HEX荧光，则表明样品是mfb-MH86转基因纯合体；如果仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到FAM荧光，则表明样品是野生型；如果HEX荧光和FAM荧光都没有检测到，则需要重新检测(图3)。

6.结果比较：将样品的检测结果与样品的基因型信息进行比较(表6)，一共检测了352个样品，其中351个样品的检测结果与样品本身的基因型信息一致，只有一个样品的检测结果无法判断，检测结果的准确率达99.7％，表明使用本发明方法对样品进行高通量检测具有很高准确性和可靠性。

表6：检测结果与样品本身的基因型信息比较

应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种基于KASP技术区分转基因植物纯合体和杂合体的方法，其特征在于，

其步骤包括：（1）DNA提取；（2）引物设计及其合成；（3）进行KASP反应；（4）进行结果判定；

步骤（2）为：设计两对引物，第一对的正向引物F1和反向引物R1分别设计在外源插入片段两侧的植物基因组区域，正向引物F1的5'端添加了一种荧光标签序列；第二对的正向引物F2和反向引物R2分别设计在外源插入片段区域和插入片段侧翼的植物基因组区域，正向引物F2的5'端添加另一种荧光标签序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中的荧光标签序列选自HEX标签序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，及FAM标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：第一对的正向引物5'端添加了HEX标签序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，第二对的正向引物5'端添加FAM标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）为：将引物、DNA模板以及KASP反应液按照一定比例混合构建PCR反应体系，将加样完毕的反应板进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个TouchDown 循环，每个Touch Down循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环，所述PCR反应体系如下表所示：

。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）为：反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，如果能检测出显著的两种不同荧光，则表明样品是转基因杂合体；如果仅检测到显著的第一对引物的正向引物所对应的荧光，则表明样品是不含该转基因片段；如果仅检测到显著的第二对引物的正向引物所对应的荧光，则表明样品是转基因纯合体；如果两种荧光信号都没有检测到，则需要重新检测。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（4）为：反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，如果能检测出显著的HEX荧光和FAM荧光，则表明样品是转基因杂合体；如果仅检测到显著的HEX荧光，则表明样品不含该转基因片段；如果仅检测到显著的FAM荧光，则表明样品是转基因纯合体；如果两种荧光信号都没有检测到，则需要重新检测。

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